你在这里

条文本

菜单条
XML
炎症性肠病
原文
神经紧张素调节的miR-133α参与人结肠上皮细胞和实验性结肠炎的促炎信号传导
  1. 罗家文1，
  2. Kyriaki Bakirtzi1，
  3. 克里斯托Polytarchou2，
  4. 才气Oikonomopoulos1，
  5. 丹尼尔Hommes1，
  6. Dimitrios Iliopoulos2，
  7. Charalabos Pothoulakis1
  1. 1加州大学洛杉矶分校大卫格芬医学院消化疾病科炎症性肠病中心，加州洛杉矶美国
  2. 2加州大学洛杉矶分校大卫格芬医学院消化疾病学部系统生物医学中心，加州洛杉矶美国
  1. 对应到Charalabos Pothoulakis教授，加州大学洛杉矶分校David Geffen医学院消化疾病部炎症性肠病中心，675 Charles E Young博士，美国加州洛杉矶90095南MRL楼1240;cpothoulakis在}{mednet.ucla.edu

摘要

客观的神经紧张素(NT)通过其受体神经紧张素受体1 (NTR1)介导结肠炎症。NT刺激结肠上皮细胞中miR-133α的表达。我们研究了miR-133α在体外和体内nt相关结肠炎症中的作用。

设计用定量PCR法检测miR-133α和AFTPH水平。反义(as)-miR-133α在诱导2,4,6 -三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的结肠炎和右旋糖酐硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎之前被灌胃。体外用基因沉默法检测AFTPH的作用。

结果NT增加了NCM-460过表达NTR1 (NCM460-NTR1)和HCT-116细胞中miR-133α的水平。nt诱导的nnc -460- ntr1细胞中p38、ERK1/2、c-Jun和NF-κB激活，以及IL-6、IL-8和IL-1β信使RNA (mRNA)表达在miR-133α沉默细胞中降低，而miR-133α过表达逆转了这些作用。与野生型结肠炎小鼠相比，TNBS(2天)和DSS(5天)结肠炎小鼠MiR-133α水平升高，而NTR1缺陷DSS暴露小鼠MiR-133α水平降低。结肠内as- mir -133α减弱了结肠炎的几个参数以及结肠黏膜中促炎介质的表达。在与qPCR相结合的硅质搜索中，发现AFTPH是miR-133α的下游靶点，而NT降低了nnc -460- ntr1结肠炎细胞中AFTPH的表达。AFTPH基因沉默增强nt诱导的促炎反应，实验性结肠炎中AFTPH水平下调。与对照组相比，在溃疡性结肠炎患者的结肠活检中，miR-133α水平显著上调，而AFTPH水平下调。

结论nt相关的结肠炎和炎症信号是由miR-133α-AFTPH相互作用调节的。靶向miR-133α或AFTPH可能是炎症性肠病的一种新的治疗方法。

  • 炎症性肠病的基础研究
  • 结肠疾病
  • 实验性结肠炎

这是一篇根据创作共用署名非商业性(CC BY-NC 4.0)许可发布的开放获取文章，该许可允许其他人以非商业性的方式发布、混编、改编、构建本作品，并以不同的条款许可其衍生作品，前提是原始作品被正确引用且使用是非商业性的。看到的:http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/

http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl-2014-307329

来自Altmetric.com的统计

    请求的权限

    如果您希望重用这篇文章的任何部分或全部，请使用下面的链接，它将带您访问版权清除中心的RightsLink服务。您将能够快速获得价格和以多种不同方式重用内容的即时许可。

    本研究的意义

    关于这个问题，我们已经知道了什么?

    • 神经紧张素(NT)通过其高亲和受体(神经紧张素受体1 (NTR1))介导结肠炎症。

    • NT和NTR1在实验性结肠炎和溃疡性结肠炎(UC)炎症结肠组织中表达上调。

    • NT可调节结肠细胞中38种microRNAs的差异表达，其中包括miR-133α。

    • MicroRNA-133α调节与癌细胞系和肌细胞增殖、分化和肥大相关的信号通路。

    新的发现是什么?

    • miR-133α在体外调节nt诱导的MAP激酶和NF-κB激活，以及促炎细胞因子的转录。

    • 降低人结肠细胞和小鼠结肠中miR-133α的水平可减弱促炎信号和体外和体内实验性结肠炎的发展。

    • Aftiphilin (AFTPH)是nt诱导的人结肠上皮细胞中参与促炎信号通路的miR-133α表达的一个新的下游靶点。

    • UC患者和结肠炎小鼠的结肠组织中miR-133α水平高于对照组，但AFTPH水平较低。

    在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?

    • 抑制miR-133α和恢复炎症性肠病(IBD)结肠中AFTPH的表达可能是治疗IBD的有前途的方法。

    • UC中miR-133α和AFTPH水平的反向关联与NTR1表达的增加可能是UC的新生物标志物。

    简介

    神经紧张素(NT)是一种在中枢神经系统和肠道中表达的神经肽，1，2而它的高亲和力受体，NT受体1 (NTR1)3.在神经元中表达，4结肠上皮,2，5 - 7免疫细胞,8，9以及不同的结肠癌细胞系。10在结肠中，NT/NTR1信号通路促进急性结肠炎动物模型的炎症。2，5在肠毒素介导的肠道炎症中，结肠NT和NTR1表达增加，2右旋糖酐硫酸钠结肠炎，6，11，12以及溃疡性结肠炎(UC)患者的结肠中。6此外，小鼠NTR1缺乏与实验性结肠炎患者体重减轻和死亡率降低有关。5．13

    MicroRNAs (miRs)是短的(19-25个核苷酸)单链RNA分子，作为负转录调控因子。它们与转录本的3 '非翻译区域(UTR)结合14并导致信使RNA (mRNA)降解，或抑制翻译成蛋白质。15最近，一些研究发现了UC患者结肠黏膜miR的差异表达，16 - 19克罗恩病(CD)18，20.和实验结肠炎。17然而，单个miRs在炎症性肠病(IBD)病理生理学中的作用仍在研究中。

    我们最近发现NT/NTR1偶联在人结肠上皮NCM460过表达NTR1 (NCM460-NTR1)细胞中诱导miRs的差异表达，10包括mir - 133α。miR-133α及其靶基因的异常表达与结直肠癌的发生有关第21至28通过调节的兵29，30.和一种蛋白激酶21，31NT/NTR1信号通路在人结肠上皮细胞中的作用。7，10，32基于这些考虑，我们研究了NT-miR-133α相互作用在体外结肠炎症和体内由三硝基苯磺酸(TNBS)和DSS诱导的两种实验性结肠炎模型中的作用。我们还进行了研究，以确定nt - ntr1调节的miR-133α介导这些效应的靶点。我们的研究结果指向AFTPH，作为miR-133α的一个新的下游靶点，并为miR-133α及其下游靶点AFTPH在结肠炎病理生理学中的关联提供了证据。

    材料和方法

    细胞培养和试剂

    如前所述，NCM460- ntr1细胞来源于用慢病毒颗粒转转的人结肠上皮NCM460细胞(INCELL, San Antonio, Texas, USA)10并在添加10%胎牛血清的M3:D培养基(INCELL)中维持(FBS, Life Technologies, Grand Island, New York, USA)。人类胚胎肾成纤维细胞、HEK293和结肠癌HCT-116细胞分别保存在Eagle's Minimum Essential Medium (MEM, Life Technologies)和McCoy5a (ATCC, Manassas, Virginia, USA)中，并添加10%胎牛血清。Lipofectamine 2000、Lipofectamine RNAimax和OptiMEM均来自Life Technologies公司。NT来自Bachem Americas(托伦斯，加利福尼亚州，美国)。TNBS和SR48962来自Sigma Aldrich (St Louis, Missouri, USA)， DSS来自MP Biomedicals (Santa Ana, California, USA)。山羊抗aftph (sc-167055)、小鼠抗绒毛蛋白和兔抗β微管蛋白来自Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, California, USA)。

