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摘要
客观的免疫检查点抑制剂在胰腺导管腺癌(PDAC)中疗效有限，这促使了对联合治疗的研究。我们假设白介素6 (IL-6)阻断会调节PDAC的免疫特性，并增强抗程序性死亡配体1 (PD-L1)检查点抑制剂治疗的疗效。
设计分别通过Nanostring和免疫组化分析原发性患者源性胰腺星状细胞(PSCs)的转录谱和IL-6分泌。我们使用靶向IL-6、PD-L1、CD4或CD8的抗体(Abs)在皮下或原位模型中使用Panc02、MT5或KPC-luc细胞系进行体内疗效和机制研究;以及激进的基因工程PDAC模型(KrasLSL−G12D, Trp53LSL−R270HPdx1-cre, Brca2/ F(KPC-Brca2老鼠))。用流式细胞术或免疫组化分析检测全身和局部免疫表型的变化。
结果PSCs (n=12)表现出显著的IL-6表达，其定位于肿瘤间质。IL-6和PD-L1联合阻断可在皮下MT5和Panc02肿瘤小鼠中产生疗效(p<0.02)，并伴有瘤内效应T淋巴细胞(CD62L)增加−CD44−)．在具有Panc02肿瘤的小鼠中，消耗cd8但不消耗cd4的抗体废除了IL-6和PD-L1联合阻断剂的疗效(p=0.0016)。这种治疗组合还在KPC-luc原位肿瘤小鼠中激发了显著的抗肿瘤活性，并限制了KPC-Brca2小鼠的肿瘤进展(p<0.001)。组织学分析显示，多种模型肿瘤中t细胞浸润增加，α-平滑肌肌动蛋白细胞减少。最后，与同型对照相比，IL-6和PD-L1阻断增加了KPC-Brca2小鼠的总生存率(p=0.0012)。
结论这些临床前结果表明，靶向抑制IL-6可能增强抗pd - l1在PDAC中的疗效。
- 胰腺癌
- 白细胞介素
- 免疫疗法
来自Altmetric.com的统计
本研究的意义
关于这个问题，我们已经知道了什么?
检查点阻断免疫疗法在胰腺癌患者中的疗效有限。
促炎细胞因子白细胞介素6 (IL-6)在胰腺癌患者中高度升高，是预后的一个因素。
新的发现是什么?
胰腺星状细胞是胰腺肿瘤微环境中IL-6的主要来源。
阻断IL-6和程序性死亡-1配体1 (PD-L1)可以限制肿瘤进展，提高侵袭性胰腺癌小鼠模型的总生存率。
联合治疗增加了具有Th1表型特征的循环细胞和瘤内效应T细胞。
联合阻断IL-6和PD-L1免疫治疗在CD8中产生疗效+T-cell-dependent方式。
在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?
这些临床前的结果阐明了一种新的联合疗法，可以转化为临床。
我们的结果表明靶向IL-6可以改善胰腺癌患者对检查点阻断免疫治疗的反应。
简介
预计到2030年，胰导管腺癌(PDAC)将超过乳腺癌和结肠癌，成为癌症相关死亡的第二大原因。1PDAC的主要困难之一是其临床沉默。通常情况下，这种疾病只有在肿瘤侵入周围组织或转移到远处器官后才会变得明显。2多年来，目前大多数晚期PDAC患者的治疗标准都是基于吉西他滨的方案，包括与nabb -紫杉醇(Abraxane)的联合治疗。3.或积极化疗(如FOLFIRINOX)作为一种策略，以缩小肿瘤和提高手术的可能性。无论如何，这些进展可能只是渐进式的，并证明了进一步的研究，以确定具有长期临床反应潜力和治愈这种毁灭性恶性肿瘤的新策略。
白介素6 (IL-6)下游的信号在PDAC的发生和发展中很重要。4，5这种多效性细胞因子结合膜受体复合物，其中含有共同信号转导受体链GP130(糖蛋白130)，6从而启动一系列复杂的信号事件，包括JAK/STAT, MAPK和磷酸肌醇3激酶(PI3K)通路。7，8特别是STAT3通过Tyr位点的磷酸化被激活705在大多数人PDAC标本中，并与活化合作喀斯特在小鼠模型中驱动PDAC的启动和进展。9，10IL-6/STAT3轴可同时促进免疫抑制细胞的扩增或改变t细胞亚群的平衡。在这些亚群中，最值得注意的是骨髓来源的抑制细胞(MDSCs)和T调节细胞，因为它们的显著扩张和在晚期GI癌患者中作为不良预后指标的作用。11 - 13有趣的是，我们和其他研究小组的数据表明，胰腺间质可能是IL-6的来源之一。这种细胞因子由包括胰腺星状细胞(PSCs)和肿瘤相关骨髓细胞在内的基质成分大量产生。5，14通过这种方式，IL-6可以与其他细胞因子合作，无论是在全身还是在肿瘤微环境中，进一步放大患者的免疫变化。最近的研究使用诱导剂喀斯特-介导的PDAC小鼠模型也显示IL-6在PDAC进展中起作用。4，15事实上，IL-6的缺乏完全消融了癌症的进展，即使是在致癌物质存在的情况下喀斯特．4与这些数据一致的是，我们小组最近的结果强调了全身IL-6在PDAC患者中的重要性。16我们分析了未经治疗的转移性或不可切除PDAC患者的血浆，发现IL-6、IL-10和MCP-1与总生存率显著相关，而IL-6与总生存率呈强负相关。16
