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  • 肠道来源的脂多糖增加脂肪巨噬细胞的积累，但不是必需的受损的葡萄糖或胰岛素耐量小鼠

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肠道微生物群
肠道来源的脂多糖增加脂肪巨噬细胞的积累，但不是必需的受损的葡萄糖或胰岛素耐量小鼠
  1. 罗伯特·凯撒1，2，
  2. 克里斯托弗·S·瑞格斯塔德1，2，
  3. 海琳·克林Bäckhed1，2，
  4. Christoph莱因哈特1，2，
  5. 玛丽亚Ketonen1，2，
  6. Gunnel Östergren Lundén1，2，
  7. 帕特里斯·D·卡尼3.，
  8. 弗雷德里克·Backhed1，2
  1. 1Sahlgrenska心血管和代谢研究中心/瓦伦堡实验室，瑞典哥德堡
  2. 2瑞典哥德堡大学分子与临床医学系
  3. 3.Université鲁汶天主教，鲁汶药物研究所，代谢和营养研究小组，布鲁塞尔，比利时
  1. 对应到Fredrik博士Bäckhed，瓦伦堡实验室，Sahlgrenska大学医院，S-413 45哥德堡，瑞典;fredrik.backhed在{}wlab.gu.se

摘要

背景肥胖与白色脂肪组织(WAT)中巨噬细胞的积累有关，这有助于胰岛素抵抗的发展。无菌(GF)小鼠减少了脂肪，并对饮食诱导的肥胖有保护作用，

客观的研究肠道菌群，特别是肠源性脂多糖(LPS)是否促进WAT炎症并导致糖代谢受损。

方法比较GF、常规培养和WAT中巨噬细胞组成及促炎和抗炎标志物的表达大肠杆菌-monocolonised老鼠。此外，测定了这些小鼠的葡萄糖和胰岛素耐量。

结果在WAT中，肠道菌群的存在导致糖代谢受损，巨噬细胞积累增加，并向促炎M1表型极化。GF小鼠单定殖4周大肠杆菌W3110或等基因菌株MLK1067(表达低免疫原性的LPS)导致WAT中葡萄糖和胰岛素耐量受损，并促进CD11b细胞的M1极化。然而，殖民与大肠杆菌W3110促进巨噬细胞聚集，促炎和抗炎基因表达上调，JNK磷酸化上调，而MLK1067不促进。

结论在WAT中，肠道菌群诱导LPS依赖性巨噬细胞积累，而系统糖代谢损害不依赖于LPS。这些结果表明WAT中的巨噬细胞积累并不总是与糖代谢受损相关。

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  • 无菌老鼠
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  • 代谢性炎症
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  • 能量代谢
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  • 炎性疾病
  • 巨噬细胞、肥胖
  • 结肠微生物区系
  • 肠道通透性
  • 生命起源以前的
  • 粘膜免疫
  • 心血管病
  • 肠上皮细胞
  • 肠道
  • 脂质代谢

这是一篇根据创作共用署名非商业许可协议发布的开放获取文章，该协议允许在任何媒介上使用、分发和复制，前提是原始作品被正确引用，使用是非商业性的，并且在其他方面符合许可。看到的:http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0/而且http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0/legalcode

http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl-2011-301689

数据来自Altmetric.com

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    本研究的意义

    关于这个问题我们已经知道了什么?

    • 肥胖小鼠和人类的肠道菌群都发生了改变。

    • 无菌小鼠减少了脂肪，并对饮食引起的肥胖有抵抗力。

    • 肥胖和胰岛素抵抗与脂肪组织发炎有关。

    新的发现是什么?

    • 肠道菌群促进脂肪炎症。

    • 巨噬细胞招募到脂肪组织需要脂多糖(LPS)。

    • 大肠杆菌促进巨噬细胞极化为促炎(M1)偏倚表型，这是独立于LPS。

    • 大肠杆菌-诱导的小鼠葡萄糖和胰岛素耐量损害不需要促炎LPS。

    在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?