    转染实验

    小干扰RNA (siRNA)购自Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz)。用Lipofectamine RNAiMAX转染ncm460 - ntr1细胞抗AFTPH siRNA (si-AFTPH)。所有的mir都是从Life Technologies购买的。对于miR-133α沉默或过表达，细胞分别用反义miR-133α (as-miR-133α)或miR-133α前体(miR-133α)转染，使用Lipofectamine RNAiMAX。转染siRNA-A (si-对照)、反义对照miR (as-miR-对照)或miR-阴性对照前体(miR-对照)的细胞作为对照。

    NT/ ntr1介导的磷酸化蛋白活化和细胞因子的产生

    NCM460-NTR1细胞转染as-miR-133α、miR-133α和si-AFTPH及其各自的对照。细胞在无血清培养基中孵育一夜，并用NT (100 nM)刺激。收集细胞裂解液用于磷蛋白检测，刺激后6小时收集培养基用于细胞因子测定。根据制造商的说明，定制设计的Bio-Plex Pro细胞信号传导检测面板(Bio-Rad, Hercules，加州加州)和Bio-Plex Pro人类细胞因子27-plex检测(Bio-Rad)分别用于磷酸化蛋白激活和细胞因子生产(IL-8除外)。

    动物模型及实验性结肠炎模型的建立

    神经紧张素受体1敲除小鼠模型

    Ntsr1tmDgen(以下称为NTR1KO)从杰克逊实验室购买并在我们的设施繁殖。动物为129在C57BL6/J上的第五代回交。我们在交叉动物之前进行了一个额外的回交，作为杂合子NTR1KO杂交产生窝伴侣对照。

    TNBS-induced结肠炎

    C57BL6/J野生型(WT)小鼠购于Jackson Laboratories。TNBS溶于30%乙醇(5 mg/kg)，灌胃50 μL给小鼠。5，33简单地说，TNBS通过1ml注射器(Becton Dickinson, Laguna Hills, California, USA)缓慢注入，并配有聚乙烯套管(intrintrdic PE-20管;正欲)。给药48 h后收集结肠组织。

    DSS-induced结肠炎

    如前所述，将NTR1KO及其WT对照物或C57BL6/J WT动物在饮用水中加入5%的DSS，13，34治疗开始后5天收集结肠组织。

    NT在体内输注。NT溶于添加1%牛血清白蛋白(BSA)的PBS中35C57BL6/J WT小鼠灌胃(300 μg/kg)，每天2次，连续4天。对照组小鼠在PBS中注入1%牛血清白蛋白。在给药后5天收集结肠组织。

    miR-133α在体内的表达下调

    C57BL6/J WT小鼠结肠组织内源性miR-133α表达被结肠内给药miRCURY LNA Inhibitor探针沉默mmu - mir - 133 a(20μg /鼠标,Exiqon)。简单地说，适量的寡核苷酸对抗mmu - mir - 133 a在TNBS或DSS处理前24 h和72 h，分别用100 μL的Opti-MEM和2 μL的lipofectamine 2000重悬。

    MicroRNA原位杂交

    TNBS治疗后2天，WT小鼠结肠组织(远端3cm处)。立即用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片(5 μm)进行组织学研究。5 ' -DIG和3 ' -DIG标记的小鼠miR-133α (Cat。No. 39270-15)和miRCURY LNA microRNA ISH优化试剂盒(FFPE)购自Exiqon，并按照制造商说明进行实验。

    患者样本中RNA表达的研究

    UC患者(n=12)、CD患者(n=8)和正常受试者(n=9)结肠组织中总rna从Origene (Rockville, Maryland, USA)购买。按照上述方法对RNA样品进行cDNA转化，通过qPCR分析测定miR-133α和AFTPH的水平。

    免疫组织化学

    UC慢性活动性患者(n=3)和正常对照组(n=3)的冷冻组织切片(5 μm)购自Origene。用4%多聚甲醛固定，用0.3% Triton X-100在PBS (PBS-Triton)中添加5%正常牛血清进行阻断。适当的抗体与组织切片在4℃下孵育过夜，PBS-Triton冲洗，与适当的二抗孵育(Santa Cruz Biotechnology)。使用Axio Imager对组织进行成像。Z1显微镜(卡尔蔡司)。

    请参考在线补充方法进行定点突变、荧光素酶测定、NF-κB p65易位、测量白细胞介素-8 (IL-8)产生、免疫印迹分析、mRNA和miR表达分析以及血液样本中的microRNA谱分析。

    统计分析

    所有体外结果来自至少三组实验，用平均值±SD表示，并用Student t检验进行分析。动物实验和人体组织研究的结果用Student t检验进行分析，用均数±SEM表示。在所有统计比较中，p<0.05表示差异显著。

    结果

    NT暴露后人结肠上皮细胞miR-133α水平升高

    NT作用于结肠上皮细胞2，5 - 7通过它的高亲和力受体NTR13.在结肠癌细胞系中观察到NTR1过表达，10，36实验性结肠炎小鼠的结肠组织，6，11，12肠道肿瘤37以及UC患者的组织活检。6在先前的微阵列分析中，我们发现NT/NTR1偶联在人结肠上皮NCM460-NTR1中增加了miR-133α的表达。10在我们目前的研究中，我们首先通过qPCR检测人结肠上皮NCM460-NTR1细胞和结肠癌腺癌HCT-116细胞中miR-133α的水平来验证这一结果。与我们之前的发现一致，10NT暴露后miR-133α水平上调2.6±0.43倍(p<0.01);图1A)在NCM460-NTR1细胞中，而在HCT-116细胞中，miR-133α水平升高1.5±0.07倍(p<0.01);图1B)在加入NT后。因此，NT增加了两种不同的人结肠上皮细胞系中miR-133α的表达。

    Levels of miR-133α were upregulated after neurotensin (NT) exposure in human colonic epithelial cells. (A) Expression of miR-133α in human colonic epithelial NCM460 cells after NT exposure was analysed by qPCR analysis. **p<0.01, compared to vehicle control. (B) miR-133α levels in human colon cancer HCT-116 cells after NT exposure were analysed by qPCR analysis. **p<0.01, compared to vehicle control.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    人结肠上皮细胞暴露神经紧张素(NT)后miR-133α水平上调。(A)用qPCR分析NT暴露后人结肠上皮NCM460细胞中miR-133α的表达。**p<0.01，与车辆对照比较。(B)用qPCR分析NT暴露后人结肠癌HCT-116细胞中miR-133α的水平。**p<0.01，与车辆对照比较。

    NT通过miR-133α的表达诱导人结肠上皮细胞的促炎信号

    NT偶联NTR1通过MAPK刺激炎症反应38，39端依赖和NF -κB7，40，41端依赖途径。本研究中，我们使用as-miR-133α反义方法检测了NCM460-NTR1细胞中miR-133α是否参与nt相关的促炎信号和细胞因子表达。首先，我们发现转染as-miR-133α可以阻断nt诱导的NCM460-NTR1细胞中miR-133α的过表达(图2A)，与转染对照as-miR的比较，验证了这种方法。此外，NT刺激仅在转染as-miR的细胞中激活p38和ERK1/2信号，而在转染as-miR-133α的细胞中没有激活as-miR-133α，而NT诱导的c-Jun激活在转染as-miR-133α的细胞中显著减弱(图2B、p < 0.05)。此外，nt诱导的NF-κB p65磷酸化在as- mir -133α-转染的细胞中被阻断(图2C)，而nt诱导的IL-6和IL-8 mRNA (图2D, E, p<0.05)和IL-8分泌在miR-133α敲除后也显著减弱(图2F, p < 0.05)。对细胞培养基的分析表明，NT刺激增加了促炎IL-1β的产生，但减少了抗炎IL-1ra的产生(图2G、p < 0.05)。转染as-miR-133α显著降低nt诱导的IL-1β的产生，同时阻止IL-1ra产生的下降(图2G)。总的来说，这些结果表明miR-133α在诱导促炎信号通路和细胞因子生成中对人类结肠细胞NTR1激活的应答中发挥重要作用。

