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客观的肠道microbiota-derived代谢物,三甲胺N-oxide (TMAO)中扮演一个重要的角色在心血管疾病(CVD)。空腹血浆TMAO是显示为心血管疾病事件的病人的预后指标,提出干预针对肠道微生物群的利益。这里我们开发临床适用的方法称为口腔肉碱的挑战测试(OCCT) TMAO-related治疗药物努力评估和个性化饮食指导。
设计药代动力学研究来验证OCCT协议的设计。OCCT是在23日进行的素食者和34杂食动物验证肠道微生物群TMAO生产能力。OCCT调查与肠道微生物组集成,宿主基因型,饮食记录和血清生化。一个人性化无菌老鼠研究转化进行了验证。
结果OCCT显示效果比空腹血浆TMAO识别TMAO制片人表型。杂食动物表现出高10倍或高TMAO生产商比素食者。由OCCT TMAO-associated类群发现这项研究与先前的动物研究是一致的。TMAO生产商表型也复制人性化无菌老鼠模型。此外,我们发现粪便编制工作基因并不是与TMAO生产;因此,其他关键相关微生物的基因可能参与其中。最后,我们证明了尿液TMAO与等离子TMAO表现出强烈的正相关(r = 0.92, p < 0.0001)和改进OCCT的可行性。
结论可以用来识别OCCT TMAO-producer表型的肠道微生物群,可能作为个人指导心血管疾病预防和治疗。
试验注册号码NCT02838732;结果。
- 肠道微生物群
- 三甲胺n-oxide
- 口服肉碱挑战测试
- 心血管疾病
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本研究的意义
已知在这个问题上是什么?
肠道微生物群相关的代谢物,三甲胺N-oxide (TMAO)被证明导致动脉粥样硬化的进展。
虽然空腹血浆TMAO显示为心血管疾病(CVD)患者的预后指标,这可能低估了TMAO生产函数的肠道微生物群,因为主机的有效的等离子TMAO肾清除率。
肠道微生物群的杂食动物和素食者有不同的功能,但是功能TMAO产能还未解决清楚。
微生物Rieske-type编制/ B基因据报道部分负责有氧肉碱代谢的三甲胺从硅片和体外研究但尚未评估在人类体内研究。
有什么新发现吗?
这是第一个研究设计的临床评估个人TMAO产能使用口服肉碱挑战测试(OCCT)验证挑战剂量和采样时间。
OCCT展览效果比空腹血浆TMAO识别TMAO-producer人类肠道微生物群的表型。
杂食者比素食者有更高的风险TMAO生产商,但是一些长期素食者仍然可以证明巨大TMAO生产从口腔肉碱的肠道微生物群。
可能不是一个有用的生物标志物识别粪便编制TMAO生产商根据我们人类体内研究表型。可能会有其他潜在的微生物基因负责肉碱代谢TMAO粪便。
本研究的意义
它会如何影响临床实践在可预见的未来吗?
OCCT揭示了TMAO-producer表型,并可能作为一种个性化的心血管疾病患者的饮食指导。
OCCT使用在人类研究中可以作为一个基准来评估治疗药物TMAO通路的开发工作。
OCCT可以模拟一个餐后TMAO并为未来提供一个基准调查食源性血栓性增强的潜力。
介绍
肠道微生物群中扮演着一个关键的角色在心血管疾病(CVD)的发展,研究表明,一些micro-organism-derived肠道产生的代谢产物参与心血管疾病的发病机理。1 - 4肠道微生物的代谢产物,如三甲胺N-oxide (TMAO),短链脂肪酸和二次胆汁酸,充当调解人在CVD-related慢性疾病如动脉粥样硬化、肥胖和2型糖尿病。5个6在这些肠道microbiota-derived代谢物,TMAO主要来源于饮食碱和胆碱的代谢肠道细菌。研究已经确定了TMAO作为基本proatherogenic和凝血复合驱动心血管疾病的发病机制。7号到9号
