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摘要
客观的小鼠结肠内黏液层通常将细菌从上皮细胞中分离出来。人类是否有类似的内部黏液层?黏液层的缺陷是小鼠模型自发性结肠炎和溃疡性结肠炎(UC)的共同特征吗?
方法与结果Muc2黏蛋白缺失小鼠的结肠黏液层，Core 1O-聚糖、Tlr5、白细胞介素10 (IL-10)和Slc9a3 (Nhe3)与右旋糖酐硫酸钠处理小鼠的Muc2进行免疫染色，并分析粘液中的细菌定位。所有小鼠结肠炎模型均显示细菌与上皮细胞接触。进一步分析炎症程度较轻的IL-10−−/小鼠的黏液层比野生型更厚，但性质不同，因为内部黏液层既可以被体内的细菌穿透，也可以被体外细菌大小的荧光珠穿透。在正常的乙状结肠活检样本中，细菌或荧光珠与由内黏液层介导的上皮细胞之间的明显分离也很明显。相比之下，UC合并急性炎症患者结肠活检标本上的粘液是高度可穿透的。大多数处于缓解期的UC患者都有与对照组相似的不可穿透的黏液层。
结论正常的人体乙状结肠有一个细菌无法穿透的粘液层。在动物模型中自发发展结肠炎和活跃UC患者的结肠粘液允许细菌渗透并到达上皮细胞。因此，结肠粘液的性质可以被调节，这提示了UC病理生理学的一个新模型。
- 粘液
- 黏蛋白
- 粘膜屏障
- 粘膜病理
- 细菌易位
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数据来自Altmetric.com
本研究的意义
关于这个主题我们已经知道了什么?
在小鼠结肠中，细菌通过MUC2粘蛋白形成的内黏液层与上皮细胞分离。
muc2缺陷小鼠没有任何分泌粘液，有细菌与上皮细胞直接接触。这些小鼠会患上结肠炎，然后患上结肠癌。
新的发现是什么?
人体内有一层黏液，通常可以将细菌与上皮细胞隔离开来。
细菌大小的珠子对粘液内层的穿透与细菌的穿透有关。
小鼠结肠炎模型有细菌和珠子穿透内层黏液。
患有活动性溃疡性结肠炎(UC)的人有一层可穿透的内层粘液。
一些缓解期的UC患者也有可穿透的内层粘液。
在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?
这一观察将使人们对UC有新的认识，并开辟新的研究方向。
了解内部黏液的渗透性如何被调节将提供新的治疗机会。改善粘液保护可能有助于维持UC缓解。
介绍
炎症性肠病在西方国家呈上升趋势，可分为克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)。这两种疾病都依赖于肠道微生物群的存在，尽管还没有特定的细菌与疾病有关。1，2经典CD在基因和功能上与NOD2和ATG16L1等蛋白质有关。3.UC不像乳糜泻那样容易理解，局限于结肠和直肠，以浅表粘膜炎症为特征。4与环境和微生物接触相结合，该病可能发生在遗传易感性个体中。5用于评估疾病活动度的一个形态学特征是典型的杯状细胞衰竭，反映了杯状细胞的清空，这可能表明黏液系统在UC中的作用。
肠道上皮以一种允许宿主和微生物之间的共生关系的方式管理肠道细菌群。沿着肠道，上皮细胞的功能和需求各不相同，因此对这些表面的保护也以不同的方式处理。6小肠上皮介导营养吸收，覆盖在这些表面的粘液允许这种运输。然而，肠道的细菌负荷在远端方向显著增加，并在结肠中大量定植。这些大量的细菌通常不会引起炎症，但有时免疫系统被强烈激活，并观察到严重的炎症。这种平衡是如何控制的尚不完全清楚，但最近发现的结肠内黏液层，它不受细菌的影响，并将细菌与上皮细胞物理分离，为这种功能提供了新的见解。7有人认为，人类的细菌和上皮细胞之间也有分离，2，8，9但目前尚不清楚人类是否也有类似的由MUC2黏蛋白形成的保护性黏液层，尽管有人认为黏液层是分层的。10
