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摘要
背景和目的:关于硫唑嘌呤(AZA)硫鸟嘌呤核苷酸(TGN)代谢物在炎症性肠病(IBD)优化治疗中的作用，有相互矛盾的报道。本研究的目的是调查TGN在患者体内的变化，以及TGN浓度与长期服用恒定剂量AZA的IBD患者的疾病活动性之间的关系。
方法:TGN和甲基巯基嘌呤核苷酸(MeMPN)的浓度每隔两年测量一次。使用克罗恩病活性指数或沃姆斯利溃疡性结肠炎简单指数评估每次临床访问的疾病活性。
结果:159例患者中测量了TGN序列(3-14次TGN检测，中位数6次)。患者体内TGN浓度变化为1 - 5倍(中位数1.6);不依从性发生率为13%。两年后，131例患者在TGN稳定状态下进行评估。在这组患者中，持续缓解的患者TGN的平均浓度显著高于那些出现活跃性疾病的患者(TGNs中位数为236v175年,分别;中位差值44 pmol(95%置信区间1-92);p = 0.04)。MeMPN浓度与AZA疗效或毒性无关。
结论:这项研究表明，较低的TGN浓度与活动性疾病的发展有关，并且TGN可能作为依从性的有用标记。然而，很明显，为了获得活性代谢物暴露的明确指标，需要重复TGN测量。鉴于患者体内TGN产生随时间的高度可变性，目前可能不提倡将TGN测量用于常规临床使用。
- ALT,丙氨酸转氨酶
- 5-ASAs, 5氨基水杨酸
- 阿扎,咪唑硫嘌呤
- 克罗恩病活性指数
- 炎症性肠病
- MeMPN, methylmercaptopurine核苷酸
- 6 mp,巯嘌呤
- RBC，红细胞
- 硫代嘌呤甲基转移酶,thiopurine甲基转移酶
- TGN,硫鸟嘌呤核苷酸
- 硫唑嘌呤
- 硫鸟嘌呤核苷酸
- 炎症性肠病
- 5-aminosalicylic酸
- 6 -巯基嘌呤
- methylmercaptopurine核苷酸
来自Altmetric.com的统计
- ALT,丙氨酸转氨酶
- 5-ASAs, 5氨基水杨酸
- 阿扎,咪唑硫嘌呤
- 克罗恩病活性指数
- 炎症性肠病
- MeMPN, methylmercaptopurine核苷酸
- 6 mp,巯嘌呤
- RBC，红细胞
- 硫代嘌呤甲基转移酶,thiopurine甲基转移酶
- TGN,硫鸟嘌呤核苷酸
硫唑嘌呤(AZA)是1957年合成的一种巯基嘌呤(6MP)缓释制剂，目前已被用于治疗炎症性肠病(IBD)超过40年。AZA广泛应用于激素依赖、激素难治性、慢性活动性疾病或需要维持缓解的IBD患者。使用AZA减少对类固醇治疗的需求1 -3.也降低了复发率。4，5
一次口服剂量后，AZA迅速降解为6MP和咪唑衍生物，但高达12%的剂量可分裂形成嘌呤碱次黄嘌呤和硫咪唑。6，7三种酶竞争代谢6MP:黄嘌呤氧化酶，硫嘌呤甲基转移酶(TPMT)和次黄嘌呤磷酸基转移酶(图1)。6MP的激活由次黄嘌呤磷酸基转移酶催化，最初形成6MP核苷酸，最终形成活性代谢物硫鸟嘌呤核苷酸(TGNs)。6MP的TGN代谢物作为嘌呤拮抗剂，抑制DNA、RNA和蛋白质的合成，诱导细胞毒性和免疫抑制。有人认为，AZA免疫抑制是由于TGN(硫鸟嘌呤三磷酸)结合到鸟嘌呤三磷酸结合蛋白Rac1而不是鸟嘌呤三磷酸。Rac1激活被抑制并诱导细胞凋亡。这种机制被认为是控制激活淋巴细胞的消除。8细胞毒性部分是由于TGN代谢物直接并入DNA。9最初的6MP核苷酸也是TPMT的底物，产生甲基巯基嘌呤核苷酸(MeMPNs)。MeMPNs是嘌呤从头合成的有效抑制剂，它可能通过阻止嘌呤碱的合成来增强TGNs的作用。此外，MeMPNs与硫嘌呤的肝毒性作用有关10日,11
硫唑嘌呤(AZA)新陈代谢。巯基嘌呤(6MP)核苷酸代谢物形成的最初步骤由次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)催化。巯基嘌呤核苷酸的进一步代谢最终形成硫鸟嘌呤核苷酸(TGNs)。黄嘌呤氧化酶(XO)催化的氧化和硫嘌呤甲基转移酶(TPMT)催化的甲基化与TGN的形成形成竞争。
