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客观的减少Paneth细胞(PC)数字在炎症性肠道疾病和电脑功能受损导致回肠克罗恩病(CD)的发病机理。电脑位于靠近Lgr5就+肠道干细胞(ISC)和线粒体是ISC-renewal和分化的关键。在这里,我们描述ISC和PC出现炎症条件下和描述ISC niche-maintenance线粒体功能的作用。
设计从CD患者回肠组织样本,线粒体功能障碍(Hsp60的小鼠模型Δ/ΔISC)和CD-like回肠炎(TNFΔARE),肠道瀑样被用来描述个人电脑和isc与线粒体功能。
结果在CD患者和肿瘤坏死因子ΔARE老鼠,炎症与Lysozyme-positive颗粒数目减少在电脑和减少Lgr5就表达在地下室的地区。抵抗改变个人电脑和ISC外观坚持non-inflamed组织区域的CD和预测患者手术切除后复发的风险。ISC-specific删除Hsp60和抑制线粒体呼吸的线粒体功能异常的PC表型有关。符合减少具备干细胞体内,隐窝发炎TNFΔARE老鼠不能长成瀑样体外。Dichloroacetate-mediated抑制糖酵解,迫使细胞转移到线粒体呼吸,改善ISC利基功能和拯救TNF的能力ΔAREmice-derived隐窝形成瀑样。
结论我们提供的证据表明,炎症反应在肠道上皮细胞线粒体功能障碍引发代谢失衡,导致减少具备干细胞和收购一个功能失调的PC表型。阻止糖酵解可能是一种新的药物靶标与电脑功能障碍发病机制的CD。
- 炎症性肠病
- 克罗恩氏病
- 肠道干细胞
- 能量代谢
- 肠上皮细胞
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本研究的意义
已知在这个问题上是什么?
减少Paneth细胞(PC)数字经常在炎症性肠病(IBD)和PC功能受损是回肠克罗恩病(CD)的一个特征。
电脑涉及粘膜防御和支持肠道干细胞(ISC)利基。
线粒体功能障碍和能量代谢改变与发病期间和炎症性肠病的进程。
线粒体功能、代谢及线粒体的蛋白反应参与肠道上皮细胞分化并确定细胞表型。
有什么新发现吗?
ISC标记的表达Lgr5就除了减少电脑的粒度,CD和CD-like患者肿瘤坏死因子与炎症ΔARE老鼠。
在未受感染的组织形态出现的pc和ISC利润预测内窥镜术后早期复发患者的CD。
诱导线粒体功能障碍的ISC Hsp60损失导致整体降低Lgr5就表达和分化的原因Lgr5就+异常的电脑。
增强线粒体呼吸的抑制糖酵解恢复inflammation-imprinted ISC利基市场的障碍。
它会如何影响临床实践在可预见的未来吗?
我们提供的证据表明,线粒体功能受损有关CD-associated具备干细胞和功能失调的PC表型的一代。展示一个概念验证针对ISC改变通过实现与毒品有关的代谢转变,我们为CD合理化的一种新的治疗方法。
介绍
克罗恩病(CD),属于群和炎症性肠病(IBD),特点是透壁的急性和慢性炎症肠组织的区域,通常包括回肠末端。1在CD的发病机制,多个遗传风险因子一起环境诱因导致干扰免疫反应朝着dysbiotic共生的微生物群。2肠道上皮细胞微生物群之间的接口和主机非常有助于肠道内稳态,和改变肠道上皮细胞(IEC)亚型包括杯状细胞数目减少和Paneth细胞(pc)经常在炎症条件下观察到的。3电脑位于小肠隐窝基地,住在富亮氨酸repeat-containing g蛋白耦合的受体(Lgr) 5地下室基础柱状(CBC)肠道干细胞(isc)和通过分泌的抗菌肽(安培),如溶菌酶defensins (cryptdins) angiogenin-4 (Ang4)和分泌磷脂酶A2,电脑有助于病原体间隙和形状共生的微生物群。4个5
除了粘膜防御,电脑的维护提供必要的信号ISC利基。其中切口配体(Dll4),分泌EGF和Wnt3等因素,6而且最近确定的代谢信号分子包括循环ADP核糖(cADPR)7和乳酸,8促进最佳的干细胞功能。此外,急性损伤,电脑本身作为储备干细胞群,恢复Lgr5就+ISC通过去分化,从而促进组织再生。9 - 11
遗传风险变异知名CD-relevant自噬基因(ATG16L1),bacterial-sensing (NOD2),内质网(ER)应激反应(XBP1)和Wnt信号(TCF4)被证明影响电脑功能的音箱生产和分泌,和损失的PC defensins尤其与回肠表型相关的CD。3日然而,它是有争议的回肠CD是否特定疾病的电脑,或者失去电脑功能仅仅是相关的,但并不是发展的因果CD。IEC-specific基因敲除模型发展CD-like回肠炎症包括半胱天冬酶8- / -,17Atg16l1- / -15和Xbp1- / -12老鼠共享电脑的损失函数的发病机制;然而,基因消融的pc不足以生成CD-associated表型。18 19符合个人电脑在疾病进展中的作用,肿瘤坏死因子ΔARE老鼠,bacterial-driven模型慢性CD-like回肠炎,显示亏损lysozyme-positive个人电脑之后,爆发前,但不是TNF-driven组织病理学。