结肠粘液是由杯状细胞产生的，这是一种专门负责这一任务的细胞类型。肠内黏液的主要成分是MUC2黏蛋白，体积大而重O-糖基化凝胶形成粘蛋白，通过c端二聚和n端三聚形成巨大的聚合网。11，12在杯状细胞分泌时，粘液迅速膨胀，并建立一个分层的致密层，附着在上皮细胞上。13这种粘液含有额外的蛋白质，其中FCGBP蛋白很重要，因为它可以通过额外的交联稳定粘液。14在远离上皮表面的远处，内部黏液转化为可溶的、组织性较差的外黏液层，通过蛋白水解膨胀，为共生微生物提供了首选的栖息地。11muc2缺陷小鼠自发性结肠炎的发展证实了结肠内黏液层的保护特性。7，15在这些小鼠中，发现细菌与上皮细胞直接接触，远至结肠隐窝和肠细胞内，这是在野生型(WT)动物中从未观察到的位置。这些观察和早期对UC患者的研究表明细菌与上皮细胞接触16，17这可能表明，粘液内层的缺陷使细菌比正常情况下更多地到达上皮细胞，从而激活免疫系统。这促使我们在小鼠模型和人类UC中研究，结肠内黏液层是否存在与结肠炎有关的缺陷。我们现在发现，结肠炎小鼠模型和UC患者的结肠粘液功能失调，可以被细菌渗透。
材料与方法
动物
实验用WT C57/Bl6、IL-10−−/, Slc9a3−−/, C1galt1−−/和Tlr5−−/根据当地伦理委员会的指导方针，所有小鼠均为C57/Bl6背景(雄性8-12周)。所有实验都包括来自与剔除菌株相同的动物设备的对照。右旋糖酐硫酸钠(DSS)实验按所述进行。18，19
人体实验对象和活组织检查
研究对象是从瑞典哥德堡Sahlgrens大学医院转诊进行结肠镜检查的患者中招募的。对28例UC患者乙状结肠的活检标本进行了评估。疾病活动度由Mayo内镜评分确定。20.UC患者的临床信息在表1．同时取12例宏观和微观黏膜正常的患者(对照组)进行活检。这些患者的临床信息在网上显示补充表S1。本研究获得了所有研究对象的书面和知情同意，并获得了哥德堡大学人类研究伦理委员会的批准。活检标本使用一次性大容量钳(Olympus)一次采集一个，立即放入冰冷的含氧克雷布斯溶液中或固定在Carnoy固定液中。7
荧光原位杂交(FISH)和免疫染色
石蜡包埋carnoy固定切片脱蜡后用H&E或阿利新蓝/高酸希夫(PAS)染色，或与10 ng/µl的普通细菌16S rRNA探针(EUB338)杂交，并使用MUC2C3抗血清免疫染色Muc2，或用4 '，6-二氨基氨基-2-苯基吲哚(DAPI)免疫染色DNA。7图像使用Axio Examiner Z1 LSM 700共聚焦显微镜和ZEN 2010软件(蔡司)获得。
粘液渗透评分、组织学评分和杯状细胞测量
在dna染色切片上盲目评估细菌对粘液的渗透(IL-10 n=5)−−/和WT)由两名独立观察员。评分(0-4)基于对每个样本的整个肠道横截面的观察，评分的增加对应于细菌与上皮细胞之间接触的增加。对H&E和阿利新蓝/ pas染色切片进行炎症组织学评分(每种基因型n=3)，由两名独立观察员对每个样本的整个组织切片进行盲法评分。计算炎症细胞浸润(0 - 4分)、杯状细胞衰竭或粘液积累减少(0 - 4分)、黏膜增厚(0 - 4分)、结构破坏(0分或3-4分)和隐窝丢失(0分或3-4分)得分之和(最多20分)。所有数据均以均数±标准差表示。
