你在这里

条文本

菜单条

下载PDF

XML
炎症性肠病
原始研究
抗tnf治疗IBD通过巨噬细胞IL-10信号传导发挥其治疗作用
  1. Pim J Koelink1，
  2. Felicia M Bloemendaal1，2，
  3. 卜蜂李3.，
  4. Liset Westera1，
  5. Esther W M Vogels1，
  6. Manon van Roest1，
  7. Anouk K Gloudemans4，
  8. Angelique B van 't Wout4，
  9. Hannelie Korf5，
  10. Severine Vermeire5，
  11. Anje A te Velde1，
  12. Cyriel Y Ponsioen6，
  13. 吉尔特·拉姆·达恩斯6，
  14. J Sjef Verbeek7，
  15. 特伦斯·盖革3.，
  16. Manon E Wildenberg1，6，
  17. Gijs R van den Brink1，6，8
  1. 1Tytgat肝脏和肠道研究所，阿姆斯特丹联华电子，阿姆斯特丹，荷兰
  2. 2消化内科和肝病科，阿姆斯特丹联华电子，阿姆斯特丹，荷兰
  3. 3.病理科，圣裘德儿童研究医院，孟菲斯，田纳西州美国
  4. 4杨森疫苗和预防BV预防中心，强生公司杨森制药公司，莱顿，荷兰
  5. 5胃肠疾病转化研究中心(TARGID)，临床与实验医学系，KU鲁汶，鲁汶、比利时
  6. 6胃肠病学和肝病学，阿姆斯特丹联华电子，阿姆斯特丹，荷兰
  7. 7人类遗传学，利兹大学医学中心，莱顿，荷兰
  8. 8巴塞尔罗氏创新中心，F hoffman - la Roche AG，巴塞尔协议、瑞士
  1. 对应到Pim J Koelink博士，阿姆斯特丹联合大学Tytgat肝脏和肠道研究所，荷兰阿姆斯特丹1105 BK;p.j.koelink在{}amc.nl

摘要

客观的巨噬细胞白细胞介素(IL)-10信号在防止IBD发展的调节表型的维持中起着关键作用。我们之前发现，抗肿瘤坏死因子(TNF)单克隆抗体通过fc γ受体(FcγR)信号通路起作用，促进促炎肠巨噬细胞的再极化到CD206+调节表型。IL-10在抗tnf诱导的巨噬细胞复极化中的作用尚未被研究。

设计我们使用人外周血单核细胞和小鼠骨髓来源的巨噬细胞来研究IL-10的产生和CD206+调控巨噬细胞的分化。为了确定抗tnf的疗效是否依赖于体内的IL-10信号转导以及在哪种细胞类型中，我们使用了CD4+CD45Rb高t细胞转移模型与几种遗传小鼠模型的结合。

结果抗tnf治疗以fc γ r依赖的方式增加巨噬细胞IL-10的产生，这导致巨噬细胞在体外分化为更具调控性的CD206+表型。IL-10信号通路的药物阻断阻止了这些CD206+调控巨噬细胞的诱导，并降低了抗tnf治疗CD4+CD45Rb的治疗效果高IBD的t细胞转移模型。利用细胞类型特异性IL-10受体突变小鼠，我们发现IL-10信号在巨噬细胞中，而不是T细胞中，对于诱导CD206+调节性巨噬细胞和抗tnf的治疗反应至关重要。

结论抗tnf在解决肠道炎症中的治疗效果严重依赖于巨噬细胞中的IL-10信号。

  • IBD基础研究
  • 肿瘤坏死因子
  • 抗体靶向治疗
  • 英夫利昔单抗
  • 白细胞介素
http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/

这是一篇开放获取的文章，根据创作共用署名非商业(CC BY-NC 4.0)许可证发布，该许可证允许其他人以非商业方式分发、混音、改编、在此基础上进行构建，并以不同的条款许可其衍生作品，前提是正确引用原始作品，给予适当的荣誉，任何更改都已注明，并且使用是非商业性的。看到的:http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/．

http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl-2019-318264

数据来自Altmetric.com

    请求的权限

    如果您希望重用本文的任何或全部内容，请使用下面的链接，该链接将带您到版权清除中心的RightsLink服务。您将能够快速获得价格和即时许可，以多种不同的方式重用内容。

    本研究的意义

    关于这个问题我们已经知道了什么?

    • 肠道免疫耐受依赖于固有层巨噬细胞中的白介素(IL)-10信号通路来维持CD206+调控表型。

    • 抗肿瘤坏死因子(TNF)治疗IBD的效果取决于fc γ受体信号。

    • fc γ受体(FcγR)信号通路诱导巨噬细胞产生IL-10。

    新的发现是什么?

    • 抗tnf治疗诱导fc γ r依赖性IL-10在小鼠和人巨噬细胞体外产生。

    • 抗tnf治疗在体外以il -10依赖的方式使人和小鼠巨噬细胞向CD206+巨噬细胞极化。

    • 抗tnf治疗在结肠炎T细胞转移模型中的疗效取决于IL-10信号，特别是在巨噬细胞而不是T细胞中。

    • 在克罗恩病患者体内肠道活检中，抗tnf治疗诱导IL-10的产生，并使巨噬细胞向CD206+调控巨噬细胞极化，特别是在抗tnf应答者中，与无应答者相反。

    在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?

