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客观的牙周疾病史和循环选择口腔病原体抗体的存在与胰腺癌的风险增加有关;然而,直接口腔微生物与胰腺癌的关系没有被评估的前瞻性研究。我们检查口腔微生物群的关系与随后的胰腺癌的风险在一个大的嵌套病例对照研究。
设计我们选择361事件的胰腺腺癌和371匹配控制两个前瞻性群组研究,美国癌症协会癌症预防研究二世和国家癌症研究所前列腺癌、肺癌、直肠癌和卵巢癌筛查试验。从pre-diagnostic口腔清洗样品,我们口腔微生物群的构成特征使用细菌16 s rRNA (16 s rRNA)基因测序。口腔微生物群和胰腺癌的风险之间的关系,控制群体的随机效应和其他协变量,使用传统的检查和L1-penalised至少绝对收缩和选择算子逻辑回归。
结果口腔病原体,运输Porphyromonas gingivalis和Aggregatibacter actinomycetemcomitans,与胰腺癌的风险更高(有关调整或存在与缺乏= 1.60,95%可信区间1.15到2.22;或= 2.20,95% CI 1.16到4.18,分别)。门Fusobacteria和它的属纤毛菌属有关与降低胰腺癌风险(或每分每增加的相对丰度= 0.94,95%可信区间0.89到0.99;或= 0.87,95% CI 0.79到0.95,分别)。这些相关风险phylotypes仍然排斥的情况下,发达在2年后的样本收集,减少在这个前瞻性研究反向因果关系的可能性。
结论这项研究提供了支持证据表明口腔微生物群可能在胰腺癌的病因学中扮演一个角色。
- 胰腺
来自Altmetric.com的统计
本研究的意义
已知在这个问题上是什么?
胰腺癌是高度致命的;93%的患者在5年的死亡诊断。
口腔健康和牙周疾病的历史与胰腺癌的风险更高。
血清抗体水平选择牙周病原体与胰腺癌的风险增加有关。
有什么新发现吗?
在口腔genomic-based微生物的直接评估样本,马车的口腔病原体Porphyromonas gingivalis和Aggregatibacter actinomycetemcomitans与胰腺癌的风险增加相关。
Fusobacteria和它的属纤毛菌属与胰腺癌的风险降低有关。
这些相关风险phylotypes仍然排斥的情况下,发达在2年后的样本收集,减少在这个前瞻性研究反向因果关系的可能性。
它会如何影响临床实践在可预见的未来吗?
识别特定的口腔细菌与胰腺癌相关科学知识的进步胰腺癌的病因学。
这些口腔细菌可能另外作为易达到的,非侵入性生物标记为后续胰腺癌的风险,这有助于确定这种疾病的高危人群。
有针对性的预防治疗可能发展到战斗牙周病原体和减少患胰腺癌的风险。
介绍
胰腺癌是高度致命的;93%的病人在确诊5年内死亡,这是第四个在美国癌症死亡的主要原因。1对预防这种癌症的机会。除了遗传因素外,胰腺炎,吸烟和过量的体重是危险因素,然而这些只是部分解释这种疾病的风险。2 - 5减少公共卫生负担,有一个关键的科学知识需要提高胰腺癌的病因和预防措施提供指导。
超过700种不同的细菌种类的细菌将人类的口腔,统称为口腔微生物。6新兴证据显示口腔微生物群扮演了一个重要的角色在人类健康,包括免疫反应,致癌物质代谢和营养消化。7号到9号一系列最近的流行病学研究表明,口腔健康状况10 - 14和血液抗体选择口腔病原体15与胰腺癌的风险增加有关。因为口腔健康口腔微生物状态密切相关,16我们假设,口服health-pancreatic癌症协会可能会有潜在的微生物基础,然而没有研究直接评估口腔微生物之间的关系以及随后患胰腺癌的风险。
