条文本
PDF
文摘
客观的的临床表现和克罗恩病(CD)是高度可变的。我们试图更好地理解指导这种异质性的细胞和分子机制,并描述与疾病表型相关的细胞过程。
设计我们对基因表达和基因调控(染色质易访问性)non-inflamed结肠组织一群成年患者CD和控制患者。支持我们的研究结果的普遍性,我们分析了以前公布的表达数据从一个大群首次治疗儿科CD和控制回肠。
结果我们发现成年患者CD显然隔离成两类基于结肠癌组织基因表情,很大程度上与正常结肠和一个特定基因表达模式通常特定于回肠。这些类是由基因调控配置文件的变化观察到在染色质水平的可访问性,反映潜在的分子表型的根本性转变。此外,基因表达的国际执法学院首次治疗的儿科患者CD可以同样分为colon-like和ileum-like类。最后,表达模式在这些CD子类强调大规模免疫反应和细胞代谢方面的差异,并与多个临床表型描述疾病有关的行为,包括直肠疾病和结肠切除术的必要性。
结论我们的研究结果有力地表明,这些分子签名定义两个临床相关形式的CD无论组织采样位置,病人年龄或治疗状况。
- 克罗恩氏病
- 基因调控
- RNA表达
- 能量代谢
- 炎症性肠病临床
来自Altmetric.com的统计
本研究的意义
已知在这个问题上是什么?
克罗恩病(CD)是一种临床异质性的疾病与变量表示和进展。
目前治疗乳糜泻患者主要是基于主观的临床分类导致不一致的反应。与其他复杂疾病,特别是某些癌症,目前无法确定个性化的治疗方法。
遗传协会研究表明潜在的分子或遗传因素导致疾病异质性,但确切机制知之甚少。
有什么新发现吗?
基因表达和染色质易访问性可以细分CD到至少两个不同的分子子类与特定疾病表型。
这些子类表现出鲜明的表达差异在细胞代谢和免疫途径。
相似的分子表型也观察到在首次治疗儿科患者CD,从而定义真正的疾病子类独立于治疗历史和病人的年龄。
它会如何影响临床实践在可预见的未来吗?
我们的研究结果提供的证据的分子基础观测到的异质性在CD。他们还提供了一个独特的机会,开始探索定制治疗方案指导下子类疾病提供新的治疗途径和预测疾病的结果。
介绍
克罗恩病(CD)是一种慢性异构炎症性疾病有明显的临床行为模式。CD可能现在或随着时间演变成一个更复杂的表型患者发展狭窄、漏管和/或脓肿,许多病人高度变量响应治疗经验。基因关联1,2最近和一个定义脂质metabolism-based基因表达特征预测疾病的介入3表明分子或遗传因素和可能导致疾病异质性,但确切机制知之甚少。定义的分子亚型基因表达影响的临床表型也被记录在其他复杂疾病,特别是癌症。4 - 6成人CD是否可以同样分为两个或两个以上的子组,这些分子类是否可以解释疾病表型在很大程度上仍是个未知数。
了解基因调控基因表达提供补充信息。我们和其他研究基因调控通过关注访问染色质,转录监管机构可以绑定到否则高度浓缩的核基因组。染色质易访问性与推动者,增强剂,消音器和绝缘体,7和改变细胞通过分化和发展建立身份8,9或细胞反应压力。染色质分析提供了一种机制为什么表达变化,以及是否观察到的变化可能是临时或永久。我们已经证明,染色质易访问性可以区分疾病亚型10并有助于描述疾病的遗传和环境因素。11因此,我们试图确定是否有多个临床成人CD存在不同的子类通过检查两个基因表达,使用RNA-seq,染色质可访问性,使用formaldehyde-assisted隔离监管元素(FAIRE-seq),12在从CD和non-IBD患者结肠粘膜的影响。
结果
全基因组审讯的结肠转录和染色质景观揭示了两个不同的分子类CD
来确定,以公正的方式,无论基因表达水平分隔成不同的分子组样品,我们进行了主成分分析(PCA)使用一套组合的基因表达谱21 CD患者和11 non-IBD患者。出现了一个引人注目的集群模式,即与CD被分成两个不同的个体,表达式的子类,其中一个集群non-IBD控制(图1A)。专门询问这两个CD子类,我们确定了这两个组之间的基因差异表达CD患者(849个基因在错误发现率(罗斯福)< 0.05;图1B,看到在线补充表S1排名前20位的差异表达基因在每个CD子类)。令人惊讶的是,当看排名前25位的差异表达基因不管方向,大多数人组织表达模式,从小肠结肠歧视(回肠),包括NXPE4,CWH43和游离钙(结肠靶向)以及RBP2,TM6SF2,飞机观测,MTTP,CREB3L3和CPS1(ileum-specific)。13CD non-IBD控件(样品相似图1一)表现出丰富的上面的结肠靶向基因的表达,而其他CD子类显示表达模式更符合回肠结肠尽管被取样。