    • 我们的结果指出il -10诱导巨噬细胞再极化到IBD患者治疗中的调节表型的核心作用。

    • 对IL-10的反应降低有助于IBD对抗tnf的原发性无反应，可用于识别此类患者。

    简介

    尽管抗肿瘤坏死因子(TNF)-α在IBD治疗中有相当大的疗效，但高达30%的IBD患者没有反应，目前尚不清楚是什么原因导致了这种原发性无反应。1这种不确定性部分与抗tnf治疗在IBD中的作用机制尚未完全阐明有关。2抗TNF治疗在IBD中的作用机制不能仅仅归因于TNF的中和，因为一些TNF中和药物，如依那西普，在类风湿性关节炎的治疗中是成功的3 4但对IBD没有疗效。５ ６最近，有研究表明，高抑瘤素M (OSM)水平与IBD对抗tnf无反应有关。7

    白细胞介素(IL)-10是一种细胞因子，有令人信服的证据表明在IBD的发病机制中起作用。通过多项全基因组关联研究(GWAS)， IL-10与IBD的病因有关，当IL-10或其受体在基因上被破坏时，小鼠和人类都会发生自发的IBD。8 - 11先前已经确定IL-10在IBD中的作用取决于巨噬细胞中的IL-10信号。在这里，IL-10的作用是维持固有层巨噬细胞的CD206+表型，这对维持肠道免疫耐受至关重要。12日13有趣的是，先前有报道称，IL-10突变小鼠对抗tnf治疗难治，而它们对IL-12/IL-23p40抗体高度敏感。14目前尚不清楚为什么IL-10突变小鼠对抗tnf难以抵抗。也许IL-10突变小鼠表现出一种独立于抗tnf干预的炎症类型。另一种更有趣的说法是，IL-10信号通路可能是抗tnf作用机制所必需的。

    我们之前已经证明，抗TNF的完全单克隆抗体(mAbs)与Fcγ受体(Fcγ rs)接合，并且这种Fc-FcγR相互作用对于抗TNF在IBD临床前模型中的治疗效果是必要的。在t细胞转移性结肠炎模型中，未激活FcγRs的小鼠完全失去了对抗tnf治疗的反应，相反，低聚焦的抗tnf抗体与增强的fc结合亲和力显示出更好的疗效。15日16此外，我们已经证明，抗tnf在体外以fc依赖的方式使人单核细胞向CD206+调控巨噬细胞倾斜17在体内，16小鼠和人类抗tnf治疗的反应伴随着肠道中CD206+调控巨噬细胞的形成。16日18然而，这些巨噬细胞诱导的确切信号机制及其在抗tnf治疗中解决肠道炎症的确切作用目前尚不清楚。

    有趣的是，先前的研究表明巨噬细胞中的FcγR信号通路增加了IL-10的分泌。月19 - 21日鉴于巨噬细胞IL-10信号在确定m2样CD206+调节巨噬细胞表型以预防肠道炎症的关键作用，12日13抗tnf反应依赖于FcγR信号16以及观察到IL-10突变小鼠对抗tnf难以抑制，我们决定研究IL-10信号在抗tnf治疗反应中的作用。

    在这里，我们发现抗tnf单抗治疗在体外以fc γ r依赖的方式增加单核细胞/巨噬细胞中IL-10的产生，这使它们倾向于CD206+调节表型。使用细胞类型特异性突变小鼠，我们发现巨噬细胞中的IL-10信号通路对于抗tnf诱导的巨噬细胞向CD206+调节表型倾斜以及治疗反应是绝对必要的。

    材料与方法

    有关小鼠品系和所用材料、原位杂交、免疫组化、流式细胞术、体外实验以及western blot或ELISA蛋白定量的信息，请参见在线补充信息．

    老鼠实验

    t细胞转移模型如前所述进行。22通过注射3-5×10引起结肠炎5CD4+CD45RB高t细胞腹腔注射，以未转移的小鼠作为对照。Il10KO动物在8 ~ 14周龄时给予抗小鼠TNF、抗小鼠IL-12/23-p40或同型对照单抗，300µg，每周两次腹腔注射。抗tnf剂量滴定已在前面描述过。23从t细胞转移后3周开始，当动物开始表现出结肠炎的临床症状，直到实验结束，所有进一步的实验都使用有效剂量100µg anti-TNF，每周两次腹腔注射。t细胞转移实验FcgRKO/ Rag1KO动物已在前面描述过。16抗il - 10r α抗体从t细胞转移后2周开始，每周两次250µg腹腔注射，直到实验结束。小鼠结肠炎内窥镜指数(MCEI)和小鼠结肠炎组织学指数(MCHI)测定如最近所述。24所有实验均经学术医学中心(AMC)批准

    克罗恩病(CD)患者的队列研究

    在抗tnf治疗前和治疗期间采集乳糜泻患者的肠道活检(在线补充表1)．7例有应答者和7例无应答者，应答定义为克罗恩病严重程度内镜指数(CDEI)或克罗恩病简单内镜评分(SES-CD)下降25%。研究方案由阿姆斯特丹联合医学中心和鲁汶大学医院的医学伦理委员会批准，所有参与者都提供了书面知情同意书。

    统计分析

    数据以柱状散点图表示，柱状图表示中位数，点表示个体值/动物，或柱状图表示均值+SEM。数据由GraphPad Prism V.7.02 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA)分析，并在图图例中指定统计检验。p<0.05为显著。

    结果

    结肠炎的Il10KO小鼠对抗tnf治疗具有耐药性

    如前所述，14我们发现慢性肠道炎症Il10KO小鼠对IL-12/23治疗高度敏感，但对抗tnf治疗完全耐药。与抗tnf相比，抗il -12/23抗体治疗可改善体重(图1一个)，冒号密度(图1 b)、内窥镜下疾病严重程度(图1 c, D)和组织学评分(图1 e, F)与同型对照处理比较。无抗tnf治疗作用Il10KO小鼠使我们假设IL-10是诱导抗tnf治疗反应的必要因素。