左卡尼汀是一种营养丰富的肉类产品(特别是红肉)和功能进行跨线粒体膜脂肪酸的机会。10然而,肉碱可能会被肠道微生物群的代谢,从而增加心血管事件的风险患者的冠状动脉疾病。11在肠道,肠道微生物群的未被吸收的肉碱转化为三甲胺(TMA),随后氧化TMAO的黄素单氧酶(FMO3)在肝脏。1TMAO然后进入循环,有效地由肾脏排泄。12前瞻性流行病学研究表明增加血浆TMAO水平和心血管疾病之间的正相关进展。1 2 13 14群组(n = 2595)的冠状动脉疾病的患者,高碱含量与心肌梗死的风险事件,3年内中风和死亡,但只有在患者显著高与此同时TMAO水平。11这些发现可能作为一个合理的解释的红肉的消费,增加心血管疾病风险之间的关系。15在动物实验中,长期食用碱接触TMAO的血浆水平增加,肠道微生物群的三甲胺(TMA)合成能力和动脉粥样硬化的进展。11日16动脉粥样硬化的机制TMAO的贡献涉及增加泡沫细胞的形成,减少反向胆固醇运输,和增强血小板聚集。1 11日17TMAO生产的微生物效应可以减少广谱抗生素,但抗生素耐药的问题仍然是一个挑战。2一个名为3的最近发现胆碱类似物,3-dimethyl-1-butanol表明承诺效力抑制微生物胆碱/碱转化为蓝玉。18 19大蒜素等天然生物活性化合物白藜芦醇和动物研究中也发现了减少TMAO生产。20 21
最近,空腹血浆TMAO也证明作为短期和长期预后标记事件心血管事件中主题与急性冠脉综合征或中风。14日22尽管如此,仍然没有明确的截止值的等离子TMAO不利的结果。在临床研究的剂量反应分析,全因死亡率增加了7.6%的风险每10µM增量的等离子TMAO。23在最近的动物和人类血小板聚集的研究中,等离子体的浓度TMAO大于10 ~ 30µM显著提高血栓形成的潜力。17日19日24然而,受试者的空腹血浆TMAO水平与正常肾功能就更难超过10µM健康和患病的人群。2 25因此,餐后血浆TMAO可能理论上反映TMAO的病理生理水平。因此,我们建立了一个口头肉碱挑战测试(OCCT)模拟餐后血浆TMAO以及功能测量TMAO合成能力从host-diet-microbiota交互。
结果
杂食动物表现出显著的更高的血浆肉毒碱水平和胆固醇比素食者
人口数据和生化值的比较显示显著差异在一些代谢参数,即等离子体肉碱,血清总胆固醇、低密度脂蛋白、尿素氮、空腹血糖和天冬氨酸转氨酶水平,杂食动物和素食者(表1)。的参数相比,碱和胆固醇水平杂食动物和素食者之间表现出最显著的差异(p < 0.0001)。然而,尿液肉碱水平之间的杂食动物和素食者没有表现出显著差异。一般来说,尿液TMAO水平显著高于等离子TMAO水平,而肉碱更丰富的血浆样品中。这一发现可能表明人体倾向于保护肉碱作为营养和排泄TMAO废物通过泌尿系统。12个26空腹血液和尿液TMAO水平都更高的杂食动物(血:3.54±0.96µM;尿液:68.13±20.70 nmol /更易)比素食者(血:1.87±0.21µM;尿液:33.98±3.49 nmol /更易);然而,差异没有达到统计学意义(表1)。
明显不同的饮食模式杂食动物和素食者之间导致小肠道微生物组的差异
87营养水平计算使用食物频率问卷(FFQ), 43个不同显著之间的杂食动物和素食者(p < 0.05),罗斯福< 0.1(在线补充表S1)。杂食动物消耗更多的胆固醇、肉碱、饱和脂肪和动物蛋白比素食者(图1 a, B)。因此,杂食动物表现出更高的血清胆固醇,肉碱、低密度脂蛋白和尿素氮水平(表1)。主成分分析结果的所有营养计算使用FFQ也显示不同的饮食模式之间的杂食动物和素食者(图1 c)。然而,肠道微生物组概要及指标之间的杂食动物和素食者没有显著差异根据原则协调的结果分析,α多样性和厚壁菌门和拟杆菌门(F / B)比(图1 d-f),尽管适度显著差异小肠道微生物群落物种(< 2%)(在线识别补充图S1A)。线性判别分析的结果的影响大小(LEfSe)分析显示,Prevotellaceae普遍在素食者的杂食动物的肠道微生物,而肠道微生物组特色Clostridiaceae特有类群,细菌性的S24和真细菌(在线补充图印地)。这些发现与之前的研究一致。27 28
膳食模式的差异之间的素食和杂食动物肠道微生物组成和多样性无显著差异。(A)的热图膳食微量营养素的杂食动物和素食者(q值< 0.1)与聚类营养物质颜色标签由六类营养物质。红色=更高的丰度,蓝色=低丰度。(B)素食者和杂食动物的肉碱和胆固醇消费水平表现出极显著差异。(C) FFQ营养成分数据的主成分分析表明显著不同模式之间的杂食动物和素食者(置换多元方差分析(PERMANOVA): p < 0.001)。(D)成分分析肠道微生物群的素食者和杂食动物显示无显著差异(PERMANOVA: p = 0.3528)证明了主坐标分析计算Bray-Curtis距离。的α多样性指数(E)比较素食者和杂食动物。(F)的厚壁菌门和拟杆菌门比杂食者和素食者表现出无显著差异。数据在所有酒吧图表示为±SEM。酒吧的所有数据块和箱形图分析学生的学习任务。 FFQ, food frequency questionnaire.