免疫疗法在其他癌症中的显著疗效可能会在PDAC患者身上实现，这一点仍然是乐观的。事实上，用中和抗体(Abs)阻断t细胞检查点受体已成为一种有前途的免疫治疗方法。17，18程序性死亡-1配体1 (PD-L1)，也被称为B7-H1，是一种细胞表面蛋白，是程序性死亡受体1 (PD-1)的两种配体之一，PD-1是一种负调控t细胞反应的共刺激分子。19，20.肿瘤细胞上的PD-L1与T细胞上表达的PD-1连接可抑制T细胞的活化和增殖，并可诱导细胞凋亡。PDAC患者肿瘤内PD-L1表达与不良预后相关。17，21事实上，肿瘤细胞或基质中PD-L1表达的增加是逃避宿主免疫的基本机制。
理论上，IL-6的封锁可以调节PDAC在体循环和肿瘤微环境中的免疫特性，从而增强抗pd - l1的抗肿瘤活性。IL-6阻断Ab是PDAC联合治疗方案中有吸引力的组成部分，原因有很多。首先，FDA批准了IL-6靶向抗体用于其他适应症，并可以很容易地用于肿瘤学。其次，来自我们小组和其他人的数据表明IL-6是由多个细胞隔层产生的促进免疫抑制和PDAC进展的主要因素。17，22 - 24最后，阻断IL-6可能会调整肿瘤宿主的髓细胞和t细胞间室的表型特性，使其更适应免疫治疗方案的疗效。
这项临床前研究验证了IL-6阻断会增强PDAC临床前模型中抗pd - l1检查点抑制剂治疗效果的假设。在皮下MT5和Panc02模型、原位KPC荧光素酶模型和PDAC侵袭性基因工程小鼠模型(GEMM)中观察到这种治疗的显著益处。机制研究显示增加的胰腺效应t细胞浸润和疗效依赖于CD8+T细胞。这些结果表明，靶向IL-6可能通过改善表型特性和T细胞浸润来增强靶向PD-L1的Abs在PDAC中的疗效。
实验方法
细胞系和试剂
小鼠胰腺癌细胞系Panc02从ATCC购买，在RPMI (Gibco)中与10%胎牛血清(FBS)、10 mM l-谷氨酰胺和抗生素培养。小鼠MT5(喀斯特LSL−G12D, Trp53LSL−R270H和Pdx1-cre)胰腺细胞是Tuveson博士(冷泉港实验室，冷泉港，纽约，美国)善意的礼物，并在RPMI (Gibco)与10%胎牛血清，10 mM l-谷氨酰胺和抗生素培养。原位实验用KPC-luc细胞来源于KPC小鼠(KrasLSL−G12D, Trp53−−/和PDX-1-Cre)，并如前所述用增强型萤火虫荧光素酶转染。25小鼠同型对照(克隆3E5.2H12)、抗il - 6r(克隆BP-5875)和抗pd - l1阻断抗体从Genentech公司(San Francisco, California, USA)获得，用于在KPC-Brca2小鼠模型中进行体内研究。小鼠抗IL-6抗体(克隆MP5-20F3)、PD-L1(克隆10F.9G2)或同型对照(克隆LTF-2和HRPN)从BioXcell(美国新罕布什尔州西黎巴嫩)购买，用于使用MT5、Panc02和KPC-luc细胞系进行体内研究。
小鼠胰腺癌模型
KPC-Brca2小鼠通过杂交繁殖产生Brca2flox2 / flox2；喀斯特LSL−G12D / +与Brca2flox2 / flox2，Trp53LSL−R270H/+而且Pdx1-cre动物。26鼠标菌株p53LSL−R270H(应变01 xm3数量),喀斯特LSL−G12D(菌株号01XJ6)和Pdx1-cre(品号01XL5)从美国国家癌症研究所弗雷德里克小鼠库获得。本研究中产生的所有转基因小鼠均维持在129/B6混合遗传背景下。所有涉及MT5、Panc02和KPC-luc肿瘤的研究都使用了同基因雌性C57BL/6小鼠，5-6周龄。
体内疗效研究