    Il10KO mice are anti-TNF refractory. Il10KO mice were treated with 300 µg anti-TNF (n=9), anti-IL-12/23 (n=9) or isotype control (n=10) two times per week for 6 weeks as described in the Materials and methods section (healthy control mice (n=10) were included in B–F. (A) Body weight, (B) colon density, (C) representative endoscopy images and (D) endoscopy score (MCEI). (E) Representative images of H&E-stained intestinal slides (E) and (F) histology score (MCHI). Significance was determined by Kruskal-Wallis followed by Dunn’s post hoc test with *p<0.05 and **p<0.01. IL, interleukin; MCEI, Mouse Colitis Endoscopy Index; MCHI, Mouse Colitis Histology Index; TNF, tumour necrosis factor.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    Il10KO小鼠抗tnf难治性。Il10KO小鼠给予300µg抗tnf (n=9)、抗il -12/23 (n=9)或同型对照(n=10)，每周2次，持续6周，如材料和方法部分所述(健康对照小鼠(n=10)包括在B-F。(A)体重，(B)结肠密度，(C)代表性内镜图像，(D)内镜评分(MCEI)。(E) h&e染色肠片的代表性图像(E)和(F)组织学评分(MCHI)。显著性由Kruskal-Wallis检验，Dunn事后检验*p<0.05， **p<0.01。IL,白介素;小鼠结肠炎内镜指数(MCEI);MCHI(小鼠结肠炎组织学指数);肿瘤坏死因子。

    阻断IL-10信号通路降低了抗tnf治疗的疗效

    自Il10KO小鼠自受孕以来缺乏IL-10，目前尚不清楚抗tnf反应的缺乏是否与不同免疫细胞亚群的发育异常有关，还是由于治疗期间缺乏IL-10信号。为了研究IL-10是否是抗tnf治疗中疗效的关键因素，我们在t细胞转移模型中联合使用了抗il - 10r α抗体。抗il - 10r α降低了抗tnf的治疗效果，表现为内窥镜评分没有显著改善(图2 a, B)，组织学评分(图2 c, D)和结肠密度(图2 e)．有趣的是，它并不影响抗tnf对体重减轻的作用(图2 f)，表明体重减轻依赖于循环TNF的公认的恶病质效应，这是我们之前看到的，15它们对IL-10的依赖程度较低。肠道有增加Il10抗tnf治疗的表达，特别是当Il10水平的表达相对于关键的促炎细胞因子的水平，如Ifng或Il1b（图2 g)．归纳Il10通过阻断IL-10信号传导而降低，表明正反馈机制。抗tnf治疗增加Cd163而且Cd206在IL-10依赖的方式下，两种调节巨噬细胞的标记物降低了IL-10的表达Nos2,一种促炎巨噬细胞的标志物，独立于IL-10 (图2 h)．增加的比例Cd206 / Nos2而且Cd163 / Nos2虽然有些人为，但很好地表明抗tnf以IL-10依赖的方式将肠道巨噬细胞平衡转向调节表型。总之，这些数据表明，IL-10信号通路是IBD对抗tnf的完全治疗反应所直接需要的。

    The efficacy of anti-TNF is IL-10 dependent. Severe combined immunedeficient (SCID) animals received 3×105 CD4+CD45Rbhigh T cells and were treated with an anti-IL-10Rα (250 µg two times per week) from 2 weeks after the T-cell transfer, in combination with isotype or anti-TNF (100 µg two times per week) from 3 weeks after the T-cell transfer. Representative stills of endoscopy movies (A) scored for the MCEI in (B). Representative images of H&E-stained intestinal slides (C) scored for the MCHI in (D), the colon density in (E) and the bodyweight gain/loss during the experiment in (F). Intestinal expression levels of Il10, Ifng and Il1b relative to Gapdh and Il10/Ifng and Il10/Il1b ratios, determined on whole-colon mRNA, are shown (G). (H) Expression levels of Cd206, Cd163 and Nos2 relative to Gapdh and Cd206/Nos2 and Cd163/Nos2 ratios. All significance was determined by Kruskal-Wallis followed by Dunn’s post hoc test (n=11–13). Asterisks in (F) indicate comparison between anti-TNF and isotype (*, p<0.05) and between isotype +anti-IL10Rα and anti-TNF +anti-IL10Rα (****, p<0.0001). IL, interleukin; MCEI, Mouse Colitis Endoscopy Index; MCHI, Mouse Colitis Histology Index; TNF, tumour necrosis factor.*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 and **** p<0.0001.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    抗tnf的疗效依赖于IL-10。严重联合免疫缺陷(SCID)动物接受3×105CD4 + CD45Rb高T细胞转移后2周开始使用抗il - 10r α(250µg每周2次)，T细胞转移后3周开始与同型或抗tnf(100µg每周2次)联合使用。(B)为MCEI评分的内窥镜电影(A)的代表性照片。(C)为h&e染色的肠载片的代表性照片(D)为MCHI评分，(E)为结肠密度评分，(F)为实验期间体重增加/减少评分Il10，Ifng而且Il1b相对于Gapdh而且Il10 / Ifng和我l10 / Il1b(G)。(H)的表达水平Cd206, Cd163而且Nos2相对于Gapdh而且Cd206 /不s2和Cd163 / Nos2比率。所有显著性由Kruskal-Wallis检验，然后是Dunn事后检验(n= 11-13)。(F)中的星号表示抗tnf与同型之间的比较(*，p<0.05)以及同型+抗il10r α与抗tnf +抗il10r α之间的比较(****，p<0.0001)。IL,白介素;小鼠结肠炎内镜指数(MCEI);MCHI(小鼠结肠炎组织学指数);肿瘤坏死因子,肿瘤坏死因子。* * * p < 0.05, p < 0.01, * * * p < 0.001, * * * * p < 0.0001。

    抗tnf治疗成功后，肠道IL-10增加

    我们之前已经证明t细胞转移结肠炎模型对抗tnfmab治疗有剂量依赖的反应。23在本滴定实验中，抗tnf有效剂量处理的动物肠道IL-10水平升高(图3一)．肠道IL-10水平与抗tnf治疗反应之间存在相关性，肠道IL-10水平与MCHI之间呈强负相关(Spearman 's rho=−0.582,p<0.0001;图3 b)．为了研究在抗tnf治疗中哪些细胞负责IL-10的产生，我们进行了原位杂交。抗tnf治疗导致的Il10肠内cd3阴性细胞的转录本(图3 c)．连续玻片上巨噬细胞标记物F4/80的免疫组化分析强烈提示抗tnf增加Il10特别是在巨噬细胞中(图3 d)，但我们不能排除在其他类型的细胞中表达。

