醛固酮对人结肠隐窝细胞中导钾通道的非基因组调控

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结肠

免费的

K个Bowley1，
M J莫顿2，
米亨特2，
克我八婆1

¹英国利兹圣詹姆斯大学医院分子医学科
²英国利兹大学生物医学科学系

通信:
G I Sandle教授，英国利兹LS9 7TF，贝克特街圣詹姆斯大学医院临床科学楼分子医学科;
g.i.sandle在{}leeds.ac.uk

摘要

背景:醛固酮对宏观基底外侧K有快速的、非基因组的抑制作用⁺人体结肠中的电导，降低结肠对Cl的吸收能力⁻分泌。K的分子恒等式⁺构成这种醛固酮抑制K的通道⁺电导尚不清楚。

目的:刻画K⁺醛固酮抑制的通道存在于人结肠隐窝细胞的基底外侧膜。

方法:隐窝是从结肠镜检查中获得的健康乙状结肠活检中分离出来的。醛固酮对基底外侧K⁺渠道，以及罗某可能参与其中⁺: H⁺用膜片钳技术进行了研究。从分离的隐窝中提取总RNA，使用中间导电性为K的引物进行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)⁺通道(KCNN4)之前在其他人体组织中发现。

结果:1 nmol/l醛固酮显著降低细胞贴壁斑块的中间电导(27ps) K活性⁺1分钟、5分钟和10分钟后，频道分别下降了31%、53%和54%。当醛固酮浓度增加到10 nmol/l时，5分钟后通道活性进一步下降56%。在20 μmol/l的乙基异丙基胺氯的存在下，1-10 nmol/l的醛固酮对通道活性没有影响⁺: H⁺交换。rt - pcr鉴定KCNN4mRNA，它可能编码27ps K⁺醛固酮抑制的通道。

结论:中间电导K⁺存在于人结肠隐窝细胞基底外侧膜的通道(KCNN4)是醛固酮非基因组抑制作用的靶点，这涉及到Na的刺激⁺: H⁺交换，从而减少结肠对Cl的吸收能力⁻分泌。

醛固酮
人类结肠
KCNN4
钾离子通道

EIPA, ethylisopropylamiloride
RT-PCR，逆转录聚合酶链反应

http://dx.doi.org/10.1136/gut.52.6.854

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目前公认的电致氯化模型⁻哺乳动物肠的分泌需要基底外侧K的激活⁺通道促进细胞超极化和钾循环⁺通过基底外侧Na进入细胞⁺K⁺2氯⁻协同转运和Na⁺K⁺腺苷三磷酸酶。¹这维持了持续Cl的电化学梯度⁻通过cAMP激活的根尖Cl退出⁻频道。T₈₄人结肠腺癌细胞系，广泛用于研究肠道Cl⁻分泌，具有两种药理学上不同的基底外侧K⁺宏观层面的电导，Ca激活的电导^{2 +}另一个是依赖于cAMP的Cl⁻分泌受体激动剂。^2，^3.封锁这些基底外侧K⁺电导抑制Cl⁻分泌过程。^3.⁴电生理研究显示基底外侧K低电导(1-3 pS)⁺在大鼠结肠隐窝细胞中，这些通道在cAMP刺激Cl时被激活⁻分泌和抑制色素醇293B。^5，⁶在T₈₄细胞这些低电导K⁺通道被描述为KCNQ1和KCNE3的复合物。⁵然而，人结肠隐窝细胞的基底外侧膜主要由中间电导(~ 25ps) K支配⁺这种通道在很大程度上与电压无关，内向整流较弱，并被Cl激活⁻secretagogues carbachol^{2 +}介导的毒蕈碱激动剂)和二丁基cAMP (cAMP的膜透类似物)。^７，⁸这些中间电导K的基本性质⁺通道与IK相似_Ca通道(被人类基因组组织命名为KCNN4，被个别作者命名为hSK4、hIK1、hKCa4和rSK4)最近从人类胎盘的cDNA文库中克隆出来，⁹胰腺,¹⁰淋巴结¹¹和T淋巴母,¹²大鼠远端结肠，¹³而是IK的分子特性_Ca人类结肠中的通道不清楚。