TPMT活性的遗传变化决定了患者在6MP或AZA剂量后形成TGN活性代谢物的能力。12那些TPMT活性高的个体产生较低的tgn，对标准剂量的6MP有较差的治疗反应。缺乏功能性TPMT活性的个体产生大量的tgn浓度，并经历严重的骨髓抑制。13日,14在早期以抗代谢物为基础的治疗儿童白血病的方案中，那些累积了较高TGN浓度的儿童有明显更好的无白血病生存期。15
这些和其他硫嘌呤用于儿童白血病的研究16为IBD的平行研究提供了动力。10日,17 -20.迄今为止，对IBD患者体内AZA代谢物浓度的研究报道了相互矛盾的结果。许多研究已经报道，较高的TGN浓度与IBD的缓解有关，10日,18，21但其他研究小组还没有证实这些发现。22在服用AZA的患者中，没有明确的证据表明TPMT可以预测临床反应或药物毒性。23
关于长期服用恒定剂量AZA的IBD患者中TGN稳定浓度的信息很少。考虑到AZA的可变分解，在同一个体中，可用于活性代谢物形成的6MP量可能因剂量不同而不同。本研究的目的是建立恒剂量AZA患者TGN浓度的个体内变异。我们评估了TGN和MeMPN的平均稳态浓度与疾病活动性的关系，并调查了伴随治疗对活性代谢物浓度的影响。此外，我们使用活性代谢物浓度来调查这组患者长期口服AZA的非或部分依从性的患病率。
患者和方法
在谢菲尔德皇家哈勒姆郡医院的一个胃肠病学门诊就诊的连续患者被招募到这项前瞻性研究中。在研究之前，被招募的患者已经被开了至少4个月的恒定剂量的AZA。然后对患者进行了为期两年的随访。在两年的研究期间，每隔1-3个月采集血液样本(10 ml肝素锂)，测定全血计数和红细胞6MP代谢物浓度。在每次门诊就诊时，使用既定的克罗恩病活性指数(CDAI)评估疾病活性。24溃疡性结肠炎Walmsley简易指数。25缓解被描述为CDAI低于150，或简单指数评分小于5的患者。收集的其他临床数据包括性别、年龄、诊断时的年龄和疾病部位、体重、AZA的剂量、开始治疗时的年龄、AZA治疗的原因、伴随治疗和毒性数据，包括全血计数和肝功能测试。患者信息，包括疾病活动评分，由临床医生收集。在整个研究过程中，临床研究人员对6MP代谢物浓度保持盲目。AZA被处方为Imuran(片剂25 mg)或非专利AZA(片剂50 mg)。该研究得到了南谢菲尔德伦理委员会的批准，并获得了参与患者充分知情的书面同意。
如前所述，用高效液相色谱法测定红细胞(RBC) TGNs和MeMPNs。26检出下限为30 pmol/8×108红细胞和所有检测均重复进行。测定精密度采用患者质量控制，使用池化红细胞制备，并保存在−80°C。每次试验都要解冻一个样品，并与每批患者样品并行处理。
利用合并的患者质量控制样本的变异(即仅检测变异)作为参考点，研究患者体内TGN活性代谢物积累的变异。考虑到AZA分解到6MP的可能的患者内部变异，代谢产物稳定状态组被定义为:TGN重复测量浓度变化小于患者质量控制样本变化的两倍的患者。
校准图是通过在每8×10使用范围为0到100 ng (600 pmol)的硫鸟嘌呤原液和范围为0到1000 ng (6000 pmol)的甲基巯基嘌呤对对照红细胞进行加标构建的8红细胞(约100 μ l填充细胞)。准确性是通过在所有测定中加入50 ng (300 pmol)硫鸟嘌呤加标的红细胞样品来确定的。自始至终，所引用的代谢物浓度值为pmol/8×108红血球。
使用Minitab V13 (Minitab Inc, USA)进行统计分析。对未配对值采用Mann-Whitney检验，对三个或三个以上未配对值采用Kruskal-Wallis检验进行统计比较，并用rank Spearman相关系数评估相关性。所有试验均为双尾检验，p值在0.05处显著。
结果
研究小组