    Downregulation of miR-133α attenuated neurotensin (NT)-associated proinflammatory signalling in NCM460-neurotensin receptor 1 (NTR1) cells. (A) Levels of miR-133α in NCM460-NTR1 cells upon NT stimulation after transfection of as-miR-133α and its control were analysed by qPCR analysis. *p<0.05, compared to cells transfected with as-miR-control. (B) Levels of MAP kinase phosphorylation, including p38, ERK1/2 and c-Jun and (C) NF-κB phosphorylation in NCM460-NTR1 cells transfected with as-miR-133α and its control were analysed as stated in Methods. *p<0.05, compared to cells transfected with as-miR-control; ##p<0.01, compared to cells treated with NT. (D) IL-6 and (E) IL-8 levels in NCM460-NTR1 cells transfected with as-miR-133α and its control was analysed by qPCR analysis. **p<0.01, compared to cells transfected with as-miR-control and #p<0.05, compared with NT-treated cells. (F) IL-8 production in NCM460-NTR1 cells transfected with as-miR-133α and its control was measured using ELISA. **p<0.01, compared to cells treated with vehicle control; #p<0.05, compared with NT-treated cells. (G) IL-1β and IL-1ra production in NCM460-NTR1 cells transfected with as-miR-133α and its control was measured as stated in Methods. *p<0.05, compared to cells treated with vehicle control.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    ncm460 -神经紧张素受体1 (NTR1)细胞中miR-133α衰减神经紧张素(NT)相关的促炎信号的下调(A)通过qPCR分析转染as-miR-133α及其对照后NT刺激NCM460-NTR1细胞中miR-133α的水平。*p<0.05，与转染as-miR-control的细胞相比。(B)在转染as- mir -133α及其对照的NCM460-NTR1细胞中，分析MAP激酶磷酸化水平，包括p38、ERK1/2和C - jun和(C) NF-κB磷酸化水平，详见方法。*p<0.05，与转染as-miR-control的细胞相比;# #p<0.01。(D)转染as-miR-133α及其对照的NCM460-NTR1细胞的IL-6和(E) IL-8水平通过qPCR分析。**p<0.01，与转染as- mir对照和#p<0.05，与nt处理细胞比较。(F) ELISA检测转染as-miR-133α及其对照的NCM460-NTR1细胞中IL-8的产生。**p<0.01，与对照细胞比较;#p<0.05，与nt处理细胞比较。(G)转染as- mir -133α及其对照的NCM460-NTR1细胞中IL-1β和IL-1ra的产生，如方法所述。*p<0.05，与对照细胞比较。

    我们进一步验证了NT和miR-133α在转染NTR1和miR-133α的NCM460细胞中的促炎作用。过表达miR-133α进一步增加nt诱导的ERK1/2, c-Jun (图3A, p<0.05)和NF-κB p65 (图3B、p < 0.05)激活。此外，在没有NT刺激的情况下，单独过表达miR-133α促进NF-κB p65的核易位(图3C, p<0.05)。此外，与对照组相比，过表达miR-133α的细胞中IL-8、IL-1β和TNF-α mRNA增加(图3D, p < 0.05)。对于细胞因子的产生，miR-133α过表达后IL-8分泌增加(图3E、p < 0.05)。过表达miR-133α的细胞也显著减少IL-1ra的产生(p<0.05)，而IL-1β的产生略有增加，但不显著(图3F).总之，这些结果强烈表明miR-133α在人类结肠细胞促炎信号传导中起重要作用。

    Overexpression of miR-133α promoted proinflammatory signaling in NCM460-neurotensin receptor 1 (NTR1) cells. (A) Levels of MAP kinase phosphorylation, including ERK1/2 and c-Jun and (B) NF-κB p65 phosphorylation in NCM460-NTR1 cells transfected with miR-133α and its control was analysed as stated in Methods. *p<0.05, compared to cells transfected with control miRNA precursor. (C) Translocation of NF-κB p65 in NCM460-NTR1 cells transfected with miR-133α and its control was analysed by ELISA. *p<0.05, compared to cells transfected with control miRNA precursor. (D) Expression of IL-8, IL-1β and TNF-α in NCM460-NTR1 cells transfected with miR-133α and its control was analysed by qPCR analysis. *p<0.05, compared to cells transfected with control miRNA precursor. (E) IL-8 production in NCM460-NTR1 cells transfected with miR-133α and its control was measured using IL-8 ELISA. *p<0.05, compared to cells transfected with control miRNA precursor. (F) IL-1β and IL-1ra production in NCM460-NTR1 cells transfected with miR-133α and its control was measured as stated in Methods. *p<0.05, compared to cells treated with vehicle control; #p<0.05, compared to cells transfected with miR control precursor.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
    图3

    过表达miR-133α促进ncm460 -神经紧张素受体1 (NTR1)细胞的促炎信号。(A)在转染miR-133α及其对照的NCM460-NTR1细胞中，分析MAP激酶磷酸化水平，包括ERK1/2和c-Jun和(B) NF-κB p65磷酸化水平，详见方法。*p<0.05，与转染对照miRNA前体的细胞比较。(C) ELISA分析转染miR-133α及其对照的NCM460-NTR1细胞中NF-κB p65的易位。*p<0.05，与转染对照miRNA前体的细胞比较。(D)用qPCR分析转染miR-133α及其对照的NCM460-NTR1细胞中IL-8、IL-1β和TNF-α的表达。*p<0.05，与转染对照miRNA前体的细胞比较。(E)用IL-8 ELISA法检测转染miR-133α及其对照的NCM460-NTR1细胞中IL-8的产生。*p<0.05，与转染对照miRNA前体的细胞比较。(F)转染miR-133α及其对照的NCM460-NTR1细胞中IL-1β和IL-1ra的生成按方法测定。 *p<0.05, compared to cells treated with vehicle control;#p<0.05，与miR对照前体转染细胞比较。

    MiR-133α在体内过表达依赖于NT/ ntr1

    由于如上所示，NT在体外调节结肠细胞中的miR-133α，我们接下来研究了这种作用是否可以在体内重现。为此，C57/BL6J WT (WT)小鼠在殖民地内注射NT (300 μg/kg)。354天后，对小鼠实施安乐死，并对结肠组织进行RNA纯化。qPCR分析显示结肠miR-133α水平升高(增加1.3±0.04倍，图4A, p<0.05)，与结肠内给药相比。因为NT是急性结肠炎症的重要媒介，2，13我们还检测了两种结肠炎模型中miR-133α的结肠表达水平。在C57BL6/J WT小鼠结肠内灌胃5 mg/kg TNBS或在饮用水中添加5% DSS诱导急性结肠炎。qPCR分析显示miR-133α水平升高(增加3.2±1.01倍)，图4B, p<0.05)，但第7天下降63% (图4B、p < 0.05)。接受DSS的小鼠miR-133α水平增加了3.6±0.61倍(图4B, p<0.001)，与对照组相比。