杯状细胞的数量按照在线补充中的描述进行计数。34个人类样本(10个对照组，14个UC缓解患者，10个疾病活动性患者)和10个小鼠样本(5个WT, 5个IL-10)的数据以均值±SEM表示−−/)。根据在线补充中描述的抗muc2c3染色切片的图片测量杯状细胞粘液填充的膜腔面积。34个人类样本(10个对照组，14个UC缓解患者，10个疾病活动性患者)和10个小鼠样本(5个WT, 5个IL-10)的数据以平均面积±SEM表示−−/)。
用于体内和体外实验的小鼠组织的制备
在体内实验中，小鼠通过持续给药异氟醚麻醉(Isoba vet;先灵葆雅)。打开腹部，在打开的肠段上放置一个杯子，并装满温生理盐水。在离体实验中，小鼠用异氟醚麻醉后颈椎脱位致死。远端结肠被解剖，冲洗，纵向肌肉层被移除。组织外植体安装在水平灌注室中。
粘液厚度
如前所述，测量结肠粘液的厚度。19简单地说，通过添加木炭颗粒可以看到结肠粘液的上表面。通过在立体显微镜(徕卡MZ12)下观察微量移液管测量上皮表面与粘液表面之间的距离来确定粘液厚度。
粘液穿透性
如前所述，测量粘液穿透性。19简单地说，结肠外植体放置在灌注室中孵育20分钟;然后将2µm绿色珠子和0.5µm红色珠子的悬浮液添加到根尖表面(Fluospheres;英杰公司)。将珠粒在黏液中沉淀40分钟，之后通过LSM 700 Axio Examiner Z.1共聚焦成像系统和ZEN 2009软件(蔡司)在XY堆叠中拍摄共聚焦图像，分析珠粒与上皮细胞的关系。结果采用Volocity 5.5.1软件(perkins - elmer)进行分析。通过分析黏液的穿透性，可以发现黏液中有接近上皮细胞的珠粒和含有珠粒的黏液厚度。关于这些方法的详细描述可以在在线补充中找到。
统计分析
使用双尾Mann-Whitney U检验分析小鼠数据。对于人类数据，使用了Kruskal-Wallis检验和Dunns的多重比较校正。p值<0.05为显著。
材料和方法的详细描述可以在在线补充中找到。
结果
在自发发展结肠炎的动物模型中，内部黏液层有缺陷
远端结肠的内黏液层是由Muc2粘蛋白片形成的，以一种不允许细菌渗透的分层方式组织成堆叠层。这将细菌从上皮细胞中分离出来(图1WT)。缺乏Muc2基因的动物缺乏分泌的黏液层，导致细菌与上皮细胞之间不断接触(图1, Muc2−−/)。7估计与上皮细胞接触的细菌的存在(图2A和在线补充图S1A)，并在H&E和阿利新蓝/ pas染色的组织切片上评估炎症水平，评估免疫细胞浸润、隐窝结构和杯状细胞充盈(“耗尽”)(图2B,C和在线补充图印地)。如前所述，Muc2−−/动物表现出以白细胞浸润为标志的严重炎症和以隐窝伸长为证据的细胞增殖增加(图2C, Muc2−−/)。15修饰Muc2粘蛋白的一种更微妙的方法是通过缩短其糖基化O聚糖。通过删除C1galt1糖基转移酶来阻断核心1的延伸，导致粘蛋白糖基化减少，从而导致自发性结肠炎。21这些动物表现出有缺陷的内黏液层，允许细菌穿透并接触上皮细胞(图1和在线补充图S1A, C1galt1−−/)。
不同小鼠结肠炎模型中结肠内黏液层细菌的定位。保留黏液的固定结肠切片用普通细菌16S探针荧光原位杂交检测到Muc2(绿色)和细菌(红色)，并用4′，6-二氨基氨基-2-苯基吲哚(DAPI;蓝色)。野生型(WT)与不同中断基因(Muc2)的自发性结肠炎模型进行比较−−/, C1galT1−−/, Slc9a3−−/, Tlr5−−/和il - 10−−/)。用3%右旋糖酐硫酸钠(DSS)治疗小鼠12小时或5天。双头箭头表示内黏液层并不总是没有细菌。箭头指向靠近上皮细胞的细菌。比例尺为20微米。影响力。，inflamed; Non-infl., non-inflamed.
