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摘要
背景:在过去的30年里，英国和其他工业化国家报道的肝内胆管癌(CCa)死亡率急剧上升，其原因尚未得到解释。DNA加合物的形成是诱发性的，表明暴露于DNA损伤剂。这是化学诱导致癌的关键步骤。我们假设CCa死亡率的增加是由基因毒性环境因子的增加引起的，导致胆管细胞DNA损伤。
目的:研究和比较肿瘤和肿瘤邻近的CCa组织，以及非癌控制胆管组织，DNA加合物作为基因毒素暴露的生物标志物。
方法:使用核酸酶P1方法对32例肝内CCa患者(28例来自邻近非肿瘤组织)和7例非癌症患者胆道DNA加合物的存在进行了研究32P postlabelling。DNA加合物水平(加合物数量/108核苷酸)被定量。
结果:肿瘤邻近DNA(中位数8.6，范围1.2-51.6)和CCa DNA(7.2, 1.8-48.4)之间的相对加合物标记(RALs)没有显著差异。然而，与非癌症患者DNA相比，癌症患者DNA(肿瘤邻近DNA和CCa DNA)中的RALs明显更高(2.9,0.6-11.5;p=0.032，双尾Mann-Whitney U检验)。与非癌症患者相比，CCa中也发现了不同的加合模式。
结论:癌症患者和非癌症患者加合物的定量和定性差异支持基因毒素可能在肝内CCa的发展中发挥作用的假设。
- 胆管癌
- DNA加合物
- 32P postlabelling
- CCa,胆管癌
- CYP细胞色素P450
- RAL，相对加合物标签
- TLC，薄层色谱
数据来自Altmetric.com
胆管癌(CCa)是一种由胆道上皮层的胆管细胞引起的恶性肿瘤。它通常是致命的。1 -3.在世界范围内，CCa是继肝细胞癌之后第二常见的原发性肝癌，占所有原发性肝脏恶性肿瘤的15%。2总体而言，CCa在亚洲的发病率是欧洲的50倍，在欧洲它被视为一种罕见的肿瘤。2，3.然而，最近的报告显示，在工业化国家，肝内CCa(发生在肝实质内)正在稳步上升(图1)。4 -6自20世纪90年代中期以来，CCa已成为英格兰和威尔士恶性肝脏肿瘤最常见的死亡原因。7
肝内胆管癌发病率上升的国家的例子。ASMR，年龄标准化死亡率(修改自Khan和同事4）.
工业化国家CCa持续上升的原因尚不清楚。死亡率编码的变化或诊断的改进不能充分解释这一点。7许多致癌毒素通过肝胆途径代谢，有毒化合物与其他原发性肝肿瘤有关，例如酒精和黄曲霉毒素8肝细胞癌，氯乙烯和血管肉瘤。9这种化学毒素的致癌特性很可能是通过基因毒性作用介导的。8日,9CCa升高的一个可能的促成因素可能是胆管上皮中的胆管细胞长期和不断地暴露于胆汁中的环境致癌代谢物。
DNA加合物
DNA加合物是由亲电致癌物或其代谢物在核苷酸水平上结合而形成的共价修饰碱基。加合物的形成是基因毒性致癌的主要启动事件，并清楚地表明暴露于DNA损伤剂。10这是化学诱导致癌的关键步骤，因为错误或未修复加合物可导致突变。10 -12除了引起突变外，DNA加合物还通过染色体损伤诱导致癌。DNA加合物在各种人体组织中的形成已被广泛研究，作为高危人群暴露于职业和其他致癌物的生物标志物。12 -18大多数考虑不同部位癌症与加合物水平之间关系的研究表明，癌症病例的加合物水平高于非癌症对照组。19对家族性腺瘤性息肉病患者的一系列研究表明，胆汁中含有诱导加合物的化学物质20 -24由于APC肿瘤抑制基因突变，大肠和上胃肠道的多个腺瘤发生恶性转化。一些研究表明，暴露于致癌化学物质后，DNA加合物在人类和啮齿动物肝脏中被诱导。例如，发现石油馏分中DNA加合物的形成与诱变指数之间存在相关性。25DNA加合物也在暴露于类固醇激素后的人类肝细胞中被检测到26还有多氯联苯。27DNA加合物的诱导也与导致血色素沉着症患者恶性变化的肿瘤的起始有关。28
本研究
在超过200项研究中，DNA加合物已在各种人体组织中被检测到，包括肝脏、肺、结肠、膀胱、乳房、宫颈、大脑、血液淋巴细胞和胃。12然而，目前还没有发表关于DNA加合物在恶性或正常人类胆道组织中检测的研究。由于肝脏在异种生物代谢中的作用以及胆汁中此类化合物的浓度，对胆道系统的研究可能具有相当大的兴趣。
