条文本
PDF
摘要
背景:瘘管是克罗恩病的一个麻烦的并发症，但对负责基质降解的最终效应分子知之甚少。尽管基质金属蛋白酶(MMPs)与克罗恩病的组织损伤密切相关，但它们在瘘管形成中的作用尚不清楚。
目的:目的:探讨克罗恩病(Crohn’s disease)患者瘘管中基质金属蛋白酶(mmp)和金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPs)的表达规律。
患者和方法:切除的瘘管标本来自克罗恩病患者(n = 11)，并根据主要组织学特征(即急性和慢性炎症)进行分类。其他疾病导致瘘管的患者(n = 9)和结肠正常的患者(n = 5)作为对照组。用单标记或双标记免疫组化法检测MMP和TIMP蛋白表达，用原位杂交法检测mRNA表达。用明胶酶谱法测定MMP活性。
结果:与正常结肠相比，克罗恩病瘘管中持续观察到强的MMP-3表达，与炎症活动的阶段无关。MMP-3转录本和蛋白定位于大的单个核细胞和成纤维细胞。MMP-9转录本和蛋白在粒细胞中表达，仅在急性炎症的瘘管中表达。MMP-1和MMP-7染色弱，MMP-10阴性，而MMP-2在正常结肠和瘘管中均有表达。TIMP-1、TIMP-2和TIMP-3在所有样本中表达均较低。在疾病对照组的瘘管中也有类似的表达模式。通过明胶酶谱法测定，瘘管也表达活性MMP-2和MMP-9。
结论:MMP-3和MMP-9在肠瘘中显著上调，可能通过细胞外基质的降解促进瘘管的形成，而与潜在的疾病过程无关。
- 克罗恩氏病
- 基质金属蛋白酶
- 管状器官
- 免疫组织化学
- 炎症性肠病
- 金属蛋白酶组织抑制剂
- 英国石油(bp)碱基对
- 乙二胺四乙酸
- 炎症性肠病
- MMP的基质金属蛋白酶
- PBS，磷酸盐缓冲盐水
- PFA,多聚甲醛
- 核糖核酸酶、核糖核酸酶
- TNF-α，肿瘤坏死因子α
- 金属蛋白酶组织抑制剂TIMP
- TBS，特里斯缓冲盐水
来自Altmetric.com的统计
- 英国石油(bp)碱基对
- 乙二胺四乙酸
- 炎症性肠病
- MMP的基质金属蛋白酶
- PBS，磷酸盐缓冲盐水
- PFA,多聚甲醛
- 核糖核酸酶、核糖核酸酶
- TNF-α，肿瘤坏死因子α
- 金属蛋白酶组织抑制剂TIMP
- TBS，特里斯缓冲盐水
大约三分之一的克罗恩病患者会出现瘘管，并可能导致严重的痛苦症状。1尽管抗肿瘤坏死因子(TNF) α抗体的引入在瘘管性克罗恩病的治疗中取得了重要进展，2，3.这种并发症的处理仍然是一个主要的治疗挑战。在克罗恩病中，瘘管可能是手术或脓肿形成的并发症，但更多的情况下，它们是活动性管腔疾病的自发发展。4虽然感染、缺血和营养不良是导致术后瘘管形成的重要因素，4免疫抑制剂的作用，尤其是抗tnf -α抗体，表明免疫介导的机制在自发瘘管形成中也起着主要作用。2在这里，它们被认为产生于空化性溃疡或透壁裂，逐渐穿透周围软组织，最终与其他肠段或器官相通，或在皮肤上开放。5尽管对炎症性肠病(IBD)的免疫发病机制的了解取得了实质性进展，6以及克罗恩病显型背后的分子遗传学，7，8对瘘管形成的确切机制知之甚少。
蛋白酶，包括丝氨酸蛋白酶和锌依赖性基质金属蛋白酶(MMP)家族，介导细胞外基质几乎所有成分的降解。9 -11虽然丝氨酸蛋白酶活性似乎对肠道中的蛋白水解组织损伤无关紧要，12日,13一些证据强烈表明，某些基质基质蛋白(尤其是基质基质蛋白-3)的合成和释放增加在克罗恩病免疫介导的组织损伤中起着重要作用。12 -20.这在人类IBD的体外人胎肠模型中得到了最清楚的证明21其中重组MMP-3 (stromelysin-1)的加入引起了广泛的组织损伤。此外，合成MMP抑制剂的加入几乎完全消除了激活固有层T细胞引起的组织破坏。21MMP的活性由金属蛋白酶的特定组织抑制剂(TIMPs)调节，TIMPs是由产生MMP的同一类型细胞分泌的。9日,10