钠-氢交换剂Slc9a3 (Nhe3)缺失小鼠已被证明会发生自发性结肠炎。22，23当分析这些小鼠的结肠组织切片时，观察到基本上正常的黏液，就厚度和分层外观而言，但它被细菌渗透(图1和在线补充图S1A, Slc9a3−−/)。如前所述，组织切片还显示有免疫细胞浸润的炎症迹象(图2C和在线补充图印地Slc9a3−−/)。造成这种粘液表型的原因尚不清楚，但一个最佳的局部离子环境被认为是正常粘液扩张和组织所必需的。
最广泛使用的结肠炎模型是DSS模型，其中啮齿动物在饮用水中加入2-5%的DSS。24炎症通常在3-5天后出现。暴露12小时后检查远端结肠组织切片，内部黏液层在厚度和分层模式方面看起来相对正常。然而，细菌已穿透黏液，并在未发炎的上皮附近发现(图1和在线补充图S1A DSS)。18DSS 5天后，内黏液层消失，组织严重发炎。
细菌识别是先天反应的一部分，tlr5缺陷小鼠的一个亚群自发地发展成结肠炎。25当研究这些动物时，观察到内部黏液层，但它被细菌渗透，并观察到大量的免疫细胞浸润(图1而且2C, Tlr5−−/影响力)。未发炎的tlr5缺陷小鼠显示出更完整和无细菌的内部粘液(图1, Tlr5−−/Non-Infl)。
最早被淘汰的动物之一是缺乏IL-10的动物，导致炎症依赖于细菌的存在。26，27当这些动物被分析时，它们有非常轻微的炎症，内部黏液层的厚度和分层模式正常。有趣的是，它们的内部黏液也被细菌渗透(图1而且2, il - 10−−/)。一般来说，更严重的炎症往往与与上皮细胞接触的细菌数量较多有关。该规则的主要例外是暴露在DSS中仅12小时的动物，其中细菌在结肠炎发生之前已经穿透了内部黏液层。这表明与上皮细胞的细菌接触先于炎症发生，细菌接触可引发随后的炎症。il - 10的−−/小鼠表现出较低的组织学评分和较低的粘液渗透评分，这表明细菌渗透和炎症之间存在关系。因此，所有发生结肠炎的测试小鼠模型都显示细菌与远端结肠上皮直接接触。
il -10缺乏的结肠炎小鼠的分泌黏液层并不薄
因为IL-10−−/小鼠已经成为实验性结肠炎的原型，并且在任何粘液成分中都没有主要缺陷，我们更详细地分析了这个模型。由于细菌穿透内部黏液层似乎是小鼠结肠炎的一个标志，人们可以推测这是由于黏液层较薄。为了解决这个问题，我们测量了年轻IL-10体内和体外远端结肠的粘液厚度−−/轻度炎症小鼠和WT小鼠(图3A、B)。在体内直接测量总黏液层(内层和外层)的厚度;然后吸出松散的外部粘液，并测量内部牢固粘附的粘液的厚度。IL-10之间的总厚度没有差异−−/和WT小鼠，但IL-10黏液明显变厚−−/老鼠(图3A).远端结肠组织也置于水平灌注室，体外观察黏液生长1 h。19在此期间，IL-10之间的粘液厚度和生长没有差异−−/和WT小鼠(图3B).因此，较薄的黏液层不能解释为什么在IL-10中发现细菌靠近上皮细胞−−/老鼠。
野生型(WT)粘液厚度和白细胞介素10缺乏(IL-10)−−/老鼠)。(A) WT (n=7)和IL-10中初始黏液厚度的体内测量−−/(n = 5)老鼠。测量总黏液厚度(total)，然后吸出黏液并测量剩余黏液厚度(adhesion)。(B) WT (n=5)和IL-10中黏液总厚度随时间增加的体外测量−−/(n = 6)老鼠。(C) WT (n=5)和IL-10中每个上隐窝的杯状细胞数−−/(n = 5)老鼠。(D) WT (n=5)和IL-10抗muc2c3染色结肠切片中杯状细胞膜面积−−/(n = 5)老鼠。数据以均数±SEM表示，采用双尾Mann-Whitney U检验比较WT和IL-10的粘液厚度−−/老鼠。
