条文本
PDF
摘要
背景在发展中国家，建议婴儿在家中进行铁强化，以控制贫血，但低吸收通常会导致80%的铁进入结肠。铁是许多致病性肠杆菌生长和毒力所必需的。我们测定了高剂量和低剂量家庭铁强化对婴儿肠道菌群和肠道炎症的影响。
方法我们对6个月大的肯尼亚婴儿(n=115)进行了两项双盲随机对照试验，这些婴儿连续4个月每天食用家庭强化玉米粥。在第一组实验中，婴儿接受含有2.5毫克铁的微量营养素粉(MNP)作为NaFeEDTA或不含铁的微量营养素粉。在第二组中，他们分别接受含有12.5毫克铁的富马酸亚铁的MNP和不含铁的MNP。主要结果是通过16S焦磷酸测序和靶向实时PCR (qPCR)分析肠道微生物组组成。次要结局包括粪便钙保护素(肠道炎症的标志)和腹泻发生率。我们分别分析了试验和合并。
结果在基线时，总微生物16S rRNA的63%可以被分配Bifidobacteriaceae但病原体的发病率很高，包括沙门氏菌梭状芽胞杆菌难相处的，梭状芽胞杆菌perfringens和致病性大肠杆菌．使用焦磷酸测序，+FeMNPs增加了肠道细菌，特别是埃希氏杆菌属/志贺氏杆菌(p=0.048)，肠杆菌/双歧杆菌比值(p=0.020)梭状芽胞杆菌(p = 0.030)。这些效应大部分通过qPCR得到证实;例如，+FeMNPs增加了致病性大肠杆菌菌株(p = 0.029)。+FeMNPs也增加了粪便钙保护素(p=0.002)。试验期间，阳性12.5 mgFeMNP组的27.3%的婴儿需要治疗腹泻，阴性12.5 mgFeMNP组的8.3%需要治疗腹泻(p=0.092)。两组均未发生与研究相关的严重不良事件。
结论在这种情况下，向断奶婴儿提供含铁的MNPs会对肠道微生物群产生不利影响，增加病原体的丰度并引起肠道炎症。
试验注册号码NCT01111864。
- 铁营养
- 肠道细菌微生物区系
- 婴儿肠道
- 肠道炎症
- 致肠病的大肠杆菌
来自Altmetric.com的统计
本研究的意义
关于这个问题，我们已经知道了什么?
婴儿肠道菌群的组成可能因膳食铁的供应而不同，但大多数数据来自培养方法，或来自动物实验。
建议发展中国家的婴儿在家中进行铁强化，以控制贫血，但低吸收通常会导致80%的铁进入结肠。
最近在发展中国家的婴儿中进行的两项铁强化试验引起了安全方面的担忧:在加纳，可能因腹泻而住院的比率增加了，在巴基斯坦，腹泻的总体患病率虽小但显著增加。
关于非洲婴儿在断奶期间肠道菌群的组成，以及在这个年龄强化铁的影响，我们知之甚少。
新的发现是什么?
这是第一个检验铁强化对非洲婴儿肠道微生物群影响的对照干预试验。
强化铁可以改变非洲断奶婴儿的肠道微生物群，增加肠道细菌数量，减少双歧杆菌数量，并增加特定肠道病原体的丰度，例如致病性细菌大肠杆菌．
非洲断奶婴儿铁强化增加粪便钙保护素水平，表明肠道炎症。
这些数据为在最近的婴儿强化研究中看到的腹泻增加提供了一个可能的机制。
在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?
我们的研究结果表明，在获得更安全的配方之前，不应向所有婴儿提供铁强化剂，而应仅针对明显缺铁性贫血的婴儿，同时提供预防腹泻的充分保护。
简介
虽然婴儿患缺铁性贫血(IDA)的比率最高，但他们也是普遍强化规划覆盖较少的群体。烹饪后直接添加到辅食中(家庭强化)的微量营养素粉是提供额外膳食铁和降低贫血率的有效方法。1目前，包括撒哈拉以南非洲10个国家在内的36个国家正在实施或计划实施家庭强化规划。2
然而，含铁MNPs (+FeMNPs)的安全性是不确定的。2007年世卫组织就补充铁和叶酸增加儿童死亡率的彭巴试验结果举行了一次磋商，3.由于担心感染可能增加，不建议在疟疾流行地区使用+FeMNPs。4最近的两项强化试验在婴儿中使用含有12.5毫克富马酸亚铁的多溴代磷酸钠，这引起了人们对安全的担忧:在加纳，可能因腹泻而住院的人数增加了，5在巴基斯坦，腹泻、血性腹泻和呼吸系统疾病的总体患病率虽小但显著增加。6早前的一项系统综述得出结论，补充铁，而不是强化铁，可能会增加腹泻的风险。7如果+FeMNPs增加了感染和腹泻病的风险，这将是一个重要的不利影响，因为腹泻导致撒哈拉以南非洲五岁以下儿童死亡的比例约为九分之一。8
大多数以谷物和豆类为基础的辅食的食物基质富含植酸，这是一种有效的铁吸收抑制剂;因此，通常这些食物中只有不到20%的铁被吸收。9，10在炎症和感染水平较高的非洲农村人口中，吸收可能更低，因为炎症增加了循环的主要铁调节剂hepcidin，它通过结合和降解肠细胞基底外侧膜上的铁外排蛋白、运铁蛋白来减少膳食铁的吸收。11因此，向同时患有炎症的个体提供+FeMNPs会导致大部分铁离子未被吸收进入结肠。一旦被吸收，体内的铁与限制铁进入潜在病原体的蛋白质结合，在感染期间，铁在细胞外室的供应进一步减少，保留在巨噬细胞和肠细胞中。12虽然中性的pH值和防御分子，如脂钙素2的存在，13可能降低铁的溶解度和对肠道微生物的可利用性。