没有观察到的细胞凋亡可能是增长隐窝肿瘤坏死因子ΔARE老鼠,表明上皮改造而不是PC-specific细胞死亡。20.电脑改变的原因以及PC在慢性炎症条件下目前未知的命运,尽管胞外分泌通路在PC的障碍小鼠hypomorphic CD易感性基因的表达Atg16l1由线粒体退化平行。14有趣的是,一些基因危险因素影响线粒体功能被确定为炎症性肠病,21和肠道炎症疾病被建议作为能量不足的iec线粒体代谢的改变。22日23日与此同时,线粒体功能和信号通路如线粒体的蛋白反应(MT-UPR)已成为细胞检查点的新陈代谢,具备干细胞分化和IEC计划。24我们之前证明MT-UPR激活在IEC IBD患者和肠道炎症的小鼠模型25MT-UPR显示激活,引起线粒体伴侣Hsp60 IEC-specific损失,导致受损的线粒体呼吸、以及ISC的损失。26然而,细胞起源和特定的病理机制,线粒体功能集成到CD仍然未知。细胞的新陈代谢也正越来越被认为是细胞表型和干细胞命运的决定因素,24和电脑的重要作用ISC利基市场的监管,我们旨在描述pc和Lgr5就+ISC的线粒体功能和炎症。
在这项研究中,我们表明,计算机粒度,并将减少Lgr5就表达与CD患者炎症和肿瘤坏死因子ΔARE老鼠。重要的是,在未受感染的形态外观ISC利基组织利润预测内窥镜术后早期复发患者的CD,识别客观生物标记选择病人进行预防性治疗。诱导线粒体功能障碍的ISC Hsp60损失导致整体降低Lgr5就表达和分化的原因Lgr5就+异常的电脑。值得注意的是,抑制糖酵解足以覆盖inflammation-imprinted ISC利基体外的变化和拯救TNF的能力ΔAREmice-derived隐窝给瀑样。
结果
Paneth细胞功能和减少Lgr5就表达与CD-like炎症
在肿瘤坏死因子ΔARE老鼠,在肿瘤坏死因子(TNF)删除AU-rich (adenosin-uracil)元素是导致TNF的平移控制损失,导致microbiota-driven回肠末端的透壁的炎症。20.在TNF CD-like组织炎症逐渐发展ΔARE老鼠和与PC功能障碍。20.电脑包含不同的细胞质颗粒胞外分泌的安培,27和lysozyme-positive (Lyz+)分泌颗粒形态功能标记用于PC表型分类。13日14我们利用异质性在TNF CD-like炎症的品位ΔARE老鼠在广泛的组织病理学特征电脑分数(HS)。回肠组织部分来自TNFΔARE老鼠没有(HS 0),中等(HS < 4)和严重(HS > 4)炎症是彩色Lyz和电脑分为高颗粒(≥2 Lyz+胞质颗粒)和较低的颗粒(< 2 Lyz+胞质颗粒和/或胞质扩散Lyz染色)表型(图1一个)。代表组织部分)染色法在不同的商品了图1 b。总数量的Lyz+电脑每crypt (图1 c)和高度的百分比细粒度的电脑(图1 d)具有负相关性等级的炎症和电脑异常的迹象已经出现在中度炎症小鼠(图1 c, D)。比较从non-inflamed组织肿瘤坏死因子ΔARE小鼠和野生型(WT)同窝出生的,我们观察到在个人电脑的总数没有差异。然而,non-inflamed肿瘤坏死因子ΔARE老鼠表现出轻微的减少电脑的粒度(在线补充图1 a, B)。确认电脑功能降低TNFΔARE老鼠,转录水平的Lyz1和PC-derived安培alpha-defensin 5 (Defa5),Ang4和ISC-niche支持Dll4减少(图1 e)。描述ileitis-associated变化的影响在PC功能CBC ISC Lgr5就标志着我们进行原位杂交Lgr5就(图1 f)。点的数量,代表Lgr5就成绩单、数(图1 g)和隐窝与高分为隐窝Lgr5就表达式(≥10点)和低Lgr5就表达式(< 10点),分别。符合减少电脑功能,Lgr5就+isc减少炎症条件下(在线补充图1 c)和高的多的隐窝Lgr5就表达与组织病理学的程度呈负相关(图1 h)。具备干细胞减少发炎TNFΔARE老鼠qPCR分析证实了Lgr5就(图1我)。没有观察到墓穴形态和差异Lgr5就表达与WT non-inflamed TNFΔARE老鼠(在线补充图1 c, D)。Olfactomedin原位杂交(Olfm) 4,一个更广泛的活跃isc标记,确认具备干细胞减少炎症条件下(在线补充图1 eg)。电脑具备干细胞功能和显示的并行减少紧功能ISC利基在炎症条件下的相互关系。
Paneth细胞功能障碍和降低Lgr5就表达与TNF CD-like炎症ΔARE老鼠从TNF回肠组织部分ΔARE小鼠不同程度的炎症和IEC隔离来自TNFΔARE老鼠和WT同胞进行分析。(A)免疫荧光(如果)costaining溶菌酶(红色)和钙粘蛋白(IEC边界,灰色)复染色Dapi(核、蓝),低面板:高放大显示的部分。数字图片上面显示的商品各自的组织切片。(B)代表)图像HS 0 (non-inflamed), 2(中度炎症),4(严重的炎症)。(C)相关分析(Pearson)溶菌酶阳性的数量(Lyz+)细胞和HS和(D)的比例高度粒状Lyz+细胞(≥2颗粒)和海关。右:Lyz染色描绘Lyz代表+分别较低的细胞和高粒度。(E)中存在的分析iec对电脑功能的基因研究(n = 5) (F)代表的照片原位Lgr5就杂交,包括的放大;数据显示各自的商品。(G)的例子Lgr5就成绩单量化;黑色箭头表示的每个点代表一个Lgr5就成绩单。(H)相关分析(Pearson)的隐窝的比例高Lgr5就表达式(≥10成绩单)和海关。(我)存在分析iec的Lgr5就(n = 5)。统计数据是由未配对t以及。酒吧代表意味着+ SEM。星号显示显著差异* * * p < 0.05, p < 0.01, * * * p < 0.001。,AU-rich (adenosin-uracil)元素;CD,克罗恩病;海关,组织病理学评分;IEC,肠道上皮细胞;电脑,Paneth细胞;肿瘤坏死因子,肿瘤坏死因子;WT,野生型。