基底外侧K的作用的新见解⁺肠内Cl通道⁻分泌来自于醛固酮的快速非基因组效应的研究。¹⁴在哺乳动物结肠中，纳摩尔浓度的醛固酮刺激钠⁺: H⁺交换，增加细胞内钙^{2 +}浓度，刺激蛋白激酶C活性，抑制基底外侧K⁺电致Cl所需的电导⁻分泌，并激活ATP依赖的基底外侧K⁺钠的电导⁺吸收。^{14 -}，¹⁶这些发现提示醛固酮的非基因组效应导致结肠对氯的吸收能力(在几分钟内)迅速下降⁻同时增加钠的吸收能力⁺吸收。¹⁴

展示了丰富的本土知识_Ca人结肠隐窝细胞基底外侧膜中的通道，^７，⁸我们研究的第一阶段是确定这些K⁺通道构成宏观基底外侧K⁺电导是易受醛固酮的非基因组调控的，如果是，这种影响是否与钠的变化有关⁺: H⁺交换活动。¹⁴第二阶段是确定本土知识是否存在_Ca存在于人类结肠隐窝细胞中的通道与在其他人体组织中发现的KCNN4相同。^{9 -}，¹²

方法

人类结肠隐窝的分离

在获得书面知情同意后，从接受结肠镜或软式乙状结肠镜检查的患者中获得4-6份看起来正常的乙状结肠黏膜活检，以调查排便习惯的改变和/或腹痛。在手术期间，所有患者都没有接受药物治疗。接受结肠镜检查的患者在前24小时内接受了Klean-Prep (Norgine, Harefield, UK)，而接受弹性乙状结肠镜检查的患者在手术前接受了准备使用灌肠剂的Fleet (De Witt, Runcorn, UK)。所有病例的常规组织学均正常。该研究得到了利兹卫生局伦理委员会的批准。完整的隐窝被先前描述的Ca^{2 +}螯合物的方法。⁸活组织切片在37°C的Ca中孵育45分钟^{2 +}游离溶液含(mmol/l): edta10, NaCl 112, KCl 5，二硫苏糖醇3,HEPES 20，滴定至pH 7.1，以Trizma碱。然后用磁棒在37°C轻轻搅动活检组织30分钟，以释放完整的隐窝。通过离心收集隐窝，洗涤两次，并重新悬浮在含有(mmol/l): K的储存溶液中⁺葡萄糖酸酯100，氯化钾30，氯化钠20，氯化钙₂1.25, MgCl₂1, HEPES 10，葡萄糖5，钠⁺丙酮酸5和钠⁺丁酸5，加入1 g/l牛血清白蛋白，用KOH滴定至pH 7.4，冷藏至需要。用这种方法分离出的隐窝似乎完全由上皮细胞组成(图1)⇓)．

Photomicrograph of intact colonic crypts isolated by Ca²⁺ chelation and visualised using Hoffman modulated optics (×400). Note that the crypts were isolated devoid of non-epithelial cells originating from the lamina propria. The lumenal opening and base of each crypt can be clearly distinguished. Arrows indicate the continuous layer of crypt epithelial cells (A) and the crypt lumen (B).

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图1

Ca分离出完整结肠隐窝的显微照片^{2 +}螯合和可视化使用霍夫曼调制光学(×400)。注意隐窝是孤立的，没有来自固有层的非上皮细胞。每个隐窝的管腔开口和基底可以清楚地区分出来。箭头表示隐窝上皮细胞的连续层(A)和隐窝管腔(B)。