由于之前的研究没有专门讨论这些蛋白酶及其抑制剂在瘘管形成中的作用，我们使用免疫组化和原位杂交方法检测了克罗恩病瘘管标本中MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-9、MMP-10、TIMP-1、TIMP-2和TIMP-3的表达模式。为了进行比较，我们还研究了来自广泛的非克罗恩病引起的瘘管患者的标本。
材料和方法
病人
根据标准化诊断标准确诊的11例克罗恩病患者，通过手术切除获得瘘标本。22研究对象为8名女性和3名男性(中位年龄31岁(范围16-57岁))。6例患者在研究期间有活动性疾病的宏观体征。进一步的临床细节和瘘的类型在表1中总结。1例患者接受5-氨基水杨酸灌肠(1 g/天)、口服泼尼松龙(7.5 mg/天)和硫唑嘌呤(100 mg/天)局部治疗。1例患者术前6天接受单疗程英夫利昔单抗(5 mg/kg)治疗。还从9名因克罗恩病以外原因造成瘘管而接受手术治疗的患者中获得瘘管标本。疾病对照组包括3名女性和6名男性(中位年龄49岁(30-80岁))。进一步的临床细节和瘘管类型在表2中总结。这些患者在研究期间均未接受免疫抑制或抗炎治疗。最后，从5例患者(2男3女; median age 49 years (range 27–68)) with no known history of IBD. For zymography experiments, fistulae from an additional four patients with Crohn’s disease (median age 35 years (range 24–39)) (table 1) and four patients without Crohn’s disease (median age 35 years (range 24–39)) (table 2) were obtained. The study was approved by the Regional Ethics Committee for Copenhagen County Hospitals.
组织
瘘管或正常结肠标本立即固定在4%多聚甲醛(PFA)磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，脱水，并包埋石蜡。样本切片(5 μm)用苏木精和伊红染色，根据标准化组织学标准将其分为急性炎症伴有肉芽组织、慢性炎症伴有纤维化或两者合并。23日,24克罗恩病瘘管标本包括四个有明显急性炎症和肉芽组织的样本，四个有慢性炎症和纤维化的样本，以及三个有两个炎症阶段的样本。疾病对照组包括2个急性炎症样本，3个慢性炎症和纤维化样本，4个同时具有这两种特征的样本。偶尔，两组均获得完整的瘘道样本。
单标记和双标记免疫组化
抗MMPs和TIMPs单克隆和多克隆抗体购于Biogenesis(英国;MMP-1)， NeoMarker(加利福尼亚州，美国;MMP-2 (CA-4001)， MMP-7 (ID2)， MMP-9 (IIA5)， MMP-10 (IVC5)， TIMP-2，和TIMP-3)，圣克鲁斯生物技术(英国;MMP-3 (sc-6930))和癌基因(UK;TIMP-1)。CD68(一种巨噬细胞标记物)和vimentin(一种成纤维细胞标记物)抗体从丹麦DakoCytomation公司购买。福尔马林固定切片和石蜡包埋切片(5 μm)在甲苯中脱蜡10分钟，用一系列稀释乙醇彻底水化。内源性过氧化物酶被0.45%过氧化氢乙醇抑制30分钟后，组织切片在10 mM柠檬酸缓冲液中，pH值为6.0 (MMP-2, MMP-9和TIMP-3)或在10 mM Tris, 0.25 mM乙二胺四乙酸(EDTA)， pH值为9.0 (MMP-1, MMP-3, MMP-7, MMP-10, TIMP-1和TIMP-2)中进行15分钟的微波炉处理抗原检索步骤。