在本研究中，我们比较了来自CCa、肿瘤邻近组织和非癌控制组织的DNA，以确定DNA加合物作为基因毒素暴露的生物标志物的水平和模式。
检测组织中DNA加合物的方法多种多样，包括加速器质谱、荧光光谱、气相色谱/质谱和免疫分析。10我们使用32P后贴，最敏感和最流行的技术之一。它的优点包括能够检测10个加合物中的1个10仅使用1 μg DNA就能合成正常的核苷酸。它的独特之处在于它是一种通用程序，不需要预先加合物的特征，因此可以检测到未知的加合物。12，29
材料与方法
样本采集
手术时采集32例肝内CCa患者的肿瘤组织样本(12例男性，年龄36-70岁;平均56)由伦敦帝国学院汉默史密斯医院的肝胆外科医生进行手术。所有样本经组织学和影像学证实为原发性肝内胆管癌。28例还收集肿瘤邻近组织。采集7例非癌症患者的囊管(3例男性，29-72岁;平均54例，因胆结石行腹腔镜胆囊切除术。囊管由伦敦帝国理工学院圣玛丽医院的肝胆外科医生收集。样本采集已获得当地伦理委员会批准。在DNA提取之前，将组织样本保存在−70°C。从组织样本中提取DNA的苯酚使用了古普塔设计的方法的改进。30.在标记后，将暴露于苯并(c)甘油(因其形成DNA加合物的显著能力而闻名)的小鼠皮肤DNA和鲑鱼精子DNA分别用作阳性和阴性对照。3名非癌症患者(43%)和6名CCa患者(19%)是吸烟者。
试剂
微球菌核酸酶、脾脏磷酸二酯酶和核酸酶P1来自Sigma (Poole, Dorset, UK)， T4多核苷酸激酶来自Gibco/BRL (Life Technologies, Paisley, UK)。γ32P-ATP从ICN (Thame, Oxfordshire, UK)获得。pei -纤维素板由machery - nagel制造。从Sigma中提取鲑鱼精子DNA，用RNAse和苯酚提取DNA。
32P标记后测定
消化和32P标记后测定
使用岛津MPS-2000光谱仪，用A260和A280紫外光谱读数测定从组织样本中提取的DNA的浓度和纯度。DNA样品(4 μg)在Gyrovap旋转干燥器中蒸发至干燥，在37℃下与0.12 U的微球菌核酸酶和脾脏磷酸二酯酶(1 μg/μl)， 0.8 μl氯化钙/琥珀酸钠(50 mM CaCl)孵育过夜2和100 mM琥珀酸钠(pH 6.0)， 2.8 μl蒸馏H20.第2天，加入核酸酶P1 0.96 μl (1.25 μg/μl)、氯化锌1.44 μl (2 mM)、乙酸钠2.4 μl (0.25 M, pH 5.0)，在37℃下孵育1小时。然后，在每个样品中加入1.92 μl 0.5 M Tris碱，然后用50 μCi γ标记32P-ATP(比活性7000 Ci/mmol)，激酶缓冲液(200 mM bicine, 100 mM MgCl) 1 μl2， 100 mM二硫三醇，10 mM亚精胺，pH 9.0)， 6u t4 -多核苷酸激酶(终浓度0.6 U/μl)。样品在37°C下孵育60分钟。
薄层色谱(TLC)
样品在10×10 cm的聚乙烯亚胺纤维素薄层色谱板上染色，在溶剂D1 (1 M磷酸钠，pH 6.0)中显影，在灯芯上过夜。将灯芯丢弃，平板在D2缓冲液(2.5 M甲酸铵，pH 3.5)中洗涤。接下来，将平板旋转180°，在D3溶剂(3.5 M甲酸锂和8.5 M尿素，pH 3.5)中显影。然后在D4溶剂(0.8 M氯化锂，0.5 M Tris HCl, 8.5 M尿素，pH 8.0)中将平板翻转90°，显影。D3和D4都跑到板的顶部。
检测、定量和统计分析
射线自显像检测加合点。底片在−70°C的Biomax-MS胶卷(柯达)中过夜。闪烁读数取自代表加合物的热点和每个板上的空白区域，使用Minaxi Tri-Carb 4000系列计数器。对于每个样品相对加合物标签(RAL)值(每10个加合物的数量)8核苷酸)在两个独立的测定中进行测定，以确保技术的一致性。RALs是根据每分钟计数与(特定activity×quantity的DNA标记)的比率计算的，如前所述。31第二次试验的RAL评分可重复至第一次RAL评分的12%以内。加合模式在重复分析中也是可重复的。由于数据不符合正态分布(Shapiro-Wilk检验0.010)，采用Mann-Whitney U检验检验组间差异的显著性。