我们进行了一项前瞻性研究嵌套在两大军团,美国癌症协会癌症预防研究(CPS)二世和国家癌症研究所前列腺癌、肺癌、结肠直肠癌和卵巢癌(全方位)筛查试验,以确定口腔微生物与随后的胰腺癌的风险。我们直接评估口腔微生物群从16 s rRNA的高通量测序(16 s rRNA)基因在pre-diagnostic口腔样本361例胰腺癌病例和371例对照在这些军团,和这些群体相比基线总体微生物群组成,口腔病原体,运输和其他特定的细菌类群的相对丰度。
方法
研究人群
父母军团
CPS二世和全方位军团组成大型美国研究人群与存储口腔清洗样品,综合统计信息,为癌症发病率和前瞻性随访。两个群体的特征具有可比性,口腔清洗样品收集以类似的方式在两个组别。研究设计和癌症是详细描述事件的识别在线辅助方法(见补充方法)。
简单地说,CPS II组17包括184多000人,年龄在50 - 74,来自21个美国邮寄基线的饮食和生活方式问卷调查在1992年完成。随访问卷已发送到群成员每隔一年更新暴露信息,确定事件癌症病例;> 87%的反应率为每个后续问卷取得的。事件的癌症通过医疗记录,验证国家癌症登记,或死亡证书。2000 - 2002年期间,口腔清洗样本收集的邮件从70年004群组成员。18该分析包括胰腺癌病例诊断口腔清洗收集至2008年12月。
全方位的队列19是一个很大的以人群为基础的随机试验,检查筛选癌症相关的死亡率和二级端点上的影响,在55 - 74岁的男性和女性,招募了1993年和2001年之间,跟从了癌症发病率。参与者被随机筛选或控制臂。口腔冲洗样品收集在控制臂52 (n = 000)。在随访期间,事件癌症被一年一度的邮寄问卷确定后续率(> 95%),通过医疗记录或死亡证明和验证。该分析包括胰腺癌病例诊断口腔清洗收集至2010年12月。
嵌套病例对照研究选择
例受试者从两个群体事件主要胰腺腺癌(ICD-O-2代码C25.0-C25.3 c25.7 - 25.9),没有之前的历史癌症(non-melanoma皮肤癌除外),一个有效的同意和pre-diagnostic口腔清洗样品。组嵌套控件被incidence-density选择不重复抽样群体成员之间没有癌症之前的选择,提供了一个有效的同意和口服洗样品。控制被人群匹配情况下,年龄(5年)、性别、种族(白色、其他)和日历年的口腔清洗收藏。截至2012年12月,170例病例和170例对照CPS II和191例和201控制从全方位都有资格为这个项目(见在线补充图S1)。
测量
协变量的评估,摄取
在招生和随访期,参与者在两个军团完成了结构化问卷的问题,包括年龄、性别、种族、身体质量指数(BMI)、吸烟状况、饮酒和糖尿病史。我们使用共调查问卷最密切的时间为每个参与者口腔清洗样品收集。有关队列数据协调和转移到纽约大学医学院。
口腔冲洗样品
口服漱口水样本最初收集在两个军团代替血液样本为目的的人类基因组研究获得颊细胞DNA。17,19参与者在两组被要求漂亮的大力10毫升范围漱口水(宝洁公司),然后咳出痰标本管。这些样本被运到每个队列的biorepository,颗粒状和储存在-80°C到使用。18,19我们的试验使用对口腔微生物DNA测序;DNA是高度稳定的处于冻结状态,因此让我们使用冷冻口服洗丸在CPS二世和全方位的群组研究中进行归档。我们以前所示适用性口腔微生物的这种样品测量,20.和优秀的质量控制(QC)协议,这些样本。21因为我们的假设是,口腔细菌通过间歇性影响胰腺癌的风险而持久的口腔细菌迁移到胰腺,口腔清洗样品含有口腔细菌的广泛,适合测试这个假说。22
口腔微生物群描述使用16 s rRNA基因扩增和测序
