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摘要
背景与方法:已知细菌DNA的胞质鸟苷二核苷酸(CpG)基序是先天性免疫的有效激活因子。我们之前已经证明，在右旋糖酐硫酸钠诱导的结肠炎发作前给小鼠服用含有寡核苷酸(CpG- odn)的CpG可以改善结肠炎，并抑制促炎细胞因子的诱导。探讨CD4的可能参与+T细胞在预防CpG-ODN作用时，我们采用了结肠炎的SCID转移模型。
结果:CD4+CD62L+与对照细胞相比，来自CpG-ODN处理的供体的T细胞在SCID受体中没有诱导明显的肠道炎症。此外，这些细胞与CD4共转移+CD62L+正常小鼠的细胞保护受者免于结肠炎，这表明细胞具有调节活性。此外,CD4+CD62L+来自toll样受体9缺陷动物的细胞在SCID受体中诱导的结肠炎明显更严重，这表明“内源性”细菌DNA具有类似的保护作用，导致这些细胞的“侵略性”较低。在侵袭性细胞池和减毒细胞池之间，调节性T细胞表面标记物没有可检测到的差异，但在抗cd3刺激后，减毒细胞池在体外和体内均显示增殖减少，产生的干扰素γ、白介素(IL)-5和IL-6减少。
结论:总的来说，我们的数据支持这样一个概念，即内源性细菌DNA和外源性提供的细菌DNA的CpG基序诱导CD4的调节特性+T细胞。因此，来自正常肠道菌群的细菌DNA可能有助于健康个体效应免疫机制和调节免疫机制之间的稳态，以保护他们免受慢性肠道炎症的影响。
- IBD，炎症性肠病
- CpG，胞质鸟苷二核苷酸
- CpG- odn, CpG含寡脱氧核苷酸
- TLR, toll样受体
- ,白介素
- 肿瘤坏死因子
- IFN-γ，干扰素γ
- TGF-β，转化生长因子β
- PBS，磷酸盐缓冲盐水
- RT-PCR，逆转录聚合酶链反应
- 实验性结肠炎
- CpG图案
- 细菌的DNA
- 结肠炎SCID转移模型
数据来自Altmetric.com
- IBD，炎症性肠病
- CpG，胞质鸟苷二核苷酸
- CpG- odn, CpG含寡脱氧核苷酸
- TLR, toll样受体
- ,白介素
- 肿瘤坏死因子
- IFN-γ，干扰素γ
- TGF-β，转化生长因子β
- PBS，磷酸盐缓冲盐水
- RT-PCR，逆转录聚合酶链反应
慢性炎症性肠病(IBD)的发病机制尚不清楚。其病因复杂、多因素，涉及遗传和环境因素。1，2大量证据表明，肠道菌群在慢性肠道炎症的发生和延续中起着关键作用，这在许多在无菌条件下未能发病的自发性结肠炎遗传小鼠和大鼠模型中得到了证明。3 -9另一方面，有几项观察表明，“过度清洁”的环境，尤其是在儿童早期，会增加IBD的风险。10最近，NOD2基因突变被发现与克罗恩病有关。11NOD2基因产物被认为是微生物成分的细胞内受体，如muramyl二肽，12日,13导致单核细胞中的核因子κB活化。14因此，累积的令人信服的证据表明，细菌及其产物在慢性肠道炎症的发展中起着多方面的作用。
几年前，人们认识到细菌DNA作为脊椎动物免疫系统激活产物的重要性。15如图所示，由未甲基化的CpG二核苷酸组成的胞嘧啶鸟苷二核苷酸(CpG)序列基序是细菌DNA的免疫刺激成分。16含有CpG基基的寡核苷酸(Oligonucleotides, ODN)可以直接或间接激活树突状细胞、小鼠巨噬细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞和T淋巴细胞。在对这种刺激的反应中，细胞开始增殖、加工和呈现抗原，并开始分泌各种促炎细胞因子，包括白细胞介素(IL)-6、IL-12、肿瘤坏死因子(TNF)和干扰素γ (IFN-γ)，最终导致强烈诱导Th1倾斜免疫反应。17细菌DNA与脊椎动物DNA主要有三个不同之处。首先，CpG基序在细菌DNA中随机出现(1/16)，而在脊椎动物DNA中很少见(1/60)。18其次，与细菌DNA相比，脊椎动物DNA中的胞嘧啶大多是甲基化的。第三，在脊椎动物DNA中有大量的基序可以抑制CpG基序的刺激作用。19基于这些差异，脊椎动物的免疫系统已经发展出特异性识别细菌DNA的机制。最近的研究表明toll样受体(TLR) 9对细菌DNA CpG基序的识别至关重要20.迄今为止，观察到的所有CpG基序诱导效应都依赖于TLR9连接。21