    Anti-TNF therapy increases intestinal IL-10 levels. IL-10 levels in whole-colon homogenates of severe combined immunedeficient (SCID) mice that received a CD4+CD45Rbhigh T-cell transfer and were treated with different dosages of anti-TNF (n=10–12) for 4 weeks from 3 weeks after the T-cell transfer. Animals treated with a therapeutic dosage of anti-TNF (100 μg) are shown in red (A). (B) Correlation between intestinal IL-10 levels and the histological score (MCHI) in all mice that received a T-cell transfer (n=53). The proportion of CD3-negative lamina propria cells expressing Il10 was determined by image analysis (C, n>10 images/condition, n=11 per group) as determined by fluorescent in situ hybridisation. (D) Representative Il10 in situ hybridisation (red) with F4/80 immunohistochemical staning (green) on a consectutive intestinal tissue slide of an anti-TNF-treated animal. Scale bar is 50 µm. Significance was determined by analysis of variance followed by Sidak’s post hoc in (A) and Mann-Whitney test in (D) with* p<0.05 and ***p<0.001. DAPI, 4',6-diamidino-2-fenylindool; IHC immunohistochemistry; IL, interleukin; ISH, in situ hybridisation; MCHI, Mouse Colitis Histology Index; TNF, tumour necrosis factor.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
    图3

    抗tnf治疗增加肠道IL-10水平。严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠全结肠匀浆中IL-10的水平，接受CD4+CD45Rb高t细胞转移后，从t细胞转移后3周开始用不同剂量的anti-TNF (n= 10-12)处理4周。接受治疗剂量抗tnf (100 μg)治疗的动物用红色表示(a)。(B)接受t细胞移植的所有小鼠肠道IL-10水平与组织学评分(MCHI)之间的相关性(n=53)。cd3阴性固有层细胞表达比例Il10采用荧光原位杂交的方法进行图像分析(C, n>10张/条件，每组n=11张)。(D)代表Il10原位杂交(红色)与抗tnf治疗动物连续肠组织切片上F4/80免疫组化染色(绿色)。比例尺为50µm。(A)采用Sidak事后检验，(D)采用Mann-Whitney检验，*p< 0.05， ***p<0.001，通过方差分析确定显著性。DAPI 4’,6-diamidino-2-fenylindool;包含IHC免疫组织化学;IL,白介素;ISH，原位杂交;MCHI(小鼠结肠炎组织学指数);肿瘤坏死因子。

    Anti-TNF通过FcγR诱导IL-10信号通路

    在之前的研究中，我们已经证明FcγR相互作用对于抗tnf治疗IBD的疗效至关重要，可能是通过诱导调节巨噬细胞。15 - 17日由于FcγR连接是巨噬细胞中IL-10的有效诱导剂，月19 - 21日我们调查了Il10在t细胞转移模型中的表达FcgRKO/ Rag1抗tnf治疗难治的KO动物。16肠内增加Il10 / Ifng或Il10 / Il1b抗tnf单抗的比例确实依赖于FcγR，因为这种增加在缺乏所有激活的FcγRs的小鼠中被取消(图4一)．这支持了IL-10的产生依赖于FcγR的假设。为了进一步研究anti-TNF是否能诱导巨噬细胞产生IL-10，我们在骨髓来源的巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages, BMDMs)中进行了体外实验。为了区分抗TNF单抗增加的FcγR信号传导与单纯TNF中和的作用，我们生成了抗TNF单抗的Fab片段(在线补充图S1)．如图4 b如所述，脂多糖(LPS)刺激的BMDM免疫复合物的IgG2a对照抗体增加了IL-10的分泌。19抗TNF Fab对TNF的中和降低了IL-10的分泌，而与抗TNF Fab片段相比，抗TNF单抗显著增加了IL-10的分泌(图4 b)．这与转录的增加有关Il10（图4 c)，而对前炎症细胞因子的表达几乎没有影响Il1b，白细胞介素6或Tnfa本身(在线补充图S2)．抗tnf单克隆抗体不增加IL-10的产生FcgRKO BMDMs，证实了对FcγR信号的依赖(在线补充图S3)．IL-10的诱导可被抗il - 10r α抗体阻断Il10rbKO bmmdms (图4 d)，提示存在自分泌正反馈机制。IL-10通过激活磷酸化的信号换能器和转录激活因子(STAT)介导其信号活性。25与抗tnf单抗的孵育确实导致BMDMs中il -10依赖的STAT3磷酸化(图4 e)．由于我们假设抗tnf单抗通过增加IL-10信号通路诱导调控型巨噬细胞分化，我们确定了其对Cd206．与抗tnf单抗孵育确实导致表达增加Cd206，这完全依赖于IL-10信号(图4 f)．流式细胞仪检测CD206 (图4 g)．这些结果表明，抗tnfmab诱导的FcγR信号通路增加了巨噬细胞中IL-10的产生，从而使分化成为更具调节性的表型。