异常的PC表型和LGR5就回肠CD表达与活跃
来验证肿瘤坏死因子的相关性ΔARE老鼠,我们获得的样本70 CD患者接受手术切除以前公布的前瞻性研究。28术后早期病变观察到ileocolonoscopy最佳预测病程和ileocolonoscopy目前的黄金标准来评估临床复发的风险。29日回肠组织收集的利润率在切除手术和术后内镜进行6 - 12个月后复发评估内镜根据Rutgeerts得分。内窥镜复发被定义为一个Rutgeerts分数≥i2。CD患者分类根据炎症的存在与否在基线,切除组织样本和术后复发内窥镜分类示意图所示图2一个手术时,病人的特点编制在线补充表1。符合肿瘤坏死因子ΔARE老鼠,LYZ的数量+电脑和细粒度的pc (≥2 LYZ+胞质颗粒)显著降低组织利润列为发炎时手术相比分为non-inflamed (图2 b, C)。有趣的是,LYZ的数量+细胞“上隐窝”(+ 6以上职位)显著增加在发炎与non-inflamed组织利润相比,表明一个异常ISC利基架构在炎症条件下(图2 b,对吧)。反映了CD-like小鼠模型,发炎组织利润显示高的隐窝的减少LGR5就表达式(≥15点),以及LYZ相伴+细胞+ 6的位置之上,LGR5就表达上隐窝是诱导(图2 d, E)。
异常Paneth细胞表型LGR5就表达式与疾病活动在回肠组织利润的CD患者回肠组织部分CD切除手术的患者进行分析和组织利润列为non-inflamed和发炎,分别的时候手术进行比较。(A)的概述CD病人编号为基线和内窥镜随访疾病分类。(B)量化LYZ的总数+细胞、高颗粒LYZ+细胞(≥2颗粒)和LYZ的数量+基于LYZ如果染色细胞上隐窝。(C)代表的照片如果costaining溶菌酶(红色)和钙粘蛋白(IEC边界,灰色)复染色Dapi(核、蓝),右面板:更高的放大显示部分。(D)代表的照片原位LGR5就杂交,包括的放大。(E)的量化原位LGR5就杂交给隐窝的比例高LGR5就表达式(≥15LGR5就成绩单)和隐窝的LGR5就表达上隐窝。统计数据是由未配对t以及。酒吧代表意味着+ SEM。星号显示显著差异* * * p < 0.05, p < 0.01, * * * p < 0.001。CD,克罗恩病;IEC,肠道上皮细胞;LYZ+溶菌酶阳性。
Paneth细胞表型和LGR5就表达模式预测复发患者的CD
正如前面所示的,28炎症在切除回肠组织基线是内窥镜复发的预测,然而44%的分析CD患者non-inflamed组织利润仍然发达复发性疾病(图2一个)。分析地区严重的肠自由活动或慢性炎症已经提出更精确地反映疾病发展由于潜在的早期分子和病理变化。13因此,我们测试了在回肠利润列为non-inflamed手术如果PC表型异常和异常LGR5就+表达预测内窥镜6 - 12个月后复发。实际上,低比例的高细粒度的电脑(图3 a, B)和大量LYZ+在上隐窝细胞(图3 c, D)与复发的风险,而LYZ的总数+电脑在隐窝没有复发和临时组织之间的不同(在线辅助图2 a, B)。,隐窝的比例较低,高LGR5就表达式(图3 e, F)和增强LGR5就表达式上隐窝(图3 g, H)进一步预测内窥镜复发。分配的数量非常细粒度的电脑,电脑上隐窝、高度Lgr5就表达隐窝和Lgr5就表达上隐窝的风险因素(0 - 4),我们展示了一个强大的累积效应的风险因素对疾病复发的概率图2 c在线补充)。吸烟,前面已经确定为复发的危险因素在这一群人,28与PC粒度降低,低比例的隐窝与高吗LGR5就表达和增强LGR5就表达式上隐窝(在线辅助图3 a - c)。然而,在CD患者出现复发,吸烟没有额外的影响的风险因素分析(在线辅助图3 d, E)。NOD2 CD-associated风险等位基因和ATG16L1已报告影响PC表型;13然而,我们观察到没有影响的单核苷酸多态性ATG16L1 rs6752107和NOD2 rs2066845或rs2066844 ISC利基的外表,可能由于高比例的风险等位基因载体(在线辅助图3 f-h)。相反,在组织利润列为发炎的时候手术,具备干细胞异常的PC表型和未能更好的分层疾病复发在线辅助图4)。总之,这些数据显示,一个强有力的预测价值改变早期内镜ISC利基的复发,表明这些表型的变化作为第一分子炎性改变的迹象,前宏观损伤。