在MMP-3免疫组化实验中，使用生物素阻断系统(DakoCytomation)阻断与内源性生物素的非特异性反应。用0.5%酪蛋白在Tris缓冲盐水(TBS: 0.05 M Tris/HCl, pH 7.6, 0.15 M NaCl)中阻断其他非特异性反应。 Primary antibodies against MMP-1 (10 μg/ml), MMP-2 (1 μg/ml), MMP-3 (2 μg/ml), MMP-7 (12 μg/ml), MMP-9 (2 μg/ml), MMP-10 (2 μg/ml), TIMP-1 (5 μg/ml), TIMP-2 (0.1 μg/ml), and TIMP-3 (0.3 μg/ml) were applied for 12–20 hours at 4°C. Biotinylated rabbit-antigoat immunoglobulin (Vector laboratories, California, USA), diluted 1:300 in 0.5% casein in TBS, was applied as a secondary antibody on sections incubated with the antibody against MMP-3. Avidin DH and biotinylated horseradish peroxidase H reagents (ABC) (Vector Laboratories, California, USA) was applied and the reactions visualised using 3,3′-diaminobenzidine as a chromogen. For the remaining antibodies (MMP-1, MMP-2, MMP-7, MMP-9, MMP-10, TIMP-1, TIMP-2, and TIMP-3), the Envision Detection Kit (DakoCytomation) was used according to the manufacturer’s instructions. Nuclei were stained with haematoxylin in all sections. The specificity of the immunohistochemical analysis (negative control) was confirmed by substituting the primary antibody with unspecific goat (MMP-3), rabbit (MMP-1, TIMP-2, and TIMP-3), or mouse (MMP-2, MMP-7, MMP-9, MMP-10, TIMP-1) immunoglobulins (DakoCytomation) on parallel sections. As positive control tissue, human placenta villous tissue from first trimester (MMP-2, MMP-3, MMP-7, and MMP-10, TIMP-1, TIMP-2, and TIMP-3) or colon with active ulcerative colitis (MMP-1, MMP-9) was used. Staining results were evaluated as either positive cellular staining (above background staining) or negative. Tissue sections were examined by light microscopy to determine the cellular localisation of immunohistochemical staining. Quantification was performed by counting the numbers of positive cells/mm2如前所述，在25倍放大倍数下，随机选择至少7个显微镜视野。