    Anti-TNF induces IL-10-dependent M2 differentiation in BMDMs in vitro. (A) Intestinal Il10 expression level relative to Gapdh and Il10/Ifng and Il10/Il1b ratios of the Rag1 KO and FcgRKO/Rag1KO animals treated with anti-TNF. Relative Ifng and Il1b expression levels were reported in Bloemendaal et al.16 Significance was determined by Kruskal-Wallis followed by Dunn’s post hoc test, n=9–11. (B) IL-10 levels in medium of BMDMs stimulated with lipopolysacharide (LPS,100 ng/mL) and IFN-γ (20 ng/mL) in combination with the IgG isotype control antibody (10 µg mL), IgG immune complex (10 µg mL), the anti-TNF mAb (10 µg/mL) or Fab fragment (7.2 µg/mL) after 48 hours (B). (C) Levels of Il10 normalised for Gapdh expression in BMDMs after 24 hours. (D) IL-10 levels in medium of BMDMs (after 48 hours). (E) Western blot for pSTAT3, STAT3 and β-actin. (F) Levels of Cd206 normalised for Gapdh expression after 48 hours in (G) Representative histogram of flow cytometry for CD206, expressed as fold increase of the mean fluorescence intensity (MFI) in graph on BMDMs after 72 hours. Wild-type BMDMs are shown in black, wild-type BMDMs incubated with anti-IL-10Rα (10 µg/mL) in blue and Il10rbKO BMDMs in green. All data represent mean+SEM (n=3–6), representative of two to three independent experiments. Significance was determined by analysis of variance. followed by Sidak’s post hoc test (B,C) or unpaired t-test with *p<0.05, **p<0.01,***p<0.001 and ****p<0.0001. BMDM, bone marrow-derived macrophage; IFN, interferon; IL, interleukin; TNF, tumour necrosis factor.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
    图4

    Anti-TNF诱导体外BMDMs中il -10依赖的M2分化。(一)肠Il10表达水平相对于Gapdh而且Il10/Ifng和Il10/Il1b的比率Rag1KO和FcgRKO /Rag1KO动物用抗tnf治疗。相对Ifng而且Il1b在Bloemendaal报告表达水平等．16显著性由Kruskal-Wallis确定，然后是Dunn的事后检验，n= 9-11。(B)脂多糖(LPS,100 ng/mL)和IFN-γ (20 ng/mL)联合IgG同型对照抗体(10µg mL)、IgG免疫复合物(10µg mL)、抗tnf单抗(10µg/mL)或Fab片段(7.2µg/mL)刺激48小时后BMDMs培养基中的IL-10水平(B)Il10正常的Gapdh24小时后BMDMs的表达。(D) BMDMs培养基中IL-10水平(48小时后)。(E) Western blot检测pSTAT3、STAT3和β-actin。(F)的水平Cd206正常的Gapdh(G)流式细胞术中CD206的代表性直方图，表示为72小时后BMDMs上的平均荧光强度(MFI)增加了一倍。黑色为野生型BMDMs，蓝色为与抗il - 10r α(10µg/mL)孵育的野生型BMDMsIl10rbKO绿色的BMDMs。所有数据均为均值+SEM (n= 3-6)，代表两到三个独立实验。显著性由方差分析确定。其次是Sidak的事后检验(B,C)或未配对t检验，* p<0.05， **p<0.01，***p<0.001， ****p<0.0001。骨髓来源的巨噬细胞;干扰素干扰素;IL,白介素;肿瘤坏死因子。

    IL-10在t细胞中的信号转导对于抗tnf的治疗作用是不可或缺的

    为了排除抗tnf治疗的免疫抑制作用是通过体内IL-10水平升高对t细胞的直接作用介导的可能性，我们过继转移CD4+CD45Rb高Il10rbKO t细胞Rag1KO小鼠。抗tnf单抗治疗引起了类似的内窥镜评分降低(图5 a, B)、组织学评分(图5 c, D)和结肠密度(图5 e)Rag1接受CD4+CD45Rb过继转移的KO小鼠高Il10rbKO T细胞，与接受野生型CD4+CD45Rb的小鼠相比高t细胞。这清楚地表明，T细胞中的IL-10信号转导对于抗tnf单抗治疗的反应是可有可无的。t细胞中IL-10信号通路的缺失并没有改变抗tnf单抗诱导的细胞凋亡的增加Il10 / Ifng而且Il10 / Il1b比(图5克)或Cd206 / Nos2而且Cd163 / Nos2比率(图5 h)．

    Efficacy of anti-TNF is independent of IL-10 signalling in T-cells. Rag1KO animals received a 3×105 wild type (grey) or 3×105 Il10rbKO (green) CD4+CD45Rbhigh T-cell transfer and were treated with isotype or anti-TNF. Control Rag1KO animals did not receive a T-cell transfer. Representative stills of endoscopy movies (A) scored for the MCEI in (B). Representative images of H&E-stained intestinal slides (C) scored for the MCHI in (D), the colon density (E) and the bodyweight gain/loss during the experiment in (F). (G) Intestinal expression levels of Il10, Ifng and Il1b relative to Gapdh and Il10/Ifng and Il10/Il1b ratios, determined on whole-colon mRNA. (H) Expression levels of Cd206, Cd163 and Nos2 relative to Gapdh and Cd206/Nos2 and Cd163/Nos2 ratios. All significance was determined by Kruskal-Wallis followed by Dunn’s post hoc test with *p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001 (n=10–12). IL, interleukin; MCEI, Mouse Colitis Endoscopy Index; MCHI, Mouse Colitis Histology Index; TNF, tumour necrosis factor.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5
    图5

    抗tnf的疗效与t细胞中IL-10信号转导无关。Rag1KO动物收到了3×105野生型(灰色)或3×105Il10rbKO(绿色)CD4+CD45Rb高t细胞转移和同型或抗tnf处理。控制Rag1KO动物没有接受t细胞转移。(B)为MCEI评分的内窥镜电影的代表性图片(A)。(C)为MCHI评分的代表性图片(D)， (F)为实验期间的结肠密度(E)和体重增加/减少。(G)肠道表达水平Il10, Ifng而且Il1b相对于Gapdh而且Il10/Ifng和Il10/Il1b比例，由全结肠mRNA决定。(H)表达水平Cd206，Cd163而且Nos2相对于Gapdh而且Cd206 /不s2和Cd163 / Nos2比率。所有显著性由Kruskal-Wallis检验，然后是Dunn事后检验，*p<0.05， **p<0.01， ***p<0.001 (n= 10-12)。IL,白介素;小鼠结肠炎内镜指数(MCEI);MCHI(小鼠结肠炎组织学指数);肿瘤坏死因子。