对许多肠道细菌来说，铁是一种必需的、限制生长的营养物质，与食物中未被吸收的铁竞争。14对于大多数肠道革兰氏阴性菌(如沙门氏菌，志贺氏杆菌或致病大肠杆菌)，铁的获取在毒力和定植中起着重要作用。15相比之下，乳酸菌，一组主要有益的“屏障”细菌，改善肠道完整性，减少肠道病原体的定植，16不需要铁，而是依靠锰。17因此，通过强化或补充膳食中未吸收铁的增加可以改变结肠菌群平衡，有利于致病菌株的生长，而不是“屏障”菌株。
人类胃肠道的定植始于出生，取决于分娩方式、卫生和早产。18母乳中的铁结合蛋白，乳铁蛋白，限制了铁对肠道菌群的可用性，19可能对母乳喂养的婴儿有保护作用。随着补充喂养的引入，母乳喂养的婴儿相对简单的肠道菌群进一步多样化。20.在一项比较美国、委内瑞拉和马拉维婴儿肠道菌群的研究中，不同地点之间存在显著差异，但一个共同的模式是双歧杆菌在生命的第一年占主导地位，此后，双歧杆菌稳步减少，导致在大约3岁时建立一个类似成年人的肠道菌群。21
在Côte d’ivvoire的一项学童铁强化对照试验中，铁增加了肠道细菌和肠道炎症，减少了乳酸菌。22在对欧洲婴儿用培养方法进行的较早的研究中，铁引起了大肠杆菌双歧杆菌的减少，23伴随着更高的计数拟杆菌．24最近一项针对美国婴儿(n=14)的小型研究报告称，通过强化谷物或肉类提供铁的辅助性喂养方案，增加了铁细菌性的双歧杆菌减少，Lactobacillales而且罗思氏菌属．25在巴基斯坦的婴儿中，+FeMNPs导致气单胞菌属与未补充的对照组比较。6
我们的研究目的是确定两种广泛使用的高剂量和低剂量+FeMNPs对肠道微生物组的影响，使用16S rRNA焦磷酸测序和靶向实时PCR(定量PCR, qPCR)，以及肯尼亚易患腹泻病婴儿的肠道炎症。我们的假设是:铁强化可以:(1)增加粪便肠杆菌及其与双歧杆菌和/或乳酸菌的比例;(2)有利于潜在病原体的定植;(3)增加肠道炎症。
材料和方法
研究地点和参与者
这项研究是在肯尼亚南部沿海的Msambweni县进行的。这是一个疟疾流行地区，2006年有40%的儿科住院病人是由于疟原虫感染。26该地区从4月到7月的雨季很长，从10月到11月的雨季很短。农业是这个人口稀少地区的主要经济活动，玉米是主要粮食作物。当地典型的断奶食品是液体玉米粥，' uji ';一份普通的玉米粉约8-10克，用100-150毫升的水煮沸，加糖。
在基科内尼保健中心的集水区，我们不断招募5.5个月大的婴儿。我们从2010年3月到2011年9月招募了80名婴儿，并随机分配他们接受含或不含2.5 mg铁作为EDTA铁钠的MNP (NaFeEDTA，±2.5 mg femnp, MixMe, DSM欧洲营养产品，巴塞尔，瑞士)。从2011年9月到2012年5月，我们招募了80多名婴儿，并随机分配他们接受含或不含12.5 mg铁作为富马酸亚铁的MNP(±12.5 mg femnp, Sprinkles, Hexagon Nutrition, Mumbai)。MNPs的组成如图所示表1．入选标准为婴儿5.5月龄(±3周)，母亲至少≥15岁，婴儿血红蛋白(Hb)≥70 g/L，无母婴慢性疾病。MNPs被包装在分组编码的小包装中(包含一天的剂量)。
研究设计
在干预之前，我们进行了三角感觉测试27在当地成年人中(n=25‰)。在这些测试中，+FeMNPs与相应的−FeMNPs难以区分，它们的可接受性很高(数据未显示)。
训练有素的实地工作人员指导母亲们如何用MNPs烹饪“uji”及其防御工事。此外，参与研究的母亲还接受了关于在家中收集婴儿粪便样本的培训。在开始MNPs干预之前，我们进行了2周的磨合期，让家庭熟悉粪便收集方法和玉米粥的介绍。
然后，连续4个月，我们每周从6个分发点直接向参与的母亲分发7袋MNP小包和2公斤玉米粉(肯尼亚蒙巴萨的多拉、基图伊面粉厂)。我们用原子吸收光谱法分析了三份玉米面粉样品的铁浓度和植酸含量28，29在苏黎世联邦理工学院。在每周分发期间，现场工作人员收集前一周用过和未用过的MNP小袋，以评估依从性，并通过多项选择问卷记录婴儿的喂养史和健康状况。如果一位母亲报告了任何疾病，专门的研究护士将对孩子进行检查，并记录治疗后的疟疾、腹泻和呼吸道感染(RTI)发作。研究护士使用强制选择问卷来记录基线时(包括最后3个月)和4个月后(包括整个干预期)的疟疾、腹泻和呼吸道感染治疗病例。
肠道微生物群，短链脂肪酸(SCFA)和粪便钙保护蛋白
分别于基线、3周和4个月时采集粪便样本。研究人员为这些母亲提供了塑料尿布、容器、抹刀、Anaerocult小包(德国达姆施塔特默克KGaA公司)，以产生厌氧环境，一个猎鹰管，用于测量8毫升水，以润湿Anaerocult，以及一本插图小册子，以加强采样说明。早晨收集粪便标本，保持无氧，同等份于当天- 20°C冷冻。
以下材料和方法的完整描述可在在线补充材料和方法中找到:DNA提取、16S rRNA焦磷酸测序肠道微生物组分析、靶向qPCR和短链脂肪酸(SCFA)测量。
生化指标
在基线时，4个月(±12.5 mgFeMNP)和6个月(±2.5 mgFeMNP)后，使用肝素抽真空器和蝴蝶针抽取静脉血样本。血清在采集日分离并冷冻。