PC表型和LGR5就表达预测复发non-inflamed CD患者回肠组织部分分为non-inflamed CD切除手术患者手术时间进行分析。组织切片染色的LYZ如果和LGR5就分别通过原位杂交和表达模式被量化。高颗粒LYZ的数字+细胞(≥2颗粒),LYZ的数量+细胞上隐窝,隐窝的比例高LGR5就表达式(≥15LGR5就成绩单)和隐窝的比例LGR5就表达上隐窝被确定。CD患者内镜复发(Rutgeerts评分≥i2) 6 - 12个月手术后的患者相比CD没有经历复发。(A, C, E, G)的总体比较复发和临时病人各自的标志;(B、D、F、H)从左到右:分配各自的标记患者复发(红圈)和临时(黑色圆圈)CD中值表示;CD患者经历复发的概率如果高于或低于中位数的各自的标志;代表图片显示部分从CD患者高于或低于中位数。(A, B)的高度粒状LYZ+细胞(≥2颗粒),(C, D) LYZ的数量+上隐窝细胞(B, D)如果costainings溶菌酶(红色)和钙粘蛋白(IEC边界,灰色)复染色Dapi(核、蓝)。(E, F)隐窝的比例高LGR5就表达式(≥15LGR5就成绩单),(G, H)比例的隐窝LGR5就表达上隐窝(F、H)原位LGR5就杂交。(A, C, E, G)统计数据是由未配对t以及。酒吧代表意味着+ SEM。星号显示显著差异* * * p < 0.05, p < 0.01, * * * p < 0.001。(B、D、F、H)统计分析了通过χ²测试。CD,克罗恩病;IEC,肠道上皮细胞;LYZ+溶菌酶阳性;电脑,Paneth细胞。
炎症在肿瘤坏死因子ΔARE老鼠与线粒体功能受损有关
表型变化的电脑被描述与此同时结构受损的线粒体,14和线粒体的压力信号(MT-UPR)是明显的IEC IBD患者肠道炎症的小鼠模型。25因此,三磷酸腺苷(ATP)含量降低TNF的孤立的回肠隐窝ΔARE老鼠,随着水平的提高MT-UPR标记蛋白质Hsp60和Pkr (dsRNA-activated蛋白激酶)25在炎症条件下(图4模拟)。与此同时,转录水平的基因信号通路相关干扰线粒体功能,包括MT-UPR (Trb3,Atf5,切)、抗氧化反应(Hif1a)和ATP含量低(Prkaa2在回肠隐窝,amp激酶调节(图4 e),而表达Grp78ER应激未加(代孕的标记图4 f)。,透射电子显微镜显示明显减少数量的电脑与典型的形态学特征回肠隐窝发炎TNF的基地ΔARE老鼠。硕果仅存的几个Paneth-like细胞通常表现出与扩大晕分泌颗粒,胞浆内空泡形成,扩张的呃,以及退行性线粒体的改变,包括线粒体肿胀的解散和中断嵴,损失矩阵密度和偶尔的形成intramitochondrial电子致密夹杂物(图4 g)。自噬对细胞能量存储的动员和改变autophagy-related蛋白质与PC颗粒胞外分泌的干扰途径和线粒体退化。14因此对自噬标记LC3染色,增加LC3发炎TNF的表达在地下室基地ΔARE观察小鼠伴随代谢和形态变化(在线补充图5 a, B)。
炎症在肿瘤坏死因子ΔARE老鼠与线粒体功能障碍在回肠隐窝孤立从TNF回肠隐窝和组织部分ΔARE老鼠和WT同胞进行分析。(A) ATP含量主要生活相对孤立的隐窝细胞蛋白酶活动通过测量荧光分析(n = 10/7)。(B)地下室结构的概述和插图的区域用于蛋白质量化。(C)如果Hsp60的图片(绿色)与Dapi复染色(核、蓝),包括的放大。数字图片上面显示的商品各自的组织切片。右:相应的量化。(D) Costaining Pkr(绿色)和钙粘蛋白(IEC边界,灰色)复染色Dapi(核、蓝),包括的放大。数字图片上面显示的商品各自的组织切片。右:相应的量化。(E)中存在的分析主要为基因参与线粒体MT-UPR回肠隐窝,线粒体信号和(F) ER应激(n = 6)。 Statistics were performed by unpairedt以及。酒吧代表意味着+ SEM。星号显示显著差异* * * p < 0.05, p < 0.01, * * * p < 0.001。(G)透射电子显微镜回肠隐窝的基地。面板一个:WT;A1-2:电脑显示丰富,顶端,电子致密SGs狭窄晕(箭头所指)。星号标记分泌颗粒和小电子致密核心和宽的边缘低电子密度的絮状物质。a - 3。一成不变的r和线粒体WT-PLC (M)。B:non-inflamed肿瘤坏死因子ΔARE老鼠;B-1-6:电脑超微结构本质上类似于WT老鼠。护士:细胞核。C:炎症肿瘤坏死因子ΔARE老鼠。C-1-2:少数细胞与PLC-typical位置和形态常常显示空泡形成分泌颗粒的晕圈(V)和扩大。集成电路:炎性细胞浸润C-4-6:线粒体病变PLC包括intramitochondrial夹杂物(4),线粒体肿胀的解散和中断嵴,损失矩阵r的密度和膨胀(其他)。,AU-rich (adenosin-uracil)元素;CD,克罗恩病;海关,组织病理学评分;IEC,肠道上皮细胞;电脑,Paneth细胞;r,粗面内质网;SG,分泌颗粒;肿瘤坏死因子,肿瘤坏死因子;WT,野生型。
ISC线粒体损伤导致转向功能失调Paneth细胞