    IL-10在巨噬细胞中的信号通路是体内抗tnf治疗作用的必要条件

    为了证实巨噬细胞中的IL-10信号通路对于抗tnf单克隆抗体治疗IBD的疗效至关重要，我们使用LysMCreIl10rafl / flRag1KO小鼠，其中IL-10Rα在巨噬细胞中被特异性删除。26这些小鼠肠道炎症的发展，CD4+CD45Rb高t细胞转移，完全抵抗抗tnf单抗治疗。抗tnf单抗对内窥镜评分无影响(图6 a, B)、组织学评分(图6 c, D)，冒号密度(图6 e)或体重下降(图6 f)在巨噬细胞特异性缺失IL-10Rα的小鼠中。抗tnf的耐药性与抗tnf单克隆抗体水平的降低无关(在线补充图S4A)或减少肠道Tnfa表达式(在线补充图S4B)．然而，抗tnf的耐药性与肠道内没有增加相关Il10 / Ifng而且Il10 / Il1b比(图6克)．此外，相对于Rag1KO对照组小鼠，无抗tnf依赖性增加Cd206 / Nos2而且Cd163 / Nos2（图6 h)比率。这些比率与Il10 / Ifng而且Il10 / Il1b肠道内的比率(在线补充图S5)．随着Cd206 / Nos2而且Cd163 / Nos2虽然巨噬细胞去极化和炎性单核细胞浸润之间的比例无法区分，但我们已通过流式细胞术证实，在巨噬细胞特异性IL-10Rα突变小鼠中，抗tnf单抗单抗诱导的调节性巨噬细胞极化确实完全消失(图6我)．总之，这些数据表明巨噬细胞IL-10信号通路对于调节巨噬细胞极化和抗tnf单抗的治疗效果都是绝对必要的。

    The efficacy of anti-TNF is dependent on IL-10 signalling in macrophages in vivo. Rag1KO (grey) or LysMcreIl10rafl/flRag1KO (blue) animals received a CD4+CD45Rbhigh T-cell transfer (5×105 cells) and were treated with isotype or anti-TNF. Control animals (Rag1KO) did not receive a T-cell transfer. Representative stills of endoscopy movies (A) scored for the MCEI in (B). Representative images of H&E-stained intestinal slides (C) scored for the MCHI in (D), the colon density (E) and the bodyweight gain/loss during the experiment in (F). (G) Intestinal expression levels of Il10, Ifng and Il1b relative to Gapdh and Il10/Ifng and Il10/Il1b ratios, determined on whole-colon mRNA. Expression levels of Cd206, Cd163 and Nos2 relative to Gapdh and Cd206/Nos2 and Cd163/Nos2 ratios are shown (H). Flow cytometry analysis for CD206 and LY6C is shown in (I), after gating for colonic macrophages (DAPI−CD45+ CD11b+Ly6G−CD64+). All significance was determined by Kruskal-Wallis followed by Dunn’s post hoc test with *p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001, n=7–12. IL, interleukin; Mouse Colitis Endoscopy Index; MCHI, Mouse Colitis Histology Index; TNF, tumour necrosis factor.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图6
    图6

    抗tnf的疗效依赖于体内巨噬细胞中的IL-10信号。Rag1KO(灰色)或LysMcreIl10rafl / flRag1KO(蓝色)动物接受CD4+CD45Rb高t细胞转移(5×105细胞)，并用同型或抗tnf治疗。对照动物(Rag1KO)没有接受t细胞转移。(B)为MCEI评分的内窥镜电影的代表性图片(A)。(C)为MCHI评分的代表性图片(D)， (F)为实验期间的结肠密度(E)和体重增加/减少。(G)肠道表达水平Il10, Ifng而且Il1b相对于Gapdh而且Il10 / Ifng而且Il10 / Il1b比例，由全结肠mRNA决定。表达水平Cd206, Cd163而且Nos2相对于Gapdh而且Cd206 /不s2和Cd163 / Nos2(H)所示。(I)为结肠巨噬细胞(DAPI)门控后，流式细胞术分析CD206和LY6C−CD45+CD11b+Ly6G−CD64+)．所有显著性由Kruskal-Wallis检验，Dunn事后检验*p<0.05， **p<0.01， ***p<0.001, n= 7-12。IL,白介素;小鼠结肠炎内镜指数;MCHI(小鼠结肠炎组织学指数);肿瘤坏死因子。

    抗tnf对人IBD中IL-10信号通路的影响

    为了研究IL-10的上调和随后的信号传导是否与抗tnf单抗在IBD患者中的作用相关，我们首先在体外研究了IL-10在分化人单核细胞中的产生。与抗tnf单抗阿达木单抗孵育相比，与抗tnf Fab片段certolizumab孵育可导致IL-10的产生增加(图7)，并使巨噬细胞在体外系统中分化为更具调节性的表型，其特征是CD206（图7 b)．这在很大程度上依赖于IL-10信号，因为抗IL-10阻断抗体强烈减少了IL-10的上调CD206（图7 b)．流式细胞仪检测CD206 (图7 c)．最后是粘膜IL10用抗tnf单克隆抗体治疗的CD患者的mRNA水平。我们包括7名内镜应答者和7名内镜无应答者(在线补充表1)．虽然相对表达量没有增加IL10，与接受抗tnf治疗的小鼠一样IL10 / IFNG抗tnf治疗应答者的表达率显著增加，而抗tnf无应答者的表达率没有增加(图7 d)．诱导调节巨噬细胞抗tnf单抗治疗，表明增加CD206 / NOS2与无反应者相比，在抗tnf反应者中也特别发现(图7 e)，并与IL10 / IFNG水平(在线补充图S6)．