探索更在全球范围内,我们比较这些差异表达的基因有947个基因与已知的结肠和回肠之间重要的微分表达式(图1C)。14我们发现34%的基因高表达colon-like CD样本确实正常结肠的标记,和44%的回肠标记基因高表达ileum-like CD样本(p < 1×10−95超几何测试)。来验证这些表达差异,我们执行反向transcription-quantitative PCR 18日光盘的样本影响结肠粘膜(9 colon-like 9 ileum-like)使用CEACAM7和APOA1作为colon-like代理和ileum-like表达模式(请参阅在线补充图S1A)。同意RNA-seq数据,CEACAM7明显更丰富colon-like CD样本(p = 0.017,片面的t检验),而APOA1在ileum-like CD更丰富的样品(p = 0.020,片面的t检验)。
两个不同的分子亚型在成人克罗恩病(CD)。(A) RNA-seq数据的主成分分析(PCA)分析从结肠组织21 CD患者和11 non-IBD患者显示了两个不同的集群。八百四十九(B)两者之间的基因差异表达CD子类(p < 0.05, DEseq),定义为调整colon-like ileum-like。被标记的结肠和回肠高亮显示。(C)基因调节colon-like(上)和ileum-like(底部)CD子类之前定义的结肠靶向和ileum-specific基因重叠,分别。(D)访问不同地区(dar)确定使用formaldehyde-assisted隔离监管元素(FAIRE-seq) (p < 0.05,双面的t检验,正常读计数,windows 300个基点)在colon-like和ileum-like CD样本显示不同的概要文件。(E) Colon-like-associated dar是丰富和ileum-like-associated dar枯竭在colon-like样本基因调节附近(p≤0.01,排列测试)。(F) Ileum-like-associated dar是丰富和colon-like-associated dar枯竭在ileum-like样本基因调节附近(p < 0.001,排列测试)。
确定这些表情的变化代表了这些组织的功能细胞的身份根本转变,我们通过执行FAIRE-seq染色质易访问性调查12在同一样本来自CD子类。支持潜在的分子表型的根本性转变,我们确定了300 - 3339 bp的地区明显微分染色质colon-like和ileum-like CD样本之间的可访问性(图1D;p < 0.05,双面的t检验),以下简称为不同地区(dar)访问。这些dar可分为两类基于更大的可访问性colon-like或ileum-like CD样本,并进一步,一个无监督的PCA FAIRE-seq数据近分离ileum-like colon-like CD子类(见在线补充图就是S1C)。子类特有的染色质景观变化与强烈附近(在50 kb)基因表达的差异(图1E, F;p≤0.01,排列)。此外,结肠靶向和ileum-specific dar表现出显著富集CD全基因组关联研究(GWAS)位点15与什么相比预计由于随机机会(ileum-specific结肠靶向p = 0.018, p = 0.006;排列),这表明染色质易访问性的变化发生在disease-relevant区域的基因组。
我们接下来寻求注释这些dar基于组织基因调控的信息。转录后修饰组蛋白蛋白质有助于compartmentalise监管的基因组和划分的功能元素。16使用染色质免疫沉淀反应(ChIP-seq)表观基因学的数据项目,17我们评估了六组蛋白的浓缩的修改反映潜在的监管活动(活动:H3K4me1 H3K4me3, H3K27ac, H3K36me3;压制:H3K27me3 H3K9me3)在结肠靶向和ileum-specific dar。我们发现结肠靶向dar被H3K27ac划定,H3K4me1修改存在于结肠但不是回肠(见在线补充图印地),这表明这些dar函数作为活跃的监管区域只在正常结肠。相比之下,ileum-specific dar证明积极H3K27ac H3K4me1浓缩只发现在正常小肠,尽管这些样本来自结肠组织。这些表明监管活动dar有助于colon-like和ileum-like表达水平。确认监管活动,我们克隆三dar(两个结肠靶向和ileum-specific染色质易访问性)为最小的上游启动子荧光素酶向量在两个方向使用THP-1单核细胞(见在线补充图S1D)。相对于空的矢量控制,两个dar(联系在一起SATB2-AS1和DEPDC7)表现出显著增加(p < 0.01,片面的t检验)的荧光素酶活性在两种取向,强烈提示的增强功能。第三个DAR(联系在一起SLC16A9)也增强的荧光素酶活性显著(p = 8.9×10−5片面的t检验),然而,只有在相反的方向。