KPC-Brca2小鼠(5周龄)以同型对照、抗il - 6r和/或抗pd - l1抗体(基因泰克)200 μg/只，每周3次(周一、周三和周五)。治疗2周后，动物经CO安乐死2窒息，然后心脏穿刺。收集血浆、脾细胞和肿瘤组织作进一步分析。通过h&e染色玻片评估病理学，以确定组织的分化状态为胰腺上皮内瘤变(PanIN) 1A, PanIN 1B, PanIN 2或PDAC。关于使用MT5和Panc02肿瘤的研究，请访问1×106或3×105分别在C57BL/6小鼠腹部皮下注射200 μg/只的同型、抗il -6或抗pd - l1抗体(BioXCell)抗体治疗，从肿瘤达到50-100 mm开始，每周3次3.体积。在原位研究中，C57BL/6小鼠被注射1×106胰腺尾部基质(BD Biosciences)中的KPC-luc(荧光素酶表达)细胞。每周用生物发光成像分析肿瘤生长情况，研究结束后立即测定肿瘤重量。小鼠每周用200 μg/只的同型抗il -6或抗pd - l1抗体(BioXCell)治疗3次。在t细胞消耗研究中，Abs消耗CD4(克隆GK1.5;或CD8(克隆2.43;BioXCell)分别在−2、−1、+1、+4天和之后每隔3天腹腔注射100 μg /只小鼠，直到如上所述的研究完成。27在生存研究中，KPC-Brca2小鼠从5周龄开始使用同型对照、IL-6或PD-L1抗体作为单一或联合药物(200 μg/小鼠每个Ab, BioXCell)治疗，直到根据机构动物护理和使用委员会(IACUC)协议确定小鼠死亡。
PSC分离和纳米串分析
在James癌症医院和Solove研究所(美国俄亥俄州哥伦布市)接受手术切除的人类胰腺肿瘤患者的组织是在知情同意后，根据机构审查委员会批准的方案获得的。用手术刀将组织切开0.5-1 mm3.切片，然后镀成六孔10厘米2在含10%胎牛血清和抗生素的DMEM中无包被培养孔，37℃培养。PSCs通常在2-3周内从组织中生长出来，通过形态学和组织学分析α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的特征+)染色。PSCs在每周两次的新鲜培养基中培养3代，然后用Trizol萃取法收集RNA。RNA分析使用nCounter胰腺癌免疫分析面板(Nanostring Technologies, Seattle, Washington, USA)。
免疫组织化学分析
肿瘤组织在知情同意后，在机构审查委员会批准的方案下，在手术中前瞻性地获得。从人体组织标本和小鼠体内实验中提取福尔马林固定的胰腺组织，在用抗IL-6抗体(Abcam和eBioscience)、pSTAT3染色后进行免疫组化(IHC)分析(目录4904;细胞信号通路)，α-SMA(目录M0851;Dako)、PD-L1 (NBP1-76769目录)和CD3 (A0452目录;Dako)。α-SMA定量时，使用PerkinElmer's Vectra多光谱幻灯片分析系统捕获胰腺20倍放大图像(每只小鼠8-10张)。使用inForm软件工具来量化每张图像中的阳性SMA细胞(快速红显色原)(见在线)补充图1)．用于分析CD3+在40倍放大倍率下计数胰腺细胞，盲法组织学染色，每只小鼠至少计数10个野。
流式细胞术
用流式细胞术对肿瘤的脾细胞和单细胞悬液进行免疫表型分析。MDSCs的抗体为CD11b-APC(克隆M1/70;BD Biosciences)， Ly6G-FITC(克隆1A8;BD Biosciences)和Ly6C-PE(克隆AL-21;BD生物科学)。对于t细胞激活标记物，细胞用CD4-PE-Cy7特异性抗体染色(克隆RM4-5;BD Biosciences)， CD8-PE-Cy7(克隆53-6.7;BD Biosciences)， CD62L-PE(克隆MEL-14;BD Biosciences)和CD44-FITC(克隆IM7;Biolegend)。 To determine Th1 and Th2 phenotypes, cells were stained using fluorochrome-conjugated Ab-targeted CXCR3-PE-Cy7 (clone CXCR13-173; Biolegend), CCR4-PE (clone 2G12; Biolegend) and CCR6-APC (clone CK4-L3; BD Biosciences). Cells were incubated on ice for 30 min, washed and fixed in phosphate buffered saline (PBS) containing 1% formalin for flow cytometric analysis on a LSRII flow cytometer (BD Biosciences).