个人电脑和Lgr5就+ISC修改并发炎症条件下线粒体损伤是目前肿瘤坏死因子ΔARE老鼠。因此,我们为特征的作用线粒体功能ISC利基外观使用小鼠模型中Hsp60可以专门删除Lgr5就+ISC (Hsp60液氧/液氧×Lgr5就-eGFP-IRES-CreERT2-Tg通过它莫西芬(Hsp60)Δ/ΔISC)。26Hsp60代表一个目标基因MT-UPR信号,是主要的女伴线粒体基质。30.因此,Hsp60的损失导致干扰proteostasis MT-UPR线粒体和随后的激活的信号。26因此,Hsp60不足导致线粒体功能障碍,包括减少线粒体呼吸和细胞ATP含量下降。26确认MT-UPR激活Hsp60损失,转录cochaperone和代理MT-UPR的标志,Hsp10增加后早期诱导Hsp60删除与感应的Trb3,切,Hif1a Prkaa2(图5一个)。后Lgr5就和Lyz Hsp60回肠的表达式Δ/ΔISC小鼠6天结束后他莫昔芬治疗,ISC利基的瞬态变化特征。在第二天,高度的比例Lgr5就表达隐窝下降(图5 b, C)。PC表型特征表明,平行的努力Lgr5就- - - - - -Lyz+细胞数量减少,而数量的Lgr5就+Lyz+双阳性细胞增加,从天0年底它莫西芬治疗后(图5罪犯)。isc的标记表达减少和电脑,PC PC-derived安培的粒度和表达减少,以应对Hsp60损失isc线粒体功能障碍(图5比)。反映炎症肿瘤坏死因子ΔARE老鼠,LC3染色Hsp60的地下基地Δ/ΔISC老鼠描绘诱导自噬(在线辅助图5 c)代谢和形态改变的ISC利基。排除的线粒体dysfunction-mediated细胞死亡的可能性Lgr5就+ISC和Lyz+细胞,组织部分的第二天,当损失Lgr5就表现最为明显,分别为TUNEL和eGFP或Lyz costained,。此外,组织部分被染色的细胞凋亡标记裂解半胱天冬酶3 (CC),确认没有增强细胞凋亡在结束后的第二天他莫昔芬治疗,但表明增加细胞凋亡在地下室基础4和6天(在线辅助图6)。Hsp60不足Lgr5就+isc与完整的扩散损失的Ki67染色(在线辅助图7)。然而,的表达Olfm4和Hopx,+ 4的一个标志储备干细胞可能导致Lgr5就+ISC补给,31日在隐窝(暂时保留,增强在线辅助图7 b, C)。,细胞在地下室基础仍然Hsp60, Ki67积极在整个观测时间点(在线辅助图7)。Crypt-based细胞恢复Hsp60, Ki67表达式从第四天开始,表明Hsp60缺乏细胞的凋亡细胞死亡和挤压。Lgr5就+ISC可以分化成电脑,反之亦然,去分化的pc和收购干细胞特性被描述在CBC ISC的损失。9日10确定功能失调的电脑来自线粒体function-impaired isc,我们为Lyz和Hsp60染色。Hsp60负直接源于细胞Lgr5就+isc患有线粒体功能障碍。Lyz的比率+细胞中Hsp60无法检测到在每天0和2(增加图5 h,我),表示Lgr5就+,Hsp60- - - - - -isc收购Lyz表达式通过机制由线粒体功能障碍。此外,减少电脑的粒度和扩散Lyz染色与缺乏Hsp60在个人电脑(图5 j)。总之,这些数据表明,线粒体损伤,包括减少线粒体呼吸,发起一个过渡的Lgr5就+isc pc的表型。然而,这些无能的Lgr5就+Lyz+双阳性细胞调整新cell-phenotypic线粒体功能需求(由于缺乏Hsp60),似乎阻碍分化为功能成熟的电脑(图5 k)。有趣的是,costaining Hsp60的粘蛋白2 (Muc2) Chromogranin (ChgA)或doublecortin-like激酶1 (dclk1)分泌IEC的标记类型(enteroendocrine细胞和簇细胞,杯状细胞)表示,ISC患有线粒体功能障碍只有获得Lyz表达式,Muc2以来,ChgA dclk1表达细胞仍Hsp60正面的(在线辅助图8 a - c)。在他莫昔芬治疗后6天,isc和电脑恢复正常的表型媲美Hsp60液氧/液氧老鼠(图5 b, C, E、F、H)。在这个时间点,Hsp60信使rna表达IEC回到控制水平(图5一个)。Hsp60的完全恢复+,Lgr5就+ISC和正常ISC利基表型表示的补充Lgr5就+ISC预备役ISC人群所描述。9点32
细胞线粒体损伤ISC导致转向功能失调Paneth回肠组织部分和IEC Hsp60的隔离液氧/液氧老鼠和Hsp60Δ/ΔISC老鼠分析它莫西芬治疗结束后在不同的时间点。iec (A)中存在的分析Hsp60和基因参与线粒体MT-UPR和线粒体信号在天0。(B)原位Lgr5就杂交(棕色)和溶菌酶(Lyz绿松石)immunehistochemistry(包含IHC) costaining降低面板:放大,虚线表示隐窝细胞边界,箭头指示Lyz+细胞,箭头表示Lgr5就-Lyz double-positive细胞。(C)量化的隐窝的比例高Lgr5就表达式(≥10Lgr5就成绩单)的比例Lgr5就-Lyz double-positive细胞的比例Lgr5就负,Lyz阳性细胞。(D)代表的照片Lgr5就-Lyz double-positive细胞,Lgr5就负,Lyz阳性细胞;虚线表示隐窝细胞边界,箭头表示Lgr5就-Lyz double-positive细胞,箭头指示Lgr5就负,Lyz阳性细胞。