    Levels of miR-133α were upregulated during experimental colitis in vivo. (A) miR-133α levels in colon tissues from C57BL6/J mice intracolonically administered with NT (300 μg/kg) was analysed by qPCR analysis. *p<0.05, compared to mice receiving vehicle control. (B) Expression of miR-133α in colon tissues from C57BL6/J mice collected 2 and 7 days after 5 mg/kg trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) administration and 5 days after 5% dextran sodium sulfate (DSS) feeding was analysed by qPCR analysis. *p<0.05, compared to treatment control. (C) Representative images of in situ hybridisation of miR-133α of colon tissues from TNBS-treated C57BL6/J mice and their control counterparts (arrows, epithelial cells; arrow heads, lamina propria cells infiltration). Scale: 50 μm. (D) Expression of miR-133α in colon tissues from neurotensin receptor 1 (NTR1) KO and its control counterparts collected 5 days after 5% DSS feeding was analysed by qPCR analysis.*p<0.05, compared to wild-type mice with same treatment.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
    图4

    在实验性结肠炎中miR-133α水平上调。(A)用qPCR分析NT (300 μg/kg)灌胃C57BL6/J小鼠结肠组织中miR-133α的水平。*p<0.05，与对照组小鼠比较。(B)用qPCR分析miR-133α在C57BL6/J小鼠结肠组织中的表达情况，分别在5mg /kg三硝基苯磺酸(TNBS)给药后2天和7天以及5%右酐硫酸钠(DSS)给药后5天。*p<0.05，与治疗对照组相比。(C) tnbs处理的C57BL6/J小鼠及其对照小鼠结肠组织中miR-133α原位杂交的代表性图像(箭头为上皮细胞;箭头，固有层细胞浸润)。规模:50μm。(D)用qPCR分析5% DSS喂养后5天收集的神经紧张素受体1 (NTR1) KO及其对照物结肠组织中miR-133α的表达，*p<0.05，与野生型小鼠相比。

    为了研究结肠炎期间结肠组织中miR-133α的黏膜分布，从tnbs处理的WT小鼠及其对照小鼠结肠组织切片中对miR-133α进行原位杂交，方法中描述了这一过程。我们的结果表明，虽然miR-133α在炎症结肠中的表达较高，但大部分miR-133α的表达定位于上皮细胞(图4C，箭头)，固有层的其他细胞减少(图4C,箭头)。

    在NTR1缺陷的NTR1KO小鼠中进一步研究结肠炎发展过程中结肠组织中内源性NT/NTR1信号通路与miR-133α表达的直接关系。将NTR1KO小鼠和WT小鼠的饮用水中添加5%的DSS, 5天后将小鼠安乐死，并测定miR-133α水平。所示图4D、DSS处理后WT小鼠结肠miR-133α水平升高(2.4±0.32倍，p<0.01)，而NTR1KO小鼠结肠miR-133α水平降低(p<0.05)。因此，在急性结肠炎中miR-133α表达的增加涉及到NT/NTR1的相互作用。

    结肠内沉默miR-133α可减弱急性结肠炎的发展

    我们接下来确定了miR-133α在实验性结肠炎发展中的作用。在结肠内给药TNBS (5 mg/kg)或对照剂24小时和72小时之前，C57BL6/J WT小鼠灌胃两剂as-miR-133α或其对照。在tnbs处理后48小时收集结肠组织进行基因表达和组织学分析。未接受tnbs治疗的小鼠结肠组织的组织学检查未显示出任何差异(图5A).正如预期的那样，TNBS给药可诱导As - mir -control给药小鼠的急性结肠炎症，而在TNBS治疗前给药As - mir -133α可减轻结肠炎的发展(图5A).此外，定量PCR分析显示，结肠内给药as-miR-133α显著降低内源性miR-133α的结肠表达(p<0.05，图5B).接受as-miR-133α和TNBS治疗的小鼠在结肠长度归一化后结肠重量显著减少(图5C, p<0.05)、中性粒细胞浸润和黏膜完整性的改善导致组织学评分显著改善(图5D, p < 0.05)。经TNBS治疗的结肠组织中促炎细胞因子的产生普遍增加。在TNBS给药前用as-miR-133α进行预处理，阻断了增加的中性粒细胞产物脂脂素2 (lcn2)和TNF-α(结肠炎中主要的促炎细胞因子)的表达。cxcl1是一种重要的中性粒细胞趋化剂(图5E, p<0.05)在as- miR-133α组小鼠中显著降低，与对照组as- miR-133α组相比(图5E).我们还研究了as-miR-133α治疗dss诱导的结肠炎模型的效果。在DSS治疗前24小时和72小时给药as-miR-133α及其对照。给予as-miR-133α和DSS的小鼠在DSS治疗后5天体重减轻(见在线补充图S1A, p<0.05)，而给予as-miR-133α的小鼠在DSS诱导的结肠炎后5天TNF-α和IL-1β水平升高，而as-miR-133α的小鼠显著降低(见在线补充图S1B, C, p<0.05)。综上所述，这些结果提示miR-133α参与了结肠炎的病理生理过程。

    Intracolonic administration of as-miR-133α attenuated trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS)-induced colitis development in wild-type mice. (A) Representative images from H&E staining of colon tissues from C57BL6/J mice intracolonically administered with as-miR-133α and its control with or without TNBS treatment. Scale: 50 μm. (B) Levels of miR-133α in colon tissues from C57BL6/J mice intracolonically administered with as-miR-133α and its control were analysed using qPCR analysis. *p<0.05, compared to mice administered with control as-miRNA. (C) Colon weight from C57BL6/J mice intracolonically administered with as-miR-133α and its control with or without TNBS treatment were measured and normalised by colon length. *p<0.05, compared to mice administered with control as-miRNA. (D) Total histological score, neutrophil infiltration and mucosal integrity of colon tissues from C57BL6/J mice intracolonically administered with as-miR-133α and its control with TNBS treatment were scored. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.005 compared to mice administered with control as-miRNA. (E) Levels of lcn2, TNF-α and cxcl1 in colon tissues from C57BL6/J mice intracolonically administered with as-miR-133α and its control with or without TNBS treatment were analysed using quantitative PCR analysis. *p<0.05, compared to mice administered with control as-miRNA.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5
    图5

    结肠内给药as-miR-133α减毒三硝基苯磺酸(TNBS)诱导野生型小鼠结肠炎发展。(A)结肠组织H&E染色的代表性图像，C57BL6/J小鼠在结肠内注射as-miR-133α及其对照，TNBS治疗或不治疗。规模:50μm。(B)用qPCR分析结肠内给予as-miR-133α及其对照的C57BL6/J小鼠结肠组织中miR-133α的水平。*p<0.05，与对照组as-miRNA相比。(C)在结肠内注射as-miR-133α的C57BL6/J小鼠及其对照组(不论是否接受TNBS治疗)中测量结肠重量，并按结肠长度归一化。*p<0.05，与对照组as-miRNA相比。(D)对结肠内注射as-miR-133α及其对照TNBS治疗的C57BL6/J小鼠结肠组织的总组织学评分、中性粒细胞浸润和黏膜完整性进行评分。*p<0.05， **p<0.01， ***p<0.005。(E)采用定量PCR分析在结肠内给予as-miR-133α及其对照的C57BL6/J小鼠结肠组织中lcn2、TNF-α和cxcl1的水平。 *p<0.05, compared to mice administered with control as-miRNA.

    mir - 133直接调节αAFTPH其3 ' UTR在结肠上皮细胞中的表达

    MiRs通过与靶基因的3 ' utr结合，抑制mRNA转录物的表达，起到基因沉默的作用。14为了识别参与NTR1-miR-133α反应的候选基因，我们在它们的3 ' utr中寻找可能具有miR-133α结合位点的基因。在硅搜索使用三个在线数据库(TargetScanHuman (http://www.targetscan.org）;miRBase (http://www.mirbase.org)及PicTar (http://pictar.mdc-berlin.de))，鉴定为aftiphilin (AFTPH)， miR-133α结合位点在其3 ' UTR高度保守(图6一个)。