25日,26
有代表性的样品用CD68(1:100)或波形蛋白(1:70)和MMP-2或MMP-3进行双重染色。MMP-2或MMP-3染色使用3-氨基-9-乙基卡唑(Sigma-Aldrich, Denmark)作为显色剂，而CD68和波形蛋白染色使用Fast Blue BB (Sigma-Aldrich)。
RNA探针的制备
从两种细胞因子刺激转化的人结肠上皮细胞系HT-29或DLD-1中提取总RNA，通过逆转录聚合酶链反应获得人MMP-2(碱基对(bp) 2021 ~ 2296)、MMP-3 (bp 1529 ~ 1757)和MMP-9 (bp 2009 ~ 2245)的cDNA片段。片段亚克隆到pCR II-TOPO质粒(Invitrogen, UK)并测序。结果构建物分别用Not I或Spe I限制性内切酶(New England BioLabs, UK)线性化，然后分别用Sp6或T7 RNA聚合酶(New England BioLabs)转录，在40°C (Sp6)或37°C (T7)下进行2小时。根据单个片段的方向，这将产生有意义或反意义的RNA探针。体外转录的RNA用α [33P]UTP(阿默舍姆生物科学，丹麦)，根据制造商的说明。加入2u核糖核酸酶(RNase)游离DNA酶(RQ1;Promega, Madison, Wisconsin, USA)孵育15分钟，在65°C孵育10分钟前加入2 μl EDTA (0.2 M)，所有酶活性均被抑制。去除未束缚α [33P]UTP使用G50自旋柱(Amersham Biosciences)，样品用苯酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)提取，然后用氯仿-异戊醇重新提取(24:1)。酵母转移RNA (40 μg;加入Gibco BRL, UK)作为载体蛋白，用硫酸铵和乙醇沉淀转录的RNA，用20 μl二乙基焦碳酸H溶解2O。
原位杂交
福尔马林固定切片和石蜡包埋切片(5 μm)在甲苯中脱蜡10分钟，用一系列稀释乙醇彻底水化。所有样品均用蛋白酶K (5 μg/ml;罗氏，丹麦)在37°C下放置30分钟，并在室温下添加4% PFA在PBS中放置20分钟。为了减少非特异性结合，切片在含有0.25%乙酸酐的三乙醇胺(0.1 M)中乙酰化10分钟。在含有50%甲酰胺，0.3 M NaCl, 20 mM Tris/HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA, 1× Denhardt 's, 10%硫酸葡聚糖，250 μg/ml tRNA的缓冲液中进行杂交33P标记反义或义RNA探针(5×104cpm /μl)。每个切片加杂交缓冲液(100 μl)，在55°C的湿润室中杂交16-20小时。杂交后，切片在严格的条件下洗涤，包括RNase A (20 μg/ml;Roche)移除未绑定的探针。最后，切片通过含有0.3 M醋酸铵的分级乙醇，风干，并浸在LM-1乳剂中(Amersham Biosciences)。在4°C光密箱中暴露28天后，根据制造商的说明使用柯达酚醛显影试剂进行杂交。切片用苏木精和伊红反染色，并在光场显微镜下观察分析数据。当细胞颗粒密度高于背景水平时，可见mRNA阳性表达。