储存在杯状细胞中的粘液是用来建立和更新分泌黏液层的物质。用IL-10计算隐窝上方100µm的杯状细胞数量−−/和WT小鼠结肠切片。杯状细胞的数量在两者之间没有差异(图3C).通过测量隐窝上部杯状细胞中粘液填充膜的面积来评估粘液的储存量。WT和IL-10在杯状细胞黏液填充的膜面积上无显著差异−−/老鼠(图3D).因此IL-10中可用于分泌的储存粘液没有改变−−/老鼠。
il -10缺乏小鼠的粘液质量有缺陷
在IL-10中，内部黏液并没有变薄−−/相反，我们分析了小鼠粘液对细菌大小的珠子的穿透能力。结肠外植体放置于水平灌注室，分泌黏液20 min;然后将荧光珠(0.5和2µm)放置在形成的粘液上。让小球沉淀40分钟，用共聚焦显微镜确定小球相对于上皮细胞的位置。WT外植体黏液不允许小珠穿透，并使0.5和2微米的小珠与上皮细胞分离(图4A).另一方面，IL-10产生的粘液−−/小鼠无法产生这样的分离(图4A).为了量化粘液穿透性，我们估计了靠近上皮细胞的珠状强度(图4B)在IL-10上−−/在小鼠中，接近上皮细胞的珠状细胞密度为50%，而在WT小鼠中为1%。来自IL-10的粘液−−/小鼠是完全可穿透的，而对照组有约200微米厚的不可穿透的内部粘液(图4C).因此，内部黏液的质量在IL-10中受到损害−−/老鼠。黏液的厚度以含珠的黏液为基础，如IL-10中的黏液−−/鼠标的结肠是非常可穿透的，这就导致在一个较小的值比在图3B，黏液的厚度是基于木炭与黏液表面的结合。
野生型(WT;n=5)和白细胞介素10缺乏(IL-10−−/；n = 5)老鼠。(A)各归一化强度图的代表性z层投影。比例尺为100微米。(B)接近上皮表面的总珠强的百分比(40µm)。使用双尾Mann-Whitney U检验分析两组之间的差异。(C)可穿透黏液与不可穿透黏液的关系。条形图的黑色部分代表不可穿透的粘液，绿色部分代表含有2微米珠子的粘液(即可穿透的)。
正常人体乙状结肠内的细菌与上皮细胞分离良好
如前所述，小鼠结肠有两层粘液系统，其中内层没有细菌，因此我们首先询问人类是否存在相同的组织。接受结肠镜检查的患者在知情同意后被纳入研究。对照患者的临床资料在网上汇编补充表S1。与小鼠结肠一样，测量乙状结肠活检样本分泌物的穿透性，并收集不同组的代表性Z-stack投影和相应的归一化强度图(图5)。对照组患者表现出平均400微米厚的不可穿透(IP)黏液层，将珠粒与上皮细胞分离(图5A, D).为了证实人类结肠粘液形成了与小鼠结肠中观察到的相似的内黏液层，7我们分析了未经泻药预处理的乙状结肠对照样本(图6C, D)。活检样本固定以保存粘液，MUC2免疫染色，DNA反染色以显示细胞核和细菌(FISH探针不能检测到与活检样本相关的所有细菌)。与小鼠相似，观察到一个分层的黏液层，细菌仅存在于黏液的管腔表面。
来自对照组(n=12)和溃疡性结肠炎患者(Mayo 0, n=17, Mayo 1-3, n=11)的人类结肠活检样本的粘液穿透性。(A)各归一化强度图的代表性z层投影。比例尺为100微米。(B)接近上皮表面的总珠强百分比(<120µm)。使用Kruskal-Wallis检验和Dunns校正进行多重比较分析组间的差异(2µm珠子的初步分析p=0.0009, 0.5µm珠子的初步分析p=0.0004)。(C)珠粒与个别患者黏液总厚度的比例。数字是指填写的病人编号表1．(D) 2µm绿珠可穿透黏液与不可穿透黏液的关系。C、控制;M0 IP, Mayo内镜评分为0，粘液不能穿透;M0 P、Mayo评分0、可穿透粘液(患者1、2、12);M1-3, Mayo评分1-3。