    • 了解肠道菌群诱导代谢性疾病的机制可能为治疗这些危及生命的疾病提供新的诊断和治疗靶点。它也证明了结合细菌遗传学和灵生动物模型来研究宿主代谢的力量。

    简介

    肥胖与胰岛素抵抗和慢性低级别炎症相关，其特征是白色脂肪组织(WAT)中促炎M1巨噬细胞的积累。1 - 3最近的证据表明，无菌(GF)小鼠对饮食诱导的肥胖有保护作用，并表现出较低的WAT炎症和胰岛素抵抗4 - 6表明肠道菌群在肥胖，炎症和胰岛素抵抗之间的联系中的作用。此外，肥胖的人肠道微生物多样性减少，7通过抗生素或益生元调节肠道菌群可以改善代谢和炎症特性，这表明肠道菌群在代谢性疾病中具有直接作用。8 - 10

    目前尚不清楚是哪些微生物因素促进了WAT炎症，但细菌内毒素脂多糖(LPS)被认为是一个关键因素。肥胖小鼠和患有2型糖尿病的人血浆脂多糖浓度增加11，12LPS通过激活toll样受体(TLR) 4促进促炎细胞因子的分泌。13此外，长期皮下输注LPS可增加巨噬细胞的积累和WAT中炎症标志物的表达以及肝脏中的胰岛素抵抗。11因此，LPS构成了微生物诱导的炎症、肥胖和代谢性疾病之间的假定联系。在这里，我们使用无菌小鼠结合细菌遗传学来研究LPS是否起源于大肠杆菌足以促进WAT中的葡萄糖和胰岛素耐量和巨噬细胞积累。

    材料与方法

    小鼠和菌种单定殖

    GF雄性瑞士韦伯斯特小鼠，10-12周龄，在严格的12小时光照周期下，保持在柔性薄膜隔离器中。除PCR检测细菌16外，还通过厌氧培养定期验证GF状态年代rDNA。14GF小鼠和常规饲养(convc - r)小鼠均自由饲喂蒸压饲料(Labdiet)。

    大肠杆菌菌株W3110和MLK1067 (W3110waaN)用于单殖。两株菌株均表达1型菌毛，但不表达p -菌毛或α-溶血素。15W3110是一种特征良好的野生型菌株，选择等基因菌株MLK1067是因为它与W3110相比具有较低的免疫原性。15 - 17日GF小鼠接种4周大肠杆菌W3110或MLK106718(3 - 4×109每笼菌落形成单位(CFU);∼109每只老鼠)。通过连续稀释和在Luria-Bertani琼脂上镀液来确定小鼠盲肠的最终定殖密度。

    在禁食5小时后采集附睾WAT和血浆。

    DEXA、胰岛素和葡萄糖耐量试验以及血浆瘦素、血脂和胰岛素水平的测量

    DEXA的执行如前面所述。19空腹5 h后分别腹腔注射胰岛素(0.75 U/kg体重)或葡萄糖(2 g/kg体重)进行胰岛素和葡萄糖耐量试验。在0、30、60、90和120分钟收集尾血样本，使用HemoCue葡萄糖201+分析仪(HemoCue， Ängelholm，瑞典)测定血糖水平。根据制造商的协议，分别使用Meso Scale (Gaithersburg, Maryland, USA)、Abcam (Cambridge, Massachusetts, USA)、Thermo Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)和Crystal Chem (Downers Grove, Illinois, USA)的试剂盒测量空腹瘦素、游离脂肪酸、甘油三酯和胰岛素。

    WAT免疫组化

    对石蜡包埋的附睾WAT切片(5 μm)进行脱蜡处理，用2100检索器使用1× DIVA溶液和热冲洗进行抗原检索(HistoLab Products AB，哥德堡，瑞典)。内源性过氧化物酶活性用0.3% H培养2O2在5%兔血清、1%牛血清白蛋白和0.1% Triton X-100中，在室温下封闭30分钟。巨噬细胞用MAC-2/半乳糖凝集素-3抗体(在线补充表S1)在阻断缓冲液中1:500稀释，在4℃过夜，用生物素化抗大鼠抗体(10 μg/ml)检测。使用vecastain Elite ABC试剂检测免疫复合物，然后使用NovaRed底物溶液(Vector Laboratories, Burlingame, California, USA)根据制造商说明显色，并用苏木精反染。冠状结构计数在15-40毫米2每只小鼠的组织学切片。

    RAW 264.7巨噬细胞的培养和刺激

    RAW 264.7巨噬细胞(ATCC, Manassas, Virginia, USA)保存在Dulbecco的改良Eagle's培养基(PAA实验室，Pasching, Austria)中，培养基中含有100u /ml青霉素，100mg /ml链霉素，2mm l -谷氨酰胺，2mm丙酮酸钠和10%胎牛血清。细胞以相同的密度播种，到达汇合点时，对它们进行清洗和热杀大肠杆菌或控制介质。按照制造商的方案培养4小时后，用中尺度免疫分析法测定上清液中的肿瘤坏死因子α。在单独的实验中，细胞在RTL缓冲液(Qiagen, Hilden, Germany)中裂解，并在液氮中快速冷冻。