这些数据支持的存在两个分子不同的子类的CD。此外,染色质易访问性数据显示这些子类存在由于基因组的稳定分子转换架构在结肠组织细胞,而不是由于外部细胞信号瞬态差异。
全基因组RNA-seq分析显示colon-like ileum-like子类在首次治疗儿科患者CD
基因表达谱在成人患者由于治疗CD可能不同的历史。因此,我们试图确定是否首次治疗儿科患者CD也隔离成类似分子类。之前我们进行了主成分分析在从回肠活检RNA-seq数据发表在儿科患者年龄CD (n = 201)和non-IBD (n = 40)小儿内产生危险分层研究。3尽管集群与成人一样的样品没有观察到,non-IBD回肠样本聚集一些CD样本在第一主成分,而其他CD样本(见在线分离补充图S2)。这种模式是否与成人CD分子亚型,我们进行了主成分分析结合成人结肠和儿科回肠表达数据(图2A)。不出所料,样品主要由组织的起源(结肠和回肠;第一个主成分)。然而,一个分离的两个分子子类明显的说明第二个主成分,第一主成分和相关几乎完全在单一队列PCAs(见图1一个在线补充图S2)。此外,儿科CD样本落在光谱高度相关的表达APOA1回肠的标志基因和疾病指标结果在儿科人群。3这种模式一致与ileum-like (APOA1-)和colon-like (APOA1低)子类我们发现在成年人的CD结肠。
首次治疗儿科克罗恩病(CD)样本显示类似的分子亚型。(一)主成分分析(PCA)相结合的分析从成人结肠RNA-seq数据组织和儿科患者回肠组织CD和non-IBD显示分离的组织类型(PC1)和复制ileum-like和colon-like集群(PC2)。的表达APOA1(蓝色粉色低)在儿科样本非常符合子类。(B)使用500结肠靶向和ileum-specific RNA-seq数据的分层聚类基因显示集群与ileum-like和colon-like样本相关的基因在成人结肠和儿科回肠军团,以及原产地与组织相关的基因。
仔细检查之间的关系两个CD子类在成人和儿科军团,我们评估基因表达模式在500年大多数不定地表示已知的结肠和回肠标记基因14使用层次聚类(图2B)。专注这一分析,我们选择了50个儿科回肠样品每个最colon-like和大多数ileum-like基于PCA (图2第二主成分)。许多上述结肠和回肠代表基因(例如,APOA1,CEACAM7,MTTP,LEFTY1和游离钙)表现出高度一致的表达模式在所有样本分子子类定义,无论队列。有趣的是,对于这些500个基因,表达模式之间非常一致colon-like CD和non-IBD结肠癌样本,ileum-like之间以及CD和non-IBD回肠样本。重要的是,我们注意到的一个子集基因区分所有回肠结肠组织组织表明tissue-of-origin-specific表达并非完全丢失。总之,这些数据表明,colon-like和ileum-like分子特征定义两种形式的CD现在无论组织采样位置,病人年龄或治疗状况。
代谢和免疫激活基因表达谱特征不同的分子表型在成人和儿科CD
基因表达差异colon-like ileum-like子类在成人和儿科CD军团超越上述标记基因(图1B, C)。评估这个更广泛地说,我们计算和比较pathway-level表达模式CD子类和non-IBD控制在两个病人军团。18,19然后我们分组显著改变途径基于相似的基因组成和方向(见的表达差异图3在线补充数据S3和S4)。首先,众多有关干扰素信号通路,g蛋白偶联受体(GPCR)信号、和抗原处理显著调节CD患者作为一个整体相对于non-IBD在线控制在两个组别补充图S3:“CD-enriched”,红色)。鉴于成人患者队列由disease-unaffected组织,和儿科人群首次治疗,这表明基底激活免疫系统的CD。相比之下,很多RNA加工通路相关,翻译和转录表达下调在CD在儿科病人(见在线补充图S3:“CD-depleted”,蓝色)。这些结果充分证实研究在小鼠和人类整体缺陷在CD细胞蛋白加工与免疫激活和炎症有增无减。20.