合成的未甲基化CpG-ODN模拟细菌DNA的免疫激活特性，并成功地用作免疫研究的佐剂22日,23以及过敏性疾病的模型。24CpG-ODN在实验性结肠炎中的作用是不同的。我们和其他研究人员先前表明，在持续的结肠炎中应用CpG基序会导致IFN-γ依赖性加重25日,26而预防性CpG-ODN可抑制疾病。26日,27我们观察到，经CpG-ODN预处理后，结肠炎诱导后IL-10的产生增加，IFN-γ的分泌减少，26说明有很强的免疫调节作用因为这两种细胞因子都是T辅助细胞极化的指标，我们推测特异性T细胞亚群的诱导参与了这些保护性免疫机制。为了验证这一假设，我们使用了结肠炎的SCID转移模型，该模型由定义的CD4控制+T细胞亚群。
材料与方法
老鼠
体重20-22克(Charles River，德国)的C.B-17 SCID和Balb/c小鼠被用于实验，并被安置在常规设施中。TLR9缺陷小鼠是Shizuo Akira博士(大阪，日本)的一份友好礼物。所有小鼠均为129/Ola × C57BL/6的F1后代。作为对照，使用年龄匹配的窝友。从Balb/c供体或TLR9分离的细胞−−/小鼠或同窝对照组转移到SCID小鼠。未见移植物抗宿主病征象。动物研究得到了当地机构审查委员会的批准。
Oligodeoxynucleotides
硫代磷酸稳定ODN从Metabion (Martinsried, Germany)获得。ODN的顺序如下:
CpG-ODN:“ODN1668”28" 5 ' -tcc atg acg TTC CTG atg ct-3 ' "
GpG-ODN: " ODN1668G " " 5 ' -TCC ATG AGG TTC CTG ATG CT-3 ' "(对照)。
CD4+CD62L+结肠炎T细胞转移模型
脾脏CD4+CD62L+从Balb/c小鼠中分离T细胞，如前所述，略有修改。29简而言之，CD4+通过使用抗cd8、抗mhc - ii、抗b220和抗cd11b细胞抗体(购自德国汉堡的Pharmingen)和抗大鼠igg免疫磁微珠(Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany)对其他类型的细胞进行负性消耗，从健康小鼠的脾脏单个核细胞中纯化T细胞。由此产生的CD4+免疫磁珠将T细胞进一步分离成CD62L+和CD62L−T细胞。经FACS分析，前者细胞(纯度为>95%)CD45RB高表达。CD4+CD62L+T细胞(0.25×106)重悬于200 μl无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，腹腔注射于受体C.B.-17 SCID或RAG1缺陷小鼠。在共转移实验中，0.25×106CD4+CD62L+未经治疗的捐赠者的细胞加上0.25×106CD4+CD62L+CpG-ODN处理过的供体细胞被注射。通过体重变化和组织学分析监测结肠炎活性，如下所述。在CpG-ODN或GpG-ODN处理的供体动物实验中，小鼠腹腔注射10 μg ODN，加入100 μl无菌PBS，持续5天，然后分离CD4细胞+CD62L+T细胞。
组织学检查