统计数据
对于Nanostring (Nanostring Technologies, Seattle, Washington, USA)获得的数据，阳性峰值对照首先用于规范化分析效率。阴性对照用于访问背景杂交和过滤低表达探针。参考基因用于生物样本的归一化。然后用线性混合模型检测差异表达的rna。方差平滑法用于改进检验中的方差估计。28通过控制假阳性的平均数来调整显著性。29流式细胞术和免疫组化获得的数据以及肿瘤体积在分析前进行对数转换，以满足模型的正态性和同方差假设。泊松回归用于建立KPC-Brca2小鼠PanIN3/肿瘤病灶数量的模型。肿瘤体积随时间的变化采用混合效应回归模型，对分组、时间和两者的相互作用具有固定效应。采用非结构化协方差矩阵对随机效应进行分析。在检验肿瘤生长的t细胞消耗实验中，建立了相互作用对比，以实现对考虑中的假设的直接检验。30.对于Kaplan-Meier生存曲线，使用log-rank检验来确定差异。其他结果采用方差分析进行比较。p值<0.05被认为具有显著性，所有分析均在SAS V.9.4 (SAS Institute, Cary, North Carolina, USA)或R V.3.2.3 (R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria)中进行。
结果
胰腺肿瘤间质是肿瘤微环境中IL-6的主要来源
在这些研究中，我们对基因表达进行了无监督评估，以确定PSCs中可操作的免疫靶点，这是PDAC基质的重要组成部分。如前所述，从10例不同患者的手术切除的胰腺组织中分离和体外培养星状细胞。14经过三次传代后，提取RNA，并使用纳米串技术(Nanostring panccancer Immune profiling Panel)对与免疫生物标志物相关的转录本进行分析。与从正常人类胰腺成纤维细胞中分离的RNA相比，从患者来源的PSCs中分离的RNA表现出细胞因子和趋化因子(包括IL-6和CCL11)表达显著增加(图1和在线补充图2)．通过免疫组化分析进一步的研究证实了IL-6的染色模式，主要定位于胰腺肿瘤的粘连组织和间质区域，偶尔在包含恶性胰腺上皮细胞的区域染色(图2A).这一趋势在几个(n=13)有代表性的患者(图2B).这些数据与我们对PSCs转录本的分析一致，表明间质间室是胰腺肿瘤微环境中IL-6的主要来源。
患者源性胰腺星状细胞(PSCs) mRNA转录产物的概况。从10个患者来源的胰腺癌星状细胞中分离出RNA，并使用Nanostring nCounter PanCan免疫分析板进行分析。数据表达为与正常人类胰腺成纤维细胞系比较的表达的折叠变化和相对于几个管家基因。基因的折叠变化从高到低排列。具有层级聚类的基因的热图，具有至少两倍的上升或下降变化，且p<0.01截止。红色表示高表达，绿色表示低表达。
白细胞介素6 (IL-6)在人胰导管腺癌(PDAC)组织间室表达丰富。人PDAC肿瘤(n=13例患者)免疫组化染色IL-6表达。(A) 3个代表性患者样本的IL-6 (Brown Chromogen)免疫组化(IHC)染色，放大倍数分别为10倍和20倍。每个患者的组织切片用同型对照Ab染色，以说明背景。(B)量化每个野区il -6阳性细胞的数量。
IL-6/JAK/STAT通路组分和PD-L1在胰腺癌小鼠模型胰腺肿瘤微环境中的显著表达
与人类PDAC相似，PDAC原位和GEMM的胰腺组织学特征显示，两者间质中均表达IL-6，在某些肿瘤病灶中阳性染色更有限(图3)．与之前发表的研究一致，来自GEMM (KPC和KPC- brca2)的胰腺再现了在人类疾病中观察到的晚期PDAC的组织学特征。例如，KPC肿瘤表现为腺泡到导管化生，而KPC- brca2表现为结缔组织间质、PanIN和导管腺癌表达，与在人体组织中观察到的相似。来自原位和遗传肿瘤模型的胰腺均显示肿瘤病灶周围和插入的纤维间质(图3；年代,基质;T,肿瘤组织)。值得注意的是，在KPC和KPC- brca2小鼠的胰腺基质细胞和恶性上皮细胞中检测到STAT3的强大磷酸化(图3)．与这种免疫抑制微环境一致，肿瘤表达高水平的PD-L1，无论动物模型。
胰导管腺癌(PDAC)基因工程小鼠模型(GEMM)重现了人类疾病中白细胞介素6 (IL-6)通路的激活和PD-L1的表达。免疫组化(IHC)分析具有代表性的H&E、pSTAT3(棕色)/α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)(粉红色)、IL-6(棕色)和PD-L1(棕色)染色的人胰腺癌组织切片、原位(KPC-luc)、皮下(MT5, Panc02)或以下GEMM的胰腺组织切片LSL−G12D, Trp53LSL−R270HPdx1-cre)和KPC-Brca2 (KrasLSL−G12D, Trp53LSL−R270HPdx1-cre, Brca2/ F)．所有图片均以40倍放大倍数呈现。