固定人体乙状结肠活检标本中黏液填充的杯状细胞和细菌。人类结肠活检样本Carnoy固定以保存粘液，并结合4 '，6-二氨基氨基-2-苯基吲哚(DAPI)对MUC2进行免疫染色，以检测细胞核和细菌中的DNA。(A)在溃疡性结肠炎(UC)患者和对照组的固定切片和mu2染色切片中测定每个上隐窝的杯状细胞数量。(B) UC患者和对照组的固定切片和mu2染色切片测量杯状细胞膜面积。数据以均数±SEM表示，采用Kruskal Wallis检验及Dunn校正多重比较，将UC患者与对照组进行比较。Ctrl,控制;M0 IP，内镜Mayo评分为0，粘液不能穿透的患者;M0 P、Mayo评分0、可穿透粘液(患者1、2、12);M1-3, Mayo评分1-3。(C)人类乙状结肠活检标本MUC2(绿色)和DAPI(蓝色)染色切片。 (a) A biopsy specimen collected and directly fixed from sigmoid colon of a control patient without preceding laxative treatment. (b) A biopsy specimen from a control patient included in the penetrability study who was pretreated with laxatives before colonoscopy. (c) Biopsy specimen from patient with UC pretreated with laxative and with a Mayo endoscopic score of 2 at colonoscopy. Pictures to the right only show the DAPI staining. Bacteria (arrows) are found on the outer surface of the mucus in control patients (a and b). Bacteria are found inside the inner mucus and close to the epithelium in the patient with active UC (c). Some detached cells can be observed (arrowhead). (D) H&E-stained tissue each corresponding to parts a–c in (C). Scale bars are 10 µm (C) and 100 µm (D).
活动性UC患者和缓解期UC患者亚组有可穿透的粘液
考虑到在小鼠结肠炎模型中珠透性的增加与接近上皮细胞的细菌有关，我们询问这是否也适用于UC患者。UC患者被分为两组:缓解组(Mayo内镜评分0分)和活动性组(Mayo内镜评分1-3分)。UC患者的临床信息汇编在表1．活动性疾病患者比缓解期患者表现出更多的炎症相关组织学改变。测量乙状结肠活检标本分泌粘液的穿透性，并收集不同组的代表性Z-stack投影和相应的归一化强度图(图5)。除3例患者的粘液厚度与对照患者相似(Mayo评分为0)外，所有缓解患者(Mayo评分为0)。图5D).相反，大多数活动性UC患者的黏液层较薄，可被珠子穿透。粘液穿透率，以接近上皮细胞的珠粒数量(20µm进入组织，120µm进入管腔)来量化，活动性疾病患者为40%，缓解患者为10%，对照组为接近零(图5B).穿透性与粘液厚度(定义为含珠物质)的个体值呈现异质性，特别是在缓解期患者(Mayo评分为0)(图5C)。有趣的是，三名病情缓解的患者(编号1、2和12)产生的粘液可以穿透珠子。当这些有可穿透粘液(P)的患者与缓解组分开绘制时，IP组看起来像对照组患者，P组看起来像活动期UC患者(Mayo评分1-3)(图5D).因此，正常情况下，人类乙状结肠分泌的粘液密集而厚实，而炎症活动性患者和缓解期患者亚组的粘液较薄且可穿透。粘液质量与硫唑嘌呤治疗无关。测定了上部150µm隐窝中的杯状细胞数量，在任何组中均未观察到差异，这表明处于缓解期或炎症活动性的患者的杯状细胞数量并没有减少(图6A).以膜面积测量的上隐窝杯状细胞中储存的粘液在对照组和缓解期患者之间没有差异(图6B).经鉴定粘液可穿透的缓解期患者(图5B,C)有相似的杯状细胞膜区域，认为正常数量的粘液储存(图6B)。然而，活动性炎症患者的杯状细胞充盈较少，可见较小的膜区(图6B)，这与观察到的更薄的黏液层相对应。