共有159名IBD患者(88名男性，71名女性)(105名克罗恩病，46名溃疡性结肠炎，8名不确定结肠炎)从170名长期恒定剂量AZA治疗的患者(9名患者不希望参与，1名患者无法联系，1名患者在研究开始后3个月内死于心肌梗死)中招募入研究。恒定剂量AZA治疗持续时间为1 - 22年(中位数4年)。患者详细情况见表1。
代谢产物分析
稳定状态组
在两年的研究期间，159例纳入的患者中有156例接受了3次或3次以上的代谢物检测(范围3-14次检测(中位数6次))。31例患者进行了3次或4次检测，所有分析均使用平均代谢物浓度。对于那些进行5次或5次以上检测的患者，计算“稳态”TGN浓度的平均值和变异系数(SD/mean×100%)。在125例接受多次检测的患者中，变异系数从6%到50%(中位数17%)，TGN浓度为1.1 - 5倍(中位数1.6倍)(图2)。作为对比，质量控制汇集的患者样本，包括6个月以上的26项检测，其变异系数为7.5%。tgn变化为1.4倍。此外，在同一组患者样本中，与tgn一起测量的mempn的变异系数为9%，变异系数为1.4倍。
125例进行5次或5次以上硫鸟嘌呤核苷酸(TGN)检测的患者的变异系数。TGN测量的测定间差异为7.5%，根据质量控制汇集的患者样本定义。只有4%的患者的变异系数小于7.5%。
只有4例(3.2%)患者的变异系数小于或等于患者质量控制样本。TGN稳态组，被定义为代谢物变化小于患者质量控制样本中变化的两倍，是那些红细胞TGN变化小于3倍的患者。因此，在两年结束时，两组是明显的:一组是由111名TGN代谢物浓度变化小于3倍的患者组成的稳态组，另一组是由45名TGN代谢物浓度变化为>3倍的患者组成的可变代谢物组。
在稳态组中，个体平均TGN浓度(pmol/8×108红细胞(rbc)从70到717(中位数235)，平均mempn (pmol 8×10)8rbc)范围为30 ~ 12517(中位数1065)。在这111例患者中，AZA的剂量范围为0.4 ~ 2.8 mg/kg(中位数1.8)。
变量代谢物组
其余45例患者的TGN浓度变化大于3倍。在该组中，20例患者(156例患者研究组的13%)显示不依从性(无代谢物)。其余25例TGN浓度变化大于3倍的患者在研究期间进行了剂量调整。20例患者剂量增加:19例因活动性疾病，1例因类风湿性关节炎。5例患者剂量降低:1例病情活动性，2例缓解期延长，2例出现中性粒细胞减少(中性粒细胞计数1.96和1.78×10)9/ l)。
结果
20例患者在研究期间发展为活动性疾病，并接受了AZA剂量调整，15例患者获得缓解，5例患者继续活动性疾病，其中1例接受了手术。后者患者的剂量减少了。在这20名患者中，使用剂量调整前的平均代谢物浓度来计算稳态TGN浓度(这些患者在剂量调整前进行了5次试验的中位数(范围5-9);个体内部TGN值变化<3倍)。这些患者被纳入111名稳定状态患者中，因此稳定状态组增加到131名患者。
在两年的研究期结束时，在这组131名患者中，104名患者仍处于缓解状态(79%)，27名患者发展为活动性疾病(21%，7名患者处于最初的“稳定状态”组，20名患者进行了剂量调整)。表2总结了代谢物浓度。发生活跃性疾病的患者(中位TGNs 175 pmol)累积的TGN浓度明显低于缓解期患者(中位TGNs 236 pmol)，中位差异为44 pmol(95%可信区间(CI) 1-92) (p = 0.04)。AZA的剂量没有显著差异，剂量与TGN浓度之间也没有相关性(r年代= 0.1)(图3)。此外，在随访时，20例无代谢物不依从性患者中有7例出现活动性疾病。
硫鸟嘌呤核苷酸(TGN)浓度与硫唑嘌呤剂量的相关性(r年代= 0.1)在缓解期患者和活动性疾病患者中。
在19例因疾病活动性而接受剂量增加的患者中，15例获得缓解。缓解患者的TGN浓度在114 - 487 pmol(中位数193)之间，而4例活跃期患者的TGN浓度在66 - 571 pmol(中位数138)之间;中位差异在这个小的患者组中不显著。活动性疾病和TGNs升高(571 pmol)的患者需要将强的松龙增加到35 mg来控制疾病活动性。该患者在AZA治疗开始前已有UC 12年。在本研究开始前，AZA的持续时间为7个月。在研究结束时，他正在等待结肠切除术。