等离子体TMAO峰值之间的间隔24小时和48小时OCCT
我们假设TMAO形成血液发生在大约24小时的OCCT基于肠道运输所需的时间,微生物分解代谢和肝的酶反应FMO3摄取肉碱转化为等离子TMAO。我们进行了药代动力学研究OCCT证实这个假说(图2)。在这项研究中,13个参与者收到7个血液测试显示时间点后摄入三平板电脑的左卡尼汀延胡索酸酯(一般营养中心(GNC),宾夕法尼亚州,美国)。我们验证每个平板的碱量通过高效液相色谱法(HPLC),以确保每个测试的剂量的左卡尼汀是一致的。OCCT后,血浆TMAO水平保持稳定在槽水平12小时,山峰开始24小时后(图2一个)。血浆肉毒碱水平达到峰值后4小时OCCT虽然TMA和γ-butyrobetaine等离子体保持在非常低的浓度(在线补充图S2A, B)。13个参与者,6参加额外的药代动力学研究的3个月后,和原来的趋势和值为每个复制的结果(图2 b, C)。因此,OCCT简化涉及三个样本集合时间:基线(空腹血浆TMAO), 24小时和48小时(图2 d)。
口服肉碱的药代动力学研究的挑战测试(OCCT)。(一)13名志愿者招募OCCT的药代动力学(PK)的一项研究。每个参与者收到了三块GNC左卡尼汀(大约1200毫克左卡尼汀)和血液图纸在4小时,八小时,12小时,24小时,36小时和48小时。(B)条情节的AUC OCCT为不同的志愿者和相同的志愿者不同的PK研究(6志愿者收到第二个PK学习3个月后)。(C)正常化不同的AUC不同的药代动力学研究在相同和不同的个体(定义为| AUC1−AUC2 | / [AUC1 + AUC2]) AUC1: 1日AUC PK研究;AUC2: auc第二PK的研究。这些数据显示的趋势TMAO定期在同一个人生产能力是可再生的。(D)样本采集时间点的验证和简化OCCT根据药代动力学研究的结果。AUC,曲线下的面积;有条件现金援助,肉碱挑战测试; TMAO, trimethylamine N-oxide.
OCCT有效差异化肠道microbiota-mediated TMAO杂食者和素食团体之间的生产能力
空腹血浆TMAO水平差异的杂食动物和素食者是温和的。因此,提出OCCT开发确定个人TMAO产能由肠道微生物群。所有的杂食者和素食的志愿者参加了一个简化的OCCT与血液和尿液收集基线,24小时和48小时。OCCT曲线,杂食动物和素食者的血浆TMAO水平分化在24小时和48小时,但空腹TMAO水平仍然类似(图3 a, B)。禁食TMAO的值相比,那些曲线下的面积(AUC),和OCCT的最大值明显高于杂食者比素食者(图3 c)。
杂食动物和素食者表现出不同程度的左卡尼汀转换成体内TMAO能力。(A)口服肉碱挑战测试(OCCT)管理23个素食者和34杂食动物,和等离子TMAO水平测量OCCT后在显示时间。血浆TMAO水平的差异之间的素食者和杂食动物出现在24小时和48小时与基线相比。数据表示为均值±扫描电镜;* p < 0.05。(B)的空腹血浆TMAO水平无显著差异指出素食和杂食者之间的组织。(C)的AUC值和最大值杂食动物的肉碱挑战测试都明显高于素食者。(D)的人口被分为四个四分位数OCCT的AUC值。第四季度的人口被定义为高TMAO生产商,Q1低生产者和Q2- - - - - -第三季度中间生产商。杂食者的35.3 (E)的比例被分组为高TMAO生产商相比,8.7%的素食主义者。杂食者的比例为14.7低分组生产商相比,39.1%的素食主义者。高生产者(F), 12/14(86%)是杂食动物,而在低生产商,5/14(36%)是杂食动物。杂食动物的口服补液盐和素食者是高TMAO生产商为10.8 (95% CI 1.69 - 68.94)。数据在所有酒吧图表示为±SEM。等离子TMAO水平表示次OCCT和血浆空腹TMAO数据分析学生的学习任务。AUC TMAO TMAO马克斯在OCCT被Mann-Whitney U测试分析。AUC,曲线下的面积;TMAO,三甲胺N-oxide。
杂食动物更容易被高TMAO生产商比素食者