    脂肪组织巨噬细胞的分离

    附睾WAT彻底切碎，重悬于15 ml消化液中(7 ml Hanks'溶液、3 ml 7.5%牛血清白蛋白(BSA)和20 mg II型胶原酶(Sigma Aldrich，圣路易斯，密苏里州，美国))。组织消化在37°C下进行，使用振动筛，120 rpm，持续40分钟。去除脂肪细胞，将基质血管部分离心(1200 rpm, 4°C, 5分钟)，随后在1ml选择缓冲液(PBS, 2mm EDTA和0.5% BSA)中重新悬浮。CD11b细胞使用CD11b微珠(Miltenyi Biotec, Auburn, California, USA)，根据制造商的说明进行选择。

    流式细胞术分析

    脂肪组织巨噬细胞用BD Fc Block (BD Biosciences, Franklin Lakes, New Jersey, USA)孵育5分钟，然后用单克隆抗体孵育(在线补充表S1)。清洗后，使用Accuri C6流式细胞仪和CFlow Plus分析软件(Accuri巨细胞仪，Ann Arbor, Michigan, USA)分析细胞。使用与相应荧光色素偶联的非特异性抗体作为阴性对照，并设置荧光阈值，使总细胞的2.5%为荧光阳性。感兴趣抗体的阳性细胞百分比由超过非特异性抗体所获得的阈值的细胞百分比确定。

    有限合伙人的分析

    使用无热原注射器/针从小鼠门静脉采集血液，血浆立即分离并冷冻在液氮中。使用Endosafe-MCS (Charles River, Lyon, France)测量LPS浓度，该方法基于鲎阿米巴细胞裂解液(LAL)动力学显色方法，测量样品中与内毒素浓度直接相关的颜色强度。将血浆用无内毒素缓冲液稀释1/10，以尽量减少对反应的干扰(抑制或增强)，并在70°C下加热15分钟。每个样品用无内毒素的LAL试剂水(Charles River)稀释，重复处理，每个样品2个尖刺用于测定。20.

    为了确定饲粮中的LPS含量，随机选择颗粒在无内毒素管中研磨(Greiner, Frickenhausen, Germany)。将基础饲料(100 mg)在10 ml无内毒素的LAL试剂水(Charles River)中超声处理，并过滤(0.22 μm, Millipore)。用无内毒素的LAL试剂水稀释溶液，用Endosafe-MCS测量LPS浓度。每个样品重复处理，每个样品的两个尖刺被包括在测定中。

    检出下限为0.005内毒素单位(EU)/ml。

    定量rt - pcr

    RNA采用RNeasy试剂盒，柱上DNase处理(Qiagen, Hilden, Germany)分离。cDNA模板使用高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems, Foster City, California, USA)根据制造商说明从总rna合成。qRT-PCR检测在25 μl反应中进行，反应中含有1× SYBR Green Master Mix buffer (Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA)和900 nM基因特异性引物(300 nM引物浓度用于评估L32转录本)。基因表达数据归一化为核糖体蛋白L32。引物序列在在线补充表S2中报道。

    免疫印迹分析

    将蛋白质提取物(20 μg)加载到10% NuPAGE bi - tris凝胶(Invitrogen, Carlsbad, California, USA)上，并将其吸附到Hybond P PVDF膜(Invitrogen)上。在添加5%脱脂奶粉的PBS Tween-20 (PBST)中阻断1小时后，用1:1000稀释的一抗在阻断缓冲液中孵育过夜，然后在PBST中洗涤，用1:2000稀释的二抗在阻断缓冲液中孵育1小时，最后在PBST中洗涤(抗体列于表S1)。蛋白质检测使用LumiGLO印迹检测试剂盒(Cell Signaling, Danvers, Massachusetts, USA)。

    统计分析

    数据以平均值±SEM表示。两组之间的分析由Student确定t测试，而三个或更多组的比较采用单向方差分析，并使用GraphPad Prism 5软件进行临时Bonferroni后测。