联合阻断IL-6和PD-L1抑制小鼠胰腺肿瘤生长，并增加体内瘤内效应T细胞
我们假设IL-6的同时封锁和通过pd - l1靶向Ab的有效免疫调节刺激将绕过对t细胞介导的胰腺癌免疫抵抗的关键机制。我们使用小鼠MT5肿瘤细胞皮下注射到C57BL/6小鼠。该细胞系来源于KPC肿瘤，G12D都发生了突变喀斯特和R172HTrp53．31一旦肿瘤可触及，小鼠接受抗il -6、抗pd - l1或同型对照治疗，直到研究终点。与同型、抗il -6或PD-L1 Ab单独治疗相比，联合治疗可显著抑制肿瘤生长(图4一个;p < 0.03)。为了仔细评估免疫变化，并确认我们在另一个PDAC模型中的数据，我们也使用了特征良好的小鼠Panc02模型，因为它经常用于已发表的PDAC临床前免疫治疗研究。与MT5细胞系相似，Panc02细胞也与免疫能力强的C57BL/6小鼠是同源的。32，33一旦肿瘤可触及，小鼠接受治疗直到研究终点。与同型对照相比，抗il -6和抗pd - l1抗体联合治疗可显著抑制肿瘤生长(图4B;p = 0.0457)。在研究终点分离肿瘤并用流式细胞术进行表型分析。这些数据证实CD8浸润的比例显著增加+接受组合的小鼠肿瘤组织中的T细胞(图4C;p = 0.0006)。进一步的分析表明，具有效应因子CD62L的细胞比例增加−CD44+IL-6和PD-L1联合阻断小鼠的表型(图4D;p = 0.0086,图4E;p = 0.0024)。此外，我们观察到，与同型对照组相比，任何治疗组之间的其他循环或瘤内免疫抑制亚群(粒细胞和单核细胞MDSCs)水平没有差异(见在线)补充图3a - c)。重要的是，阻断IL-6、PD-L1或两种Ab结合的治疗并没有导致任何明显的毒性迹象，这一点在所有动物模型测试中得到了证实(数据未显示)。
白介素6 (IL-6)和程序性死亡配体1 (PD-L1)抗体阻断联合治疗可降低胰腺导管腺癌(PDAC)的肿瘤进展，并增加瘤内效应T细胞的百分比。(A) MT5或(B) Panc02小鼠胰腺肿瘤细胞皮下注射到C57BL/6小鼠，当肿瘤达到50-100 mm时开始治疗3.．小鼠注射200 μg(腹腔注射三次/周)同型对照、抗il -6和/或抗pd - l1抗体(n= 5-6只/组)，直到小鼠达到预定的iacuc批准的早期去除标准。几何意味着±SD;*p与同型比较<0.01;†p与PD-L1相比<0.03;‡p与IL-6相比<0.05。使用胶原酶II和Miltenyi Biotec的绅士macs解离剂分离Panc02肿瘤，以获得单细胞悬液。用流式细胞仪检测细胞(C) CD4+, CD8+T细胞和活化标记物不同(D) CD4+和CD8 (E)+t细胞亚群(n = 3 /组)。天真(CD62L+CD44−)，效应记忆(CD62L−CD44+)和中央存储器(CD62L+CD44+)．意味着±SD;与同型相比，*p<0.002;†p与PD-L1相比<0.01;与IL-6相比，‡p<0.02。
联合阻断IL-6和PD-L1抑制肿瘤生长的是CD8+t细胞依赖
为了确定IL-6和PD-L1联合阻断剂的疗效是否依赖t细胞，我们给携带panc02的小鼠注射CD4+或CD8+在治疗过程中消耗腹肌。研究终点小鼠脾细胞经流式细胞术证实t细胞衰竭(图5A、B)。给药CD8 (p=0.0016)，但不给药CD4消耗抗体，可消除pan - 02肿瘤小鼠中IL-6和PD-L1联合阻断剂的疗效(p=0.0016)。图5C)。
联合白介素6 (IL-6)和程序性死亡配体1 (PD-L1)的抗肿瘤反应是CD8+T-cell-dependent。将Panc02小鼠胰腺肿瘤细胞皮下注射到C57BL/6小鼠，当肿瘤达到50-100 mm时开始治疗3.．小鼠的这两种CD4细胞也都减少了+或CD8+在第5、6、8、11和14天注射耗尽抗体。(A)代表性流式细胞术和(B)脾细胞CD4和CD8定量染色，以确认耗竭。意味着±SD;* p < 0.001。(C)第7天，小鼠接受200 μg(腹腔注射三次/周)同型对照或抗il -6和抗pd - l1抗体联合治疗(n=5只/组)，直到小鼠达到预定的iacuc批准的早期去除标准。意味着±SD;同型比较，*p<0.001;†p<0.002 CD8耗竭与CD4耗竭。
在PDAC的原位模型中，IL-6和PD-L1抗体阻断联合治疗可以减少肿瘤的进展