膜片钳研究

单通道记录从细胞的基底外侧膜斑块中三分之一的隐窝附着和被内外分离的配置。实验在20-22°C而不是37°C进行，以保持活力。¹⁷在细胞附着片上进行的实验中，浴液的含量为(mmol/l): NaCl 140, KCl 4.5, CaCl₂1.2, MgCl₂1.2，葡萄糖5,HEPES 10，钠⁺丁酸5，用NaOH滴定至pH 7.4。实验还研究了在(mmol/l) KCl 145、CaCl溶液中，切除的内外贴片中通道的pH敏感性₂0.1, MgCl₂1.2，葡萄糖5,HEPES 10，钠⁺丁酸5，用KOH滴定至pH 6.8, 7.0, 7.2, 7.4或7.6。用硼硅酸盐玻璃制成贴片移液管，用含有(mmol/l): KCl 145, CaCl的溶液填充₂1.2, MgCl₂1.2，葡萄糖5,HEPES 10，钠⁺丁酸5，抗性为5 - 6 MΩ。对于使用切除的内外贴片的记录，贴片移液管中存在KCl溶液，浴中存在NaCl或KCl溶液。单通道电流用膜片钳放大器记录(List型号EPC7;达姆施塔特(Darmstadt, Germany)，在一个与移液管内部相关的保持电压范围内。经过脉冲编码调制(索尼型号PCM-701 ES，日本)后，电流存储在录像带上。存储的电流经过低通滤波(750 Hz)，并通过DigiData 1200接口系统和pCLAMP软件(Axon Instruments Inc.， Union City, California, version 5.6)加载到计算机内存(Elonex Home PC 386S-200)中进行离线分析。单通道打开概率(P_o)，使用Quick Basic 4.0(微软，雷丁，英国)编写的分析程序计算补丁中的通道数量。当电流越过在这些状态中间设置的阈值时，就会发生在全闭和全开电流水平之间的过渡。P_o计算为:

在哪里N是在30秒的录音中同时打开的通道的最大数量，n是通道的状态(0是关闭的，1是一个通道打开的，等等)，t_n是处于状态n的时间。

通过记录基础条件下的通道活性，以及在添加1 nmol/l醛固酮和再添加9 nmol/l醛固酮(最终浴液浓度为10 nmol/l)后的固定时间间隔，研究了醛固酮在细胞附着斑块中的非基因组效应。罗某的介入⁺: H⁺在20 μmol/l乙基异丙基lamiloride (EIPA)的存在下，重复该方案研究了非基因组效应的交换⁺: H⁺交换抑制剂。

逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)研究

离心制球结肠隐窝，采用Chomczynski和Sacchi的硫氰酸胍-酸酚-氯仿法提取总RNA，¹⁸并在RNase游离水中重新悬浮。总RNA在37°C下使用上标I反转录酶和寡核苷酸(dT)反转录。_{12 - 18}引物根据制造商的说明(Invitrogen，佩斯利，英国)。为了控制可能的基因组DNA污染，在没有上标的情况下也进行了反转录。寡核苷酸引物也被设计成跨越内含子/外显子的边界，以便从基因组或互补DNA (cDNA)中扩增时产生不同大小的PCR产物。随后，用cDNA作为模板进行两轮PCR，引物针对人类KCNN4 (GenBank登录号:NoAF000972)．每次PCR用2.5 U ofTaqDNA聚合酶(内部制备)，循环参数如下:94°C 30秒，58°C 45秒，72°C 30秒。前35个循环产生830个碱基对的PCR产物(义5 ' -CAG AGA TGC TGT GGT TCG GGG-3 '和反义5 ' -CTT GTA GCA CTC GGG CAG -3 ')。为了增加扩增量，我们进行了第二轮35个循环，得到761个碱基对的PCR产物(义5 ' -TTT CCA CCT TCT TAC TCC TCT gc -3 '和上述反义引物)。以KCNN4为引物扩增的人胎盘cDNA文库作为PCR的阳性对照。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分离，紫外照明可视化，使用柯达数字科学文档和分析系统拍照。使用宽范围DNA标记(Sigma, pool, UK)对每个凝胶进行分子量比较。PCR产物从凝胶中分离(GeneClean协议)，并通过自动荧光测序(Lark Technologies, Saffron Walden, UK)进行鉴定。结果序列与GenBank中的序列一致(AF000972)使用CLUSTAL X算法。