结果
在癌症患者和非癌症患者加合物中存在定性差异，以及显著的数量差异。
热点分布图
显示所获得的主要典型加合点模式的自x线照片示例如图2B-D所示，显示所获得的所有点位置的示意图如图2A所示。加合点的数量和分布总结在图3中。两组肿瘤邻近区和CCa DNA-a中位数均为4个，差异无统计学意义。然而，这两组之间在斑点的模式和强度上存在定性差异(图2B, C)。再次，这些不同于对照组患者DNA中所见的斑点，其中三个主要加合物区域很明显(图2D)。阳性对照的结果是苯并(c) chrsene的典型特征良好的加合模式(数据可根据要求提供)。阴性对照未显示加合物形成。
(A)显示所有发现斑点的位置和溶剂方向的示意图。A1-A3:非癌DNA中可见的斑点，大多数胆管癌患者也常见，包括肿瘤和肿瘤邻近组织。三者均见(D). C1-C4:仅在胆管癌DNA中可见的斑点。C1-C3的例子见(C)。T1-T5，仅在肿瘤邻近DNA中可见斑点。T2, T4, T5的例子如(B)所示。箭头表示D3和D4的溶剂方向。A1-A3与C1-C4或A1-A3与T1-T5的多种组合。(B-D)放射自显影的例子32P后标DNA(每个自放射照相的起点在左下角)。
(A)肿瘤邻近DNA、(B)胆管癌DNA和(C)非癌控制DNA加合点数量的频率，表明肿瘤和肿瘤邻近组织DNA加合点的模式相似，但与非癌DNA不同。
相对加合物标记(RAL)
RALs(每10个加合数)无显著差异8核苷酸)介于肿瘤邻近DNA(中位数8.6，范围1.2-51.6)和CCa DNA(7.2, 1.8-48.4)之间。然而，与非癌症患者DNA相比，癌症患者DNA(肿瘤邻近DNA和CCa DNA)中的RALs明显更高(2.9,0.6-11.5;p=0.032，双尾Mann-Whitney U检验)。表1给出了每组中主要典型加合点的个体RALs。三组间RALs比较见图4和图5。在非癌症受试者或癌症患者中，吸烟者和非吸烟者的总RALs没有显著差异。
相对加合物标签(RAL)值的分布(每10个加合物的数量)8(A)肿瘤邻近DNA， (B)胆管癌DNA， (c)非癌症控制DNA。
相对加合物标签值(RALs;每10加和数8核苷酸)在三个样本组。第1组，肿瘤邻近DNA (n=28);2组胆管癌DNA (n=32);第三组为非癌症DNA (n=7)。
讨论
在工业化国家，肝内胆管癌在过去三十年中呈上升趋势。4这种上升的原因仍然无法解释。考虑到这种增加发生在相对较近的时间尺度上，它不太可能是由于相关人群的基因变化造成的，而有可能是环境因素造成的。
在全球肝吸虫流行的部分地区，如中国和泰国东北部省份，CCa是一种常见的肝脏肿瘤。32人类感染了吸虫(Opisthorcis viverrini而且Clonorchis sinensis)吃了未煮熟的含有感染性囊蚴的鱼。肝内(肝外)胆管中成熟吸虫的慢性感染会导致上皮发育不良，这是一种癌前病变，通过激活原癌基因和同时灭活肿瘤抑制基因的分子异常积累，发展为肿瘤转化。2，3.在西方世界，由于没有肝吸虫，大多数CCa的病因尚不清楚。虽然有一些情况与CCa密切相关(如原发性硬化性胆管炎、溃疡性结肠炎、胆管腺瘤、胆道囊肿和慢性导管内胆结石)，但在绝大多数情况下，这些危险因素不适用，原因尚不清楚。2，3.33
对于肝内而非肝外CCa增加的一个可能的解释可能是由于肝内胆道树的表面积更大，34允许更多地接触潜在的致癌物，包括环境中的自然和/或异种生物化学残留物，这些残留物被排泄并集中在胆汁中。几种化学物质与胰腺癌的发病机制有关35岁,36和Cca,2，3.33岁的37 -39包括镉、有机氯、石棉、二恶英、异烟肼、甲基多巴、亚硝胺和多氯联苯。一种导致CCa的化学基因毒性致癌物的具体证据来自thortrast。38岁的39这种二氧化钍的胶体悬浮液曾被用作造影剂，但由于其致癌特性，特别是在胆管肿瘤方面，于20世纪60年代被禁止使用。它的致癌作用被认为是通过诱导p53突变。40