    Anti-TNF induces IL-10-dependent M2 differentiation in human monocytes in vitro. IL-10 levels in medium of human monocytes stimulated with lipopolysacharide (LPS,100 ng/mL) and IFN-γ (20 ng/mL) and the full monoclonal anti-TNF antibody (adalimumab, 10 µg/mL) or anti-TNF Fab fragment (certolizumab, 10 µg/mL) after 48 hours (A) and levels of CD206 normalised for Gapdh after 48 hours or flow cytometry for CD206 expressed as fold increase of MFI after 72 hours (C) in combination with and anti-IL-10 antibody (10 µg/mL) or isotype control (10 µg/mL). All graphs are mean+SEM representative of three independent donors with n=4–6 per condition. The IL10 and IFNG expression levels relative to GAPDH and IL10/IFNG ratios (D) and CD206 and NOS2 expression levels relative to GAPDH and CD206/NOS2 ratios (E) in intestinal biopsies before and after treatment in anti-TNF responding and non-responding patients with CD.Significance was determined by Mann Whitney in A, analysis of variance followed by Holm-Sidak's post hoc test in B andC, and Wilcoxon signed rank test in D and E with *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, and ****p<0.0001. IFN, interferon; IL, interleukin.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图7
    图7

    Anti-TNF诱导体外人单核细胞il -10依赖性M2分化。脂多糖(LPS,100 ng/mL)和IFN-γ (20 ng/mL)刺激的人单核细胞培养基中的IL-10水平，以及完全单克隆抗tnf抗体(阿达木单抗，10µg/mL)或抗tnf Fab片段(certolizumab, 10µg/mL) 48小时后(A)和IL-10水平CD206正常的GapdhCD206与抗il -10抗体(10µg/mL)或同型对照(10µg/mL)结合后72小时MFI增加一倍(C)。所有图表均为三个独立供体的均值+SEM代表，每个条件n= 4-6。的IL10和IFNG相对于GAPDH而且IL10 / IFNG(D)和CD206而且NOS2相对于GAPDH而且CD206 / NOS2比率(E)在抗tnf应答和无应答的cd患者治疗前后的肠道活检中进行。A采用Mann Whitney检验，B和c采用Holm-Sidak事后检验进行方差分析，D和E采用Wilcoxon符号秩检验，*p<0.05， **p<0.01， ***p<0.001， ****p<0.0001。干扰素干扰素;IL,白介素。

    讨论

    IBD患者抗tnf治疗无应答的原因仍然知之甚少。1在本研究中，我们发现抗tnf单抗在巨噬细胞中需要IL-10信号，并且这种IL-10信号对于抗tnf诱导的巨噬细胞极化到调控m2样表型是必要的。在巨噬细胞中IL-10信号被特异性破坏的小鼠完全抵抗CD4+CD45Rb中的抗tnf治疗高T细胞转移模型，而破坏T细胞中的IL-10信号不影响治疗反应。

    IL-10是维持黏膜免疫耐受的关键因素。缺乏IL-10的小鼠会患上慢性炎症性肠病。10在人类中，变异的IL10在全基因组关联研究中，基因座与IBD发病风险相关8 9很少有纯合突变的病人IL10或IL10R患上严重的早期IBD。11对细胞类型特异性IL-10信号缺失小鼠的研究，以及使用来自il - 10r缺陷患者的细胞的研究表明，耐受性严重依赖于巨噬细胞IL-10信号。12日13研究发现粘膜巨噬细胞m2样CD163/CD206+调控表型依赖于IL-10信号通路。在缺乏IL-10的情况下，巨噬细胞被锁定在m1样的Nos2/CD86+促炎表型中，并在刺激下分泌过量的促炎细胞因子。IL-10途径生殖系突变的小鼠和患者对抗tnf治疗均无反应。27日14这可能是由于免疫系统的发育异常导致炎症过程，其中抗tnf的作用机制是无关的。有趣的是，来自不同结肠炎小鼠模型的数据表明，TNF实际上可能在肠道炎症期间具有保护作用，而且根据具体情况，TNF甚至可能被用于抑制小鼠的肠道炎症。2例如，TNF与单抗的中和显著恶化了右旋糖酐硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎28TNF敲除小鼠对DSS高度敏感。29TNF的完全缺失会加重IL-10突变小鼠的结肠炎，30.在t细胞转移模型中，如果转移的t细胞缺乏tnf受体II (TNFRII)，结肠炎会恶化。31我们自己之前的数据表明，抗tnf的治疗效果在缺乏激活FcγRs的小鼠中丢失。16这些数据表明TNF在肠道炎症中具有重要的保护功能，支持了抗TNF可能具有独立于TNF中和的额外治疗作用模式的观点。IL-10信号可能是另一种作用方式。事实上，我们在这里发现，使用IL-10Rα阻断抗体对IL-10信号通路进行药理学阻断，会降低抗tnf在结肠炎t细胞转移模型中的治疗效果。这强烈表明IL-10信号通路是抗tnf治疗反应的直接必需。与此相符，韦斯特等7最近的研究表明，系统性IL-10Rα阻断与an幽门螺杆菌hepaticus感染导致抗肿瘤坏死因子耐药结肠炎的发展，这与OSM水平的增加有关。在我们手中，系统性IL-10Rα阻断剂似乎确实增加了肠道Osm水平(在线补充图S7A)，并与抗tnf治疗的反应丧失有关。然而，抗肿瘤坏死因子抵抗性结肠炎的发展LysMCreIl10rafl / flRag1KO与肠道增加无关Osm水平(在线补充图S7B)，表明巨噬细胞中的IL-10信号通路是独立于OSM的anti-TNF治疗效果所必需的。

    我们之前已经证明，抗tnf单克隆抗体可以在体外和体内以依赖fc γ r的方式使单核细胞偏向m2样CD206+表型。16TNF是一种三聚体细胞因子，允许形成TNF-抗TNF免疫复合物，在单抗英夫利昔单抗、阿达木单抗和golimumab的情况下，这种复合物可以有效地与FcγR接合，但不能与依那西普(一种结合单一三聚体的可溶性受体)或certolizumab(单臂Fab片段)结合。32据我们所知，这是单克隆抗体唯一独特的作用机制，与certolizumab或依那西普都不相同，这种复合物的形成可能有助于抗tnf单克隆抗体观察到的相对较高的粘膜愈合率。