    Aftiphilin (AFTPH) was the downstream target of neurotensin (NT)-induced miR-133α upregulation. (A) Conservative miR-133α binding sites were identified in 3′ untranslated region (UTR) region of aftiphilin across different species. (B) Levels of miR-133α in NCM460-neurotensin receptor 1 (NTR1) cells transfected with as-miR-133α and its control was analysed by qPCR analysis. *p<0.05, compared to cells stimulated by vehicle. (C) AFTPH 3′UTR-driven luciferase activities from NCM460-NTR1 cells transfected with as-miR-133α and its control were measured after NT stimulation. *p<0.05, compared to cells stimulated by vehicle. (D) Luciferase activity driven by AFTPH 3′UTR with or without miR-133α binding sequence was measured after NT stimulation. *p<0.05, compared to cells stimulated by vehicle. (E) AFTPH 3′UTR-driven luciferase activities from HEK293 cells transfected with miR-133α precursor (miR-133α) and its control were measured. *p<0.05, compared to cells transfected with control miRNA precursor. (F) Immunoblot analysis of AFTPH expression in NCM460-NTR1 cells 30 min and 6 h after NT exposure in the presence or absence of SR48962 (10 nM). (G) AFTPH levels in colon tissues from C57BL6/J mice intracolonically administered with NT and its control and (H) from C57BL6/J mice intracolonically administered with as-miR-133α and its control with or without trinitrobenzene sulfonic acid treatment were analysed using qPCR analysis. *p<0.05, compared to mice administered with control as-miRNA.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图6
    图6

    Aftiphilin (AFTPH)是神经紧张素(NT)诱导的miR-133α上调的下游靶点。(A)保守的miR-133α结合位点在不同物种aftiphilin的3’非翻译区(UTR)区域被发现。(B)通过qPCR分析转染as-miR-133α及其对照的ncm460 -神经紧张素受体1 (NTR1)细胞中miR-133α的水平。*p<0.05，与车辆刺激细胞比较。(C)在NT刺激后测量转染as-miR-133α及其对照的NCM460-NTR1细胞AFTPH 3 ' utr驱动的荧光素酶活性。*p<0.05，与车辆刺激细胞比较。(D)在NT刺激后测量伴有或不伴有miR-133α结合序列的AFTPH 3’utr驱动的荧光素酶活性。*p<0.05，与车辆刺激细胞比较。(E)检测转染miR-133α前体(miR-133α)及其对照的HEK293细胞AFTPH 3 ' utr驱动的荧光素酶活性。*p<0.05，与转染对照miRNA前体的细胞比较。 (F) Immunoblot analysis of AFTPH expression in NCM460-NTR1 cells 30 min and 6 h after NT exposure in the presence or absence of SR48962 (10 nM). (G) AFTPH levels in colon tissues from C57BL6/J mice intracolonically administered with NT and its control and (H) from C57BL6/J mice intracolonically administered with as-miR-133α and its control with or without trinitrobenzene sulfonic acid treatment were analysed using qPCR analysis. *p<0.05, compared to mice administered with control as-miRNA.

    NTR1-miR-133α-AFTPH相互作用首次在转染as- mir -133α并暴露于NT的NCM460-NTR1细胞中得到验证。NT暴露下调了AFTPH mRNA水平，如定量PCR分析(图6B, p<0.05)和afthph 3 ' utr调节的荧光素酶活性测定(图6C, p<0.05)。为了确认miR-133α和AFTPH之间的直接相互作用，我们删除了AFTPH 3 ' UTR上的miR-133α结合序列，并表明在没有miR-133α结合位点的情况下，没有观察到nt诱导的AFTPH 3 ' UTR荧光素酶活性下调(图6D).在没有NT刺激的情况下，HEK293细胞中过表达miR-133α显著降低了AFTPH-3 ' utr相关的荧光素酶活性(图6E、p < 0.05)。此外，用SR48962的ntr1特异性拮抗剂处理可以防止NT诱导的afph蛋白表达减少(图6F).以上结果强烈表明，NT暴露后，AFTPH是miR-133α在结肠细胞中的下游靶点，提示NT/NTR1信号通路通过miR-133α过表达抑制AFTPH的表达。

    为了在体内环境下证实我们的体外研究结果，我们比较了对照、nt暴露和tnbs暴露(2d)小鼠结肠组织中AFTPH mRNA的表达。我们的研究结果显示，nt处理的(图6G, p<0.05)和tnbs注射小鼠(图6H, p<0.05)，与车辆暴露的对照组结肠相比，与两种模型中观察到的miR-133α水平升高一致(数字4而且5F).在暴露于DSS的NTR1KO小鼠中，仅观察到少量(1.28±0.17倍，n=5 /组)但不显著的AFTPH水平增加。沿着这些方向，与对照组相比，结肠内给药as-miR-133α沉默miR-133α增加了正常和炎症结肠组织中的AFTPH水平(图6H, p < 0.05)。

    AFTPH基因沉默促进人结肠上皮细胞的促炎症反应

    为了检查AFTPH在NT介导的促炎信号中的功能，我们在NT刺激前用si-RNA转染NCM460-NTR1细胞中沉默AFTPH的表达。我们的研究结果表明，afthh基因沉默增强了nt诱导的c-Jun和NF-κB激活(图7A, B, p<0.05)，这与我们关于miR-133α在nt介导的信号激活中的作用的发现一致。此外，AFTPH基因沉默增加了基础IL-1β的产生(图7C, p<0.05)，而改良nt介导的人结肠上皮细胞IL-1ra减少(图7C)，与我们的miR-133α过表达结果一致(图3F)。

    Gene silencing of aftiphilin (AFTPH)-promoted neurotensin (NT)-associated proinflammatory response in vitro. Levels of (A) c-Jun and (B) NF-κB phosphorylation in NCM460-neurotensin receptor 1 (NTR1) cells transfected with si-AFTPH and its control was measured as stated in Methods. *p<0.05, compared to cells transfected with control siRNA; #p<0.05, compared to NT-treated cells. (C) IL-1β and IL-1ra production of NCM460-NTR1 cells transfected with si-AFTPH and its control in the presence or absence of NT stimulation was analysed as stated in Methods. *p<0.05, compared to cells transfected with control siRNA.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图7
    图7

    基因沉默aftiphilin (AFTPH)促进神经紧张素(NT)相关的体外促炎反应。在转染si-AFTPH及其对照的ncm460 -神经紧张素受体1 (NTR1)细胞中，检测(A) c-Jun和(B) NF-κB磷酸化水平。*p<0.05，与转染对照siRNA的细胞比较;#与nt处理细胞相比，p<0.05。(C)转染si-AFTPH的NCM460-NTR1细胞中IL-1β和IL-1ra的产生及其在NT刺激存在或不存在时的控制，如方法中所述。*p<0.05，与转染对照siRNA的细胞比较。

    UC患者结肠中miR-133α和AFTPH水平失调

    为了证实我们的研究结果，我们比较了UC结肠组织样本和正常结肠组织样本中miR-133α和AFTPH的水平。miR-133α水平显著升高2.6±1.82倍(p=0.048，图8A)，而AFTPH mRNA水平降低0.72±0.17倍(p=0.0073，图8A)同样的病人。相比之下，从CD患者中获得的miR-133α水平与正常对照组相比没有显著差异(每组n=8，数据未显示)。此外，UC患者结肠组织的免疫组化结果显示，与正常结肠组织相比，结肠黏膜中AFTPH的表达减少(图8B)， AFTPH主要在结肠上皮细胞中表达，并与上皮细胞标记物绒毛蛋白共定位(图8B).以上结果提示，与小鼠结肠炎一样，UC患者中miR-133α和AFTPH表达呈负向失调。

    Levels of miR-133α and aftiphilin (AFTPH) were significantly dysregulated in patients with ulcerative colitis (UC). (A) Levels of miR-133α and AFTPH in colon tissues from normal and patients with UC were analysed using qPCR analysis. (B) Representative images from immunohistochemistry against AFTPH and villin of colon tissues from normal and patients with UC. Scale: 50 μm.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图8
    图8