    结果与讨论

    即使在没有高脂肪饮食的情况下，肠道菌群也会增加脂肪，损害葡萄糖和胰岛素耐量，并增加WAT中的巨噬细胞积累

    先前的研究表明，即使在没有高脂肪饮食的情况下，C57BL/6小鼠的定殖也会导致脂肪显著增加，葡萄糖和胰岛素耐量受损。19在这里，我们使用了瑞士韦伯斯特小鼠，因为与C57BL/6小鼠相比，它们通常更大，脂肪含量增加。正如预期的那样，在12周龄时，我们发现convl - r小鼠的附睾WAT和体脂肪显著增加(图1 a, B)．convc - r小鼠的肥胖情况与先前报道的高脂肪饮食8周的C57BL/6小鼠相似(附睾WAT/g体重分别为33±2 vs 37±5 mg)，4证实瑞士韦伯斯特小鼠是轻度肥胖的合适模型。此外，通过使用chow饮食，我们避免了高脂肪饮食中存在的饱和脂肪酸等混杂因素。将12周大的GF小鼠与正常菌群定殖14天，使体脂增加到convc - r小鼠的水平(图1 b)．正如预期的那样，我们在12 - 14周大的convc - r小鼠中观察到血浆瘦素和胰岛素水平的增加，以及与年龄匹配的GF小鼠相比，葡萄糖和胰岛素耐量的受损(图1氟)．血浆游离脂肪酸或甘油三酯水平无差异(数据未显示)。

    图1

    肠道菌群增加脂肪组织重量，损害葡萄糖稳态。(A)无菌小鼠(GF)和常规饲养小鼠(convc - r)附睾白色脂肪组织(WAT)重量(每组n= 8-9只)。(B)用DEXA测定GF和convc - r小鼠的体脂，以及用正常菌群定植的GF小鼠14天(convd)(每组n= 8-10只小鼠)。(C) GF和convc - r小鼠空腹血浆瘦素和(D)胰岛素水平(每组n= 7-8只小鼠)。(E)葡萄糖(每组n= 8-9只小鼠)和(F) GF和convc - r小鼠的胰岛素耐量(每组n= 5-6只小鼠)。绘制平均值±SEM;*p<0.05， ***p<0.001。

    为了研究肠道菌群对WAT中巨噬细胞积累的影响，我们对附睾WAT中MAC-2进行了染色，并显示与GF小鼠相比，convc - r小鼠中冠状结构(CLS)的形成增加(图2 a, B)．CLS是代表巨噬细胞在死亡脂肪细胞周围聚集的组织学元素，21而大量的CLS已被证明与肥胖个体的代谢功能障碍有关。22qRT-PCR分析WAT显示泛巨噬细胞标记物表达增加Emr1与GF小鼠相比，convl - r小鼠中编码egf样模块受体，也称为F4/80的mRNA (图2 c)．对含有CD11c (M1)和CD209 (M2)抗体的CD11b脂肪组织巨噬细胞的FACS分析显示，与GF小鼠相比，convc - r小鼠WAT中的M1/M2比值增加(图2 d，在线补充图S1A,B)和CD11c细胞数量增加/g WAT (图2 e)．CD209细胞/g WAT数量也有增加的趋势(图2 ep＝0.06)。qRT-PCR分析显示，两种促炎细胞因子均为阳性肿瘤坏死因子α而且Saa3（图2 f, G)和抗炎标志物Mgl1而且il - 10（图2 h,我)与GF小鼠相比，convl - r小鼠的WAT升高。这些数据表明，M1巨噬细胞比例的增加主要是由这些细胞的浸润增加引起的。

    图2

    肠道菌群增加白色脂肪组织(WAT)中冠状结构(CLS)的形成、M1/M2比值以及促炎和抗炎细胞因子的表达。(A)无菌小鼠(GF)和常规饲养小鼠(convc - r) WAT的代表性MAC-2免疫染色。箭头表示CLS。比例尺= 100 μm。(B) CLS定量(每组n=9只)。(三)qRT-PCR分析Emr1GF和convc - r小鼠WAT的表达(每组n= 8-9只)。(D)分别用藻红素偶联CD11c抗体和CD209偶联抗原提呈细胞，用流式细胞术测定WAT M1和M2巨噬细胞的比值(n=4 (GF)和8 (convc - r))。(E)每克WAT中CD11c (M1)和CD209 (M2)巨噬细胞数量(n=4)。(F-I) qRT-PCR分析肿瘤坏死因子α，Saa3，Mgl1而且il - 10GF和convc - r小鼠WAT的表达(每组n= 8-9只)。(J) GF (n=9)和convl - r (n=15)小鼠门静脉血样中脂多糖(LPS)水平。绘制平均值±SEM;*p<0.05， **p<0.01， ***p<0.001。