细菌基因组DNA提取的漱口水样品使用该款PowerSoil DNA隔离设备(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德),与bead-beating方法该款Powerlyzer安博士的实验室仪器。从提取的DNA,我们放大16 s rRNA基因V3-V4地区使用通用引物(347 f 5′-GGAGGCAGCAGTRRGGAAT′3′和803 r 5′-CTACCRGGGTATCTAATCC-3′),同时将适配器和sample-specific条形码序列。23454年罗氏FLX钛焦磷酸测序系统被用来产生的扩增子序列。测序数据将提交dbGaP。
微生物组数据的推导
多路复用和条形码序列deconvoluted。劣质序列被排除在外QIIME脚本的使用缺省参数split_libraries.py(最小平均质量分数= 25,最小/最大序列长度= 200/1000碱基对,没有模棱两可的基地,在引物序列不允许不匹配)。24最后,与ChimeraSlayer嵌合序列被移除。25从732年pre-diagnostic口腔清洗样品,我们获得9 354 571高质量16 s rRNA基因序列读取(平均11 782 2799 (SD)序列/样本),与同样数量的读入两个组别(见在线补充表S1)。过滤后的序列被聚集到操作分类单元(辣子鸡),有97%的身份,并分配给分类使用人类口腔微生物数据库(HOMD)。26
质量控制
实验室人员对案例/控制状态,也不清楚和配对加工。瞎了积极的QC标本使用所有测序批次。22重复从两个受试者被蒙蔽的插入CPS II样本,和9个重复两个受试者插入蒙蔽全方位样本。我们以前报道,QC样品好协议在这些QC主题:21系数变化范围从8.90%到11.10%的Shannon-Wiener指数和辛普森指数的0.92%到4.68%,都受试细菌群落多样性的措施。消极的控制样品(没有DNA模板)可能被用来检测试剂和环境污染所有测序批次。
统计分析
整体口腔微生物群组成和胰腺癌之间的关系被分析的加权评估,未加权的UniFrac距离27;这些指标评估细菌的系统发育相似社区对,考虑OTU相对丰度或存在/缺失,分别。想象的分离对象基于两两距离,主坐标分析(PCoA)情节生成使用前两个主坐标并将根据胰腺癌状况。使用距离矩阵置换mutivariate方差分析(PERMANOVA)(“美男子”功能,纯素包,右)28UniFrac距离是用来测试整体口腔微生物构成的差异根据胰腺癌状态,控制了潜在的混杂因素(年龄、性别、种族、身体质量指数、吸烟状态、饮酒状况和糖尿病)的历史。
我们第一次评估胰腺癌风险与四个预定义的牙周病原体(Porphyromonas gingivalis, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Tannerella连翘和普氏菌媒介物)。29日因为这些病原体的相对丰度很低,我们描述个人作为病原体的携带者和非承运人,非承运人有零序读取特定病原体。对于运输这些病原体的病例对照比较,我们使用逻辑回归模型控制军团的随机效应,30.包容其他协变量(年龄、性别、种族、身体质量指数、吸烟状态、饮酒状况和糖尿病)的历史。结果是类似的,当我们使用条件逻辑回归模型(见在线补充结果)。