    在溃疡性结肠炎(UC)患者中，miR-133α和aftiphilin (AFTPH)水平显著失调。(A)使用qPCR分析正常和UC患者结肠组织中miR-133α和AFTPH的水平。(B)正常和UC患者结肠组织抗AFTPH和绒毛免疫组化的代表性图像。规模:50μm。

    讨论

    NT与其高亲和力受体NTR1的偶联会触发MAPK38，39和NF -κB7，40，41信号传导和促进肠道炎症。2，5，13我们之前已经证明，NT改变了一些microRNAs的表达，包括人结肠上皮细胞中的miR-133α，并提出证据表明，microRNAs是NT在肠道中影响的一个重要功能成分。10在目前的研究中，我们在体外和体内检测了miR-133α在nt相关肠道炎症回路中的作用。我们的研究结果表明，NT刺激体外和正常小鼠结肠后，miR-133α的表达增加。我们还提供了强有力的证据，证明miR-133α参与了人类结肠炎细胞中由NT/NTR1相互作用激活的炎症级联，并且在两种不同的小鼠模型中，结肠中内源性miR-133α的沉默减少了急性实验性结肠炎。最后，我们的研究结果表明AFTPH是miR-133α的一个新的下游靶点，在NT-miR-133α相互作用后介导肠促炎信号和细胞因子转录。因此，nt调控的miR-133α及其靶点AFTPH可能是体内结肠炎症反应的新靶点。

    我们目前的研究重点是了解miR-133α在nt相关结肠炎症中的作用。NT/NTR1信号通路促进急性结肠炎2，5而NTR1缺乏则会降低实验性结肠炎的严重程度。5，13此外，NT和NTR1在UC患者的结肠组织中过表达，6我们目前的研究显示，与野生型小鼠相比，NTR1KO小鼠结肠miR-133α水平降低。另一方面，miR-133α及其下游靶点表达与不同的疾病状态相关，如结直肠癌、第21至28肌细胞发育和肥大，42-44还有心肌和肝脏的纤维化。45，46然而，它在结肠炎症中的作用从未被研究过。多项研究表明miR-133α可调节ERK29，30.和PI3 K / Akt21，31信号通路，或直接靶向这些通路中的分子。22与上述研究结果一致，我们发现miR-133α可调节NT刺激时ERK1/2和p38的激活。我们还首次证明miR-133α直接调节NF-κB激活和NT暴露，以及miR-133α过表达，在细胞中增加促炎IL-1β的产生，抑制抗炎IL-1ra的产生。IL-1ra在结肠炎中拮抗IL-1β47，48有趣的是，IL-1ra/IL-1β比值降低被认为是IBD患者炎症严重程度的一个重要因素。49综上所述，我们的研究结果表明NT/NTR1偶联通过调节人结肠上皮细胞中的miR-133α水平触发促炎信号通路。

    我们的研究结果显示，与对照组相比，在tnbs诱导的急性结肠炎和dss诱导的结肠炎小鼠的结肠黏膜以及活动期UC患者的结肠组织中miR-133α水平显著升高。小鼠结肠原位杂交显示miR -133α主要在结肠上皮细胞中表达，在tnbs诱导的结肠炎中miR表达增加。然而，UC患者和正常患者的血清中未检测到miR-133α(数据未显示)。为了研究内源性miR-133α在结肠炎中的作用，我们在两个实验性结肠炎模型中引入as-miR-133α，以避免干扰非靶组织的正常细胞功能。我们的研究结果显示，结肠内接受as-miR-133α的小鼠降低了结肠炎小鼠结肠组织内源性miR-133α水平，改善了黏膜组织学，减少了促炎细胞因子的表达。在体内，反义寡核苷酸的结肠内传递主要局限于结肠上皮细胞，50我们的结果表明，结肠上皮细胞中的miR-133α水平可以影响结肠炎的病理生理。然而，由于miR-133α的表达也在循环单核细胞中被发现，51在结肠黏膜的上皮下细胞中，不能排除miR-133α参与结肠固有层细胞类型的炎症信号传导。

    我们发现了一个新的miR-133α靶点AFTPH，其表达水平受NT/NTR1相互作用的调节。一些证据支持我们将AFTPH作为miR-133α下游靶点的鉴定。与NT孵育的人结肠上皮细胞降低AFTPH mRNA水平，以及AFTPH 3 ' ultra调节的荧光素酶活性。最重要的是，在3 ' UTR上缺失miR-133α结合序列的AFTPH的表达在NT暴露时不再下调。AFTPH的存在以前没有在肠道中被发现，它的细胞功能也没有很好地描述。AFTPH与网格蛋白和衔接蛋白(AP-1, AP-2)的结合位点在细胞内运输中是必不可少的。52AFTPH位于trans-golgi网络(TGN)中，53其基因沉默导致内皮细胞内Weibel-Palade小体不受调控的胞外分泌54而不会改变TGN的形态。55然而，AFTPH或TGN在促炎信号级联中的作用尚未被研究。在本研究中，我们证实UC患者的结肠组织以及tnbs诱导和dss诱导的结肠炎小鼠的结肠中AFTPH水平显著下调。在细胞水平上，AFTPH基因沉默激活NF-κB通路，促进促炎细胞因子IL-1β的体外产生。NF-κB激活参与IL-1β的表达56NF-κB抑制剂可减少小鼠IL-1β的产生并改善结肠炎症。57因此，AFTPH表达异常可能调节促炎反应，是促炎信号通路和结肠炎发展的一种新的调控因子。此外，其表达水平的测量，以及miR-133α水平的测量，可以作为UC的生物标志物。

    总的来说，我们的研究结果代表了一个以前未被认识的范式，即激活结肠黏膜中的神经肽受体(NTR1)刺激miR (miR-133α)的表达，miR可调节结肠炎的发展。miR-133α沉默和稳定结肠AFTPH水平对结肠炎的治疗潜力值得进一步研究。