为了进一步研究IL-6阻断联合PD-L1抑制的效果，我们将KPC-luc细胞原位注射到C57BL/6小鼠的胰腺尾部。这种表达荧光素酶的细胞系来源于g12d突变的KPC肿瘤喀斯特和R172HTrp53．25每周用生物发光成像(图6A、B)。一旦通过胰腺成像检测到肿瘤，将小鼠随机分组并使用抗il -6、抗pd - l1或同型对照抗体治疗，直到研究终点。我们观察到，与同型对照、抗il -6或PD-L1 Ab单独治疗相比，接受联合治疗的小鼠最终肿瘤重量降低(图6C;p = 0.05530)。α-SMA减少+与同型对照Ab组相比，联合治疗组小鼠胰腺炎间质细胞也明显增多(p=0.0563)。此外，CD3的数量+与仅用同型对照抗体治疗的小鼠相比，用靶向IL-6和PD-L1的抗体治疗的小鼠胰腺中T细胞增多(p=0.0553)。
在胰腺癌的原位模型中，白介素6 (IL-6)和程序性死亡配体1 (PD-L1)抗体组合阻断可以减少肿瘤生长。C57BL/6小鼠原位注射基质中表达荧光素酶的KPC细胞(KPC-luc)，每周(A)通过生物发光成像评估肿瘤生长情况(B)量化。(C)研究结束时的肿瘤重量。意味着±SD;*p=0.05530与同型相比。胰腺组织染色(D) α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA+)基质细胞(平均值±SD;与同型相比，p=0.0563)和(E) CD3+T细胞(意味着±SD;*p=0.0553与同型比较)，免疫组化(IHC) 20倍放大定量分析。
靶向IL-6R和PD-L1的抗体限制了侵袭性KPC-Brca2 GEMM中的肿瘤进展
为了进一步证实我们在基因模型中的数据，更好地再现了患者肿瘤的许多方面，我们使用了一个由突变体驱动的自发产生的PDAC的高侵袭性本地模型喀斯特，Trp53而且Brca2（图7A).这种癌基因驱动的肿瘤模型的任何有效性都意味着一种有前途的方法，可以进行进一步的评估。在5-6周龄时，KPC-Brca2小鼠的PDAC外显率为100% (图7一)．在抗il - 6r和/或抗pd - l1治疗2周后，动物被安乐死，胰腺分离进行组织学分析。与同型对照Ab治疗的动物相比，靶向PD-L1和IL-6R的Abs治疗的小鼠低级别PanIN病变的比例有显著的统计学变化，PanIN3或腺癌病灶较少(图7A、B;p < 0.001)。与皮下Panc02模型相似，CD8缺失+T细胞限制了KPC-Brca2 GEMM的联合治疗效果。事实上，我们观察到来自CD8的胰腺PanIN3/PDAC病变比例更高+与单独使用该组合治疗的小鼠相比，使用该组合治疗的小鼠(图7B).重要的是，分析显示α-SMA的数量显著减少+与对照小鼠相比，以IL-6R和PD-L1为靶点的Ab治疗小鼠的胰腺基质细胞(图7C, D;p < 0.05)。小鼠CD8缺失+联合治疗的T细胞没有出现同样的α-SMA下降+与只接受联合治疗(图7D;p = 0.0033)。此外，Ab靶向IL-6、PD-L1或两种药物联合治疗并没有改变IL-6的表达(见网上)补充图5一个)或PD-L1(见网上补充图5 b)在胰腺肿瘤微环境中。
白介素6 (IL-6)和程序性死亡配体1 (PD-L1)抗体阻断联合治疗可降低胰腺导管腺癌(PDAC)的肿瘤进展和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)+)细胞从KPC-Brca2小鼠的胰腺。KPC-Brca2小鼠在5 ~ 6周龄时用200 μg(腹腔注射3次/周)同型对照、抗il - 6r和/或抗pd - l1抗体治疗2周(n=5只/组)。一组接受抗il - 6r和PD-L1抗体治疗的小鼠CD8也被耗尽+T细胞。(A) 20倍放大下胰腺代表性H&E染色和(B)病理定量。意味着±SD;*p与同型比较<0.005;与PD-L1相比，†p=0.01;(C)免疫组化染色胰腺组织中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA+)间质细胞(红色)，(D) 20倍放大定量。意味着±SD;与同型相比，*p=0.0545。
联合阻断IL-6R和PD-L1会增加具有Th1表型和CD3的T细胞+KPC-Brca2小鼠PDAC肿瘤细胞浸润
为了更好地理解IL-6和PD-L1阻断在侵袭性KPC-Brca2模型中限制肿瘤进展的联合机制，我们进行了一系列免疫表型分析。这些数据显示循环CD4的百分比更高+具有Th1表型特性的T细胞(CXCR3+CCR4−CCR6−)在靶向IL-6R和PD-L1的Ab联合治疗小鼠的脾脏中(图8一个;p < 0.0001)。CD4没有变化+与对照组相比，任何治疗组中具有Th2表型特性的T细胞均明显(图8B).重要的是，对肿瘤微环境的评估显示浸润性CD3显著增加+联合治疗小鼠胰脏中的T细胞(图8C, D;p = 0.0025)。进一步的分析显示，与同型对照相比，任何治疗组之间的其他免疫抑制亚群(MDSCs和treg)水平没有差异补充图4模拟)．这些数据表明，这种治疗方案可能调节T细胞的表型特性和它们对肿瘤微环境的访问。