定义功能表型的肠道微生物群TMAO生产,我们绘制OCCT AUC值结果为所有57参与者和分组成四分位数的值。14个参与者Q1-level AUC值贴上低TMAO生产商,和14参与者在第四季度贴上高TMAO生产商(图3 d)。参与者在第一季度和第四季度之间水平被贴上中间生产商。在杂食者的参与者中,35.3%被分组为高TMAO生产者和14.7%低分组TMAO生产商。相比之下,只有8.7%的素食主义者是分组高TMAO生产者和39.1%是低分组TMAO生产商(图3 e)。关于TMAO生产OCCT定义的表型,杂食动物组的参与者表现出10倍或(OR: 10.8, 95% CI 1.69 - 68.94)的高TMAO生产商与素食主义者集团(图3 f)。然而,尽管长期坚持一个严格的素食(> 10年),一些素食者表现出相当大的TMAO生产高剂量的肉碱消耗时。
肠道微生物组配置文件后成为独特的功能表型出现TMAO生产能力
在这项研究中,高的功能表型TMAO生产商(n = 14)和低TMAO生产商(n = 14)确定使用OCCT与独特OCCT曲线和AUC和TMAO明显不同马克斯值(图4 a - c)。然而,空腹血浆TMAO水平的差异之间的高、低TMAO生产商保持温和的(图4 b)。这一发现进一步表明,一个挑战测试,而不是一个血液测试,应考虑在临床评估确定的功能表型TMAO-producing肠道微生物群。此外,肠道微生物的组成模式的高与低TMAO生产商独特,展示的热图和主坐标分析(图4 d、G)。其他常见的肠道微生物功能指标,包括F / B比率,香农指数和Chao1指数,还表示高低TMAO生产商之间的显著差异(图4 e, F)。高的高α多样性TMAO生产商提出更高的成分的复杂性肠道微生物组获取TMA合成功能。更高的F / B比率高TMAO生产商与高危患者心血管疾病的发现在先前的研究。9 29此外,LEfSe分析的结果对于细菌类群特征之间的高、低TMAO生产商类似于以前的老鼠实验的结果(图4 h)。11日16
功能表型分组通过口服肉碱激发试验(OCCT)是显著相关的差异肠道微生物组成、多样性、特性和功能。(一)高TMAO生产者和低OCCT生产商与不同的曲线。数据表示为±SEM。(B)血浆空腹TMAO水平的差异之间的适度高生产者和低生产是非常重要的。(C) AUC值和最大OCCT值的差异非常明显。(D)的热图示范水平分层聚类关联的细菌类群之间的明显差异(p < 0.01)高、低TMAO生产商。厚壁菌门的热图显示相对更高的分类单元门(粉红色)高TMAO生产商相比,低生产商,和相反的结果表明拟杆菌门(黄色)。(E)厚壁菌门和拟杆菌门比低生产商与高生产者之间明显不同。(F)之间的α-香农多样性指数和Chao1指数高TMAO生产者和低的生产商也显著不同。(G)的原则协调分析肠道微生物组的概要文件TMAO高生产者与低生产商表示一个重要的区别。 (H) The characteristic phylogenetic taxa in the TMAO high producers versus low producers ranked by the LDA score exhibited similarities to taxa (marked in the red frame) detected in previous well-controlled mouse studies.11日16(我)八9-week-old男无菌鼠在每组(n = 4)收到high-TMAO-producer或low-TMAO-producer粪便微生物群移植供体作为人性化无菌老鼠模型。肉碱的补充饮食的老鼠被放置在水中(1.3%)和接收通过口服填喂法d9-carnitine挑战测试。的表型TMAO-producing捐助者在老鼠明显复制的能力。数据表示为±SEM。血浆TMAO水平在OCCT表示*,等离子体禁食TMAO,厚壁菌门和拟杆菌门比,香农和Chao1指数、血浆d9-TMAO和d9-TMA数据分析学生的学习任务。AUC TMAO TMAO马克斯在OCCT Mann-Whitney U测试分析;* * * p < 0.05, p < 0.01, * * * * * * p < 0.001, p < 0.0001。AUC,曲线下的面积;LDA,线性判别分析;TMAO,三甲胺N-oxide。
TMAO-producing表型决定使用OCCT复制在人性化无菌老鼠模型
使用OCCT TMAO-producing功能表型决定是基于复杂diet-gut microbiota-host交互。因此,我们使用一个人性化的小鼠体内模型重建这些复杂交互。粪便微生物群移植(FMT)进行无菌鼠用粪便从TMAO生产者和低TMAO从我们的研究对象。在动物模型中,饮食和宿主因素控制。我们八个9-week-old男性无菌鼠分为两组每组(n = 4)和执行FMT每组小鼠的胃强饲法使用粪便样本两个人捐助者(高TMAO生产者和低TMAO)。所有的老鼠收到carnitine-supplemented饮食5周后,他们接受了d9-carnitine口头挑战测试。结果表明,移植肠道微生物群传播人类宿主的TMAO-producing表型鼠标主机(图4我)。