直肠横切面用10%缓冲福尔马林固定，苏木精-伊红染色。为了量化肠道组织的组织学损伤，我们建立了一个新的评分，如表1所示。转移性结肠炎显微镜下炎症的主要特征是限于粘膜的单个核细胞浸润和连续的粘膜损伤(杯状细胞丢失，隐窝丢失)。两种特征分别从0到4进行独立评分，并记录均分。严重结肠炎的症状可能包括隐窝脓肿，炎性浸润延伸至粘膜下层，粘膜血管外出血。每一种症状的组织学评分增加0.5，最高限制在4分。组织学分析由两名研究人员以盲法进行。
CD4的孵育+CD62L+T细胞
细胞按上述方法分离，然后以10的浓度孵育6细胞培养基(rmi -1640, 10%胎牛血清，100 U/ml青霉素，100 μg/ml Gibco-BRL (Eggenstein, Germany)链霉素)和β-巯基乙醇3×10−5M (Sigma, Deisenhofen，德国)。抗cd3 (2.5 μg/孔)刺激细胞24小时以上(单抗，145-2C11;BD pharingen)包被孔和细胞因子水平通过ELISA检测上清液(均来自Endogene, Woburne, Massachusetts, USA)，每种条件使用4个孔。
扩散分析
分离出的细胞在96孔板中孵育，之前用抗cd3 (2.5 μg/孔)包被。48小时后，0.5 μCi/孔脉冲细胞(3.H)使用闪烁计数器测量胸腺嘧啶16小时和每分钟计数。
肠系膜淋巴结细胞的分离与培养
在无菌条件下，在冰冷的培养基中收集肠系膜淋巴结(从每组小鼠中收集)，机械破坏淋巴结并通过细胞过滤器(70 μm)过滤。细胞(2×105/well)在200 μl培养基中孵育24小时，ELISA法检测上清液中细胞因子水平(均来自Endogene)，每种条件4孔。
流式细胞仪分析
样品采用两色染色法进行分析。简单地说，分离的淋巴细胞用40 μg/ml 2.4G2单克隆抗体和10%胎牛血清预孵育以阻断FcRs，然后用FITC和PE偶联单克隆抗体进行染色。使用Epics XL-MCL (Coulter Electronics, Krefeld, Germany)对细胞进行清洗和流式细胞术分析。所有步骤都在4°C下进行，以防止受体内化。
定量RT-PCR (Light Cycler)
采集另一个结肠组织标本(1cm)进行定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)，并转移到冰冷的RNAlater溶液中(Ambion, Huntingdon, UK)。按照制造商的建议，使用RNeasy-kit (Qiagen, Hilden, Germany)和Qiagen Shredder-kit提取RNA。RNA按照制造商推荐使用Promega (Mannheim, Germany)逆转录系统进行转录。细胞因子mRNA的定量使用Light Cycler (Roche, Molecular Systems, Mannheim, Germany)。为了标准化，扩增β-肌动蛋白(引物对:5 ' -TGG AAT CCT GTG GCA TCC ATG AAA C-3 '和5 ' -TAA AAC GCA GCT CAG TAA CAG TCC G-3 ')。
引物和条件
IFN-γ: 5 ' -TGG AGG AAC TGG CAA AAG GAT GGT-3 '和5 ' -TTG GGA CAA TCT CTT CCC CAC-3 '，退火温度62℃，3 mM MgCl2．
IL-6: 5 ' -TGG AGT CAC AGA AGG AGT GGC TAA G -3 '和5 ' -TCT GAC CAC AGT GAG GAA TGT CCA C -3 '，退火温度62°C, 4 mM MgCl2．