统计分析

结果用均值(SEM)表示。使用学生的数据进行统计分析t检验p<0.05被认为是显著的。

结果

基底外侧K⁺人类结肠隐窝中的通道

我们之前已经描述过Ba^{2 +}blockable Ca^{2 +}敏感中间电导K⁺结肠隐窝基底外侧膜上的通道约占75%。^７，⁸在本研究中，在离体结肠隐窝中三分之一的58/113(51%)细胞附着的基底外侧膜斑块中观察到类似的通道。NaCl溶液在槽中，KCl溶液在移液器中，细胞附着的基底外侧膜片在静息膜电位(零保持电压)处可见内向电流，线性电流-电压关系表明，平均斜率电导和反转电位分别为27 (1)pS和28 (6)mV (n=15)，通道活度在−80 mV到−20 mV之间与电压无关。在将贴片从内到外的结构(n=11)切除后，可以看到曲线电流-电压关系⁺: Na⁺渗透率比值(P_K: P_Na)和反转电位分别为41(3):1和74 (1)mV，利用Goldman-Hodgkin-Katz电流和电压方程计算。^19，^20.当由内到外的贴片暴露在镀液和移液管中的KCl溶液中，电流-电压关系表明K向内整流⁺通道，单通道电导在−60 mV时大于+60 mV时(29 (2)pS)v12 (2) pS;p < 0.0008, n = 7)。

基底外侧K的非基因组抑制⁺渠道由醛固酮

在细胞附着的基底外侧膜贴片(保持电压- 40 mV)中，浴液中加入1 nmol/l醛固酮可迅速降低自发27ps K⁺当醛固酮浓度增加到10 nmol/l时，通道活性进一步下降(图2A⇓)．图2B总结了11个补丁的数据⇓说明添加1 nmol/l醛固酮可降低P_o1分钟后从0.59(0.06)上升到0.41(0.07)(下降31%)(p<0.004)， 5分钟后上升到0.28(0.07)(下降53%)(与基础值相比p<0.0005)， 10分钟后上升到0.27(0.04)(下降54%)(与基础值相比p<0.0005)。在7个处理中，当醛固酮浓度增加到10 nmol/l时，磷含量降低_o5分钟后，从0.32(0.02)到0.14(0.05)(进一步提高56%)，较低的活动水平持续了10分钟。在6个未暴露于醛固酮作为时间对照的细胞附着斑块中，通道活性在25分钟的记录期间没有显著变化(P_o0时刻的0.58 (0.12)，P_o25分钟后0.57 (0.16);NS)。

Non-genomic inhibition of intermediate conductance basolateral K⁺ channels by aldosterone (ALDO). (A) Representative recordings from a cell attached patch containing multiple channels (holding voltage −40 mV, referenced to pipette interior; 140 mmol/l Na⁺ in bath, 145 mmol/l K⁺ in pipette), showing rapid onset of inhibition of K⁺ channel activity by 1 nmol/l aldosterone, with further inhibition after increasing the aldosterone concentration to 10 nmol/l. Dashed lines indicate zero current levels (C) and dotted lines open channel levels (1–4). (B) Summary of data from 7–11 cell attached patches.

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图2

中间电导基底外侧K的非基因组抑制⁺醛固酮(ALDO)通路。(A)带有多个通道的细胞贴片的代表性记录(保持电压−40 mV，参考移液器内部;140更易与l Na⁺浴时，145 mmol/l K⁺在移液管中)，显示K⁺1 nmol/l醛固酮对通道活性的影响，当醛固酮浓度增加到10 nmol/l时，通道活性进一步受到抑制。虚线表示零电流电平(C)，虚线表示开路电平(1-4)。(B) 7-11细胞附着贴片的数据摘要。

添加1 nmol/l醛固酮10分钟后，单通道电流幅值从1.86 (0.30)pA显著下降到1.46 (0.29)pA (p<0.015)，提示细胞膜去极化。相比之下，在时间控制研究中，10分钟后电流振幅没有变化(1.77 (0.27)pAv1.71 (0.32) pA;NS)。醛固酮诱导的细胞膜去极化与基底外侧K的抑制一致⁺频道。

仔细检查图2A⇑醛固酮降低K⁺补丁中的通道。因此，矿物皮质激素可能刺激通道的循环进入细胞质囊泡池，而不是对位于基底外侧膜的通道有直接抑制作用。然而，如图3所示⇓在五个补丁中只包含一个K⁺10 nmol/l醛固酮降低而不是完全消除通道活性，这与直接抑制通道而不是刺激通道循环是一致的。

Non-genomic inhibition of intermediate conductance basolateral K⁺ channels by aldosterone (ALDO). Representative recordings from a cell attached patch containing a single channel (holding voltage −40 mV, referenced to pipette interior; 140 mmol/l Na⁺ in bath, 145 mmol/l K⁺ in pipette) showing inhibition of K⁺ channel activity 10 minutes after addition of 10 nmol/l aldosterone. Dashed lines indicate zero current levels (C) and dotted lines open channel levels (O). The presence of a low residual level of channel activity post aldosterone suggests that channels are regulated in situ within the basolateral membrane rather than being endocytosed.