具有Th1表型特征和肿瘤内CD3的循环T细胞比例较高+用白介素6 (IL-6)和程序性死亡配体1 (PD-L1)抗体封锁处理的小鼠细胞。KPC-Brca2小鼠在5 ~ 6周龄时以200 μg(腹腔注射3次/周)同型对照、抗il - 6r和/或抗pd - l1抗体治疗2周(n=5只/组)。脾细胞染色，流式细胞术分析(A) T细胞Th1表型(CD4+CXCR3+CCR4−CCR6−)或(B)具有Th2表型特性的T细胞(CD4+CCR4+CXCR3−CCR6−)．意味着±SD;与同型相比，*p<0.002;与IL-6相比，‡p=0.028。胰腺组织染色(C) CD3+T细胞(棕色)免疫组化(IHC)分析，(D) 20倍放大量化。意味着±SD;*p与同型比较<0.05;与IL-6相比，‡p=0.052。
IL-6和PD-L1的联合阻断延长了KPC-Brca2 GEMM的总生存期
在KPC-Brca2小鼠中评估这种治疗组合对总生存期的影响。在这项研究中，小鼠在5周龄时开始使用靶向IL-6和PD-L1或同型对照的抗体进行长期治疗，每周三次，直到动物死亡。总生存率显著延长(35%;p=0.0012)在IL-6和PD-L1抗体联合治疗的小鼠中观察到，与同型对照治疗的动物相比(图9)．长期接触这种治疗方案并没有导致这些动物的体重发生变化，这表明在持续的给药期间其耐受性(见网上)补充图6)．
白介素6 (IL-6)和程序性死亡配体1 (PD-L1)封锁增加了KPC-Brca2小鼠的总生存率。KPC-Brca2从5周龄开始用同型对照抗体或靶向IL-6和PD-L1的抗体(200 μ g/每个)处理小鼠，直到小鼠死亡并满足预定的iacuc批准的早期去除标准。Kaplan-Meier生存曲线，同型对照与IL-6/PD-L1抗体间的显著性检验(p=0.0012)。
讨论
在目前的报告中，我们证明了IL-6和PD-L1的联合封锁可在高度侵袭性PDAC模型中产生疗效并延长生存治疗。这些数据扩展了先前关于IL-6作为PDAC免疫治疗疗效限制因素的观察。联合治疗使T细胞向Th1表型倾斜，并增加了浸润到肿瘤中的效应细胞的数量。这是非常重要的，因为有限的t细胞浸润被认为是PDAC免疫治疗效果的障碍。进一步，我们发现联合治疗对肿瘤进展的疗效依赖于CD8+T细胞在多个模型中。总之，这些临床前数据支持这种联合治疗是一种合理的治疗方法，可提高t细胞介导的胰腺癌免疫应答。
免疫治疗的下一个前沿是发现如何通过联合方法提高检查点抑制剂的疗效，特别是在临床观察效果甚微的癌症中。在盲目推进联合治疗方法之前，重要的是根据经验数据和针对肿瘤宿主中每种因素的相对重要性来确定治疗的优先顺序。由于若干原因，伊尔-6作为一个目标是相当有吸引力的。例如，根据我们小组最近的报道，treatment-naïve例PDAC患者血浆IL-6基线水平较高与总生存率较差相关。16IL-6还能促进树突状细胞(dc)、巨噬细胞和MDSC的分化，从而抑制免疫。19，22此外，IL-6可导致胰腺肿瘤微环境中更大的增殖、侵袭性和肿瘤进展。16本报告代表了一系列重要的临床前研究，提供了该治疗组合在相关动物模型中起作用的第一个证据。有效转化的下一个后勤步骤将是了解这种药物组合在事先或同时进行化疗的情况下是如何工作的，这将与临床试验场景最相关。
il -6靶向药物已用于胰腺癌，但效果有限。这可能是因为IL-6阻断已被尝试作为单一药物，或与化疗联合在大量预处理的患者。34，35在所有这些研究中，没有在阻断IL-6的同时给予有效的免疫治疗。其他研究表明，IL-6的中和也会抑制通过PI3K/AKT通路的信号传导。36最近的一项I期研究显示，联合使用tocilizumab(抗il -6)和干扰素(IFN)-a2b治疗卵巢癌是可行/安全的，而且激活T细胞的比例更高。37因此，阻断IL-6可能比靶向单一通路(JAK/STAT, MEK和AKT)更有效，因为它可以同时限制由IL-6异常表达驱动的其他通路。