    肠道菌群增加血浆LPS水平

    重要的是，由于我们使用了chow饮食，convc - r和GF小鼠在WAT中葡萄糖和胰岛素耐量以及巨噬细胞积累和炎症的差异不能归因于饮食中的饱和脂肪酸。因此，我们假设这些差异可能是由菌群的组成部分引起的，如LPS。事实上，我们发现，与食用周粮的GF小鼠相比，convl - r小鼠血浆中的LPS水平(即代谢性内毒素血症)有所提高(图2 j)．饲粮中LPS含量为1.5 EU /mg，这可以解释GF小鼠血浆中LPS水平较低的原因。

    殖民与大肠杆菌促进肥胖、葡萄糖和胰岛素耐量，而不依赖于LPS

    LPS与小鼠和人类的肥胖和2型糖尿病有关9，12皮下注射LPS可促进肥胖和轻微损害葡萄糖代谢。11然而，很少有人知道来自肠道的LPS如何影响新陈代谢。因此，我们研究了肠道来源的LPS在介导葡萄糖和胰岛素耐量以及巨噬细胞积累和炎症方面的重要性，方法是在GF小鼠中定植这两种LPS大肠杆菌W3110或等基因突变体MLK1067，一种由于其五酰化脂a成分而降低免疫原性的菌株，154周。我们首先证实该突变体表现出诱导能力下降肿瘤坏死因子α在小鼠RAW 264.7巨噬细胞中表达和肿瘤坏死因子α分泌(在线补充图S2A,B)，并表明W3110和MLK1067在小鼠肠道定植的细菌密度大致相同(1.1×1010和1.5×1010W3110和MLK1067分别为CFU/ml)。

    不出所料，殖民与大肠杆菌与GF小鼠相比，W3110而非MLK1067可增加血浆LPS水平(图3一)．然而，殖民大肠杆菌与GF小鼠相比，菌株增加附睾WAT重量(图3 b)．与GF小鼠相比，两种菌株定植的小鼠血浆瘦素和胰岛素水平更高，MLK1067定植的小鼠血浆瘦素和胰岛素水平最高(图3 c, D)．在定殖过程中未观察到游离脂肪酸或甘油三酯的血浆水平差异(数据未显示)，也未观察到食物摄入量差异(数据未显示)。任何一种菌株的定植都会导致葡萄糖和胰岛素耐量受损(图3 e, F)．

    图3

    大肠杆菌无菌(GF)小鼠的定殖增加白色脂肪组织(WAT)的重量，损害葡萄糖和胰岛素耐量。(A) GF小鼠和W3110或MLK1067定植4周后(每组n=5-6只小鼠)门静脉血样中的脂多糖(LPS)水平。(B)附睾WAT重量(每组n= 9-10只小鼠)。(C)空腹血浆瘦素和(D)胰岛素水平在GF和常规升高(convc - r)小鼠(每组n= 9-10只小鼠)。(E)糖耐量试验(n= 9-10只/组)。(F)胰岛素耐量试验(每组5-6只小鼠)。绘制平均值±SEM;* p < 0.05;* * p < 0.01;***p< 0.001与GF在A-D; #p<0.05 vs GF for both W3110 and MLK1067 in panels E and F.

    这些发现表明单定殖与大肠杆菌即使在没有野生型LPS的情况下，也足以增加肥胖并损害胰岛素和葡萄糖耐量。其他微生物成分，如肽聚糖，可能是调节宿主糖代谢和肥胖的重要因素。例如，缺乏肽聚糖受体的小鼠Nod1而且Nod2不受高脂饮食诱导的炎症和胰岛素耐受的影响，NOD1的激活会导致胰岛素抵抗。23

    内脏来源的LPS增加WAT中的巨噬细胞积累和促炎和抗炎标志物

    殖民与大肠杆菌W3110，而不是MLK1067，导致CLS形成增加(图4 a, B)和增加的表达Emr1(F4/80) (图4 c)．观察到LPS对巨噬细胞的积累是必需的，而不是肥胖，这与早期的研究一致，在这些研究中，缺乏CD14或造血细胞特异性TLR4缺失(因此LPS信号减弱)的小鼠在高脂肪饮食中出现肥胖，但脂肪组织巨噬细胞含量显著降低。24