IL-10: 5 ' -TCC TTA ATG CAG GAC TTT AAG GGT TAC TTG-3 '和5 ' -GAC ACC TTG GTC TTG GAG CTT ATT AAA ATC-3 '，退火温度62°C, 3 mM MgCl2．
所有引物均购自MWG-Biotech AG (Ebersberg, Germany)。对每只小鼠的细胞因子mRNA进行定量。
BrdU标记和免疫组化
动物在处死小鼠前连续三天腹腔注射1mg /只BrdU (Sigma Aldrich, München, Germany)。使用BrdU原位检测试剂盒(BD Pharmingen)，按照制造商的说明对肠系膜淋巴结冷冻切片中的BrdU进行免疫组化染色。
统计数据
统计分析使用学生的t检验(细胞因子水平)、Mann-Whitney秩和检验(组织学评分)或一般线性模型(每日体重减轻)。在所有两组以上的实验中，经Kruskal-Wallis秩方差分析证实各组间有统计学差异，两组间比较采用Mann-Whitney秩和检验。误差条表示平均值的标准误差(SEM)。当p<0.05时，接受差异有统计学意义。
结果
CpG-ODN预处理供体小鼠对结肠炎SCID转移模型体重减轻和肠道炎症的影响
来评估CD4+T细胞参与了之前描述的CpG-ODN在不同结肠炎模型中的保护作用，26日,27我们采用SCID转移模型，通过脾CD4转移诱导SCID小鼠结肠炎+CD62L+细胞。供体小鼠使用CpG-ODN或对照GpG-ODN治疗超过5天，或在CD4之前不进行治疗+CD62L+分离脾T细胞，移植到受体动物体内。如图1A所示，用经过CpG-ODN处理的供体淋巴细胞重建的SCID小鼠，随着时间的推移体重增加(第8周:+14(5)%)，与未接受任何T细胞的动物相比，没有出现结肠炎的迹象(第8周:+28(4)%)。相比之下，小鼠被CD4细胞转移+CD62L+来自未经治疗的供者或用对照GpG-ODN预处理的供者的细胞随着时间的推移体重下降(第8周:−8(5)%和−5(2)%)，并如预期的那样发生结肠炎。
含低聚脱氧核苷酸(CpG-ODN)的胞素鸟苷治疗供体动物结肠炎SCID转移模型对结肠炎发展的影响供体动物用CpG-ODN或GpG-ODN(每10µg/天，持续5天)处理或不加CD4+CD62L+细胞被转移到SCID受体。作为阴性对照，SCID小鼠注射磷酸盐缓冲盐水(PBS)。(A)转移后重量变化。(B)在实验结束时(转移后8周和12周)检查不同组的组织学评分。(C)未转移小鼠和CD4转移小鼠的代表性结肠苏木精-伊红切片+CD62L+显示来自处理过的CpG-ODN或GpG-ODN(对照)或未处理的供体(对照)细胞(放大50倍)。(D) toll样受体9 (TLR9)缺失或野生型(Wt)窝伴对照组用CpG-ODN(10µg/天，5天)、CD4处理+CD62L+将细胞转移到SCID受体，并在实验结束时检查组织学评分。(A-C)中显示的数据来自每组5-8只小鼠，代表了五个独立的实验。数值为平均值(SEM)。*与转入CD4的两组有显著差异+CD62L+来自GpG-ODN或未经处理的供体小鼠的细胞。(B)(12周数据)和(D)中的数据来自每组5-8只小鼠，代表两个独立的实验。数值为平均值(SEM)。*明显不同。
体重减轻过程中的差异通过黏膜炎症的组织学征象反映出来。用经过CpG-ODN处理的供体淋巴细胞重建的SCID小鼠肠粘膜内几乎没有观察到任何炎症(组织学评分:0.4(0.4))，而接受来自GpG-ODN的T细胞或未经处理的供体小鼠则表现出完全建立的结肠炎，两组之间没有显著差异(组织学评分:来自GpG-ODN处理的供体的转移2.2 (0.3);1.8(0.4))(图1B)。