我们最后询问，活动性UC患者粘液质量的差异(允许珠粒沉积到上皮细胞)是否反映了细菌穿透内部粘液。取自于用于穿透性测量的同一个体的活检标本被固定以保存粘液，对MUC2进行免疫染色，对DNA进行反染色以显示细胞核和细菌。这些患者均在常规结肠镜检查前给予口服泻药以清理肠道。这种治疗会影响黏液及其周转，并且固定材料在对照组患者中也显示出更大的体积和结构不佳的黏液(图6cb D-b)。黏液粘附在上皮表面的数量在活检标本之间有所不同，这排除了对所有患者的评估。与服用泻药的对照组患者相比，炎症患者黏液较少，细菌穿透黏液并到达上皮细胞(图6碳碳、直流)。
讨论
如前所述，7正常健康小鼠结肠内黏液层形成隔离细菌与上皮细胞的屏障。这是通过对完整组织的Carnoy固定而没有事先清洗腔内内容物来显示的。我们现在已经研究了许多不同的结肠炎模型，并证实了所有模型中的粘液缺陷。现已证实，肠道细菌对所有这些模型都是必要的，并且微生物群的组成影响炎症的严重程度和结果。muc2缺失的小鼠完全缺乏粘液，并自发发生严重炎症，7，15而其他模型都有或多或少完整的内黏液层，但被细菌穿透。缺乏Core 1的小鼠的Muc2粘蛋白糖基化程度较低，这可能更容易被细菌降解。21DSS对粘液的直接毒性作用诱导炎症。18，28Tlr5−−/小鼠体内黏液层较薄且有缺陷。29缺乏nhe3和IL-10−−/小鼠表现出形态上分层的内黏液层，细菌仍然可以穿透。22，23这些数据表明，受损的黏液层允许细菌渗透，这是导致结肠炎症的潜在机制。
假设结肠内黏液层对结肠屏障功能至关重要，那么较薄的黏液层可能与炎症有关。然而，黏液厚度本身并不是黏液屏障功能的有用指标，例如，缺乏il -10的小鼠有更厚的黏液内层。相反，这些动物表现出粘液分泌增加，可能是为了克服粘液屏障缺陷。
我们现在可以证明，健康人的乙状结肠也有一个内部分层的含有muc2的黏液层，将细菌与上皮细胞分开。以前在发炎的肠道样本中观察到细菌与上皮细胞的接触，但只在固定的活检样本上进行了分析。16，17然后粘液经常丢失或降解，这些问题会阻碍评估。我们现在研究了粘液的保护质量，通过评估其限制小球形颗粒沉降到上皮表面的能力，以说明其排除上皮附近细菌的特性。这是在生理条件下对活的外植体进行的，以获得关于其正常体内功能的信息。在小鼠中，珠粒和细胞之间的距离为~ 200 μ m，这应该与抽吸外层松散黏液层后测量到的~ 50 μ m厚的内层黏液层进行比较。7这些珠子并没有一直下降到50微米，这表明外层黏液层不是均匀的，而且它更密集地靠近内层和外层黏液层之间的边界。这与蛋白质水解活性的预测是一致的，蛋白质水解活性负责从内部密集的黏液层到外部松散的黏液层的转换。7在人类中，分离珠子的粘液约为400微米厚，因此可以预测人类内部黏液层的厚度约为小鼠的两倍。
il - 10的−−/该模型是研究的最古老的结肠炎模型之一，其中炎症可以通过IL-10抗炎作用的丧失来解释。30.促炎启动作用是由先天防御系统的结肠单核吞噬细胞介导的。31il - 10的−−/饲养在我们动物房里的老鼠只表现出轻微的组织学炎症迹象，但仍然有一层粘液，可以穿透珠子和细菌。这证明了黏液特性与免疫系统和产生的细胞因子之间的联系。IL-10对产生黏液的杯状细胞的作用机制尚不清楚，但杯状细胞的数量和带有黏液颗粒的膜的大小与WT小鼠无差异。这意味着变化与粘液量无关，可能暗示了其他机制。粘液的组织和分泌时的扩张取决于外部环境，改变可能会产生毁灭性的影响。13，32粘液组织也是额外交联和处理的结果，其中的缺陷也可能有助于鉴定出可穿透的粘液。