    参考文献

    1. ↵
      1. 波兰语的JM，
      2. 沙利文SN，
      3. 布鲁姆老，
      4. 等
      ．放射免疫分析和免疫细胞化学对人肠内N细胞神经紧张素的特异性定位．自然1977；270：183- - - - - -4．
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    2. ↵
      1. Castagliuolo我，
      2. 王CC，
      3. Valenickl，
      4. 等
      ．神经紧张素是结肠炎症中的一种促炎神经肽．中国投资1999；103：843- - - - - -9．
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    3. ↵
      1. 田中K，
      2. Masu米，
      3. 录像年代
      ．克隆大鼠神经紧张素受体的结构和功能表达．神经元1990；4：847- - - - - -54．
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    4. ↵
      1. Fassio一个，
      2. 埃文斯G，
      3. GrisshammerR，
      4. 等
      ．使用氨基末端定向抗体研究神经紧张素受体NTS1在大鼠中枢神经系统中的分布．神经药理学2000；39：1430- - - - - -42．
      OpenUrl CrossRef PubMed
    5. ↵
      1. 官HW，
      2. 金y，
      3. 徐H，
      4. 等
      ．在2,4,6 -三硝基苯磺酸诱导的结肠炎中，神经紧张素诱导小鼠前脂肪细胞和脂肪组织中IL-6的分泌．美国国家科学研究院2009；106：8766- - - - - -71．
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    6. ↵
      1. 布朗P，
      2. MastrottoC，
      3. BeggiaoE，
      4. 等
      ．神经肽神经紧张素刺激慢性肠道炎症后肠伤口愈合．胃肠肝脏物理2005；288：G621- - - - - -9．
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    7. ↵
      1. 赵D，
      2. Keates交流，
      3. Kuhnt-Moore年代，
      4. 等
      ．信号转导途径介导神经紧张素刺激的人结肠细胞白细胞介素-8表达．J临床生物化学2001；276：44464- - - - - -71．
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    8. ↵
      1. Sundmanl，
      2. Saarialho-KereU，
      3. VendelinJ，
      4. 等
      ．神经肽S受体1在肠道和皮肤中的表达——推测在肽激素分泌中的作用．Neurogastroenterol Motil2010；22：79- - - - - -87，e30．
      OpenUrl PubMed
    9. ↵
      1. 达席尔瓦l，
      2. 七巧板BM，
      3. 莫拉l，
      4. 等
      ．神经紧张素下调皮肤树突状细胞的促炎特性，增加表皮生长因子的表达．Biochim Biophys学报2011；1813：1863- - - - - -71．
      OpenUrl CrossRef PubMed
    10. ↵
      1. BakirtziK，
      2. Hatziapostolou米，
      3. Karagiannides我，
      4. 等
      ．神经紧张素信号激活microrna -21、-155和Akt，促进小鼠肿瘤生长，在人结肠肿瘤中增加．胃肠病学2011；141：1749- - - - - -61．e1．
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    11. ↵
      1. 马戈利斯公斤，
      2. 革顺医学博士
      ．神经肽与炎症性肠病．当今杂志2009；25：503- - - - - -11．
      OpenUrl CrossRef PubMed
    12. ↵
      1. 赵D，
      2. PothoulakisC
      ．NT对胃肠运动和分泌的影响及其在肠道炎症中的作用．肽2006；27：2434- - - - - -44．
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    13. ↵
      1. BugniJM，
      2. Rabadi拉，
      3. JubbalK，
      4. 等
      ．神经紧张素受体-1促进散发性而非炎症相关的结肠癌小鼠模型的肿瘤发展．Int J癌症2012；130：1798- - - - - -805．
      OpenUrl CrossRef PubMed
    14. ↵
      1. 麦肯纳磅，
      2. SchugJ，
      3. Vourekas一个，
      4. 等
      ．MicroRNAs控制肠上皮分化、结构和屏障功能．胃肠病学2010；139：1654- - - - - -64，1664 e1．
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    15. ↵
      1. BartelDP
      ．MicroRNAs:目标识别和调节功能．细胞2009；136：215- - - - - -33．
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    16. ↵
      1. 吴F，
      2. Zikusoka米，
      3. Trindade一个，
      4. 等
      ．MicroRNAs在溃疡性结肠炎中表达差异，并改变巨噬细胞炎症肽-2 α的表达．胃肠病学2008；135：1624- - - - - -35e24．
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    17. ↵
      1. 扁Z，
      2. 李l，
      3. 崔J，
      4. 等
      ．在葡聚糖硫酸盐钠诱导的小鼠实验性结肠炎和人溃疡性结肠炎中，mir -150靶向c-Myb在结肠上皮破坏中的作用．中草药2011；225：544- - - - - -53．
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    18. ↵
      1. Fasseu米，
      2. TretonX，
      3. GuichardC，
      4. 等
      ．炎症性肠病患者不活跃结肠黏膜中异常表达成熟microRNA限制性亚群的鉴定．《公共科学图书馆•综合》2010；5：pii: e13160．
      OpenUrl CrossRef
    19. ↵
      1. 高木涉T，
      2. NaitoY，
      3. 水岛K，
      4. 等
      ．活动性溃疡性结肠炎患者炎症结肠黏膜中microRNA表达增加．胃肠醇和肝醇2010；25：S129- - - - - -33．
      OpenUrl CrossRef PubMed
    20. ↵
      1. 吴F，
      2. 张年代，
      3. DassopoulosT，
      4. 等
      ．与回肠和结肠克罗恩病相关的microRNAs的鉴定．Inflamm肠说2010；16：1729- - - - - -38．
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    21. ↵
      1. JosseC，
      2. BouznadN，
      3. 吉尔茨P，
      4. 等
      ．炎症诱导结直肠癌发生过程中靶向PI3K/Akt信号通路的microRNA景观的鉴定．胃肠肝脏物理2014；306：G229- - - - - -43．
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    22. ↵
      1. 王H，
      2. 一个H，
      3. 王B，
      4. 等
      ．miR-133a通过靶向LIM和SH3蛋白1并抑制MAPK通路抑制结直肠癌肿瘤生长和转移．欧元J癌症2013；49：3924- - - - - -35．
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    23. ↵
      1. 阿恩特通用汽车，
      2. 道l，
      3. 卡伦LM，
      4. 等
      ．全球microRNA表达特征揭示了miR-145在转移性结直肠癌中的致癌潜力．BMC癌症2009；9：374．
      OpenUrl CrossRef PubMed
    24. ↵
      1. 萨维尔艾尔，
      2. 法国AJ，
      3. Borralho点，
      4. 等
      ．人结肠癌谱显示不同的microRNA表达取决于错配修复状态和无分化增殖状态的特征．BMC癌症2009；9：401．
      OpenUrl CrossRef PubMed
    25. ↵
      1. 越南盾Y，
      2. 赵J，
      3. 吴连续波，
      4. 等
      ．miR-133a在结直肠癌中的抑癌作用．摩尔癌症Res2013；11：1051- - - - - -60．
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    26. ↵
      1. 妈Y，
      2. 张P，
      3. 杨J，
      4. 等
      ．人类结直肠癌中的候选microRNA生物标志物:系统综述、分析研究和实验验证．Int J癌症2012；130：2077- - - - - -87．
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    27. ↵
      1. NecelaBM，
      2. 卡尔JM，
      3. AsmannYW，
      4. 等
      ．MicroRNAs在慢性炎症或遗传肿瘤中的差异表达分钟/ +结肠癌模型．《公共科学图书馆•综合》2011；6：e18501．
      OpenUrl CrossRef PubMed
    28. ↵
      1. 李Z，
      2. 顾X，
      3. 方Y，
      4. 等
      ．人结直肠癌伴脑转移的microRNA表达谱．肿瘤防治杂志列托人2012；3.：346- - - - - -50．
      OpenUrl PubMed
    29. ↵
      1. 李问，
      2. 林X，
      3. 杨X，
      4. 等
      ．NFATc4在mir -133a介导的心肌细胞肥厚抑制中负调控．心脏循环物理2010；298：H1340- - - - - -7．
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    30. ↵
      1. 冯Y，
      2. 妞妞噢，
      3. 魏W，
      4. 等
      ．miR-133和ERK1/2通路之间的反馈电路，涉及调节成肌细胞增殖和分化的微妙机制．细胞死亡说2013；4：e934．
      OpenUrl CrossRef PubMed
    31. ↵
      1. 崔W，
      2. 张年代，
      3. 山C，
      4. 等
      ．microRNA-133a通过EGFR/Akt信号通路靶向表皮生长因子受体，调控乳腺癌细胞周期和增殖．2月J2013；280：3962- - - - - -74．