为了检查供体小鼠的CpG-ODN治疗是否会导致肠道炎症的延迟发作或结肠炎的持续减轻，我们将观察期延长至12周。如图1B所示，我们发现即使在细胞转移后12周，CpG-ODN供体处理仍具有显著的保护作用(CpG-ODN处理供体1.1 (0.3);未经治疗的捐赠者3.8 (0.2);GpG-ODN治疗对照组3.0 (0.4);p < 0.001)。CpG-ODN的保护性作用最近在其他结肠炎模型中被证明是TLR9依赖的。30.为了在结肠炎的SCID转移模型中验证这一点，我们用CpG-ODN处理TLR9缺陷供体小鼠和野生型窝仔。与野生型同窝小鼠相比，CpG-ODN对TLR9缺陷供体小鼠没有保护作用，表明CpG-ODN的保护作用依赖于TLR9(图1D)。
CpG-ODN预处理供体小鼠对结肠炎SCID转移模型细胞因子产生的影响
为了验证肠道炎症的改善是否伴随着细胞因子产生的调节，我们测量了肠系膜淋巴结细胞(图2A)和结肠mRNA(图2B)的细胞因子分泌。
含低聚脱氧核苷酸(CpG-ODN)的胞苷鸟苷处理供体动物结肠炎SCID转移模型对细胞因子产生的影响供体动物用CpG-ODN或GpG-ODN(每10µg/天，每天，持续5天)或不加治疗，CD4细胞+CD62L+细胞被转移到SCID受体。作为阴性对照，SCID小鼠注射磷酸盐缓冲盐水(PBS)。(A)在实验结束时分离肠系膜淋巴结细胞，并通过ELISA在过夜培养中测量细胞因子的自发分泌。IL,白介素;IFN-γ，干扰素γ。(B)从个体小鼠结肠组织中分离mRNA，通过实时聚合酶链式反应定量不同细胞因子的表达，如材料和方法所述。所提供的数据来自于五个独立的实验，每组至少有20只小鼠。数值为平均值(SEM)。*与CD4转移组均有显著差异+CD62L+未经处理和GpG-ODN处理的供体小鼠的细胞(如果没有其他指示)。
有趣的是，CD4受体+CD62L+来自CpG预处理小鼠的供体细胞与未移植的动物相比，IFN-γ或IL-6分泌没有增加，而来自未处理小鼠的细胞受体则显示两种促炎细胞因子的合成显著上调(IFN-γ为700倍;IL-6 7倍)(图2A)。相比之下，与对照组相比，使用CpG-ODN处理的供体细胞转移的小鼠IL-10分泌显著增加(4倍)。用GpG-ODN预处理供体小鼠也会影响细胞因子的产生，但水平明显较低。通过RT-PCR检测，结肠组织中促炎细胞因子的基因表达也显著降低(IL-6 6.7倍;与未处理或GpG处理的供体细胞相比，经过CpG-ODN预处理的供体细胞的IFN-γ表达上调了约3.5倍(图2B)。
CD4的转移+CD62L+来自TLR9缺陷小鼠的细胞导致SCID受体肠道炎症增加
在上述实验中，供体小鼠外源性暴露于大量的CpG-ODN超过五天，最终导致CD4+CD62L+T细胞的炎症潜能显著降低。目的探讨供体小鼠“生理”稳态TLR9/CpG DNA相互作用是否影响CD4刺激结肠炎的潜能+CD62L+我们使用TLR9缺陷小鼠作为供体动物，其中这种相互作用缺失。如图3A所示，当移植TLR9细胞时，SCID受体的体重减轻显著增加−−/供体与用对照组小鼠的细胞(TLR9细胞)移植的小鼠进行比较−−/捐助者−17%;从野生型对照转移到−8%)。体重减轻的增加与组织学评分的显著增加并行(从TLR9转移−−/3.2 (0.2);从野生型供体转移1.3(0.5))，肠系膜淋巴结细胞产生的IFN-γ(7.9倍)，IL-5(7.6倍)和IL-6(1.8倍)显著增加，而IL-10分泌减少9.7倍(图3C)。综上所述，这表明CD4+CD62L+TLR9缺陷小鼠的细胞显示出增加的炎症潜能。排除供体和受体之间的遗传差异定性地影响TLR9移植受体中观察到的炎症增加的可能性−−/细胞，我们也使用C57/Bl6 RAG1−−/和受体小鼠获得了相同的定性结果(数据未显示)。