测定了以下参数，这些参数的完整描述可在在线补充材料和方法中找到:血红蛋白(Hb)、锌原卟啉与血红素比(ZPP)、血清铁蛋白(SF)、可溶性转铁蛋白受体(sTfR)和c反应蛋白(CRP)、血清hepcidin-25、体铁储备、血清IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IFNγ、tnf - α、gm集中性刺激因子(CSF)、IL-12 (p40/p70)和IL-17。(1)贫血:Hb <110 g/L;30.(2) ID:体铁储存量<0 mg/kg31(3)炎症反应:CRP≥4.1 mg/L(厂商参考范围)。
人体测量指标
在基线和4个月后，使用悬挂称记录婴儿体重(Salter 235-6S, 25 kg×100 g;Salter Brecknell，英国)和长度使用测量板(Shorr Production, Olney, Maryland, USA)。我们计算了年龄体重(WAZ)、年龄身高(HAZ)、身高体重(WHZ)和年龄体重指数(bmi;使用世卫组织Anthro软件的z分数。32
统计分析
基于我们小组之前对学童肠道菌群的研究22和年轻人,33我们估计每组25-30名受试者的样本量，考虑到三个微生物组的SD为1.09-1.37，α=0.05， β=0.8，我们检测到肠杆菌、乳酸菌和双歧杆菌的相关差异约为0.85 log number of copies/g粪便。
通过比较时间变化来评估铁对肠道微生物组的纵向影响(通过烙铁测序进行评估)，计算方法是用4个月或3周时一个分类单元的相对丰度除以基线时一个分类单元的相对丰度，并进行后续的Mann-Whitney U检验(MWU)。用MWU比较横截面差异。以基线值为协变量的单变量一般线性模型(GLM)评估铁对肠道菌群的干预效果(通过qPCR评估)、铁状态和人体测量学。统计方法和所用软件的完整描述可以在在线补充材料和方法中找到。
道德方面
本研究获得肯雅塔国立医院/内罗毕大学伦理和研究委员会(P167/6/2009和P168/05/2011)和苏黎世联邦理工学院(EK 2009-N-53)的批准。婴儿的看护人给出了书面知情同意。一个数据安全监测委员会，包括一名儿科医生和一名营养学家，对这项研究进行了安全监测。
结果
我们估计的样本量为100-120个婴儿，我们将115个婴儿纳入研究(图1试验资料)。我们最初招募了160名婴儿，但在2周的试验期间，21名婴儿被排除在外，因为他们在前2个月接受了抗生素，24名婴儿没有提供足够的基线粪便样本。在研究期间，另有11名婴儿被排除在外，因为他们接受了抗生素，或无法提供足够的粪便样本。在这种情况下，抗生素的使用出人意料地高;这是当地的护理标准。由于工厂在第二批±2.5毫克的femnp香囊中存在标签错误，3名婴儿接受了混合处理并被排除在外。因此，最终分析完成了101名婴儿:28名来自+2.5 mgFeMNP, 21名来自−2.5 mgFeMNP, 26名来自+12.5 mgFeMNP, 26名来自−12.5 mgFeMNP。
试验资料。
贫血、铁缺乏(体内铁储备为阴性)和全身炎症的基线患病率分别为67.3%、25.5%和29.7%。几乎所有的婴儿仍在接受母乳喂养(99.0%)，但80.2%的婴儿已经开始吃辅食，主要是“uji”，平均在4个月大的时候开始。±2.5 mgFeMNP的符合性为99.4%，±12.5 mgFeMNP的符合性为96.2%。玉米粉中天然铁和植酸的含量分别为1.15±0.06 mg / 100 g和310±20 mg / 100 g。
基线婴儿肠道菌群及其随时间的发展
共分析了934 853条细菌16S rRNA序列。在基线时，婴儿肠道微生物组包括放线菌门(64.3%)、厚壁菌门(22.4%);包括4.7%乳酸菌)、拟杆菌(8.9%;包括3.6%拟杆菌和4.3%普氏菌)和变形菌门(4.1%;包括3.3%大肠杆菌、志贺氏杆菌）;被家族牢牢控制Bifidobacteriaceae，占16S rRNA总数的63.0% (图2)．基线贫血状态对婴儿的系统发育多样性没有显著影响(数据未显示)。然而，探索性分析显示，在基线时，贫血和非贫血婴儿之间的分类有显著差异:非贫血婴儿具有较低的丰度普氏菌(2.0% vs 4.5%， p=0.014)放线菌目(0.14% vs 0.09%， p=0.004)和链球菌(6.3% vs 3.9%， p=0.023) (图3)．
通过16S rRNA焦磷酸测序枚举的6个月肯尼亚婴儿的基线肠道微生物组(n=101)。在分类单元名称下面给出了归属于特定分类级别的16S rRNA reads的百分比(%)。
6个月肯尼亚贫血和非贫血婴儿基线肠道微生物组组成的差异。节点代表类群;边连接着不同的分类层次。按贫血和非贫血的相对丰度之比的2log计算(0=贫血状态之间无差异，1=非贫血的丰度是前者的两倍)。显著性用贫血和非贫血婴儿样本的Mann-Whitney U检验的p值表示。节点大小与相对丰度相对应。如果一个分类单元(即节点)符合以下标准，就会包括在这个可视化图中:所有样本的平均相对丰度为该分类单元的0.1%，研究组的折叠差异至少为0.1，显著性p<0.05，或者该分类单元有一个孩子(即更具体的分类学分类)满足标准。