在131例稳定状态患者组中，MeMPN代谢产物的积累范围为30 ~ 14267 pmol(中位数为1036)。处于缓解期的患者和出现活动性疾病的患者中测量的平均MeMPN代谢物浓度的比较无显著差异(中位差异84 pmol (95% CI−342 ~ 492);P = 0.66)(表2)。
在两年的研究期结束时，整理肝功能检测信息。131例稳定状态患者中有123例(94%)可获得数据。102例患者丙氨酸氨基转移酶活性(ALTs)在正常范围内;4例患者ALTs持续高于正常上限30iu /l, 17例患者短暂升高超过30iu /l。ALTs升高的患者(113-14173 pmol MeMPN(中位数702)和未发生ALTs升高的患者(0-14267 pmol MeMPN(中位数1027))的平均MeMPN浓度范围没有差异。在整个研究期间，仅有1例患者alt高于100iu /l(范围105-120(中位数113))。与ALTs同时测定的MeMPN浓度范围为7540 ~ 11119 pmol(中位数7798，平均值8564)。ALTs低于30iu /l患者的上四分位数MeMPN浓度为1984 pmol。
总之，在131例处于稳定状态的患者中，较高的TGN浓度与疾病缓解相关。然而，在两年的时间里，稳态TGN浓度变化高达三倍。通过比较连续的TGN分析可能无法检测到这种变化。131稳态组的TGN测量的重复分析，第一次和第二次测定之间的中位数为两个月(范围1-6)，显示两种浓度之间无显著差异。初始测量的TGN浓度范围为51 ~ 684 pmol(中位数215)，第二次测量的TGN浓度范围为57 ~ 723 pmol(中位数225)，中位数差异为2 pmol (95% CI−28 ~ 25)(p = 0.9)。
伴随的治疗
在总稳定状态患者组(n = 131)中，130例患者可获得伴随治疗信息。比较服用AZA单药治疗、AZA和5-氨基水杨酸(5-ASAs)、AZA和类固醇以及AZA、5-ASAs和类固醇(三联治疗)的患者之间的平均患者TGN和MeMPN代谢产物浓度的范围(表3)。在四个患者组中，AZA剂量、TGN浓度或MeMPN浓度无显著差异(Kruskal-Wallis, p = 0.9)。
合规
20名患者的代谢物谱表明不或部分依从口服AZA治疗。在代谢物常规监测中，其中16例患者至少有一次TGN和MeMPN代谢物均低于检出限。其余4例患者TGN浓度波动较大(3 - 6倍)。在研究期间，7例不依从性患者发展为活动性疾病，他们的平均TGN浓度从25到180 pmol(中位数112)。这些患者如图4所示。
20名患者有药物依从性问题。1-16号患者在长期服用恒定剂量硫唑嘌呤时，硫鸟嘌呤核苷酸(TGN)代谢物浓度低于检测水平(30 pmol)。在研究期间，7例患者出现活动性疾病(箭头表示)。
讨论
在这项长期服用恒定剂量AZA治疗的患者的研究中，我们观察到TGN形成的广泛的患者内部变异。有许多因素可以影响口服药物治疗中活性代谢物的形成。影响TGN形成的一个主要因素是重要的药物代谢酶TPMT的遗传调控。然而，tmt的日变化和长期变化是低的27因此这些因素对代谢物产生的影响应该是最小的。随着时间的推移，不同的药物吸收可能会影响代谢物的产生，特别是在肠功能不健康的IBD患者中。另外，AZA的配方也会影响其吸收。据报道，使用Imuran治疗的患者比使用非专利AZA治疗的患者获得更高的TGN浓度。28然而，尽管在本报告中两个患者组的AZA剂量相似，但患者数量太少，无法匹配TPMT活性。任何具有中间TPMT活性的患者(占总人口的11%)在任何给定剂量的AZA下都会产生更高的TGN浓度。这可能部分解释了服用Imuran与非专利AZA相比，TGN浓度明显增加的原因。