CD4的转移+CD62L+toll样受体9 (TLR9)缺陷小鼠与野生型小鼠的细胞对比。CD4+CD62L+从TLR9缺陷供体或野生型对照窝仔中分离细胞并转移到SCID受体。(A)转移后重量变化。(B)在实验结束时(转移后7周)检查各组的组织学评分。(C)实验结束时分离肠系膜淋巴结细胞，24小时后用ELISA法检测上清液中细胞因子的分泌。IL,白介素;IFN-γ，干扰素γ。*与CD4转移组明显不同+CD62L+来自野生型窝友的细胞。所提供的数据来自每组5只小鼠，并代表两个独立的实验。
CD4共转移+CD62L+在结肠炎的SCID转移模型中，来自CpG-ODN和未经处理的供体的细胞可以减少肠道炎症
来确定CD4+CD62L+经CpG-ODN处理的供体细胞失去了诱导肠道炎症的能力，或者是否获得了调节能力，我们进行了共转移实验。图4A表明，CpG-ODN处理和未处理供体小鼠的细胞共转移可以防止SCID宿主结肠炎的发展。与只转移CD4细胞的小鼠相比+CD62L+此外，我们发现CD4转移的SCID小鼠肠系膜淋巴结中的增殖细胞数量明显减少(BrdU染色，图5为棕色)+CD62L+CpG-ODN预处理供体细胞和共转移宿主细胞与未处理供体细胞转移的SCID小鼠进行比较。综上所述，这些数据表明CpG-ODN处理诱导CD4细胞调节活性的出现+CD62L+细胞。
CD4共转移+CD62L+来自含低聚脱氧核苷酸(CpG-ODN)的胞苷鸟苷(cytosin-guanosin)处理和未处理供体动物的SCID小鼠细胞。供体动物用CpG-ODN治疗(10µg/天，持续5天)或不加治疗，或使用CD4+CD62L+来自未处理或CpG-DNA处理的供体或两者的细胞被转移到SCID受体。作为阴性对照，SCID小鼠注射磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在实验结束时(转移后8周)显示组织学评分(A)和分离的肠系膜淋巴结细胞(B)的干扰素γ (IFN-γ)分泌。*与CD4转移组明显不同+CD62L+细胞来自未经治疗的供体小鼠。数据来源于三个独立的实验，每组10-15只小鼠。ND，未检测到。
CD4共转移+CD62L+来自含低聚脱氧核苷酸(CpG-ODN)的胞苷鸟苷(cytosin-guanosin)处理和未处理供体动物的SCID小鼠细胞。供体动物用CpG-ODN治疗(10µg/天，持续5天)或不加治疗，或使用CD4+CD62L+来自未处理或CpG-DNA处理的供体或两者的细胞被转移到SCID受体。用BrdU掺入法检测肠系膜淋巴结细胞的体内增殖。
CD4的特征+CD62L+细胞来自CpG-ODN处理过的供体
进一步研究CpG-ODN暴露对CD4细胞的影响+CD62L+我们比较了抗cd3诱导的细胞因子分泌和增殖，并进行了FACS分析，以检测被描述为优先表达在调节/抑制性T细胞上的标志物(表2)。CpG-ODN预处理小鼠减少了CD4对IFN-γ(3.9倍)和IL-5(5.2倍)的分泌+CD62L+而IL-10或转化生长因子β (TGF-β)分泌无显著差异(图6A)。此外，它们在CD3结扎上的增殖显著减少(大约两倍;图6 b)。与对照组相比，这些细胞的CD25、GITR、CTLA-4或αEβ7表面显示无显著差异(表2)。
细胞因子分泌和抗cd3增殖刺激CD4+CD62L+从含低聚脱氧核苷酸(CpG-ODN)的胞质鸟苷-鸟苷分离的细胞处理供体小鼠。小鼠分别给予CpG-ODN或GpG-ODN(每10µg/天，持续5天)或不给予治疗，并给予CD4+CD62L+如材料和方法所述，分离细胞并在抗cd3包被孔中培养，细胞因子检测超过24小时(A)或72小时3.h -胸腺嘧啶掺入(B). PBS，磷酸盐缓冲盐水;IL,白介素;IFN-γ，干扰素γ;TGF-β，转化生长因子β。*与GpG-ODN或未处理的小鼠有显著差异。孵育进行了四重复，结果具有代表性的三个独立的实验。