3周后，所有粪便样本的系统发育多样性增加(p=0.004)， 4个月后进一步增加(p=0.005，见在线补充图S1)。整个研究的冗余分析发现:(1)肠道微生物组成的个体间差异较大(p=0.001);(2)贫血和非贫血婴儿肠道菌群差异显著(p=0.031);(3)两项MNP试验婴儿肠道菌群差异显著(±2.5 mgFeMNP和±12.5 mgFeMNP, p=0.015)。此外，还发现了强烈的时间特异性特征(p=0.001)。性别、干预开始的季节和补充喂养开始的日期对肠道微生物群没有显著影响。
−FeMNP组婴儿从基线(6月龄)到终点(10月龄)的肠道微生物组组成随时间的显著变化见在线补充图S2。这些变化包括Faecalibacterium而且普氏菌，和减少肠杆菌科(p=0.010, p=0.006, p=0.002)。
铁强化期间婴儿肠道微生物组的组成
+FeMNP与−FeMNP对肠道微生物群的系统发育多样性没有显著的影响(见在线补充图S1)。联合±FeMNP组和单独分析±2.5 mgFeMNP和±12.5 mgFeMNP在终点处的肠道微生物群差异见图4得了。±FeMNP组与±2.5 mgFeMNP和±12.5 mgFeMNP之间的分类单元相对丰度随时间的变化见图5i-vi。与+FeMNP和−FeMNP相比，该属的丰度显著更高梭状芽胞杆菌,埃希氏杆菌属/志贺氏杆菌(p=0.033, p=0.010)，有降低丰度的趋势双歧杆菌属(p=0.085)在阳性FeMNP组(图4A).此外，厚壁菌门的+FeMNP和- FeMNP相对丰度随时间的变化(4个月vs基线)显著不同，大肠杆菌、志贺氏杆菌,梭状芽胞杆菌(p=0.034, p=0.030, p=0.048;图5》)。+2.5 mgFeMNP与−2.5 mgFeMNP相比，该属的丰度显著提高埃希氏杆菌属/志贺氏杆菌(p=0.044)和上升的趋势Roseburia(p=0.083)在端点处+2.5 mgFeMNP与−2.5 mgFeMNP (图4B)。此外，相对丰度随时间的变化(4个月vs基线)，+2.5 mgFeMNP与−2.5 mgFeMNP显著不同大肠杆菌、志贺氏杆菌(p = 0.034;图5iv).与+12.5 mgFeMNP相比，厚壁菌门的丰度显著高于−12.5 mgFeMNP (p=0.018)，拟杆菌(p=0.045)，呈较高丰度的趋势梭状芽胞杆菌物种(p = 0.052)埃希氏杆菌属/志贺氏杆菌(p=0.067)，丰度显著降低双歧杆菌属(p=0.047)在端点处+12.5 mgFeMNP vs - 12.5 mgFeMNP (图4C)。此外，厚壁菌门的相对丰度随时间的变化(4个月vs基线)，+12.5 mgFeMNP显著高于-12.5 mgFeMNP (p=0.046;图5V)，对的下降幅度明显更大双歧杆菌属(p = 0.049,图5(六)。
接受含铁微量营养素粉(+FeMNP)与不含铁微量营养素粉(−FeMNP)的肯尼亚婴儿4个月后肠道微生物组成的差异。(A) +FeMNP vs - FeMNP;(B) +2.5 mgFeMNP vs - 2.5 mgFeMNP;(C) +12.5 mgFeMNP vs - 12.5 mgFeMNP。节点代表类群;边连接着不同的分类层次。成倍增加的计算方法为+FeMNP和- FeMNP中相对丰度比值的2log(0=组间无差异，1= +FeMNP中丰度的两倍，等等)。显著性用Mann-Whitney U检验的p值表示。节点大小对应于相对丰度(%)。显示的分类是根据我们主要感兴趣的目标列表选择的。
从基线到4个月，+FeMNP和−FeMNP婴儿在4个月时的分类差异显著。盒图(i - vi)报告了从基线到终点随时间的显著变化(i: p=0.0.034, ii: p=0.030, iii: p=0.048, iv: p=0.034, v: p=0.046, vi: p=0.049)，在终点的类群是不同的(对应的罗马数字和颜色)图4)．以10 - 90个百分位显示2log比率的箱线图(0=两个时间点没有差异，1= 4个月时丰富了一倍，等等)。
通过qPCR分析比较+FeMNP和−FeMNP，发现铁对肠杆菌有边缘显著的影响(p=0.061)，在终点处+FeMNP(8.9±0.3 log数基因拷贝数/g粪便)比−FeMNP(8.0±0.4)浓度更高。此外，治疗效果显著Roseburia物种/真细菌rectale(p=0.020)，阳性FeMNP浓度(4.4±0.4)低于阴性FeMNP(5.8±0.4)。在对两种MNPs的单独分析中，发现了显著的处理效应Roseburia物种/E rectale±12.5 mgFeMNP (p<0.0001)，端点处+12.5 mgFeMNP(3.2±0.4)浓度低于−12.5 mgFeMNP(6.2±0.5)浓度;治疗效果显著真细菌hallii±2.5 mgFeMNP (p=0.009)，终点处+2.5 mgFeMNP(8.4±0.6)的浓度高于−2.5 mgFeMNP(7.1±0.5)。