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图3

中间电导基底外侧K的非基因组抑制⁺醛固酮(ALDO)通路。代表性的记录来自附带有单通道的电池贴片(保持电压−40 mV，参考移液管内部;140更易与l Na⁺浴时，145 mmol/l K⁺在移液管)显示抑制K⁺添加10nmol /l醛固酮后10分钟通道活性。虚线表示零电流水平(C)，虚线表示开放通道水平(O)。醛固酮后通道活性残留水平低，提示通道在基底外侧膜内原位调节，而不是被内吞。

EIPA对K⁺醛固酮抑制通道

在另外的一系列实验中，隐窝用20 μmol/l的特异Na⁺: H⁺在- 40 mV的维持电压下，5分钟后，对细胞附着基底外侧膜贴片的通道活性没有影响(P_o0.53 (0.12)vP_o0.58 (0.10);n = 6, NS)。如图4A所示⇓，随后添加1-10 nmol/l醛固酮对27 pS K无影响⁺在环评局的持续存在下进行渠道活动。六次实验的数据，如图4B所示⇓，表明1 nmol/l醛固酮对通道活性无影响(P_o1分钟后0.59(0.08)，5分钟后0.63(0.07)，10分钟后0.54(0.08)。在四个贴片中，10 nmol/l醛固酮的抑制作用也被epa (P_o1分钟后0.55(0.14)，5分钟后0.54(0.16)，10分钟后0.54(0.20)。添加1 nmol/l醛固酮前后10 min, EIPA存在时的单通道电流幅值相近(分别为1.80 (0.38)pA和2.04 (0.36)pA;NS)，表明EIPA阻止了细胞膜去极化和在没有EIPA的情况下添加醛固酮时观察到的电流下降(见上文)。

Ethylisopropylamiloride (EIPA) prevented non-genomic inhibition of intermediate conductance basolateral K⁺ channels by aldosterone (ALDO). (A) Representative recordings from a cell attached patch containing multiple channels (holding voltage −40 mV, referenced to pipette interior; 140 mmol/l Na⁺ in bath, 145 mmol/l K⁺ in pipette) showing failure of 1–10 nmol/l aldosterone to inhibit K⁺ channel activity in the presence of 20 μmol/l EIPA, a specific Na⁺:H⁺ exchange inhibitor. Dashed lines indicate zero current levels (C) and dotted lines open channel levels (1, 2). (B) Summary of data from six cell attached patches.

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图4

乙基异丙基lamiloride (EIPA)可防止中间导基外侧K的非基因组抑制⁺醛固酮(ALDO)通路。(A)带有多个通道的细胞贴片的代表性记录(保持电压−40 mV，参考移液器内部;140更易与l Na⁺浴时，145 mmol/l K⁺1-10 nmol/l醛固酮对K抑制无效⁺在20 μmol/l EIPA存在时，特异Na⁺: H⁺交换抑制剂。虚线表示零电流水平(C)，虚线表示开通道水平(1,2)。(B)来自6个电池附加补丁的数据摘要。

另外还进行了一组实验，以确定是否长时间单独接触EIPA会影响通道活性。在暴露于20 μmol/l EIPA (P_o0.54(0.07)和0.55 (0.01);NS)。因此，EIPA本身对27ps K的活性没有影响⁺通道在这些实验的时间过程中。

基底外侧K的pH敏感性⁺渠道

如上所示，EIPA抑制了醛固酮对27ps K的非基因组抑制作用⁺这表明醛固酮刺激钠离子⁺: H⁺交换。这会增加细胞内的pH值，增加细胞碱化引起K的可能性⁺通道抑制。为了进一步研究这一点，我们从浸泡在“细胞内”高K中的被切除的由内到外的斑块中获得了记录⁺溶液的pH值在pH 6.8至7.6之间。图5⇓表明27 pS K⁺通道对pH适中敏感，P_o在pH值6.8时，从0.15(0.06)增加到pH值7.6时的0.37 (0.07)(p<0.04)。这些数据表明，碱化本身会刺激而不是抑制27ps K⁺通道。

pH sensitivity of intermediate conductance basolateral K⁺ channels. Summary of data from eight excised inside out basolateral membrane patches, showing the pattern of channel activity when the pH of the bath solution was varied between 6.8 and 7.6 (holding voltage −40 mV, referenced to pipette interior; 145 mmol/l K⁺ in bath and pipette).