明胶zymography分析
如前所述进行组织提取。27简单地说，将组织置于含1 mM cacodylate HCl, pH 6.0, 1 M NaCl, 0.01% (v/v) Triton X-100, 1 μM ZnCl的缓冲液中进行摇取2， 0.2 mg/ml NaN3.蛋白酶抑制剂(NaF (5 mM)，原钒酸钠(1 mM))和蛋白酶抑制剂鸡尾酒片(罗氏)在4℃下18小时。组织提取液在5000转/分离心5分钟，上清保存在4℃，直到分析。为了避免mmp的激活，未对提取物进行冷冻。为了检测明胶酶、MMP-2和MMP-9的潜伏和活性形式，组织提取物(7.5 μg总蛋白)在10%的酶谱凝胶上电泳，0.1%的明胶为底物。采用混合人体MMP-2 (50 ng/μl)和MMP-9 (50 ng/μl)标准(Chemicon International, California, USA)作为阳性对照。凝胶在2.5% Triton X-100中洗涤三次，并在含有5mm氯化钙的缓冲液中孵育2， 1 μM ZnCl2， 50 mM Tris HCl, pH 7.4, 0.1% Triton X-100, 0.003 M NaN3.在37°C下持续摇晃18小时。酶谱在0.25%考马斯亮蓝R-250、10%乙酸和45%甲醇中染色30分钟，然后在20%乙酸、20%甲醇、17%乙醇和0.6%二乙醚中染色(30分钟;快速脱色)和20%醋酸(1-3小时;缓慢使退色)。酶谱保存在3%甘油中，干燥，扫描。
统计数据
采用单因素方差分析(ANOVA)和Bonferroni多重比较检验。两个尾p值<0.05被认为显著。
结果
MMP和TIMP蛋白在正常结肠中的表达
MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-9、MMP-10、TIMP-1、TIMP-2和TIMP-3蛋白表达在正常结肠中的细胞分布首次被研究。在上皮下和脉周成纤维细胞/肌成纤维细胞鞘、固有层单个核细胞(巨噬细胞和淋巴细胞)和血管内皮细胞中观察到大量的MMP-2染色(图1A)。肌层粘膜也可见MMP-2染色。相反，MMP-3和MMP-9仅在少数固有层单个核细胞中可见阳性(图1B, C)。正常结肠中MMP-1和MMP-7均未表达(数据未显示)，而MMP-10仅在结肠上皮中可见(数据未显示)。TIMP-1蛋白仅在少数固有层单个核细胞中表达，而在结肠上皮和少数固有层单个核细胞中观察到TIMP-2和TIMP-3染色(数据未显示)。
基质金属蛋白酶(MMP)-2 (A)， MMP-3 (B)和MMP-9 (C)在石蜡包埋的组织学正常结肠切片中的免疫组化定位。切片用苏木精染色。在上皮下和膜周成纤维细胞/肌成纤维细胞(开箭头)、固有层单核细胞(箭头)以及肌层粘膜和血管内皮细胞中观察到MMP-2染色。MMP-3和MMP-9染色仅在少数固有层单个核细胞中观察到(箭头)(B, C)。放大倍数×40。
瘘管标本中MMP和TIMP蛋白的表达
与正常结肠一样，克罗恩病患者的瘘管中也可见大量的MMP-2染色。在有急性炎症和肉芽组织的标本中，在大型单核巨噬样细胞、巨细胞和内皮细胞中可见MMP-2染色(图2A)。在慢性炎症和纤维化的样本中，MMP-2染色在成纤维细胞和大型单核巨噬细胞样细胞中(图2D)。与正常结肠相比，两种类型的瘘管中均观察到强的MMP-3免疫染色。在急性炎症的标本中，在大型单核巨噬细胞样细胞和巨细胞中观察到MMP-3染色(图2B)。在慢性炎症和纤维化的标本中，在大型单核巨噬细胞样细胞和成纤维细胞中可见MMP-3染色(图2E)。在伴有肉芽组织的急性炎症标本的小单核白细胞、粒细胞和巨细胞中观察到丰富的MMP-9染色(图2C)。在慢性炎症和纤维化的标本中，只有少数散在的小单核白细胞和粒细胞MMP-9染色阳性(图2F)。在所有样本中，MMP-1和MMP-7染色较弱，而MMP-10染色完全阴性，可能反映了缺乏完整的上皮衬里(数据未显示)。MMP-2或MMP-3结合巨噬细胞(CD68)和成纤维细胞(vimentin)的细胞标记物的双重免疫组化染色证实了MMP-2和MMP-3的细胞定位(图3)。与正常结肠类似，仅在两种类型的结肠中观察到TIMP-1、TIMP-2和TIMP-3染色阳性(数据未显示)。