在所有分析的粪便样本中检验铁对致病性肠道菌群的影响，我们发现蜡样芽胞杆菌在39.5%(平均检测样本:4.6 log拷贝/g粪便(范围:3.3-7.2))中，金黄色葡萄球菌65.4% (6.6 (3.0-10.0))，艰难梭状芽胞杆菌56.5%(7.2(3.4-10.4))的成员perfringens梭状芽胞杆菌89.7%(7.7人(3.1-10.4人));沙门氏菌占22.4%(5.7(4.4-7.9))和霍乱弧菌在0%。此外，我们检测到肠致病性大肠杆菌(EPEC)在65.0%(检测样本中平均:6.0 log copies/g粪便(范围:3.2-9.3))中，具有肠毒素大肠杆菌产热稳定性毒素(ETEC LT)占49.2%(6.0(3.0-10.5))，产热稳定性毒素(ETEC ST)占7.0%(5.7(3.5-8.7))，肠出血大肠杆菌产志贺样毒素1 (EHEC stx1)占9.6%(4.7(3.4-7.4))，产EHEC stx2占8.5%(4.6(3.6-6.3))。对致病性总和有显著的治疗效果大肠杆菌在终点处(p=0.029)，阳性FeMNP(6.0±0.5 log numbers of copies/g粪便)浓度高于阴性FeMNP(4.5±0.5)。在对两种MNPs的单独分析中，对致病菌总数有显著的处理效果大肠杆菌在中点(p=0.012)和终点(p=0.043)， +2.5 mgFeMNP(4.9±0.7)相对于−2.5 mgFeMNP(7.0±0.5)短暂较低，在终点+2.5 mgFeMNP(6.5±0.6)相对于−2.5 mgFeMNP(4.1±0.8)较高。铁对致病性无影响大肠杆菌可在±12.5 mgFeMNP中检测到。致病的总和增加了大肠杆菌通过铁强化在基线铁缺乏的婴儿中显著(p=0.012)，但在铁充足的婴儿中不显著(p=0.327)。
图6A-D为经焦磷酸测序和qPCR分析的肠杆菌、双歧杆菌和乳酸菌的丰度比。使用磷酸磷酸测序，在+FeMNP和−FeMNP中，从基线到终点，肠杆菌和双歧杆菌的相对丰度比值随时间发生了显著变化(p=0.020;图6A).在终点，+FeMNP与−FeMNP的肠杆菌与双歧杆菌比例显著高于(p=0.004);同样，在单独分析MNPs时，与各自的对照组相比，+2.5 mgFeMNP和+12.5 mgFeMNP的肠杆菌与双歧杆菌的比值显著高于终点时的对照组(p=0.030)。qPCR分析证实了这一点，在终点处，与−FeMNP组相比，+FeMNP组肠道细菌与双歧杆菌的比例有显著影响(p=0.008，图6B);在±2.5 mgFeMNP (p=0.053)和±12.5 mgFeMNP (p=0.098)的单独分析中呈显著效应趋势。使用磷酸磷酸测序，从基线到终点，+FeMNP中肠杆菌和乳酸菌的相对丰度比在3周时暂时下降(p=0.018)后，没有随时间变化;然而，在终点处，+FeMNP组肠杆菌与乳酸菌的比例显著高于对照组(p=0.023;图6C).使用qPCR，与−FeMNP相比，阳性FeMNP在终末检测到肠杆菌与乳酸杆菌比例较高的类似趋势(p=0.062，图6D)。此外，分别对±2.5 mgFeMNP和±12.5 mgFeMNP进行的磷酸磷酸测序分析显示，在终点处，+12.5 mgFeMNP与−12.5 mgFeMNP的肠杆菌与乳酸菌的比例显著高于显著的边缘(p=0.055)，但在3周后出现暂时下降(p=0.021);但在任何时间点，+2.5 mgFeMNP与−2.5 mgFeMNP之间没有差异。
基线、3周和4个月时婴儿肠杆菌与双歧杆菌的比率，比较+FeMNP和−FeMNP，通过(A)磷酸磷酸测序(相对丰度的log2比值);(B) qPCR(拷贝数/g粪便的对数比)。通过(C)焦磷酸测序法测定婴儿肠杆菌与乳酸菌的比例;和(D) qPCR。箱线图显示10 - 90个百分位。组间(+FeMNP和−FeMNP)差异显著:(A)从基线到终点的比值随时间的变化在组间差异显著(p=0.020);在终点，+FeMNP与- FeMNP的比值显著高于(p=0.004)。(B) 4个月时，使用一般线性模型(GLM)并根据基线差异进行调整后，组间比值显著不同(p=0.008)。(C)从基线到3周的比值随时间的变化有显著差异(p=0.018)，但从基线到终点的比值随时间的变化在+FeMNP与−FeMNP之间无差异;在终点处+FeMNP与−FeMNP的比值显著高于终点处(p=0.023)。 (D) the ratios were borderline significantly different between groups at 4 months using GLM and adjusted for baseline differences (p=0.062).