      OpenUrl CrossRef PubMed
    32. ↵
      1. 赵D，
      2. BakirtziK，
      3. 张ydF4y2BaY，
      4. 等
      ．胰岛素样生长因子-1受体的转激活调节人结肠上皮细胞神经紧张素的炎症和增殖反应．J临床生物化学2011；286：6092- - - - - -9．
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    33. ↵
      1. 官HW，
      2. 施D，
      3. Karagiannides我，
      4. 等
      ．P物质调节结肠炎相关纤维化．是中草药2010；177：2300- - - - - -9．
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    34. ↵
      1. 官HW，
      2. 赵D，
      3. 徐H，
      4. 等
      ．p物质介导的促血管生成因子CCN1的表达可调节结肠炎的过程．是中草药2008；173：400- - - - - -10．
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    35. ↵
      1. 埃弗斯BM，
      2. Izukura米，
      3. 汤森厘米小．，
      4. 等
      ．神经紧张素对单质饮食喂养的大鼠肠粘膜发育不良有抑制作用．挖说科学1992；37：426- - - - - -31．
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    36. ↵
      1. MaoretJJ，
      2. PospaiD，
      3. RouyerfessardC，
      4. 等
      ．神经紧张素受体及其mRNA在许多人结肠癌细胞系中表达，但在正常结肠上皮中不表达:结合研究和RT-PCR实验．生物化学生物物理学研究1994；203：465- - - - - -71．
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    37. ↵
      1. GuiX，
      2. 古斯曼G，
      3. Dobner公关，
      4. 等
      ．结肠腺癌进展过程中神经紧张素受体-1表达增加．肽2008；29：1609- - - - - -15．
      OpenUrl CrossRef PubMed
    38. ↵
      1. 赵D，
      2. 张ydF4y2BaY，
      3. 官HW，
      4. 等
      ．金属蛋白酶依赖性转化生长因子-释放介导神经紧张素刺激的人结肠上皮细胞MAP激酶激活．J临床生物化学2004；279：43547- - - - - -54．
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    39. ↵
      1. 赵D，
      2. 张ydF4y2BaY，
      3. 曾H，
      4. 等
      ．神经紧张素通过激活人结肠上皮细胞中的MAP激酶刺激早期生长反应基因-1和EGF受体的表达．Int J癌症2007；120：1652- - - - - -6．
      OpenUrl CrossRef PubMed
    40. ↵
      1. 赵D，
      2. Kuhnt-Moore年代，
      3. 曾H，
      4. 等
      ．神经紧张素通过Rho gtpase介导的NF-kappa B通路刺激人结肠上皮细胞IL-8的表达．Am J Physiol Cell Physiol2003；284：C1397- - - - - -404．
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    41. ↵
      1. 赵D，
      2. 张ydF4y2BaY，
      3. 曾H，
      4. 等
      ．神经紧张素通过调节I kappa B α磷酸化和p65转录活性刺激白介素-8的表达:参与蛋白激酶C α．摩尔杂志2005；67：2025- - - - - -31．
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    42. ↵
      1. 饶PK，
      2. 库马尔RM，
      3. Farkhondeh米，
      4. 等
      ．调节肌肉特异性微rna表达的肌源性因子．美国国家科学研究院2006；103：8721- - - - - -6．
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    43. ↵
      1. 陈X，
      2. 王K，
      3. 陈J，
      4. 等
      ．体外证据表明，mir -133a介导的解偶联蛋白2 (UCP2)调控是肌源性分化不可或缺的一步．J临床生物化学2009；284：5362- - - - - -9．
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    44. ↵
      1. 华Y，
      2. 张Y，
      3. 任J
      ．IGF-1缺乏抵抗心肌肥厚和心肌收缩功能障碍:microRNA-1和microRNA-133a的作用．细胞分子医学2012；16：83- - - - - -95．
      OpenUrl CrossRef PubMed
    45. ↵
      1. RoderburgC，
      2. Luedde米，
      3. 巴尔加斯CardenasD，
      4. 等
      ．肝纤维化过程中miR-133a介导TGF-β依赖性的肝星状细胞胶原合成解抑制．J乙醇2013；58：736- - - - - -42．
      OpenUrl CrossRef PubMed
    46. ↵
      1. CastoldiG，
      2. 迪吉奥亚阴极射线管，
      3. BombardiC，
      4. 等
      ．MiR-133a调节胶原1A1: MiR-133a在血管紧张素ii依赖性高血压心肌纤维化中的潜在作用．J细胞杂志2012；227：850- - - - - -6．
      OpenUrl CrossRef PubMed
    47. ↵
      1. CominelliF，
      2. 纳斯特CC，
      3. 克拉克双相障碍，
      4. 等
      ．白介素1 (IL-1)基因在兔免疫复合物结肠炎中的表达、合成及特异性IL-1受体阻断剂的作用．中国投资1990；86：972- - - - - -80．
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    48. ↵
      1. Ferretti)米，
      2. Casini-RaggiV，
      3. 皮萨罗TT，
      4. 等
      ．内源性IL-1受体拮抗剂的中和可加剧和延长兔免疫性结肠炎的炎症．中国投资1994；94：449- - - - - -53．
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    49. ↵
      1. Casini-RaggiV，
      2. 金l，
      3. 庄YJ，
      4. 等
      ．炎症性肠病中IL-1和IL-1受体拮抗剂的粘膜失衡慢性肠道炎症的一种新机制．J Immunol1995；154：2434- - - - - -40．
      OpenUrl 摘要
    50. ↵
      1. 黄Z，
      2. 史T，
      3. 周问，
      4. 等
      ．miR-141通过靶向CXCL12β在小鼠结肠炎和人克罗恩病过程中调节结肠白细胞运输．肠道2014；63：1247- - - - - -57．
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    51. ↵
      1. 王Y，
      2. 李l，
      3. 摩尔英国电信，
      4. 等
      ．人循环单核细胞中的MiR-133a:与绝经后骨质疏松症相关的潜在生物标志物．《公共科学图书馆•综合》2012；7：e34641．
      OpenUrl CrossRef PubMed
    52. ↵
      1. MatteraR，
      2. 里特B，
      3. Sidhu党卫军，
      4. 等
      ．耳域γ -adaptin识别的共识母题的定义．J临床生物化学2004；279：8018- - - - - -28．
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    53. ↵
      1. 缅甸人的莱托，
      2. Wasiak年代，
      3. 里特B，
      4. 等
      ．Aftiphilin是神经元中网格蛋白机制的一个组成部分．2月列托人2005；579：2177- - - - - -84．
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    54. ↵
      1. Lui-RobertsWW，
      2. 费拉罗F，
      3. 夜莺道明，
      4. 等
      ．内皮细胞中webel - palade小体的促分泌敏感性需要Aftiphilin和γ -synergin．细胞杂志2008；19：5072- - - - - -81．
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    55. ↵
      1. 赫斯特J，
      2. 波尔纳“大酒店”，
      3. 港口米，
      4. 等
      ．aftiphilin / p200 / gamma-synergin复杂．细胞杂志2005；16：2554- - - - - -65．
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    56. ↵
      1. 卡瓦略足总，
      2. 艾特肯JD，
      3. Gewirtz在，
      4. 等
      ．TLR5的激活可诱导分泌型白介素-1受体拮抗剂(sIL-1Ra)，减少炎症体相关的组织损伤．粘膜Immunol2011；4：102- - - - - -11．
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    57. ↵
      1. FunakoshiT，
      2. 山下式K，
      3. 市川N，
      4. 等
      ．一种新型NF-κB抑制剂，去羟甲基羟喹啉，可改善小鼠炎症性结肠损伤．J克隆恩氏结肠炎2012；6：215- - - - - -25．
      OpenUrl 摘要/免费的全文

    补充材料

    • 补充数据

      这个网络仅文件已由BMJ出版集团从作者提供的电子文件生产(s)，并没有编辑的内容。

      本数据补编中的文件:

    脚注

    • 贡献者项目总体设计和假设由IKML和CP进行，IKML进行实验，分析数据并撰写手稿。KB生成过表达NTR1, NCM460-NTR1的人结肠上皮细胞。DH和AO收集并提供UC患者和对照组患者的血清，用于分析这些新结果，现在列入修订的手稿。CP、DI和CP参与了实验设计，并提供了动物和试剂。所有作者都参与了修改手稿，并同意最终版本。CP和DI监督整个项目。

    • 资金这项工作得到了NIH拨款DK60729 (CP)，神经内分泌检测核心，NIDDK P50 DK 64539 (CP)，克罗恩病盲体研究基金会(IKML)和美国克罗恩病和结肠炎基金会(KB)的支持。

    • 相互竞争的利益一个也没有。

    • 来源和同行评审不是委托;外部同行评议。