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图5

中间电导基外侧K的pH敏感性⁺频道。8个由内而外的基底外侧膜片的数据总结，显示了当浴溶液的pH值在6.8到7.6之间变化时(保持电压−40 mV，参考移液管内部;145更易与l K⁺在浴缸和移液管)。

人结肠隐窝细胞中KCNN4 mRNA的检测

调查是否KCNN4在结肠上皮细胞中表达，总RNA从人类结肠隐窝分离物中提取，该分离物不含所有非上皮细胞类型，如成纤维细胞、内皮细胞和固有层细胞(图1⇑)．使用针对人类的引物KCNN4， RT-PCR(三次重复)产生一个761碱基对产物(图6)⇓)，测序显示与人类胎盘100%同源KCNN4(加入基因库没有AF000972)．这些数据证实了KCNN4mRNA在人结肠上皮细胞中表达。

KCNN4 mRNA is present in human colonic epithelial cells. Reverse transcription of total RNA from colonic crypts (HCC) performed in the presence (+) and absence (−) of Superscript and amplified using specific primers for human KCNN4. A human placental cDNA library (PL) amplified with KCNN4 primers acted as a positive control. DNA molecular weight ladder is shown on the far left of the gel.

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图6

KCNN4mRNA存在于人结肠上皮细胞中。在上标存在(+)和不存在(−)的情况下进行结肠隐窝(HCC)总RNA的反转录，并使用特定引物对人类进行扩增KCNN4．人胎盘cDNA文库(PL)扩增KCNN4引物作为阳性对照。DNA分子量阶梯显示在凝胶的最左边。

讨论

哺乳动物远端结肠是醛固酮基因组效应的主要靶上皮，包括电致Na的刺激⁺吸收和产电K⁺分泌过程。²¹这些变化出现在1型矿皮质激素受体激活数小时内，尽管持续醛固酮刺激的完全转运效应发生在2-3天后。²²醛固酮对结肠离子运输也有非基因组作用，增加细胞内钙^{2 +}刺激大鼠和人结肠上皮蛋白激酶C活性。^{14 -}，¹⁶这些影响与钠的增加有关⁺: H⁺导致细胞内碱化的交换。¹⁴有人认为醛固酮的非基因组效应抑制宏观的钙^{2 +}基底敏感,K⁺Cl中的电导⁻分泌,¹⁴虽然这K⁺电导没有在单通道水平上进行表征。本研究首次表明27ps基底外侧K⁺人结肠隐窝细胞中的通道构成了醛固酮抑制的宏观基底外侧K⁺上皮细胞的电导。低浓度(1 nmol/l)的醛固酮在1分钟后产生显著且持续的通道抑制，在较高浓度(10 nmol/l)时这种抑制更为明显(图2)⇑)．这种影响太快，无法用基因转录或mRNA翻译的变化来解释。它也不太可能反映K的刺激⁺通道回收，因为有限的通道活动在包含单个K的补丁中持续存在(而不是完全消失)⁺添加醛固酮后的通道(图3⇑)．