相比我们还广泛的细菌类群(门属)之间的病例和控制。我们有限的分析细菌类群与平均相对丰度≥0.01%。属低水平类群(类),我们有限的分析与平均相对丰度≥0.0001%。我们的分析包括5门,15类,22个订单,36科62属。探索协会类群相对丰富每一层(门属)与胰腺癌的风险,我们进行了L1惩罚至少绝对收缩和选择算子(套索)逻辑回归31日在R中实现“glmnet”计划,32遵循前一个方法解决二甲双胍治疗人类肠道微生物群的影响。33这种方法对回归系数的绝对值的总和,导致一个吝啬的模型,只有最强的类群对选择结果。协变量(人群、年龄、性别、种族、身体质量指数、吸烟状态、饮酒状况、历史的糖尿病)控制在套索类群的选择过程。评估风险协会为选定的分类单元,我们适合传统的逻辑回归模型使用每个选中分类单元作为一个单独的胰腺癌风险预测,病原体的马车中描述分析。此外,我们根据吸烟状态进行分层分析,饮酒状态和癌症诊断时间。使用R V.3.2.0进行分析。进一步的描述每一个方法都可以在网上看到补充材料的方法。
结果
人口特征的病例和控制所示表1。大部分参与者在两个军团是白人,虽然受试者在CPS二群往往比那些全方位队列。病例和控制在两个组别相似的匹配因素年龄、性别和种族。情况下更容易被吸烟者全方位队列,并消耗更多的酒精饮料的CPS II组。
我们首先检查整体口腔微生物群组成与随后的胰腺癌的风险。第一和第二组件基于加权的PCoA UniFrac距离被绘制(见网上补充图S2)。PERMANOVA分析,控制,显示没有不同的队列,对整体系统的距离口腔微生物组成、受试者之间继续开发胰腺癌(例)和那些没有(控制)(CPS II, p = 0.85和全方位,p = 0.49)(见在线补充图S2)。类似的结果被发现使用未加权的UniFrac距离(CPS II, p = 0.43和全方位,p = 0.87)。
我们下一个检查预先选择口腔牙周病原体的关系与随后的胰腺癌的风险(表2)。运输p . gingivalis与胰腺癌的风险更高(调整或存在与缺乏= 1.60,95%可信区间1.15到2.22)。这个协会是观察低运营商(低于平均相对丰富,或1.47(0.96 - 2.26))和高运营商(高于平均相对丰富,或1.73(1.14 - 2.63)),表现出有显著的剂量依赖关系趋势(p = 0.0047)。此外,这些联系是一致的在CPS II(趋势p = 0.032;在网上看到的补充表S2a)和全方位(趋势p = 0.070;在网上看到的补充表开通)。运输答:actinomycetemcomitans也与胰腺癌的风险增加(或2.20(1.16 - 4.18)),但总体上马车患病率低,这种关系不能为剂量反应评估。运输t .连翘和p .媒介物没有与患胰腺癌的风险。
我们进行了比较的情况下,控制口腔细菌类群的相对多度在所有分类水平(表3看看网上补充图S3)。我们发现更大的丰富Fusobacteria与降低胰腺癌风险(调整或每分每增加的相对丰度= 0.94,95%可信区间(0.89 - 0.99)),以及其属纤毛菌属(或0.87 (0.79 - 0.95))。属Alloprevotella也可能与胰腺癌相关风险(或1.20 (1.01 - 1.43))。经过进一步的调查结果基本相似调整运输p . gingivalis和答:actinomycetemcomitans。进一步分析,确定风险这两个属不能与特定的物种。的关联Fusobacteria和纤毛菌属与胰腺癌的风险在CPS II组群是一致的(见在线补充表S3a)和全方位队列(见在线补充表S3b),尽管的影响Alloprevotella仅限于CPS II组。
吸烟和饮酒与胰腺癌的风险,这些因素影响口腔微生物群落结构,我们对选定的微生物与胰腺癌的关系风险与不吸烟者,而在与结果(表4)。协会答:actinomycetemcomitans与胰腺癌的风险往往大于ever-drinkers(或3.03(1.31 - 7.03))比结果(或0.47(0.13 - 1.72)),尽管这些差异在统计学上没有显著的交互(p = 0.086)。除此之外,没有证据表明其他选择的关联phylotypes与胰腺癌风险由吸烟或饮酒状态不同互动(所有p > 0.05)。