通路富集差异表达基因与克罗恩病(CD)表型有关。途径充实测定使用基因关联分析(GSAA)(罗斯福< 0.1,排列测试)对所有成对比较所有的CD, colon-like CD, ileum-like CD和non-IBD样本。单独分析成人结肠(A)和(B)儿科回肠显示类似的和独特的途径与CD表型有关。每个圆圈代表一个Reactome-defined通路的大小反映通路中的基因的数量。路径是基于相似基因成员分组,和标签描述multipathway集群所示。在网上看到的补充数据S3和S4乳糜泻和non-IBD比较和通路的完整列表。
接下来,我们发现显著改变路径,描述了ileum-like colon-like CD不同子类。两个组别中最明显的影响强烈的差异反映在代谢活动包括参与脂类代谢途径和代谢的外国(异型生物质)代理(图3答:“ileum-like-enriched”,红色;图3B:“colon-like-depleted”,蓝色)。有趣的是,能源生产通过三羧酸(TCA)周期是在反对方面显著影响:在成人,调节colon-like类同时ileum-like类结肠组织中表达下调(图3答:“colon-like-enriched, ileum-like-depleted”,粉红色);而在儿科患者中表达下调colon-like ileum-like类中的类和调节在回肠组织(图3B: ileum-like-enriched, colon-like-depleted,紫色)。这表明,能源生产增加病人的亚型更类似于组织起源,并减少基因表达时采用相反的组织模式。此外,几个GPCR信号通路相关调节ileum-like子类在结肠组织(图3答:“ileum-like-enriched”,红色)和调节在回肠组织(colon-like子类图3B:“colon-like-enriched”、绿色)。GPCRs高度表达的单核细胞和巨噬细胞炎症的发展和发展核心CD,主要通过发炎组织内的迁移和积累。21
综上所述,代谢通路的失调可能代表CD亚型的定义特征。虽然脂质代谢失调已经先前描述的CD,3我们的数据显示,这些改变可能是某些子类中的特定只有病人和依赖于组织化验。此外,这些数据表明,尽管惊人的相似关键回肠和结肠标记基因的表达(图2B),有关键pathway-level表达式模式差异成人和儿科患者CD患者,如免疫反应(例如,nucleotide-binding寡聚化域(点头)信号,toll样受体(TLR)信号的信号,白介素信号),它指向每个子类的临床相关的表型和特点。
分子子类与临床结果相关联
了解临床疾病分子表型的影响,我们研究了首次治疗儿科患者的临床特征对分子的子分类。我们再次使用了50 ileum-like和50 colon-like儿科样品上面定义。我们发现更多患者colon-like CD显示结肠和回肠参与(p = 0.0014),深溃疡(p = 0.0002),显示宏观炎症(p = 0.0156),而更多ileum-like CD没有炎症患者(p = 0.0122)在流行和强大的斜向colon-only参与(p = 0.0528;表1)。
我们下一个深入回顾图审查和执行所有成年患者的前瞻性随访CD(见表1和在线补充表S1),看看类似的临床观察分子子类的影响。colon-like CD患者有更大的直肠疾病介入(p < 0.01),更有可能最终需要结肠切除术(p = 0.01)。ileum-like CD患者倾向于回肠疾病(p = 0.06),需要使用术后生物治疗(p = 0.02)。样本容量虽小,这些数据表明,分子亚型的CD可以分层病人临床上明显的和相关的子组,并可能更前瞻性地识别那些可能需要强化药物治疗。
讨论
我们确定了两个不同的分子表型在结肠组织获得成人患者的CD。当我们相同的分析方法应用于儿科RNA-seq回肠的数据,两个分子表型也出现了,尽管在这两种情况下的临床后果是相关研究的人口和有限的为每个人口数据收集的临床表型。虽然成年病人样本容量是有限的,只有colon-like CD子类有直肠疾病的病人,或者需要结肠切除术。直肠CD尤其难以管理,尽管它可能代表一种独特的CD表型,其内在的分子机制是未知的。22 - 24儿科colon-like疾病患者更有可能有宏观炎症,深溃疡、回肠和结肠的参与。这些数据强调了需要继续和扩大这些研究随着时间的推移将进化成人和儿科患者的临床表型,和需要研究这两个组织在同一病人。只有通过这样的研究我们发现起源的组织是否决定潜在的临床表型类似。
ileum-like CD子类主要特征的upregulation通路参与脂质和异型生物质新陈代谢。这些临床表型之间的关连,这里定义的脂质代谢特征还有待探索;然而,脂质代谢可能涉及的含义是有趣的有几个原因。首先,脂质代谢和改变某些脂类水平之前一直与炎症性肠病(审查有关25),可能与炎症和免疫状态信号(综述26),除了饮食和肠道微生物群组成。27血脂水平也有可能导致或增加肠内氧化应激的结果,这也被证明是在CD患者中升高了28)。值得注意的是,两个之间的差异表达基因的CD实际上是子类GSTA1和GSTA2氧化应激反应的主要介质。29日此外,饮食、胆固醇和微生物群组成各自研究自己潜在的治疗或水平如何改变由于手术或生物使用(审查25)。
细胞状态的多样性表明转录和染色质水平有着重要的潜在的治疗意义。我们的研究结果表明,额外的测试的CD患者特定的分子特征,尤其是代谢途径,可能决定潜在的治疗组。这种方法已经增加了我们对人类癌症生物学的理解。在各种形式的癌症病人子分类,尤其是乳腺浸润性肿瘤4,5导致许多联想与临床结果,并帮助塑造未来的治疗策略。越来越多的共识,亚型存在于CD,每个都有自己的演讲中,基因组成和预后。作为第一步,分子层次的存档患者主要临床试验的组织和血清可以执行上下文中的响应生物和微生物治疗CD。30.