以前发现的微生物酶系统编制/ B基因可能是一个标记为人类体内TMAO生产不足
对人体TMAO生产的过程中,关键的一步是肉碱转化为TMA在小肠肠道微生物群的代谢。据报道在体外实验,Rieske-type氧化酶/微生物酶系统还原酶基因,编制/ B是将肉碱转化为TMA的能力。30.在另一项研究中,一个简并引物设计在试图测量TMA-producing能力量化编制工作在粪便微生物社区。31日我们使用这个方法来测量大量的出版编制工作粪便DNA样本和比较粪便编制工作丰度TMAO值获得相同的参与者。结果表明,粪便编制工作量相关的差许多TMAO-relevant值决定使用OCCT (图5 a - c)。我们进一步评估之前报道的相对丰度之间的相关性编制工作含有细菌类群(即大肠杆菌,克雷伯氏菌spp和枸橼酸杆菌属spp)30 31和TMAO值,但没有显示(在线显著正相关补充图S3A-C)。此外,考虑到杂食动物TMAO-producing能力之间的差异和素食者,我们比较了碱摄入大量TMAO AUC值,计算和相关性仍非重要(图5 d)。此外,我们评估了宿主遗传因素对TMAO浓度的影响;两种常见的单核苷酸多态性FMO3(Glu158Lys和Glu308Glu)检查在这项研究中,参与者在32 33和没有显著差异在TMAO值突变体和野生型之间的参与者被识别(图5 e, F)。最后,我们比较了人口、生化和饮食数据的高和低TMAO生产者和没有发现显著不同的标记(表2和在线补充图S4)。总的来说,这些发现表明,当前微生物和宿主基因生物标记物,饮食数据和其他功能可能不反映饮食之间的相互作用的复杂的代谢途径,微生物群落和主机TMAO形成。
肉碱摄入总量,粪便编制工作丰度和主机FMO3基因型与TMAO-producing相关处于劣势,在人体的能力。(一)编制工作社区的丰度(%)表现出一个贫穷的空腹血浆TMAO相关性,AUC和最大值(B和C)等离子体TMAO OCCT。(D)肉碱摄入数量还差与等离子体的AUC TMAO。(E和F)两个常见的主机黄素mono-oxygenase (FMO)单核苷酸多态性,FMO3/ Lys158和FMO3/ Gly308突变的等位基因,在这项研究中发现了人口,没有区别的TMAO生产表现出突变体和野生基因型之间的关系。酒吧中的数据图表示为±SEM。皮尔逊相关性是用来计算两个变量之间的联系。学生的学习任务是用于双官能团的比较。AUC,曲线下的面积;OOCT、口腔肉碱挑战测试;TMAO,三甲胺N-oxide。
尿液采样OCCT和方便的方法提供了一种替代方法
而微生物酶系统编制工作遗传标记未能关联TMAO形成,OCCT仍然是标准的人体测量TMAO产能。然而,血浆TMAO水平通常OCCT 24小时后,峰值和所需的连续血液取样可能会对临床实践的挑战和病人的依从性。因此,我们比较171配对采集血液和尿液样本在同一时间。样品表现出强烈的TMAO浓度显著相关。此外,57岁的AUC值成对的血液和尿液样本的参与者接受OCCT相比,表现出一种高度显著相关(图6)。这些结果表明,尿液收集可能会提供一个替代OCCT血液采集,这可能增加临床实践这一评价方法的可行性。
![Pharmacokinetic study of oral carnitine challenge test (OCCT). (A) Thirteen volunteers were recruited for a pharmacokinetic (PK) study of the OCCT. Each participant received three tablets of GNC L-carnitine (approximately 1200 mg L-carnitine) and blood drawings at 4th hour, 8th hour, 12th hour, 24th hour, 36th hour and 48th hour. (B) The bar plots of AUC in OCCT for different volunteers and the same volunteer with different