CD4的特征+CD62L+TLR9缺陷小鼠的细胞
Anti-CD3-stimulated CD4+CD62L+TLR9缺陷小鼠的细胞与野生型同窝对照小鼠的细胞进行比较。IFN-γ(2.3倍)、IL-5(10倍)和IL-6(2.4倍)的分泌显著增加，IL-10的分泌显著减少(1.6倍)(图7A)。此外，与野生型对照相比，我们发现未经刺激的细胞在48小时后的增殖显著增加(44%)。相比之下，抗cd3激活细胞(野生型对照组的115%)增殖无明显差异(图7B)。
细胞因子分泌和抗cd3增殖刺激CD4+CD62L+细胞分离自toll样受体9 (TLR9)缺陷小鼠。CD4+CD62L+从TLR9缺陷小鼠或野生型同窝对照组中分离细胞，并在抗cd3包被孔中培养，如材料和方法所述，细胞因子检测超过24小时(A)或72小时(A)3.h -胸苷掺入(未受刺激和抗cd3刺激)(B). IL，白介素;IFN-γ，干扰素γ。*与同窝对照组显著不同。孵育进行了四次，结果至少代表两次实验。
讨论
最近，我们和其他人证明预防性CpG-ODN治疗可以改善各种肠道炎症动物模型中的结肠炎。26日,27然而，这种保护作用的机制尚不清楚。我们的数据提供了CpG诱导的保护是通过T细胞依赖机制介导的证据，并进一步表明，健康小鼠中自然发生的CpG/TLR9相互作用可能有助于T细胞的调节潜力。
我们之前在急性右旋糖酐硫酸钠结肠炎模型中的结果表明，在结肠炎诱导结束时，预处理CpG-ODN的小鼠IFN-γ减少，IL-10分泌增加。26因此，我们假设T细胞参与了CpG-ODN的保护性作用。为了验证这一假设，我们使用了结肠炎的SCID转移模型。该模型被广泛用于研究特异性T细胞在诱导肠道炎症中的作用，因为结肠炎是由“致病性”CD4的转移介导的+淋巴细胞注入免疫缺陷小鼠。我们发现，来自未处理或对照注射GpG-ODN的供体小鼠的T淋巴细胞诱导了SCID小鼠严重的结肠炎，而来自CpG-ODN预处理动物的细胞无法介导明显的肠道炎症。
这一效果令人惊讶，因为CpG-ODN最突出的活性是它们强大的Th1诱导能力。31日,32然而，我们也知道CpG基序不仅能诱导抗原提呈细胞分泌促炎细胞因子，还能诱导抗炎细胞因子IL-10的分泌。此外，其他报道描述了CpG-ODN在Th2介导的几种病理模型中的保护作用。23日,33岁的34在这些模型中，有益的效果归因于诱导强烈的Th1反应，被认为可以抵消Th2介导的病理机制。有趣的是，之前也有研究表明，在血吸虫卵应用前预防性接种CpG-DNA的积极作用不是由于Th1免疫应答的诱导，而主要是IL-10和细胞/细胞接触依赖。这表明CpG基序诱导的调节性免疫反应限制了该模型的病理。35此外，预防性CpG-ODN应用也能够预防NOD小鼠Th1驱动的自身免疫性糖尿病。36同样，保护作用与IL-10产量的增加有关。这些结果，加上我们发现接受CpG-ODN预处理供体T细胞的SCID小鼠的肠系膜淋巴结细胞比对照组小鼠分泌更多的IL-10，促使我们推测CD4+CD62L+从注射CpG-ODN的动物中分离出来的细胞不仅失去了诱导结肠炎的潜力，相反，获得了调节能力。这一假设被共转移实验证实+CD62L+经CpG-ODN预处理的供体细胞消除了CD4诱导结肠炎的能力+CD62L+细胞来自未经治疗的捐赠者。
此外，IFN-γ的产生显著减少，在共转移受体的肠系膜淋巴结细胞中未检测到淋巴细胞增殖。这表明CD4+CD62L+来自CpG-ODN预处理供体的细胞(或这些细胞的亚群)可能通过抑制促炎细胞因子的产生和抑制T细胞增殖来抑制肠道炎症。rach麦利维茨及其同事指出，CpG-ODN治疗可能诱导调节性T细胞，这也解释了为什么预防性CpG-ODN治疗可以抑制Th1和Th2介导的肠道炎症模型中的结肠炎。27