粪便钙保护蛋白，SCFAs，铁状态和全身炎症
在终点，通过粪便钙保护蛋白评估，接受+FeMNP(229.2±1.9 μ g/g)的婴儿肠道炎症明显高于接受−FeMNP(123.3±2.1 μ g/g, p=0.002)的婴儿。在单独的MNPs分析中，+12.5 mgFeMNP组(248.9±2.2µg/g)显著高于−12.5 mgFeMNP组(102.5±2.2µg/g, p=0.008)，而+2.5 mgFeMNP组(215.6±1.6µg/g)显著高于−2.5 mgFeMNP组(165.6±1.8µg/g, p=0.164。图7)．在基线铁充足的婴儿中，通过铁强化，粪便钙保护素增加显著(p=0.0002)，但在缺铁婴儿中不显著(p=0.912)。粪便钙保护素与通过焦磷酸测序评估的整体肠道微生物组组成无显著相关性。qPCR结果显示，粪便钙保护蛋白与所有共生菌均无相关性，但与致病菌总数有相关性大肠杆菌(p=0.011, t=0.177)，肠杆菌(p=0.008, t=0.201)，和成员c . perfringens3周时组(p=0.007, t=−0.206)，4月时EPEC组(p=0.024, t=0.190)。在干预期间，+FeMNPs和−FeMNPs之间的粪便乙酸、丙酸或丁酸浓度无显著差异(见在线补充表S2)。
在-FeMNP组与+FeMNP组、−2.5 mgFeMNP组与+2.5 mgFeMNP组、−12.5 mgFeMNP组与+12.5 mgFeMNP组的综合数据中，基线和4个月时的婴儿粪便钙保护素浓度。使用一般线性模型和基线变量作为协变量，在试验过程中，±12.5 mgFeMNP组(p=0.008)和合并MNP组(±FeMNP, p=0.002)之间的值存在显著差异。箱线图显示10 - 90个百分位。
+12.5 mgFeMNP与−12.5 mgFeMNP对体铁(p=0.001)、SF (p=0.004)、sTfR (p=0.008)、ZPP (p=0.039)有显著的治疗效果，对hepcidin-25有影响的趋势(p=0.052，参见在线补充表S3)。相比之下，+2.5 mgFeMNP与- 2.5 mgFeMNP对任何铁状态指标或hepcidin-25没有显著的治疗效果。+FeMNP对血清CRP(见在线补充表S3)或血清IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-17、IFNγ、tnf - α或GM-CSF均无治疗效果(数据未显示)。+2.5 mgFeMNP比−2.5 mgFeMNP对IL-12有显著的作用，+2.5 mgFeMNP对IL-12的作用更高(53.6±1.5 μ g/g vs 431.9±1.4 μ g/g, p=0.028)。
增长
铁对体重增加没有显著的治疗效果。然而，我们发现+FeMNPs的线性增长显著增加(终点为70.2±1.1 cm vs 68.5±1.1 cm, p=0.017，见在线补充表S3)。这种效应在±12.5 mgFeMNP的婴儿中显著(70.2±1.1 cm vs终点68.1±1.1 cm, p=0.011)，但在±2.5 mgFeMNP的婴儿中不显著。线性生长与肠道菌群或粪钙保护素无关。
发病
在登记时，19.2%的母亲报告说，在过去3个月内，她们的婴儿有过一次腹泻治疗，29.7%的母亲有过一次呼吸道感染治疗，3.8%的母亲有过一次疟疾治疗。在干预期间，阳性FeMNP与阴性FeMNP治疗的RTI和疟疾发病率无显著差异。然而，阳性12.5 mgFeMNP组与阴性12.5 mgFeMNP组治疗后腹泻发作的发生率呈较高趋势:分别为27.3% (n=6/22)和8.3% (n=2/24, p=0.092)。
讨论
这项研究表明，在非洲农村6个月大的母乳喂养婴儿中，肠道微生物群主要由Bifidobacteriaceae，但含有许多革兰氏阴性和革兰氏阳性病原体。我们的研究结果表明，MNPs中的铁有利于这些潜在致病亚群的生长。与此同时，铁降低了双歧杆菌的丰度，使肠道微生物平衡从有益的“屏障”菌株转向可能更具致病性的菌株。这伴随着肠道炎症的增加。我们在肯尼亚婴儿中发现的结果与最近在Côte d’ivory的学龄儿童中进行的对照试验结果相类似，该儿童每天接受含有20毫克铁的铁强化饼干作为电解铁，持续6个月。22在该环境下，电解铁的预期吸收<5%，在铁强化组中，贫血或缺铁没有减少。虽然该研究是二次分析，但只使用了qPCR方法，作者没有报告特定病原体的增加;研究确实证明，强化铁可以广泛地改变肠道菌群，增加肠道细菌，减少乳酸菌，同时增加肠道炎症，通过粪便钙保护素测量。这两项研究之间的差异可能是由于婴儿和较大儿童之间肠道菌群的年龄相关差异，但也可能反映了用于表征肠道菌群的方法的差异、地理环境的差异，以及可能的铁化合物和/或剂量的差异。最近在居住在供水改善和食物污染风险较低地区的中低收入南非学童中进行的一项高剂量铁补充试验，34支持环境变量调节铁对肠道炎症和肠道菌群的影响的建议。尽管铁的剂量很高，但通过粪便钙保护素测量的肠道炎症和通过qPCR评估的肠道菌群没有可测量的影响。总的来说，这些数据表明，在卫生标准较低的环境中，补充或强化铁对儿童肠道菌群和肠道炎症的影响更明显，而微生物群很可能被机会性肠病原体占据。