    图4

    肠源性脂多糖(LPS)可增加白色脂肪组织(WAT)中冠状结构(CLS)的形成、M1/M2比值以及促炎和抗炎细胞因子的表达。(A)无菌(GF)小鼠和W3110或MLK1067定植4周小鼠的WAT中MAC-2的代表性免疫染色。箭头表示CLS。比例尺= 100 μm。(B) CLS的定量(每组n= 4-5只小鼠)。(三)qRT-PCR分析Emr1(F4/80)(每组n= 6-7只小鼠)。(D)用结合CD11c和CD209抗体的流式细胞术测定WAT中M1和M2激活的巨噬细胞的比率(n=4 (GF)和9 (W3110和MLK1067))。(E) CD11c数+(M1)和CD209 (M2)巨噬细胞/克WAT (n= 4-5)。(F-I) qRT-PCR分析肿瘤坏死因子α，Saa3，Mgl1而且il - 10(每组n= 5-6只小鼠)。(J)用抗phospho-JNK抗体和肌动蛋白抗体免疫印迹法分析WAT的总蛋白提取物。(K) JNK磷酸化p46形式正常化为肌动蛋白的相对定量(每组n=6只小鼠)。绘制平均值±SEM;* p < 0.05。

    为了研究W3110定植小鼠WAT中巨噬细胞浸润增加是否与炎症增加有关，我们分析了WAT中的M1/M2比率以及促炎和抗炎细胞因子水平。在殖民后，M1/M2的比率增加了大约两倍大肠杆菌菌株，但仅在W3110定植的小鼠中增加显著(图4 d，在线补充图S3A,B)。在W3110定植的小鼠中，CD11c和CD209细胞的数量都有所增加(图4 e)，相应地，我们也观察到两种促炎标志物的表达增加肿瘤坏死因子α而且Saa3还有抗炎标志物Mgl1而且il - 10W3110定殖小鼠的WAT (图4外:我)．此外，免疫印迹分析显示磷酸化JNK水平升高(图4 j, K)来自W3110定植小鼠的WAT，表明炎症信号增加。相比之下，MLK1067没有增加这些标记物(图4 f - k)．M1/M2比值的增加不一定反映在促炎和抗炎细胞因子之间的平衡，这一观察表明巨噬细胞极化的复杂性，并表明需要多种标志物来研究WAT的炎症状态。

    结论

    综上所述，肠道菌群通过几种机制影响宿主代谢，这些机制结合在一起可能导致肥胖，并对葡萄糖代谢产生深远影响。在这里，我们证明LPS足以促进巨噬细胞浸润，但不是与肠道定植相关的糖代谢受损所必需的。其他微生物成分此前已被证明会影响葡萄糖和胰岛素耐量，23，25从而从糖代谢受损中解耦LPS和WAT炎症。然而，值得注意的是，TLR4对LPS的识别在小鼠和人类之间是不同的:五酰基化MLK1067 LPS是小鼠TLR4的弱激动剂，但是人类TLR4的强拮抗剂。17，26

    致谢

    我们感谢Carina Arvidsson和Anna Hallén的高超技术支持和Rosie Perkins(哥德堡大学瓦伦堡实验室)对手稿的编辑。

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    补充材料

    • 补充数据

      此网页文件由BMJ出版集团从作者提供的电子文件制作而成，并没有对内容进行编辑。

      本数据补充文件:

    脚注

    • 资金这项工作得到了瑞典研究委员会、瑞典战略研究基金会、瑞典糖尿病基金会、Petrus和Augusta Hedlund基金会、Torsten和Ragnar Söderbergs基金会、诺和诺德基金会、TORNADO (FP7-KBBE-222720)、http://www.fp7tornado.eu/)，阿斯利康通过与Sahlgrenska学院的合作，以及来自Västra Götalandsregionen的LUA-ALF资助。CSR是Wenner-Gren基金会博士后奖学金的获得者。PDC是FRS-FNRS(比利时科学研究基金会)的研究助理，是FSR (Fonds Spéciaux de recherche, UCL)和FRSM (Fonds de la recherche scientifique Médicale)的资助获得者。

    • 相互竞争的利益一个也没有。

    • 出处和同行评审不是委托;外部同行评审。