在过去的几年中，许多关于免疫反应调节过程的新见解已经获得，证明了调节性T细胞对维持免疫稳定状态的重要性。到目前为止，CD4的不同子集+具有抑制功能的细胞被描述为至少存在CD4的两个基本亚群+调节性T细胞在发育、特异性、作用机制以及对T细胞受体和共刺激信号的依赖等方面存在差异。37最典型的子集包括所谓的自然产生的CD4+CD25+胸腺发育的调节细胞。这些CD25+细胞的特征是糖皮质激素诱导的TNF受体相关蛋白GITR和转录因子Foxp3的表达。38 -40我们没有发现CD4细胞中CD25、GITR或Foxp3 mRNA的数量增加(半定量PCR的初步结果)+CD62L+来自CpG-ODN预处理动物的细胞。
因此，我们倾向于适应性或“诱导”调节性T细胞群。37据认为，这些细胞是在某些抗原刺激条件下诱导的，这些抗原刺激涉及细胞因子，如IL-10和I型干扰素，以及皮质类固醇，维生素D3.，和/或cell/cell接触。41岁的42这一假设得到了最近一份报告的支持，该报告证明CD8α+CpG-ODN成熟树突状细胞支持CD4调节性的诱导+细胞。43这些适应性T细胞发挥其调节功能的机制尚不清楚。在一些体内模型中，IL-10和/或TGF-β分泌被认为起着重要作用。44 -46然而，与自然调节细胞相似，细胞-细胞接触依赖机制被认为介导适应性调节T淋巴细胞的抑制功能。37我们的结果表明，在体内，CpG-ODN预处理抑制了CD4细胞分泌Th1 (IFN-γ)和Th2 (IL-5)细胞因子+CD62L+而调节细胞的细胞因子(IL-10, TGF-β)的产生不受影响，这表明CpG-ODN诱导细胞因子分泌在CD4中向调节模式转变+CD62L+细胞。
调节性T细胞的另一个特点是它们的增殖能力降低。CD4+CD62L+CpG-ODN处理小鼠的细胞在体外培养仅72小时后就表现出明显的增殖降低。在体内，抗增殖作用似乎更强，因为我们发现，与未接受CpG治疗的供体细胞转移的对照组相比，使用CpG治疗的供体淋巴细胞转移的SCID小鼠的肠系膜淋巴结中几乎没有增殖细胞。综上所述，这些结果证明CD4是一种调节类型+T细胞，由体内CPG-ODN释放产生，是CD4的一部分+CD62L+淋巴细胞制剂能够预防结肠炎的发展。
基于这些结果和最近的一份报告，该报告表明CpG-ODN对实验性结肠炎的预防作用实际上依赖于TLR9，30.我们提出了一个重要的问题，即可能来自正常腔内菌群的“内源性”细菌DNA的暴露，是否也以类似的方式调节CD4的潜力+CD62L+细胞诱导结肠炎。CD4+CD62L+从TLR9缺陷小鼠中分离出来的细胞不能被细菌DNA刺激，在转移到SCID或RAG-1缺陷小鼠后，将其与野生型窝仔进行比较。在结肠炎的所有测量参数中，TLR9缺陷细胞表现出明显更大的炎症潜能。因此，健康的生物体持续暴露于细菌DNA可能有助于肠道免疫系统的稳态稳态，调节效应物和调节机制之间的微妙平衡。有趣的是，最近在人类T细胞中也观察到类似的发现，这表明CpG基序是调控质量的有效诱导剂。47在这方面，我们的数据与流行病学研究的结果特别相关，这些研究表明，在发达国家，IBD的发病率与卫生标准的提高呈正相关，导致生物体与细菌和细菌制品的接触减少。10日,48因此，人们很容易推测，减少接触微生物成分(如细菌DNA)会导致由于调节T淋巴细胞活性降低而导致肠道免疫反应失调的风险增加，最终导致基因易感的宿主患上IBD。
致谢
这项工作得到了欧盟对WF (QLG1-CT-1999-00549)的资助，DFG对UGS的资助，以及德国雷根斯堡大学的研究资助，作为FO改革计划的一部分。
参考文献
脚注
↵＊F Obermeier和UG Strauch对这项工作做出了同样的贡献。
利益冲突:没有声明。
2005年5月5日在线发布