PK studies (six volunteers received the second PK study 3 months later). (C) Normalised dissimilarity of AUC of different pharmacokinetic studies in the same and different individuals (defined as |AUC1−AUC2|/[AUC1+AUC2]) AUC1: AUCs of 1st PK study; AUC2: AUCs of second PK study. These data suggested the trend of TMAO production capacity is reproducible in the same individual periodically. (D) Validation and simplification of sample collection time points for the OCCT according to the results of pharmacokinetic studies. AUC, area under the curve; CCT, carnitine challenge test; TMAO, trimethylamine N-oxide.](http://www.marcconsult.com/content/gutjnl/68/8/1439/F3.large.jpg?width=800&height=600&carousel=1){kind=link}
尿液TMAO水平与血浆TMAO水平表现出强烈的相关性和可以替代口服肉碱挑战测试标本(OOCT)。(A) 171份血浆样本强烈的对数TMAO值与相应的TMAO尿液样本的值相同的主题和采样时间。等离子体的对数AUC值TMAO 57参与者强烈与尿液的AUC值TMAO OCCT相同。(B) OCCT结果可能反映了饮食之间的串扰,肠道微生物群和主机和可以用来衡量TMAO-producing单独的能力。OCCT可能作为一种个性化的膳食指南或食源性血栓形成的风险监控。它也可以用来评估治疗效果的新药物开发或可能作为基准调查TMAO-relevant生物标志物的粪便。皮尔逊相关性是用来计算两个变量之间的联系。AUC,曲线下的面积;TMAO,三甲胺N-oxide。
讨论
我们开发了一种方法来确定人类肠道微生物群的功能状态,对其TMAO生产能力。研究中的OCCT成功区分杂食动物和素食者根据其TMAO-producing能力。使用这种方法,我们描述高和低的肠道微生物组TMAO生产商以及繁殖TMAO产生表型无菌鼠的粪便微生物群移植。我们还演示了尿液TMAO等离子体的另一个生物标志物TMAO可能促进过渡到临床实践。
OCCT可能用来识别个人TMAO-producing能力从肠道微生物群,从而作为指导的干预减少人体TMAO生产。例如,low-carnitine饮食可能建议高TMAO生产商作为心血管疾病患者的饮食指导。抗生素可能是一个选项来减少TMAO生产通过抑制TMAO-relevant肠道细菌但可能气馁由于潜在的副作用和治疗失败造成的抗生素耐药性。此外,OCCT可以模拟一个餐后TMAO和揭示病理生理水平的血浆TMAO科目。在最近的一次先锋研究朱等,241月18名健康志愿者接受连续补充胆碱显著增加空腹血浆TMAO水平以及增强血小板hyper-responsiveness。因此,OCCT也可能用于揭示了食源性TMAO及评估相关血栓形成的潜力。最后,因为OCCT可以指示TMAO生产商表型,它可能作为基准进行进一步TMAO-relevant微生物生物标志物调查和验证。
在先前的研究中,空腹血浆TMAO水平被证明是一个预后指标的主要不良心脏事件心血管疾病患者。2 11从文献综述,似乎是一个重要的重叠值/差空腹血浆TMAO心血管疾病患者和健康者之间。2 25空腹血浆TMAO水平通常是低和展览rightward-skewed分布在健康和患病的人群。2 14 25这一现象可以解释为等离子体的波动特征TMAO高效尿排泄和饮食造成的影响。12个26它还表明,空腹血浆TMAO可能无法揭示高和潜在的病理餐后血浆TMAO价值。在最近的研究等,等离子体的浓度TMAO将至少10 - 30µM增强潜在血栓和动脉阻塞。17日19日24因此,TMAO从OCCT获得的值可能有助于揭示等离子体的病理生理水平TMAO从常规diet-microbiota交互。