(E)如果costaining Lyz(红色)和钙粘蛋白(IEC边界,灰色)复染色Dapi(原子核,蓝色)显示颗粒和non-granular染色模式。(F)的量化比例高颗粒Lyz+细胞(≥2颗粒)。(G)中存在的分析iec PC-derived AMP和从0天Dll4。(H)的量化比例Hsp60负,Lyz单一阳性细胞。(我)代表的图片包含IHC costaining为Hsp60(棕色)和Lyz(青绿色)用于量化;虚线表示隐窝细胞边界,箭头表示Hsp60-Lyz双阳性细胞,箭头指示Hsp60负,Lyz阳性细胞。(J)如果costaining Hsp60(绿色),Lyz(红色)和钙粘蛋白(IEC边界,灰色)复染色Dapi(核、蓝),包括的放大。星号指示Hsp60-Lyz双重积极、高颗粒Paneth细胞,穿过表明Hsp60负,Lyz阳性细胞,描绘一个漫射Lyz染色。(K)的示意图表示主要发现在这个图。统计分析是由单向方差分析图基测试或未配对紧随其后学习任务。酒吧代表意味着+ SEM。星号显示显著差异* * * p < 0.05, p < 0.01, * * * p < 0.001。AMP,抗菌肽;方差分析,方差分析;IEC,肠道上皮细胞;MT-UPR,线粒体的蛋白反应;
隐窝发炎的肿瘤坏死因子ΔARE老鼠不能长成瀑样
进一步调查的作用线粒体功能ISC niche-regulation在炎症条件下,主要的non-inflamed隐窝和TNF红肿ΔARE老鼠没有Wnt因素孤立和播种介质。33添加Wnt媒介因素不是必不可少的小肠(SI)瀑样文化和与pc提供这些信号自然的存在。34回肠隐窝发炎的老鼠显示减少Lgr5就和Lyz表情,确认图1(图6 a, B)。一致,回肠隐窝发炎,但不是non-inflamed TNFΔARE老鼠几乎完全未能发展成瀑样。剩余瀑样显示新创墓穴形成严重的缺陷(萌芽)(图6 c)。在non-inflamed肿瘤坏死因子ΔARE老鼠和WT的同胞,播种效率和崭露头角的可比性(在线辅助图9),证实炎症,而不像负责受损基因型增长。值得注意的是,隐窝源自于空肠,直接毗邻发炎回肠但没有显示组织病理肿瘤坏死因子ΔARE老鼠,也显示形式瀑样(能力下降图6 d)。应用一个肠道瀑样培养基补充后直接与Wnt因素地穴隔离不救援增长(在线辅助图9 b)。因此,它是可能的干扰Lgr5就+isc和电脑有助于inflammation-induced生长缺陷。
具备干细胞线粒体呼吸决定和PC功能在炎症条件下(a e)回肠组织和隐窝源自non-inflamed和TNF红肿ΔARE老鼠进行了分析。(一)代表回肠部分的照片;上图:圆)与组织病理学评分显示染色;底部:如果costaining Lyz(红色)和钙粘蛋白(灰色)复染色Dapi(原子核,蓝色)显示没有电脑发炎组织。(B)中存在的分析主要回肠隐窝Lgr5就和Lyz(n = 6)。(C, D)描述的肠道瀑样来自回肠(C)和空肠(D)隐窝在体外培养的第五天。左:比例的生活瀑样;中间:量化新创隐窝的形成(萌芽);右:代表光明的现场照片。(E)中存在的分析主要回肠隐窝metabolism-determining基因(n = 6)。(F)的示意图表示寡霉素和DCA目标。(G H)回肠瀑样来自WT老鼠寡霉素处理24小时。(G)左:明视场如果costaining Lyz(红色)和钙粘蛋白(IEC边界,灰色)复染色Dapi(核、蓝)。虚线表示Lyz细胞边界+细胞;星号表示Lyz+细胞在右边的图片放大。右:Lyz量化+手机号码/地下室(图上)和高度的比例粒状Lyz(≥2颗粒)+细胞低(图)。(H)中存在的肠道瀑样分析Lgr5就和Paneth细胞(上半部分)和关联基因与线粒体信号相关的基因(较低的面板中,n = 6)。(我)分析一样(H)对人类瀑样来源于小肠和寡霉素处理24小时(n = 6)。(J-L)回肠瀑样来自发炎TNFΔARE老鼠(n = 6)进行了分析。(J)从左到右:实验方案(D0 =隔离主要隐窝和开始的文化),摘要和DCA-treated瀑样比较;比例的生活在第三天瀑样,第八天的文化;量化新创地下室形成的第三天,第八天。(K)从左到右:实验方案,DCA-treated瀑样文化是通过在第8天,随后控制(dca)和DCA-containing培养基培养,分别到14天;比例的生活瀑样每天10到14的文化;在第14天量化新创隐窝的形成。(左)代表明视场瀑样的照片在第八天(使)和14天的文化。(M) WT和TNF红肿ΔAREmice-derived回肠瀑样DCA治疗,疗程14天。存在分析Lgr5就和Paneth细胞关联的基因。统计数据是由未配对t以及由单向方差分析比较两组,其次是图基测试三组比较,分别。统计数据的分析克鲁斯卡尔-沃利斯检验队伍。酒吧代表意味着+ SEM。星号显示显著差异* * * p < 0.05, p < 0.01, * * * p < 0.001。方差分析,方差分析;,AU-rich (adenosin-uracil)元素;DCA二氯醋酸;Lyz+Lyz积极;OXPHOS,氧化磷酸化;WT,野生型。
具备干细胞线粒体呼吸需要维护和电脑功能