醛固酮对结肠Cl的非基因组抑制作用⁻分泌似乎是钙下调的直接结果^{2 +}基底敏感K⁺渠道,¹⁴这很可能是内在矫正的27ps K⁺我们已经在人类结肠隐窝细胞中发现了通道。基底类似K⁺通道存在于T中₈₄细胞和大鼠结肠隐窝，在那里它们在Cl中起着关键作用⁻分泌过程。^23日,²⁴他们的抑制导致K的减少⁺通过基底外侧膜的循环(从而减少细胞Cl⁻吸收的钠⁺- k⁺2氯⁻共转运)，以及无法维持持续Cl所必需的细胞超极化⁻经根尖腔出口⁻频道。醛固酮对钙的快速抑制作用^{2 +}依赖宏观基底外侧K⁺大鼠和人结肠中的电导与蛋白激酶C敏感钠的刺激有关⁺: H⁺交换和胞质pH值升高。¹⁴醛固酮对非上皮细胞的信号通路有多种非基因组效应，改变细胞内离子浓度、细胞体积和Na⁺: H⁺人类单核白细胞的交换，^25，²⁶Na⁺: H⁺血管平滑肌细胞的交换，²⁷增加细胞内钙^{2 +}在血管平滑肌细胞和猪主动脉内皮细胞中，^28日,²⁹增强人单核白细胞和血管平滑肌细胞中的磷酸肌苷水解。^30.³¹在本研究中，EIPA的存在阻止了醛固酮对27ps K的抑制作用⁺这表明醛固酮刺激Na⁺: H⁺交换，导致细胞内pH升高。在孤立的人类结肠隐窝中，醛固酮已被证明能使细胞内pH值从7.11迅速增加到7.32，这意味着细胞碱化在某种程度上与钙的抑制有关^{2 +}依赖宏观基底外侧K⁺导,¹⁴我们认为这相当于27 pS K⁺频道。然而，我们对从内到外切除的斑块的研究表明，碱化单独刺激这些K⁺渠道(图5⇑)．因此，似乎细胞内碱化本身并不介导27ps基底侧K的醛固酮的非基因组抑制⁺虽然可能涉及另一个pH敏感信号通路。

本研究的第二个方面是27ps基底外侧K的分子特征⁺频道。这些K⁺在人和大鼠结肠隐窝和T₈₄和IK相似_Ca从多种组织的cDNA文库中克隆的通道。^{9 -}，¹²本土知识的_Ca通道向内整流，对钙极为敏感^{2 +}，将钙调素结合到其四个亚基中的每个C端，具有最小的电压敏感性。^{9 -}^12，³²在Cl⁻分泌的上皮细胞如肺和结肠，IK的作用_Ca通道的作用是使细胞高极化并维持对电致Cl的驱动⁻分泌。^8日,^33岁的 ³⁴使用人类专用引物KCNN4， RT-PCR证实存在KCNN4人结肠细胞中的mRNA(图6)⇑)．KCNN4RT-PCR已经在大鼠和人结肠的粘膜刮屑和恶性转化的T₈₄细胞。¹³我们使用的隐窝分离方法具有提供无红细胞、淋巴样细胞、成纤维细胞、内皮细胞和平滑肌细胞的非恶性人类结肠上皮细胞的优点(图1)⇑)，都表达了IK_Ca(KCNN4)通道。^11，^{35 -}，³⁸因此，假设KCNN4mRNA来源于结肠隐窝细胞。我们不能排除尖侧IK的可能性_Ca通道也可能存在于人类结肠隐窝细胞中(黏附粘液阻止了从纵向打开的隐窝顶端膜记录的单一通道)，但我们只看到过高电导(220 pS) K⁺人结肠隐窝管腔开口周围表面细胞顶端膜上的通道³⁹(和未发表的数据)。因此，我们认为KCNN4mRNA编码27ps基底外侧K⁺在人类结肠隐窝细胞中的通道，这与IK相同_Ca在许多其他上皮细胞和非上皮细胞类型中发现的通道。

总之，纳摩尔浓度的醛固酮对27 pS K有非基因组抑制作用⁺人结肠隐窝细胞基底外侧膜中的通道，从而降低结肠对Cl的容量⁻分泌。尽管醛固酮对钠有相关的非基因组刺激作用⁺: H⁺交换(增加细胞内pH值)，我们的数据表明单独碱化增强而不是抑制这些K⁺通道，以及Na的确切作用⁺: H⁺交换仍不清楚。然而，这些通道与存在于其他多种人体组织中的KCNN4通道具有相似的生物物理特性。确定了KCNN4这些结肠隐窝细胞的mRNA转录本，我们得出结论KCNN4编码27ps K⁺位于基底外侧(而不是根尖)膜域的通道。

致谢

KAB得到了医学研究理事会博士研究生奖学金的支持。这项工作得到了维康基金会和医学研究委员会的支持。人类胎盘cDNA文库是来自利兹大学生物医学科学系a Sivaprasadarao博士的礼物。

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