我们当前研究肠道的调查地区不允许来自同一个人,但是他们提供重要的动机未来的探索更大的群组研究中进行的这些分子子类纵向匹配结肠和回肠组织相同的病人。新的更大规模的研究应该允许一个更完整的理解分子宿主环境的相互作用对疾病的影响及其效用在指导临床决策。此外,这里的样本数量太有限,研究遗传变异的影响确定染色质可访问性和基因表达的变化。染色质易访问性数据强烈建议改变发生在基因组位点之前通过遗传变异与疾病相关。未来的研究样本量大,将有助于确定特定基因疾病易感性之间的关系,监管活动,基因表达水平和临床表型和更好地描述个体层面的疾病subphenotypes在这个非常异构的疾病和组织。基因组研究复合细胞类型(例如,免疫和上皮细胞)可能也有必要研究特异性机制推动phenotype-specific疾病发病机理。
材料和方法
更详细的信息,请参阅在线补充的方法。所有基因表达的测序数据综合处理(GEO)加入GSE85499通过dbGaP与原始序列数据可用。完整的数据表也在http://fureylab.web.unc.edu/datasets/crohns-disease-molecular-subtypes/。
统计数据
差异基因表达检测用DEseq调整p值阈值为0.05。微分染色质易访问性检测使用一个双边t检验p值阈值为0.05。途径充实测定使用GSAA(罗斯福< 0.1,排列测试)对所有成对比较所有的CD, colon-like CD, ileum-like CD和non-IBD样本基于微分基因表达使用双面t p值计算。临床表型关联与双边t检验或确切概率法进行测试。
研究批准
所有程序都是在北卡罗莱纳大学的机构审查委员会批准(IRB)协议10 - 0355、14 - 2445和11 - 0359。
确认
我们感谢Aronow和l . Denson援助与儿科病人数据(汽车制造商风险队列)。在UNC所有测序实验进行高通量测序设施(HTSF)。
引用
脚注
MW、JMS、TSF和深圳同样起到了推波助澜的作用。
贡献者MW、JMS、BK, AR GRG,海量存储系统(MSS)中,DPBM获得数据。MW, JMS和JWI分析和解释数据。MW和JMS准备数据,起草和修订后的手稿。苏格兰皇家银行,终极战士,RR、TSS和MJK提供帮助组织获取和患者表现型。深圳和TSF设计并监督这项研究,获取、分析和解释数据,起草和修订后的手稿和获得资金。深圳概念化的研究作为研究赞助商。所有作者维护工作的完整性,通过完整的手稿,并负责所有方面的工作。
资金国家环境健康科学研究所(R01-ES024983),国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所(P01-DK046763、P30-DK034987 R01-DK094779, T32-DK007634和U01-DK062413),美国胃肠病协会研究学者奖(深圳),广泛的医学研究项目,克罗恩氏美国ߣ年代的职业发展和结肠炎基金会奖(深圳)和微生物的财团,UNC团队转化科学奖项,和赫尔姆斯利相信分享2、项目3。
相互竞争的利益没有宣布。
伦理批准北卡罗莱纳大学IRB。
出处和同行评议不是委托;外部同行评议。