我们的团队和其他人已经报道了肿瘤、髓样细胞和基质细胞可以分泌IL-6，促进肿瘤微环境和PDAC中的免疫抑制。众所周知，PDAC具有明显的免疫抑制作用，显然还需要更多关于基质及其可溶性因子(包括IL-6)的临床相关性的数据。在转染OVA的MCA205细胞模型中，Gr-1+MDSCs是荷瘤小鼠IL-6的来源。IL-6的阻断导致肿瘤ag特异性效应T辅助细胞(Th1)的分化增加。24在本报告中，来自PDAC基质的星形细胞中的IL-6是患者PSCs RNA水平无监督分析中出现的关键因素，并通过IHC确认。这与我们之前的体外数据一致，显示患者来源的PSCs分泌IL-6，促进MDSC的分化。20.其他研究明确表明，IL-6可由肿瘤来源的巨噬细胞产生，并可能通过STAT3介导肿瘤微环境中的免疫抑制。5这些因素补充了其他细胞因子，如GM-CSF，它是由肿瘤细胞(或其他细胞)产生的，以促进免疫抑制微环境。38这些数据表明，IL-6是一种可操作的治疗靶点，可以调节PDAC肿瘤的免疫结构，并可操纵以限制免疫抑制。
很可能是PDAC基质通过il -6诱导的信号传导放大免疫抑制，限制了免疫治疗的疗效。例如，许多报道表明肿瘤和基质细胞之间存在着一种相互关系，导致PDAC的生存和生长增强。39其中一些研究表明，成纤维细胞激活蛋白(FAP+)基质细胞维持基质细胞，抑制抗肿瘤免疫。40-42其他研究使用靶向破坏基质中的超音hedgehog信号导致PDAC加速进展。43，44这些数据为先前使用hedgehog途径抑制剂Saridegib的临床研究提供了见解，该研究由于患者的进展比对照组患者快而提前停止。同样，SMA的遗传消融+基质细胞导致突变体的加速转移和疾病进展喀斯特PDAC驱动模型。45尽管有这些数据，但值得注意的是，缺乏SMA的动物对抗ctla4抗体免疫治疗的反应增强了+间质细胞。相比之下，这些动物并没有从吉西他滨化疗中获益。45
后续研究应进一步探讨IL-6阻断如何增强检查点免疫治疗。IL-6可以促进MDSC的扩大，尽管在基因或皮下小鼠模型中，肿瘤和/或脾脏中均未观察到MDSC水平的变化(见在线)补充图3和4)．MDSC和巨噬细胞是IL-6的其他潜在来源，阻断也可以使这些细胞的免疫抑制减弱，从而增强检查点抑制的效果。IL-6可在抗原递呈细胞水平起作用，通过下调IL-12的产生和随后的Th1免疫反应。24，46另一种可能是IL-6阻断可以下调T细胞中SOCS的表达，恢复IFN-γ或其他细胞因子的作用能力，促进Th1分化。47尽管考虑到可能补偿和上调SOCS表达的细胞因子的冗余，这是不太可能的，但它仍然是一种可能性。
最后一个有趣且重要的观察结果是，抗il -6和抗pd - l1联合使用增加了t细胞对肿瘤的浸润。t细胞浸润肿瘤是影响患者对检查点抑制剂反应能力的一个主要问题。48，49这种方案明显地调整了浸润肿瘤的T细胞的表型特性，并可能使受试者更有可能对免疫疗法产生反应。阻断IL-6联合检查点治疗可以改善T细胞的运输，改变肿瘤中T细胞的分布．我们相信这种组合可能是一种广泛适用于多种类型的由IL-6驱动的肿瘤的治疗策略。考虑到IL-6在调节胰腺癌发生和免疫抑制方面的多个方面，这是一个合理的靶点，具有快速临床转译的路径，因为多个IL-6阻断抗体已经被FDA批准用于其他适应症。
致谢
我们感谢俄勒冈州立大学综合癌症中心生物统计学、基因组学、靶点验证、分析细胞术、比较病理学和小鼠表型共享资源，部分由国家癌症研究所P30 CA016058拨款支持。
参考文献
脚注
贡献者TAM、ZC-M、MCO、MB、TB-S和GBL对研究的概念和设计有贡献。TAM、RS、CWM、SL、EN和XZ进行了实验并获得了数据。RS、ZC-M和TL提供了遗传小鼠模型和体内实验的专业知识。BS提供了病理分析方面的专业知识。MB提供了患者的手术标本和监管批准。GY提供了统计分析方面的专门知识。GY和LY提供了生物信息学方面的专门知识。TAM, MCO, TB-S和GBL起草了手稿。TAM、JRP、GY、TAZ和GBL对手稿中的重要知识内容进行了批判性修改。所有作者都认可了手稿的最终版本。
资金NIH资助5T32CA009338-34 (Mace)， 1R21AI124687-01 (Lesinski)， 1R01CA208253-01 (Lesinski)， P30CA016058-36 (Caligiuri)，美国-意大利癌症基金会胰腺癌倡议赠款(Bloomston)和Lustgarten基金会赠款(Zimmers)。该项目由国家研究资源中心的UL1RR025755奖号支持，由美国国立卫生研究院(OD)主任办公室资助，并由NIH医学研究路线图支持。由威廉·霍尔基金资助用于胰腺和肝脏研究。该项目由美国国家推进转化科学中心KL2TR001068号资助项目描述。这项工作也得到了Pelotonia奖学金计划的支持。任何表达的观点、发现和结论都是作者的观点，并不一定反映Pelotonia奖学金项目的观点。本文内容仅由作者负责，并不代表美国国家转化科学促进中心、国家研究资源中心或美国国立卫生研究院的官方观点。
相互竞争的利益没有宣布。
伦理批准俄亥俄州立大学和印第安纳大学的IRBs。
来源和同行评审不是委托;外部同行评议。