因为胰腺癌可能影响口腔微生物构成,我们还探讨了风险关联选择微生物之间的分层时间样本收集和胰腺癌的诊断(表4)。相关风险p . gingivalis和纤毛菌属仍然排除病例后2年内,发达的样本收集,减少在这个前瞻性研究反向因果关系的可能性。
讨论
在第一个前瞻性评估口腔微生物和胰腺癌的风险,我们表明,牙周病原体的马车p . gingivalis和a . actinomycetemcomitans和减少的相对丰度Fusobacteria和它的属纤毛菌属,与随后的胰腺癌的风险。我们提供了证据,这些联系不太可能由于吸烟或其他潜在的混杂因素。由于勘察设计,这些联系的可能性,也许是因为反向因果关系是最小化。34考虑到这些因素,我们的研究结果指出,一个潜在的病原学的口腔细菌在胰腺癌中的作用。
尽管这是第一个研究前瞻性检查口腔细菌病原体和胰腺癌的风险之间的联系使用口腔细菌的直接测量,有大量的流行病学证据支持这一发现。p . gingivalis和答:actinomycetemcomitans梯形病原体在口腔细菌参与的起始牙周疾病和牙齿脱落。35以前的研究报道,牙周疾病和牙齿脱落的历史与胰腺癌的风险增加相关的前瞻性。10 - 14提供进一步的,虽然间接,协会胰腺癌风险的证据p . gingivalis,一个大型欧洲发现升高血清抗体p . gingivalis被关联到一个胰腺癌的风险增加两倍。15
形成一致的图片时,胰腺癌与口腔健康状况和口腔疾病的细菌司机,尤其是p . gingivalis,几个问题关于潜在的生物通路胰腺癌仍悬而未决。首先,口腔细菌疾病填充遥远的网站吗?Swidsinski等36报道,用荧光原位杂交,密集的multispecies细菌生物被膜,包括口腔细菌类型,出现在患者的胰管钙化的胰腺炎;然而,细菌相同的克隆起源是否发现在胰腺和口腔是未知的。口腔的进一步证据的潜在传播人类的观察,发现这些细菌类型在动脉粥样硬化斑块,37,38远端食管组织,39老年痴呆症患者的大脑,40和foeto-placental单位。41第二,口腔细菌如何填充这些网站?虽然口腔细菌的传播途径胰腺是不确定的,还断断续续持续迁移口腔细菌能吞下或通过咀嚼后的循环系统和个人口腔卫生(刷牙和使用牙线)42,43可能到达胰腺和其他网站,我们以前了。22第三,可以口服病原体参与胰腺癌生成?p . gingivalis已被证明有可能逃避宿主的免疫系统被入侵宿主细胞,破坏细胞因子和受体退化的信号通路。44,45此外,p . gingivalis和答:actinomycetemcomitans可以启动toll样受体(TLR)信号通路,和TLR胰腺癌生成的激活是一个重要的推动力在动物模型中,我们(米勒博士)最近发布了。46
认识到之间的直接关系的证据p . gingivalis、相关口腔病原体,胰腺癌是初步的,还有另一种假说,胰腺和口头条件可能是由于平行,独立的系统性炎症过程。47免疫反应强烈与胰腺致癌作用,和几个建立胰腺癌的风险因素,包括慢性胰腺炎、吸烟和2型糖尿病,可能有炎症组件。48良好的口腔卫生和正常的宿主免疫反应足以减少牙周病原体,而免疫防御的失败可能会导致更高的细菌负荷和牙龈炎症的发展。49而我们的研究指出p . gingivalis和相关口腔病原体作为小说胰腺癌的危险因素,它将需要进一步实验研究建立这些关系的机械基础。