典型克罗恩病瘘中基质金属蛋白酶(MMPs)的免疫组化定位。对伴有急性炎症和肉芽组织(A - C)或慢性炎症和纤维化(D - F)的石蜡包埋瘘标本切片进行抗MMP-2 (A, D)、抗mmp -3 (B, E)和抗mmp -9 (C, F)染色。在伴有肉芽组织的急性炎症中，内皮细胞、大型单核巨噬样细胞、在大型单核巨噬细胞样细胞和巨细胞中可见MMP-3染色(B)，而在小型单核白细胞、粒细胞和巨细胞中可见MMP-9染色(C)。在伴有纤维化的慢性炎症中，大型单核巨噬细胞样细胞和成纤维细胞中可见MMP-2和MMP-3染色(D, E)，而MMP-9染色仅在散在的小型单核白细胞和粒细胞中观察到(F)。放大×40。
在典型克罗恩病瘘管中，基质金属蛋白酶MMP-2/MMP-3和巨噬细胞(CD68)或成纤维细胞(波形蛋白)的细胞标记物的双免疫组化定位。按照材料和方法进行双免疫染色。用3-氨基-9-乙基咔唑对mmp(红色)和Fast Blue BB对细胞标记(蓝色)进行显色反应。深棕色到黑色反应表示大型单核巨噬细胞样细胞中MMP-2和CD68的同时染色(箭头)(A)。大型单核巨噬细胞样细胞中MMP-3和CD68的共染，表示同时出现的红色和蓝色细胞质颗粒(箭头)(B)。成纤维细胞中MMP-2或MMP-3 (D)和波形蛋白的共染，表示同时出现的红色和蓝色细胞质颗粒(箭头)。放大×100。
为了进一步说明mmp在瘘管形成过程中组织降解中的作用，我们还在偶尔可用的完整瘘管纵断面中检查了MMP-2、MMP-3和MMP-9蛋白的定位。图4显示了面向瘘管管腔的单核巨噬样细胞中MMP-3蛋白染色明显的代表性切片，周围非炎症组织中MMP-3蛋白染色最少。此外，观察到瘘管腔内的细胞外MMP-3染色。
克罗恩病瘘管中基质金属蛋白酶(MMP)-3的免疫组化定位。用抗mmp -3染色对石蜡包埋瘘管的完整瘘管标本切片进行染色。在面向瘘管管腔的单核巨噬细胞样细胞以及管腔内观察到强免疫染色(箭头所示)。
最后，当从一组非克罗恩病的异质患者中获得瘘管标本(表2)时，按照上述炎症阶段进行分层，观察到非常相似的MMP和TIMP染色细胞模式(数据未显示)。
瘘管标本中MMP和TIMP蛋白表达的定量分析
为了量化单个MMPs和TIMPs在整个患者材料中的相对表达，阳性细胞数/毫米2在每个瘘管标本中进行计数。由于组织结构的差异，基于细胞数量与正常结肠直接比较是不可行的。所有样品的MMP-10蛋白染色均为阴性，因此在图中省略。在伴有急性炎症和肉芽组织的克罗恩病瘘管中，MMP-2、MMP-3和MMP-9阳性细胞的中位数显著(2 - 20倍)高于MMP-1、MMP-7或两者的中位数(图5A)。在慢性炎症和纤维化的样本中，细胞总数较低，即使MMP-2和MMP-3阳性细胞的中位数也明显高于MMP-1和MMP-7，但没有达到统计学意义(图5A, B)。同样，在这些样本中也没有观察到MMP-9阳性细胞的显著增加。TIMP-1、TIMP-2和TIMP-3阳性细胞的中位数在两种检查的标本中都非常低，没有观察到显著差异(图5A、B)。如图5C和5D所示，当疾病对照组患者的瘘管中定量阳性细胞数量时，观察到非常相似的MMP和TIMP表达谱。