DNA加合物在所有检测样品中均被发现。我们测量的加合物浓度与以前使用的人类加合物研究相似32P postlabelling。其中包括家族性腺瘤性息肉病患者胃肠道胆汁加合物诱导特性的研究20 -24(0-30 RALs)，以及人类肝脏暴露于化学基因毒素的研究26日,27(2 - 100、)。一般认为，DNA内收的背景水平基本上是普遍的。41然而，在我们的研究中发现CCa中加合物水平高于非癌症患者，这与胆道胆管细胞暴露于DNA损伤剂的假设是一致的，DNA加合物形成的程度以及随后的突变风险与肿瘤发生的风险相关。因此，增加加合物负担可能会导致致癌风险的增加。11，12，41
一旦形成，DNA加合物通常被细胞切除修复机制去除。因此，组织中致癌物-DNA加合物的存在反映了许多不同的过程，包括暴露于毒素、毒素水平以及取决于宿主酶、吸收和DNA修复的活性物种的代谢(或解毒)。例如，细胞色素P450 (CYP)家族对于多环芳香烃(CYP2B1/2和2C9/10)和多氯联苯(cypl - 1a1, 1B1, CYP2B1/2)代谢形成的加合物特别重要。42岁的43因此，DNA加合物水平提供了暴露和影响这些过程的宿主因素的衡量标准。鉴于DNA加合物广泛存在，但只有少数人发展为癌症，推测宿主因素以及暴露在癌症中起着决定癌症变化进展的关键作用。
已经描述了参与致癌物质代谢和DNA修复的激活和灭活途径的酶的活性的显著个体间差异。44这种变异越来越多地与癌症易感性的差异联系在一起，这可能是修改DNA加合物水平的结果。12例如，已观察到人肺中体积较大的DNA加合物水平与芳基烃羟化酶(CYP1A1)的表达之间存在线性关联。45此外，在肺中，大体积DNA加合物的水平随谷胱甘肽s转移酶GSTP-1基因型而变化，而N7-甲基鸟嘌呤(外源性甲基化剂暴露产生的主要加合物)与不同的CYP2E1和CYP2D6基因型相关。46
DNA修复酶在确定加合物水平和随后的癌症风险方面很重要。在一项研究中，O6膀胱中- n7 -甲基鸟嘌呤水平与DNA修复蛋白O呈负相关6-烷基鸟嘌呤- dna烷基转移酶活性。47修复系统的缺陷会增加致癌，例如，在紫外光诱导的皮肤加合物不能正确修复的情况下，着色性干皮病的皮肤癌。
另一个可能改变加合物生成和随后致癌之间风险的因素是暴露于细胞增殖剂的差异。在慢性胆管细胞周转增加的背景下，暴露于DNA加合物诱导致癌物，例如继发于肝吸虫感染、原发性硬化性胆管炎或导管内胆结石(所有公认的CCa危险因素)，可能提供肿瘤发生所需的额外“打击”。
我们采用的后标记方法通常不检测小的内源性加合物，这些加合物是由与甲基化剂或自由基相互作用形成的。因此，本研究中看到的加合物很可能是由于外源因素，但不能完全排除一些加合物可能是内源性的可能性。然而，内源性和外源性DNA加合物的形成可能会因环境和/或宿主因素而增强，从而导致体内加合物形成的易感性。
虽然后标记是一种高度敏感的技术，用于检测未知加合物，而之前的加合物表征是不可用的，但它不是特异性的。后贴标法存在加合物结构不能直接确定的缺点。因此，这些DNA修饰的起源和确切性质尚不清楚，因为所研究的患者中没有持续接触治疗性或职业性加合物形成剂的历史。还必须指出的是，并非所有DNA加合物在诱变潜力方面都是相等的。不同的加合物也可能有不同的半衰期和修复倾向。此外，必须记住，肿瘤特有的加合物可能不仅代表更高的致癌风险，而且理论上也可能反映肿瘤诱导的细胞代谢谱的改变，导致代谢致癌物的能力改变，从而形成加合物。因此，很难对所发现的任何单独加合物的致癌意义得出任何结论。大规模流行病学调查，包括病例对照和聚类研究，也可能提供关于任何潜在病原体的重要信息。
这项研究首次研究了人类胆管癌中的DNA加合物作为致癌物暴露的生物标志物。我们发现在CCa和邻近的非肿瘤组织之间加合物的浓度或总数没有显著差异，但在所见加合物模式上发现了质的差异。我们还发现，与非癌症个体相比，CCa患者胆道组织中的加合物明显更多。癌症患者和非癌症患者加合物在数量和质量上的差异支持基因毒素可能在CCa的发展中发挥作用的假设。进一步阐明致病因素将取决于流行病学研究和实验室研究。
致谢
我们感谢帝国理工学院圣玛丽医院校区的Ara Darzi教授和他的外科同事提供对照组织样本，感谢帝国理工学院医学院的Daniel Forton博士提供统计分析方面的建议。