我们还发现,更高的相对丰度的门Fusobacteria和它的属纤毛菌属与胰腺癌的风险降低相关。这一发现来自一个嵌套病例对照研究的结果是一致的从欧洲队列,更高的整体血液抗体水平的同桌的口腔细菌与降低胰腺癌风险(包括抗体有关Fusobacteria物种,虽然不是纤毛菌属具体来说),15但不符合最近8患者的横断面研究,发现大量的高纤毛菌属在胰腺癌患者的唾液而控制。50Fusobacteria厌氧、non-spore-forming革兰氏阴性杆菌和两个主要的家庭,Leptotrichiaceae和Fusobacteriaceae(见在线补充图S3;系统发育树),经常发现在人类口腔。6在纤毛菌属有广泛的遗传多样性,六种属于这属确认到目前为止;51然而,的特点和作用纤毛菌属在人类健康仍不清楚。纤毛菌属被认为是一个投机取巧的病原体,这往往导致疾病在当地或一般预处理因素和被报道参与各种人类感染,51-53包括牙周炎、肺脓疡、肺炎、骨髓炎、心内膜炎和菌血症,后者主要是在immune-depressed病人。此外,纤毛菌属引发人类的免疫反应,血清抗体是很常见的。51可能引发的免疫反应纤毛菌属,而不是纤毛菌属本身,可能对胰腺癌生成提供保护。54需要进一步的人类和实验研究来证实这种关系,并解开复杂的免疫反应在胰腺癌生成的作用。
我们研究的一个限制是漱口水的一次性收集样本,减少我们的捕捉能力可能口腔微生物群和胰腺癌之间动态关系的发展。我们还缺乏研究参与者的牙周疾病状态的信息,这将使我们能够确定牙周病原体是牙周病的独立与胰腺癌。研究的人口是白人,仅限于研究志愿者,可能限制这些发现的generalisability普通人群和其他高风险群体。我们认识到,一些控制胰腺癌确诊或隐瞒,然而,这是不太可能常见的低存活率胰腺癌的确定通过两个组别死亡登记所有癌症死亡。17,19最后,我们没有信息是否相关研究的参与者彼此;这种现象,如果存在,可以引入混淆由于集群内的微生物组成和癌症家庭。
我们的研究有几个优势。首先,进行前瞻性研究,使用口腔样本收集10年癌症诊断之前,提供机会确定口腔微生物群之间的时序关系和胰腺癌的后续发展。此外,嵌套病例对照研究的勘察设计与发病率密度采样控制避免了选择偏差可能发生在传统的病例对照设计。我们的研究使用综合16 s rRNA口腔微生物的筛选,大大拓宽我们对整体的理解细菌结构和大量的细菌类型与胰腺癌。相对较大的样本大小,其中包括361名胰腺癌病例和371匹配控制,提供足够的统计能力检测相关关系提出解释因素和胰腺癌的风险。此外,我们建立和胰腺癌的可能危险因素调整的分析,包括年龄、种族、性别、吸烟情况、饮酒、BMI和糖尿病史。
总之,这个未来的嵌套病例对照研究表明,运输p . gingivalis和a . actinomycetemcomitans和减少门的相对丰度Fusobacteria和它的属纤毛菌属,相关后续增加胰腺癌的风险。这项研究表明,口腔微生物群可能在胰腺癌的病因学中扮演一个角色。
引用
脚注
贡献者是有完全访问所有的数据研究,负责数据的完整性和数据分析的准确性。研究概念和设计:XF, RBH和农协。采集的数据:JW, EJJ、SMG MPP, CCA, RS-S RBH。分析和解释数据:XF,艾娃,JW,软面包卷,EJJ, SMG, MPP, CCA, RS-S,通用汽车、小,RBH和农协。起草的手稿:XF,软面包卷,RBH和农协。关键的修订手稿的重要知识内容:XF,艾娃,JW,软面包卷,EJJ, SMG, MPP, CCA, RS-S,通用汽车、小,RBH和农协。统计分析:XF,艾娃,RBH和农协。获得资金:是的。
资金研究报告在这发表支持部分由美国国家癌症研究所奖数字R01CA159036 U01CA182370, R01CA164964, R03CA159414, P30CA016087 R21CA183887和AACR / J安胰腺癌行动网络。美国癌症协会(ACS)基金的创建、维护和更新的癌症预防研究II组。
相互竞争的利益没有宣布。
伦理批准纽约大学。
出处和同行评议不是委托;外部同行评议。