UC不是由致病菌引起的，而是对正常微生物群的异常反应的结果，可能与生态失调有关。3.，4，33，34抗生素治疗和粪便偏移有时对结肠炎患者有益，35，36尽管降低与上皮细胞接触的共生细菌负荷的重要性的最佳论据是基于小鼠研究。表面上皮细胞层可能可以承受和处理一些细菌，但可能很难长期承受大量的直接细菌接触。广泛的细菌接触会导致细菌泄漏到组织中，这可能会触发上皮下适应性免疫系统。
大多数处于缓解期的UC患者(Mayo评分为0)与对照组患者一样，有一层厚厚的内层粘液，荧光珠无法穿透。然而，其中3例患者的粘液或多或少完全被珠子穿透，但与IL-10相比，杯状细胞膜面积没有缩小−−/老鼠。其中2例患者为原发性硬化性胆管炎。由于所有自发的小鼠结肠炎模型都有粘液可被细菌穿透，因此可以预期，一些UC患者可能也有粘液缺陷，使其粘液的保护作用减弱。在活动性结肠炎患者中观察到的黏液改变的原因可能是黏液分泌增加，如相同数量但填充不充分的杯状细胞所示——观察到更小的膜面积或更多空的杯状细胞——PAS染色后描述为杯状细胞耗竭。这一特征主要归因于更严重的炎症组织，而在非活动性疾病或炎症程度较低的IL-10中没有观察到−−/动物。由于庞大的MUC2聚合网络的生成是耗时且困难的，在炎症中，高需求和快速周转可能会产生质量较差的粘液。37最近对结肠缺血的研究证明了这一点，再灌注清空隐窝杯状细胞，同时清除细菌。38在此之后，杯状细胞在许多小时内都不会被重新填充，另一个挑战将无法有效处理。黏液胶内黏液粘稠度较低的黏液胶可能更容易穿透，但可能涉及其他更复杂的机制。引起和维持UC的遗传和环境因素可能很多。我们的观察表明，内部黏液及其屏障功能是限制细菌与上皮细胞接触的重要因素，该系统的缺陷可能引发炎症。结肠粘液的性质也被证明是动态的，可能是由细菌和宿主因素使用部分已知机制调节的。了解这些机制可能为延长UC患者的缓解期提供新的方法。
致谢
赫伯特·海兰德医生和马茨·伍尔夫医生接受病理检查。
参考文献
补充材料
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脚注
贡献者MEVJ和GCH构想了最初的想法。MEVJ, JKG, JH-L, HS, KSJ和GCH设计研究，分析数据并撰写手稿。MEVJ、JKG和JH-L进行了实验，并对数据进行了分析。LX、HX、FKG、FAC和ATG提供转基因小鼠组织。KSJ和HS对患者进行分析。
资金这项工作得到了瑞典研究委员会(No 7461,21027)，瑞典癌症基金会，克努特和Alice Wallenberg基金会，IngaBritt和Arne Lundberg基金会，Sahlgren大学医院(LUA-ALF)， Wilhelm和Martina Lundgren基金会，Torsten och Ragnar Söderbergs Stiftelser, Sahlgrenska学院，美国国立卫生研究院(U01AI095473, R01DK073638，内容仅为作者的责任，并不一定反映美国国立卫生研究院)，瑞典战略研究基金会-固有免疫计划的粘液细菌结肠炎中心(MBC)和Assar Gabrielsson基金会。
相互竞争的利益一个也没有。
伦理批准所有的动物研究都得到了哥德堡大学、埃姆罗伊大学、亚利桑那大学和俄克拉何马大学动物伦理委员会的批准。人体研究得到了哥德堡大学人类研究伦理委员会的批准。
病人的同意获得的。
出处和同行评审不是委托;外部同行评审。