基质金属蛋白酶(MMP)和组织抑制金属蛋白酶(TIMP)蛋白在瘘管标本中表达的定量，根据炎症活动的主要阶段划分。从克罗恩病患者中纳入4个伴有急性炎症和肉芽肿的瘘标本，4个伴有慢性炎症和纤维化的瘘标本，以及3个伴有肉芽肿组织的瘘标本(n = 11) (a, B)。从非克罗恩病患者中纳入2个伴有急性炎症和肉芽肿组织的瘘标本，3个伴有慢性炎症和纤维化的瘘标本，以及4个同时伴有两者的瘘标本(n = 9) (C, D)。横线表示中值。* p < 0.05和MMP-7;**p<0.01与MMP-1、MMP-7或两者比较;***p<0.001与MMP-1和MMP-7比较。
MMP mRNA在克罗恩病瘘管中的表达
为了扩展免疫组化研究中的关键发现，我们使用原位杂交技术检测了MMP-2、MMP-3和MMP-9 mRNA的细胞定位33P标记的RNA探针。图6显示了克罗恩病患者瘘管切片中代表性的mRNA表达研究。在急性炎症和肉芽组织的标本中，在内皮细胞和大型单核巨噬细胞样细胞中观察到MMP-2 mRNA的表达(图6A)。在慢性炎症和纤维化患者中，在大型单核巨噬细胞样细胞和成纤维细胞中观察到MMP-2 mRNA的表达(图6D)。MMP-3 mRNA的表达只在伴有急性炎症和肉芽组织的瘘管中的大型单核巨噬细胞样细胞中检测到(图6B)。在慢性炎症和纤维化的样本中，在大型单核巨噬细胞样细胞和成纤维细胞中观察到MMP-3 mRNA的表达(图6E)。最后，在伴有急性炎症和肉芽组织的瘘管样本的粒细胞中观察到大量的MMP-9 mRNA表达(图6C)，并在少数小的单核白细胞中观察到零星表达。除了少数小的单核白细胞和粒细胞外，如预期的那样，在慢性炎症和纤维化的样本中没有检测到MMP-9 mRNA(图6F)。在与有意义的MMP-2、MMP-3和MMP-9 RNA探针杂交的样品中未检测到信号(图6G-I)。当从非克罗恩病的异质患者组中获得标本(表2)时，观察到非常相似的MMP mRNA表达的细胞模式，并根据上述炎症阶段(数据未显示)进行检查和分层。 In summary, cellular localisation of MMP-2, MMP-3, and MMP-9 mRNA was in good agreement with immunohistochemical findings, except that MMP mRNA was not expressed in giant cells.
基质金属蛋白酶(MMP) mRNA在克罗恩病瘘管中的原位杂交表达。带有急性炎症和肉芽组织(a - C, G - I)和慢性炎症和纤维化(D - F)的石蜡包埋瘘管标本切片与反义MMP-2 (a, D)、MMP-3 (B, E)和MMP-9 (C, F)或有义MMP-2 (G)、MMP-3 (H)和MMP-9 (I)混合。在大型单核巨噬细胞样细胞和内皮细胞中观察到MMP-2 mRNA表达(A)。在大型单核巨噬细胞样细胞中观察到MMP-3 mRNA表达(B)，而在粒细胞和小型单核白细胞中观察到MMP-9 mRNA表达(数据未显示)(C)。在伴有纤维化的慢性炎症中，大型单核巨噬细胞样细胞和成纤维细胞中观察到MMP-2和MMP-3 (D，E)而MMP-9在散在的小单核白细胞和粒细胞中可见(数据未显示)。放大倍数×100 (A-F)和×20 (G-I)。
组织提取物的酶分析
为了扩展形态学研究中的关键发现，我们检查了瘘管标本是否表达MMP活性，通过明胶酶谱测定。如图7所示，在克罗恩病患者的瘘管标本中观察到与MMP-2活性形式相对应的胶溶活性增加。同样，MMP-9的潜伏和活性形式也被识别出来，反映了炎症活动的阶段。
具有代表性的明胶酶谱显示，在正常结肠(a)和克罗恩病患者瘘管标本(B, C)中存在基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9(明胶)的潜伏(l)和活性(a)形式。
讨论