在目前的研究和科特迪瓦的研究中，22肠杆菌比双歧杆菌和/或乳酸菌更容易生长，这可能是由于它们不同的铁需求和代谢。许多致病性肠杆菌需要铁获取细菌的毒性35，36和/或胃肠道定植。37只有少数细菌不需要铁，其中乳酸菌是主要的细菌群。17乳酸菌不产生铁载体，在含铁和不含铁的培养基中生长相似。38双歧杆菌谕令是母乳喂养婴儿中的一种重要双歧杆菌，它可以利用二价金属渗透酶隔离腔内铁，39，40但大多数双歧杆菌不产生铁载体或其他活性铁载体。结肠中丰富的双歧杆菌、乳酸菌和其他有益细菌对病原体的定植和入侵提供了重要的“屏障效应”。17，41，42我们的研究结果表明+FeMNPs削弱了这种保护作用。如果+FeMNPs促进肠细菌的扩张，这可能是重要的，因为密切相关的物种的丰度可以预测致病菌肠道定植的敏感性。43在我们的研究中，这种效应可能鼓励了该属潜在致病成员的定植大肠杆菌、志贺氏杆菌在终点的+FeMNP组中该属的丰度较高，特别是在五种致病菌中大肠杆菌亚组(EPEC, ETEC LT, ETEC ST, EHEC stx1，和stx2)。
钙保护蛋白是一种钙和锌结合蛋白，存在于中性粒细胞、单核细胞和活化巨噬细胞的胞浆中。44粪便钙保护素水平主要反映中性粒细胞向肠道黏膜的迁移，是胃肠炎患儿肠道炎症升高的非特异性标记物。45婴儿期粪便钙保护素明显高于儿童后期。46健康乌干达儿童3-6月龄时粪便钙保护素中位数为278 μ g/g, 6-12月龄时为183 μ g/g，学龄时降至28 μ g/g。47我们使用了与乌干达研究不同的分析方法，但发现在基线时粪便钙保护素水平相当。在4个月的干预期间，−FeMNP组粪便钙保护素下降，而+FeMNP组，特别是+12.5 mgFeMNP组，粪便钙保护素水平仍显著升高。在科特迪瓦的强化研究中，学龄儿童每天摄入约9毫克铁，粪便钙保护素急剧增加，并与肠道肠道细菌的增加有关。22尽管我们没有发现大多数细胞因子的全身浓度有显著差异，但在终点处+2.5 mgFeMNP的循环IL-12浓度明显高于−2.5 mgFeMNP。肠道微生物抗原可刺激肠道巨噬细胞分泌IL-12，诱导Th1细胞发育。48因此，在我们的研究中，IL-12的分泌可能是由侵袭性病原体或由腔内铁含量增加引起的生物失调引起的;值得注意的是，在+2.5 mgFeMNP和−2.5 mgFeMNP中埃希氏杆菌属/志贺氏杆菌分类单元在终末显著升高，而在+12.5 mgFeMNP中未见影响。此外，在这项研究和其他研究中，饮食中的铁已被证明会增加肠道炎症22，49通过不同的潜在途径，如中性粒细胞浸润、脂质过氧化、NF-κB活化和促炎细胞因子。49作为宿主炎症反应的副产物产生的电子受体被认为有利于兼性厌氧菌，特别是肠杆菌。50
我们在本研究中使用的+FeMNPs含有两种不同形式的铁，亚铁和铁，铁与螯合剂(EDTA)结合。我们的数据没有阐明膳食铁的形态是否是肠道菌群诱导变化的潜在决定因素，因为膳食铁摄入导致的人类结肠中铁和铁的相对浓度尚不清楚。然而，即使摄入了不同形式的铁，大部分进入结肠的未吸收的膳食铁很可能是氧化的铁(Fe＋３)的形式，主要是铁氧化物或氢氧化物。51在结肠中，低氧张力有利于铁离子还原为亚铁离子+ 2)铁。在许多胃肠道病原体中已经发现了铁和铁的获取系统。虽然铁离子的溶解度只有10−17M的pH值为7，细菌通常需要10左右的铁−7-10年−5M达到最优生长，14细菌可以将铁还原为更易溶的亚铁形式，并/或利用细胞外铁螯合物，如铁载体，作为吸收前的增溶剂。52许多肠道病原体，包括沙门氏菌物种和大肠杆菌、志贺氏杆菌物种,15通过特定的外膜受体吸收铁铁团复合物。大多数肠道革兰氏阴性菌对亚铁也有积极的运输系统，14铁转运体feob介导的亚铁获取可能增加毒性。36
在我们的研究中，含富马酸亚铁+12.5 mgFeMNP倾向于引起更大的肠道菌群修饰和更多的肠道炎症;这可能是因为它的铁剂量是+2.5 mgFeMNP中螯合铁的5倍。然而，从我们的研究结果中还不清楚高铁剂量是否更有害:尽管+12.5 mgFeMNP导致低丰度的双歧杆菌属，以及更高水平的粪便钙保护素，以及腹泻治愈率上升的趋势，对埃希氏杆菌属/志贺氏杆菌,肠杆菌与双歧杆菌之比，并对致病性有所增加大肠杆菌+2.5 mgFeMNP更强。因此，我们的数据没有阐明低铁剂量的MNP是否具有更好的安全性。
根据之前对人类肠道菌群的研究，53-56我们的婴儿在基线时的四个优势门是放线菌门(63%，主要)Bifidobacteriaceae)、厚壁菌门(22%)、拟杆菌门(9%)和变形菌门(4%)。我们发现4个月后的治疗效果比3周后更明显，可能是由于补充喂养的引入导致3周后肠道微生物群的快速波动。20.这一发现强调了在评估干预措施和比较不同试验时，让肠道微生物组有时间适应饮食变化的重要性。我们从非洲婴儿肠道微生物组中获得的数据与使用qPCR方法在荷兰婴儿中发现的双歧杆菌丰度相似的数据相比较、大肠杆菌和乳酸杆菌。18然而，相比之下，我们的许多婴儿携带肠道病原体，超过一半的粪便样本含有梭状芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌，委员会成员c . perfringens肠道致病性和/或肠毒性组大肠杆菌，近四分之一的人在港口b的仙人掌和/或沙门氏菌．我们的数据还表明，贫血和非贫血婴儿的基线肠道微生物组可能不同，正如他们对+FeMNPs的反应不同。贫血的婴儿表现较高普氏菌(拟杆菌)和低放线菌目(放线菌)和链球菌(厚壁菌门)的丰度高于非贫血的婴儿。之前的一项研究比较了来自布基纳法索和意大利的年龄较大儿童的肠道微生物群，发现拟杆菌门(Bacteroidetes)浓度更高普氏菌而且Xylanibacter)和较低浓度的厚壁菌门和大肠杆菌、志贺氏杆菌比意大利儿童多。53因此，我们的研究结果表明，非洲儿童贫血率较高可能与非洲儿童与欧洲儿童肠道菌群观察到的差异有关。