最近,Koeth等招募5杂食动物和五个素食者获得肉碱挑战测试250毫克的isotope-labelled d3-methyl-carnitine,和素食者表现出几乎没有TMAO生产比杂食动物。11然而,我们注意到一些素食者甚至素食者仍能产生TMAO从他们的肠道微生物群管理肉碱。一些TMAO生产商素食者奶蛋素食主义者,可能接触到少量的肉碱从他们的饮食,但素食者之间的饮食摄入肉碱计算FFQ OCCT TMAO生产的不相关。我们假设肉碱代谢的细菌有可能仍然能够茁壮成长的营养比碱在肠道,虽然肉碱摄入可能会提供额外的碳源这些细菌,促进经济增长。然而,这种假设还有待进一步的研究调查。先前的动物研究表明,γ-butyrobetaine proatherosclerotic中间在肠道微生物代谢TMAO肉碱。16然而,γ-butyrobetaine的水平在我们的人血浆样品非常低,没有明显的高峰值。我们推测细菌负责将肉碱转化为γ-butyrobetaine可能不是在人类肠道功能占主导地位的,但这应该是证实了在未来的研究中。此外,尽管先前的研究已经isotope-labelled肉碱用于肉碱的挑战测试,11isotope-labelled肉碱的剂量相对较低的挑战可能不能反映diet-microbiota交互的病理生理状态。isotope-labelled化合物的可访问性和代表性的挑战测试可能也是一个障碍为临床实践。集体,OCCT在这项研究中使用正则肉碱与设计用量和采样时间可能有优势一步进入临床。
一种新型微生物Rieske-type加氧酶/还原酶基因,编制/ B,能够将肉碱转化为TMA被发现。30.只有少数物种之间的基因被报道存在包括大肠杆菌,克雷伯氏菌spp和枸橼酸杆菌属spp等等。30 31然而,这两个编制工作基因量化和相关细菌物种丰度在我们的粪便样本显示从OCCT TMAO值无显著相关。因此,有可能存在其他关键球员细菌和基因导致结肠的肉碱转变成TMA(专性厌氧环境)自编制/ B是一种氧依赖性酶反应系统。然而,关于错误率qPCR用简并引物和相对较低的分类解决16 s扩增子测序,进一步metagenome广泛研究可能需要更清楚地解决这个问题。
这项研究有一些局限性。首先,尽管胆碱和肉碱都是材料从肠道微生物群产生TMA,我们只使用材料在本研究中肉碱的挑战。我们选择开发OCCT,因为在正常的人类,我们有天然的高碱和低碱消费群体(即杂食动物和素食者);因此,我们可以使用这个测试调查如果人们从他们的饮食消费高碱有更高能力的肉碱转化为TMA通过肠道微生物群。
相比之下,很难找到一个队列和主题分为高、低胆碱饮食由于胆碱广泛分布在许多食品类别,包括鸡蛋、大豆,肉,鱼,一些水果和蔬菜。19因此,我们的研究成功只能证明饮食中肉碱消耗较高的人通常有更高的产能TMAO从肠道微生物群肉碱代谢。此外,肉碱新陈代谢细菌(如编制/ B含有细菌,如大肠杆菌,克雷伯氏菌spp,枸橼酸杆菌属spp等等)不同,负责利用胆碱(例如,cutC / D包含脱磷孤菌属alaskensis,变形杆菌等等)。30 31 34因此,TMAO生产从碱和胆碱的能力被肠道菌群代谢可能更适合单独讨论。第二,在我们的研究中,我们注意到的峰值TMAO OCCT等离子体发生48小时后的在某些情况下,可以倾斜的AUC OCCT曲线。此外,只有两个采集标本后12小时至48小时OCCT和低分辨率的采样12-48跨度可能导致错过OCCT峰值。添加一个样本时间72小时会有帮助,但可能仍然小于最优。
总而言之,我们提出了一个面向临床OCCT可以用来确定proatherosclerotic TMAO-producing复杂diet-host-microbial交互的能力。我们所知,提出方法代表了迄今为止最全面的设计评估的TMAO-producing人类肠道微生物群的研究能力。OCCT精密医学的时代,可以作为一种个性化的膳食指南对于心血管疾病患者,治疗的评估工具新药发展的努力,一个标准的方法食源性血栓形成风险调查以及潜在的基准调查TMAO-relevant粪便生物标记(图6 b)。
材料和方法
杂食者和素食主义者研究人群