细胞构成的新陈代谢ISC利基协调支持彼此的需求,特别是线粒体氧化磷酸化(OXPHOS)很好满足IEC不同亚型的要求。8日24从隐窝来源于炎症环境和Hsp60Δ/ΔISC瀑样都显示线粒体功能障碍,ISC利基市场变化和增长的缺陷(图4和图6模拟,在线辅助图9 c, D),我们决定mRNA表达的关键因素参与OXPHOS和糖酵解水平主墓穴源自non-inflamed和TNF红肿ΔARE老鼠。
Pdha,属于丙酮酸脱氢酶复合物(PDC),Yy1,我的基因和转录因子调节线粒体复杂细胞色素c氧化酶(Cox) IV不断减少(图6 e)。PDC充当看门人代谢通过连接细胞质糖酵解和三羧酸循环和OXPHOS,因此,寡霉素,阻塞OXPHOS和二氯醋酸(DCA),针对PDC OXPHOS将ATP生成从糖酵解35(图6 f),被用来描述代谢对ISC细分功能的作用。小鼠回肠WT瀑样和人类如果瀑样是用亚致死剂量的寡霉素治疗(在线辅助图9 e)或DCA。瀑样对待寡霉素描绘Lyz数量下降+细胞每地下室和减少电脑的粒度(图6克)。与此同时,转录水平的Lgr5就,Lyz和Ang4被减少了,而切,Hif1a和Prkaa调节(图6克)。值得注意的,这些结果反映在人类肠道瀑样(图6 h)。相比之下,DCA对这些读数(只有最小的影响在线辅助图10)。
增强线粒体呼吸恢复inflammation-imprinted ISC利基市场的障碍
最后,我们测试了,如果炎症反应在TNF生长缺陷ΔAREDCA mice-derived隐窝可以逆转。事实上,增加DCA瀑样培养基后直接播种获救发炎TNF的能力ΔAREmice-derived回肠隐窝长成瀑样并形成新创隐窝(图6 j)。引人注目的是,DCA撤军之后使在第八天的文化赋予没有负面影响瀑样增长而持续DCA治疗(图6 k, L)。比较DCA-exposed瀑样来自发炎TNFΔARE老鼠和WT小鼠,基因转录水平的ISC和PC-associated主要聚合(图6米)。这些数据表明,激活OXPOHOS通过抑制糖酵解足以恢复inflammation-imprinted ISC利基的代谢功能障碍。
具备干细胞撤军后的持续恢复DCA突显ISC的可逆性质改变在炎症条件下,使ISC利基代谢治疗干预(一个有吸引力的目标图7)。
线粒体损伤驱动ISC转向功能失调的电脑预测克罗恩病复发的示意图表示这项工作的主要结果。靶向破坏线粒体功能的isc isc导致过渡到功能失调的电脑。在炎症条件下,线粒体损伤的ISC利基导致ISC疲惫和一代的功能失调的pc的特点是Lyz阳性颗粒,伴随异常Lgr5就在上隐窝和Lyz表达。这些改变之前组织病理学和作为早期内镜复发预测标记CD。体外,线粒体呼吸(OXPHOS)的抑制肠道瀑样反映炎症的影响环境ISC利基,而强化的OXPHOS抑制糖酵解能够覆盖inflammation-imprinted ISC利基市场的变化。,AU-rich (adenosin-uracil)元素;CD,克罗恩病;ISC,肠道干细胞;Lyz,溶菌酶;OXPHOS,氧化磷酸化;电脑,Paneth细胞;肿瘤坏死因子,肿瘤坏死因子。
讨论
炎症性肠病,包括CD和溃疡性结肠炎,构成全球卫生问题。36治疗的一个重大挑战CD的异质性疾病,只有子集的患者对治疗像管理anti-TNF抗体。37易感基因的数量确定连同一系列不同的环境诱因,可能占这些困难,暗示多元化机制导致的表型变量CD。几个CD-relevant途径聚集在电脑的水平,像ER应激,自噬和细菌识别和持续,NOD2 ATG16L1变异等位基因和细菌感染已经被证明是影响PC表型。12 14 15 38因此,异常的PC表型已经被提议作为生物标志物来分层CD患者根据类似的疾病机制为了产生更好的治疗结果。13本文提供的数据表明,确定ISC利基外观改善患者危险分层的CD,并针对潜在的线粒体功能障碍的发展作为治疗的新策略。
减少电脑功能已经广泛描述上下文中的CD AMP生产和肠道菌群的变化。3 5 15 27然而,电脑作为多功能地穴的守护者,也提供基本信号ISC利基。27个人电脑发展的正上方地下室基础,Lgr5就+isc争夺可用表面自己的直接后代,34暗示ISC变化伴随的电脑异常。因此,我们发现了Lgr5就在CD患者和发炎TNF表达ΔARE老鼠,反映出炎症反应电脑功能的逐渐丧失。此外,在CD患者,LYZ和LGR5就显示一种扭曲的表达模式与pc和isc大量出现在上隐窝。到目前为止,Lgr5就+ISC损失被描述在主DSS-induced炎症反应和高剂量γ-irradiation。9点39临时损耗及急性损伤后快速恢复这些细胞似乎背后隐窝的再生反应。在这种情况下,电脑有助于肠道受损组织的修复和再生通过收购茎像功能。9 - 11然而,辐照和DSS-induced炎症引起急性粘膜损伤,不能反映IBD病理学的慢性炎症性疾病。尽管减少了Lgr5就表情,隐窝源自DSS-treated老鼠表现出增强的能力形成瀑样,9从发炎TNF与隐窝ΔARE老鼠无法产生瀑样。因此,ISC利基的表型变化在慢性炎症可能与治疗过程无关,而是表明具备干细胞疲惫病理学的一个特征。此外,ISC利基异常在出现严重的组织病理学检测肿瘤坏死因子ΔARE老鼠和未受感染组织中利润率的CD患者,这表明这些变化最有可能代表早期,分子标记的炎性变化。