通过免疫组化分析，我们发现MMP-2和MMP-3蛋白在克罗恩病患者的瘘管中一致表达，与炎症活动的阶段无关。MMP-9蛋白在这些标本中也大量表达，但仅在急性炎症突出的标本中表达。相比之下，MMP-1、MMP-7和MMP-10以及TIMP-1、TIMP-2和TIMP-3蛋白染色没有或几乎检测不到。这些发现得到了原位杂交的支持，显示MMP-2、MMP-3和MMP-9 mRNA的表达模式非常相似，这表明这些蛋白酶在瘘管形成过程中也积极合成。MMP和TIMP的表达模式并不是克罗恩病独有的，因为在其他疾病引起的瘘管患者的标本中也观察到类似的表达模式。
MMP-2(明胶酶A)切割明胶、V型、VII型和X型胶原蛋白，以及基膜IV型胶原蛋白28因此与肿瘤细胞入侵有关。11，29 -32使用明胶酶谱学，MMP-2活性增加在克罗恩病之前已经被证明，但细胞来源尚未明确。12在我们的标本中，MMP-2不仅在内皮细胞和炎症细胞中表达，也在成纤维细胞中表达。这与结肠成纤维细胞培养的结果一致13日,21对于某些侵袭性肿瘤，31日,33并强调基质细胞作为炎症肠道中基质蛋白酶的局部生产者的重要性。13与检查的其他mmp不同，MMP-2在正常结肠中也大量表达，这提出了MMP-2是否真的在瘘管形成中起致病作用的问题。MMP-2以潜伏的66 kDa形式在正常结肠中表达，以活跃的60 kDa形式主要在炎症黏膜中表达。12MMP-2蛋白水解活性的增加也存在于克罗恩病瘘管中，我们的数据表明，活性形式可能通过基底膜的降解促进瘘管的形成，基底膜在肠道中形成支持内皮细胞和上皮细胞衬里的网络。
虽然MMP-2在粘膜损伤中的确切作用仍有待完全阐明，但我们在大型单个核细胞和成纤维细胞中发现强表达的MMP-3与之前在管腔克罗恩病中的研究一致，15 -17日,19,只有一个除外。12这同样适用于正常结肠中MMP-3的最小染色。33岁的34并与类风湿性关节炎的组织退化有关35在某些人类癌症中也是如此。11，34同样，体外人胎小肠移植体模型的功能实验清楚地表明，MMP-3也是T细胞和TNF-α介导的肠道组织损伤的关键介质。21日,36岁,37我们的数据扩展了这些发现，表明MMP-3的释放增加也可能通过降解炎症活跃区域的基质促进瘘管的形成。此外，我们关于TIMP表达的数据与之前在儿童IBD中发现的结果一致，显示炎症黏膜中MMP-3显著上调，而其自然抑制剂(即TIMP-1)的表达没有平行增加。17
MMP-9(明胶酶B)的底物特异性与MMP-2相似，MMP-9也与癌细胞侵袭有关。38在正常结肠中只观察到MMP-9表达的少量染色，12日,18MMP-9在慢性炎症和明显纤维化的瘘管中几乎不存在，这与以前在肌成纤维细胞培养中发现的结果一致。21相反，在急性炎症突出的标本中，白细胞，尤其是粒细胞中，持续检测到MMP-9的强烈表达。这与之前在克罗恩病粘膜中的发现一致18以及在纯化的中性粒细胞的匀浆中。13强的MMP-9活性先前已在活动性克罗恩病的结肠粘膜中使用明胶酶谱法证实。12在瘘管标本中也发现了类似的增加，这表明MMP-9可能通过类似于MMP-2的机制促进瘘管的形成。此外，MMP-9可能通过促进急性炎症区中性粒细胞外渗而促进组织损伤18以及通过加速被其他基质蛋白酶部分降解的基质蛋白的蛋白质水解。18
总之，我们已经表明，与正常结肠相比，患有或不患有克罗恩病的患者的瘘管标本中MMP-3和MMP-9表达强烈。随着TNF-α阻断剂改善瘘管性克罗恩病的临床过程，2可能是通过抑制MMP-3活性，22特定的MMP抑制剂39同样靶向TNF-α转化酶的药物理论上可能为这些患者提供额外的治疗益处。40
致谢
Tove Kirkegaard是丹麦技术科学学院(ATV)工业博士资助的接受者。非常感谢丹麦Herlev大学医院胃肠病学54O3实验室的Hanne Fuglsang、Anne Hallander、Birgit Dejbjerg、Anni Petersen和Vibeke Voxen以及Ulla Gundø和丹麦Herlev大学医院病理科的技术人员的技术支持。