传单广告研究分布式,57岁健康志愿者(23素食者和严格的素食主义者和34杂食动物)被招募。在这项研究中,参与者自我报告没有吃任何肉类或海鲜产品前2年或更长时间被定义为素食者。所有与会者都使用卫生史问卷筛选。入选标准如下:(1)年龄≥20年,(2)没有暴露在抗生素、益生菌或补充肉碱在前一个月。参与者被排除在研究如果他们报道最近肠胃不适(如腹痛或腹泻)或慢性疾病史包括重症肌无力、糖尿病、慢性肾脏疾病、甲状旁腺功能亢进、癫痫和严重贫血。每个参与者完成了FFQ膳食评估和提供的知情同意签署了一项豁免国立台湾大学医院的机构审查委员会。这项研究由科技部。
膳食评估
使用半定量的参与者的饮食评估FFQ。本研究中使用的FFQ验证之前的研究;识别主要的问卷信度和效度展出台湾素食者的饮食中的营养和杂食动物。35在这项研究中,营养分析计划用来计算的结果FFQ是基于台湾的食品成分数据库。肉碱摄入计算值的基础上发表之前。36的摄入营养和食品集团标准化z分数通过使用线性回归调整的卡路里摄入总量与剩余价值为中心。
口服肉碱挑战测试
所有的参与者禁食过夜OCCT之前(> 8小时)。空腹血和现场收集尿液样本作为基线,和三个平板电脑的左卡尼汀延胡索酸酯(GNC)然后口服药物的参与者。随后,参与者进行了时间序列血液与并发图纸发现尿液收集24小时和48小时后口服肉碱的挑战。参与者被要求在2小时内提供尿液样本的血液样本集合。所有的参与者被要求避免红肉、海鲜和肉碱的任何药物治疗期间挑战测试。血浆和尿液样本整除后离心3000 rpm,存储在冰箱−20°C。十个肉碱片(GNC)检查通过高效液相色谱法来验证OCCT左卡尼汀的用量。肉碱的平均剂量延胡索酸酯在每一个平板电脑是693.5 (SD±63.2)毫克(≈400毫克左卡尼汀/平板)。
药代动力学研究等离子体TMAO肉碱的口服
十三个独立志愿者招募OCCT的药代动力学研究。口服肉碱的挑战后,血液样本被收集在4、8、12、24日36和48小时。6名志愿者同意参加同样的药代动力学试验3个月后。所有志愿者签署知情同意豁免由国立台湾大学医院的机构审查委员会。
统计分析
双尾学生的学习任务或Wilcoxon非参数测试是用来比较群意味着被认为是适当的。或杂食动物和素食者是高TMAO生产者和相应的95%可信区间计算使用逻辑回归模型。皮尔森的相关性是用来计算两个变量之间的联系。所有统计分析使用R软件V.3.4.1或GraphPad棱镜(7节)。
其他网上描述的方法补充文件。
确认
我们愿意承认医学微生物群中心所提供的服务的第一核心实验室,国立台湾大学医学院。本研究中使用的无菌鼠设施人性化鼠标提供的平台:病人肿瘤,肠道微生物群的移植和基因修改服务在国家核心设施生物制药(大多数106 - 2319 - b - 492 - 001),国家实验动物中心,国家应用研究实验室、台湾。仪器支持南大质谱平台是承认的。我们也感谢实验室帮助Yu-Ting杨Chang-Hao赖和Pei-Lin王。
引用
脚注
贡献者W-KW设计了动物和人类的实验,协助统计分析,起草了手稿。C-CC H-LK辅助人类标本收集。P-YL和SP辅助实验,进行生物信息学和统计学分析。B-YL, T-YC H-TY修订生物信息学和统计学分析。THTC和C-LL辅助FFQ设计和分析膳食评估。H-LK、C-HK C-TH H-BZ进行代谢组学研究和辅助质谱分析。H-LC和提供人性化的鼠标Y-TH平台。P-CC R-AC辅助实验和动物实验。C-TH批判性回顾了手稿。L-YS M-SW设计实验,为这项研究提供了资金和批判性思维修订手稿。
资金本研究从科技部资助(台湾)(106 - 2314 - b - 002 - 039 - my3和107 - 2321 - b - 002 - 017)和部分的资助支持科学技术部(台湾)(106 - 3114 - b - 002 - 003),以及部分的资助项目转化创新生物制药开发技术支持平台的轴(106-0210-01-10-01和106-0210-01-10-01)。这项工作也是部分财政支持的“精密医学中心”的特色区域高等教育研究中心计划的框架内发芽项目由教育部在台湾(格兰特号码:南大- 107 l9014-1)和科技部,行政院,中华民国,台湾(授予数量:TCTC-TR2 106 - 2321 - b - 002 - 025)。这项工作也支持的研究由国立台湾大学医院(107 - t11)。
相互竞争的利益没有宣布。
病人的同意获得的。
伦理批准国立台湾大学医院的机构审查委员会。
出处和同行评议不是委托;外部同行评议。
数据共享声明NCBI序列读取存档:16 s rDNA扩增子的人类杂食者(SRX4119476 - SRX4119509)和素食(SRX4119396 - SRX4119418)。