此外,我们提供实验证据的直接作用线粒体功能失调发展的个人电脑使用一个ISC-specific线粒体功能障碍的小鼠模型和体外抑制OXPHOS瀑样的文化。具备干细胞实验干扰线粒体功能降低和PC的功能,展示功能失调的PC的直系后代isc患有线粒体损伤。因此,线粒体功能障碍在ISC似乎打扰自我更新和分化之间的平衡,不能调整线粒体功能随后似乎干扰分化进程,阻碍正常的电脑成熟。
这是符合线粒体的关键作用ISC命运分化期间通过代谢的调节开关。24在Lgr5就+isc隔绝鼠标小肠,OXPHOS高度导致细胞生物能疗法,和线粒体活动进一步增加肠道瀑样分化和新创墓穴的形成,8说明为什么ISC ISC分化过程可能特别容易受到线粒体损伤。OXPHOS抑制和随后的减少ISC和PC标记基因与转录激活砍,低氧诱导因子1-α和腺苷酸激酶在小鼠和人类肠道瀑样。所有这些基因是参与代谢调节和链接线粒体稳态CD-relevant pathomechanisms包括MT-UPR, ROS信号和能量传感。24 40-42
最引人注目,体外培养实验使用肠隐窝来自发炎TNFΔARE老鼠建议(I)炎性环境痕迹ISC具备干细胞利基对减少和PC功能,(II),这些变化持续在正常培养条件和Wnt无法克服的因素,(III),有针对性的使用DCA具备干细胞治疗救助和逆转代谢干预炎症印记,允许瀑样传播在正常培养条件。DCA治疗结果减少了糖酵解和改善线粒体呼吸,能用于治疗不同的固体肿瘤逆转癌细胞Warburg效应。35识别目标代谢物赋予ISC利基体内平衡可能是一个有前途的未来的研究目标。
线粒体紊乱的原因出现在CD患者肠道炎症的小鼠模型是目前未知。在一般情况下,肠上皮细胞的IBD患者已报告显示线粒体肿胀和不规则的嵴表明功能受损,43和炎症与缺氧有关。免疫细胞浸润,细胞入侵的病原体和能源需求的增加居民限制可用的氧气,44和血液供应减少,45这些变化导致缺氧条件下慢性炎症。此外,基因多态性影响线粒体功能、线粒体载体蛋白解偶联蛋白(跟单信用证)2和SLC22A5肉碱运输车OCTN2编码,在炎症性肠病被描述为危险因素。46个47UCP2提出控制柠檬酸循环的速度,和线粒体活性氧的生产,促进脂肪酸氧化代谢葡萄糖转变。48OCTN2传输长链脂肪酸共轭碱为β-oxidation线粒体。β-oxidation尤其涉及CD发病机理,因此,药物抑制肠脂肪酸β-oxidation以及基因消融OCTN2导致实验性结肠炎。49个50这些遗传风险因子可能与其他CD-relevant通路上面描述的一致行动,可能呈现iec特别敏感环境引发的炎症。
在CD患者,电脑的比例异常颗粒结构和扩散LYZ分布已被证明与累积的数量NOD2和ATG16L1风险等位基因,13连接多个CD定义PC表型遗传易感性位点。异常比例高,电脑时间较短有关手术后复发患者更积极的临床疾病。13我们的发现在PC粒度证实这些发现在一个独立的病人队列精炼的终点预测早期术后病变ileocolonoscopy 6 - 12个月后观察到手术,并扩大预测细胞标记的集合Lgr5+ISC和表达式的位置。电脑异常形态也与一个激活免疫反应的基因签名从CD患者隐窝13和转录的细胞因子刺激小鼠hypomorphic Atg16l1的表情。14结合本文提供的证据,这表明一个相互关联的角色ISC和PC的分子炎症和代谢表型。此外,我们的数据表明一些相邻的信号传播,发炎组织区域,空肠的瀑样来自发炎TNFΔARE老鼠显示增长受损。
总之,我们认为ISC利基改变目标分子炎性变化,早期内镜复发的预测标记CD。在这种背景下,我们证明了线粒体功能受损有关CD-associated具备干细胞和功能失调的PC表型的一代。Mitochondria-derived信号可能与炎症性肠病易感基因对ISC细分功能的影响,并与环境因素,如肠道菌群或饮食,导致的损失ISC利基体内平衡中观察到回肠CD。通过实现一个毒品转向线粒体呼吸,我们提供了一个概念验证线粒体代谢调节的重要性ISC和PC功能从而合理化CD的新治疗方法。
引用
补充材料
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补充数据
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脚注
SK和ER同样起到了推波助澜的作用。
贡献者SK, ER和DH实验设计,数据分析和写的手稿。SK、ER和EB鼠标和瀑样执行文化的实验。SK的患者进行组织分析。AB进行透射电子显微镜。例如,西北,是和PG支持分析。马和NH患者样本提供。
资金DH收到资金的德意志Forschungsgemeinschaft(脱硫、德国研究基金会)SFB 1371 (Projektnummer 395357507;P01)和优先级SPP计划1656。DH和马接到赫尔姆斯利Cheritable信托资金(IBDOT)。
相互竞争的利益没有宣布。
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