Elion和他的同事们6观察到大约12%的AZA剂量可以分裂成次黄嘌呤而不是6MP。正是生物硫醇、谷胱甘肽和半胱氨酸促进了AZA代谢的这一关键步骤。29香烟烟雾是一种常见的氧化剂，而谷胱甘肽是一种抗氧化剂，参与烟草烟雾化学物质的代谢。吸烟和年龄都会降低谷胱甘肽水平。30.吸烟的患者可能有更多可变的AZA到6MP分解。
在这项131例患者的研究中，每个患者都进行了多次RBC TGN测定，我们报告了平均TGN浓度为236 pmol与疾病缓解相关。这与最初的报告一致，在25名患者中，tgn高于254 pmol与临床反应有关。17在随后的几年里，这些观察得到了一些报告的支持，患者人数不断增加。10日,18古普塔和他的同事们21报道了从AZA治疗开始的一系列TGN测量，疾病缓解与TGN浓度显著相关。预测的疾病缓解概率从100 pmol TGNs时的33%增加到500 pmol TGNs时的66%。21
然而，许多研究未能显示RBC TGN浓度与疾病缓解之间的关系。22日,31在迄今为止规模最大的一项研究中，患者被邀请提交一份用于TGNs测量的血液样本，并通过IBD问卷评估疾病活动性。22收集了170例患者的血液样本;56例活跃期患者的TGN浓度为139 pmol, 114例缓解期患者的TGN浓度为131 pmol，远低于上述研究报告的浓度。
与其他研究一致的是，10我们的数据显示，白细胞减少与TGNs升高相关，但只有一小部分(2%)接受AZA治疗的患者出现这种情况。同样，我们也没有发现MeMPN代谢物浓度与疾病活动性之间的关联。10日,17，22在许多研究中，已发现升高的mempn与AZA的肝氧作用有关。10日,11日,17在本研究中，21例(16%)患者肝功能升高，但大多数患者肝毒性较轻。在一名中度毒性(ALTs 4×正常上限)的个体中，mempn高于上四分位数MeMP，其他20名ALTs持续在正常范围内的患者也是如此，其他组也进行了观察。21
TGN和MeMP代谢物浓度可用于监测依从性32．在被研究的156例患者组中，有20例患者(13%)显示出口服治疗不依从性的证据。20例不依从性患者中有7例发展为活动性疾病。法规遵循监测的研究报告称，法规遵循率可以徘徊在50%左右。33接受AZA的肾移植患者和接受6MP的白血病儿童的不依从性发生率分别为18%和10%。34岁,35这是有力的证据，表明部分依从性也可能导致稳态组患者TGN代谢物浓度的变化。
本研究组规定的AZA中位数剂量为1.8 mg/kg，远低于2.5 mg/kg的推荐剂量。许多患者的治疗剂量为2.5 mg/kg，但这被视为最大剂量，而不是起始剂量。在治疗开始时，慎用AZA;这在一定程度上是为了避免出现记录良好的直接副作用。如果患者在较低的AZA剂量下仍处于缓解期，则AZA剂量不再进一步增加。其次，目前的研究小组是建立在长期的AZA治疗，因此剂量减少，由于细胞计数下降，可能发生在过去。
据报道，在IBD治疗中常用的5-ASAs可抑制TPMT并增加TGN浓度。36，37在目前的研究中，5-ASAs的联合处方不影响TGN的浓度。然而，在“中间”TPMT活性较低的患者中，5-ASAs的影响可能更明显。本文报道的长期AZA治疗的患者可自行选择。该组可能含有过量的AZA耐受患者，且TPMT活性较高。那些TPMT活性较低的患者可能已经从AZA治疗中退出，以回应该亚组中报道的更高频率的白细胞减少。10日,22
目前的TGN浓度在患者体内变化的研究是第一个在长时间内监测的大患者群体的报告。以前的报告都是基于小数量的患者17，28日,31通过简单的重复测量。17，31据报道TGN的可变性<10%。该研究报告，在131名患者的稳态组中，在恒定剂量AZA下，TGN形成的患者内变异高达3倍。本研究中使用的品牌和通用AZA的组合是否是TGN随时间变化的一个额外的贡献因素尚不清楚。这项研究表明，由于患者体内TGN产生的可变性和依从性问题的高发，单个TGN读数可能不能反映贯穿多年的口服AZA治疗的药物代谢情况。鉴于患者体内TGN产生随时间的高度可变性，目前可能不提倡将TGN测量用于常规临床使用。
致谢
谢菲尔德医院慈善信托基金支持这些研究。