在大鼠中，结肠铁的可用性可能调节肠道菌群代谢物，特别是盲肠SCFAs的产生。57这可能具有重要的肠道调节作用，因为SCFAs已被报道抑制生长或降低浓度肠炎沙门氏菌，沙门氏菌血清型沙门氏菌感染，大肠杆菌，弗氏志贺菌而且空肠弯曲杆菌，58，59丁酸盐可以下调相关基因的表达沙门氏菌低剂量入侵。60在体外发酵中，低铁浓度减少scfa生产者的数量，包括Roseburia物种/大肠rectale，梭状芽胞杆菌簇IV成员和拟杆菌降低了流出液中丁酸和丙酸的浓度。61在目前的研究中，我们没有发现含铁MNPs对粪便中SCFA浓度的影响。这种差异可能是由于细菌发酵产生的95-99%的SCFAs在结肠中被吸收，所以粪便中测定的浓度很可能不能反映结肠腔中的水平。62在瑞典婴儿中，粪便中的丁酸盐和丙酸盐浓度在出生后的头2年稳步上升，而粪便中的醋酸盐在出生后的头几周迅速上升，然后趋于稳定。63在这项研究中，肯尼亚婴儿从6个月到10个月的情况也类似。
关于铁元素干预对儿童腹泻发病率的影响的数据并不一致。在对口服铁补充或强化对照试验的系统回顾中，提供铁与发生腹泻的风险增加11%相关(p=0.04)。7四项食物强化研究报告了腹泻结果，三项提供了铁强化婴儿配方奶粉，64 - 66其中一个提供了铁强化的婴儿食品。67自那次审查以来，在学龄儿童中进行的两项小型铁强化试验没有报告腹泻风险增加。68，69然而，在瑞典和洪都拉斯的一项对照试验中，在6个月至9个月的婴儿中提供铁补充剂，在Hb≥110 g/L的婴儿中，铁治疗增加了腹泻的风险。70秘鲁最近的对照铁补充试验(12.5-15毫克铁/天)71和孟加拉国72报告腹泻病例显著增加。在尼泊尔的两个大型试验中，在婴儿和儿童中补充铁和叶酸(12-35个月的受试者每天服用12.5 mg铁，较小的儿童服用一半剂量)73和坦桑尼亚3.报告腹泻发病率无差异。然而，在一项加纳儿童的对照研究中，使用了与我们研究中相同的+12.5 mgFeMNP，铁组的住院人数显著增加(RR (95% CI) 1.23(1.02 - 1.49)，基于门诊登记的数据，铁组中83%的额外病例是由于腹泻，但这并不显著(RR (95% CI) 1.12(0.86 - 1.46))。5巴基斯坦最近的一项研究发现，与未接受锌治疗的对照组相比，接受+12.5 mgFeMNP(无锌:or (95% CI) 1.15(1.00至1.3);含锌:1.31(1.13 - 1.51))。6在目前的研究中，接受+12.5 mgFeMNP的婴儿有需要治疗的腹泻率更高的趋势。因此，现有数据表明，口服铁补充剂和+FeMNPs可能会适度增加婴儿腹泻的风险。我们的研究发现，随着肠道炎症的增加，肠道微生物组向潜在的更具致病性的特征转变，可能为这种不良影响提供了一个潜在的机制。
这是第一个研究+FeMNPs对非洲婴儿肠道微生物群影响的对照干预试验，我们的研究结果需要在其他环境和人群中得到证实。IDA和腹泻是发展中国家婴儿发病和死亡的主要原因。家庭强化+FeMNPs已多次被证明可降低婴儿和儿童的IDA发病率，但它们是否会增加腹泻病的风险仍不确定。有限的可用临床证据和我们对它们对肠道微生物群和炎症的影响的研究结果表明，+FeMNPs在传染病负担高的环境中可能并不完全安全。目前，世卫组织建议在贫血患病率为20%的环境中，对6-23个月大的儿童使用含铁、维生素A和锌的多磷营养素强化饮食，无论其铁含量如何，并与治疗疟疾、促进改善卫生条件和改善腹泻的全面管理措施相结合。74与此同时，世卫组织建议只针对患有IDA的婴儿补充铁，同时提供对疟疾的充分保护。4我们和其他人的发现，5，6建议在获得更安全的配方之前，+FeMNPs应针对IDA患儿，同时提供对疟疾和腹泻的充分保护。
致谢
我们感谢参与这些研究的家庭、项目工作人员的辛勤工作和奉献;Viola Cassina, Simone Heeb, Alfonso Die和Erwin Wiegerinck对实验室的支持;以及来自美国国家肠道致病性细菌和李斯特菌中心(NENT)的Herbert Haechler教授，他们慷慨地证明了致病性细菌标准菌株的DNA大肠杆菌qPCRs。
参考文献
补充材料
-
补充数据
这个网络仅文件已由BMJ出版集团从作者提供的电子文件生产(s)，并没有编辑的内容。
本数据补编中的文件:
- 数据补充1——在线补充
脚注
贡献者TJ:研究设计，研究进行，数据收集，数据分析和解释，撰写初稿。GAMK和DM:数据分析和解读，撰写初稿。CC:研究设计，数据解读。PH, JN, AM和JK:研究行为和数据收集。AD、DWS和CL:数据解释。JB、HMT和HT:数据分析和解释。MBZ:研究设计、数据分析与解读、初稿撰写。所有作者都编辑了报告，批准了最终版本，并声明没有利益冲突。本文内容仅由作者负责，并不代表尤尼斯·肯尼迪·施赖弗国家儿童健康与人类发展研究所或国家卫生研究院的官方观点。
资金该项目由尤尼斯·肯尼迪·施赖弗国家儿童健康与人类发展研究所资助，资助号为U01HD064921，并与INSTAPA项目合作实现，该项目由欧盟第七框架方案(Fp7/2007-2013)资助，资助协议号为211484。
相互竞争的利益一个也没有。
伦理批准肯雅塔国立医院/内罗毕大学和苏黎世联邦理工学院伦理和研究委员会。
来源和同行评审不是委托;外部同行评议。