    之前已经证明，FcγR信号可以有效地诱导IL-10，月19 - 21日我们研究了抗tnf单克隆抗体是否会以fc γ r依赖的方式诱导IL-10信号通路。我们的数据显示抗肿瘤坏死因子增加Il10以fc γ r依赖的方式在小鼠体内和体外进行。我们在所有体外实验中发现，IL-10的表达部分依赖于TNF。当我们在没有FcγR参与的情况下，使用抗TNF Fab片段阻断TNF时，IL-10水平降低，而当我们使用完整的IgG单抗阻断TNF时，IL-10的表达与同型对照IgG相似。当我们在没有TNF阻断的情况下使用复合物IgG接触FcγR时，IL-10水平增加到非复合物IgG对照水平之上(图4；参见Bloemendaal等32)．总之，这表明IL-10的表达部分依赖于TNF, anti-TNF单克隆抗体通过参与FcγR来弥补IL-10表达的损失，随后通过STAT3磷酸化导致下游信号通路。

    尽管我们的体外数据表明存在自分泌IL-10信号环路，但我们没有确定体内抗tnf单抗暴露后导致肠道IL-10水平升高的细胞类型。抗tnf治疗小鼠的原位杂交表明Il10巨噬细胞产生IL-10，但我们的数据并不能证明巨噬细胞过度产生IL-10。尽管Il10 / Ifng而且Il10 / Il1b比率可以间接反映抗tnf和安慰剂治疗小鼠之间炎症水平的差异，它是FcγR依赖的事实再次指向髓系种群。尽管IL-10的来源仍然不确定，但从我们的数据中可以非常清楚的是，巨噬细胞对IL-10的感知是抗tnf单抗治疗效果所必需的。与IL-10信号在巨噬细胞调节偏斜中的关键作用一致，12日13阻断IL-10信号完全阻止了抗tnf依赖的巨噬细胞在体外和小鼠体内和体外的扭曲。有趣的是，IL-10信号的重要性可能相对特定于抗tnf的治疗效果，我们之前没有观察到米替福辛对IL-10的影响，这种药物可以改善临床症状和组织学，并在t细胞转移模型中有效抑制多种细胞因子。33同样，在最近的一项小分子激酶抑制剂实验中，我们观察到在同一模型中，粘膜几乎完全愈合，而对IL-10表达没有任何影响(ME Wildenberg，个人通讯2019)。相反，当我们对增强抗tnf诱导的CD206+调控巨噬细胞极化的药物进行无偏性药物筛选时，我们发现阿苯达唑是一种在体外和体内增强抗tnf作用的药物。23我们发现阿苯达唑与抗tnf特异性协同上调IL-10表达。总之，这些数据支持IL-10的上调可能相对特定于抗tnf单克隆抗体的作用方式的观点。然而，由于抗il - 10r α阻断抗体对抗tnf治疗效果的影响不如完全敲除所有FcγR的效果显著，16这可能是因为我们使用这种方法未能完全阻断IL-10R信号，FcγR也可能影响IL-10信号传导水平低于受IL-10Rα阻断影响的受体水平，或者是完全独立于IL-10信号传导的机制。以前已经描述了抗tnf的各种替代作用机制。所描述的机制之一涉及膜结合肿瘤坏死因子(mTNF)的结合，它干扰单核细胞表达的mTNF对CD4+ T细胞的抗凋亡作用，导致T细胞凋亡。34然而，这种机制在抗tnf单抗和Fab片段certolizumab之间是共享的，并且不能解释使用certolizumab观察到的低粘膜愈合率(10周时4%)。35与单抗英夫利昔单抗相比(第10周31%)36以及阿达木单抗(第12周27%)。37

    我们的数据表明，粘膜巨噬细胞无法对IL-10信号通路作出反应可能是IBD患者对抗tnf无反应的主要机制之一。Nunberg最近的一项研究等38显示与健康对照组相比，部分乳糜泻患者的单核细胞对IL-10的反应降低。一项针对CD患者pbmc的小型研究表明，这种对IL-10的反应与对TNF的反应相关(未显示)，并且可能是抗TNF治疗反应的非常有用的预测标志物，我们的目标是在更大的患者队列中验证这一点。由于这项工作的重点是在慢性t细胞驱动炎症的小鼠模型中IL-10依赖的巨噬细胞对抗tnf治疗的反应，这可能只与CD患者相关，如图所示图7．然而，研究急性严重结肠炎中il -10依赖的巨噬细胞反应可能会发现类似的反应特征，并有助于在这种临床情况下对抢救抗tnf治疗与手术的管理决策，这也是进一步研究的主题。fc γ r介导的IL-10对抗tnf单抗诱导的巨噬细胞表型的影响可能与其他免疫介导的疾病(如牛皮癣和类风湿性关节炎)不太相关。由于牛皮癣和类风湿性关节炎患者对不同种类的TNF阻滞剂有更相似的反应，IBD患者对FcγR信号的依赖似乎相对特定。总之，在这里，我们发现IL-10信号通路在抗tnf诱导的人类和小鼠巨噬细胞的调节倾斜中是必需的。在结肠炎小鼠模型中，抗tnf的治疗反应完全依赖于粘膜巨噬细胞中的IL-10信号。我们的数据表明，IL-10依赖的巨噬细胞倾向于CD206+调节表型是IBD治疗的一个关键方面，那些对IL-10反应降低有助于疾病病因的患者可能对抗tnf治疗反应不佳。这种对IL-10反应的降低可能用于识别这些患者，他们可能是使用其他作用模式(如最近建议的针对IL-12/23或IL-1β的抗体)治疗的更好候选人。39

    致谢

    我们感谢Dave Shealy博士(Janssen Research & Development)抗小鼠肿瘤坏死因子、抗小鼠il -12/23-p40和同型对照单克隆抗体。

    参考文献

    1. ↵
      2. 又G，
      3. JharapB，
      4. NeerajN，等
      ．抗肿瘤坏死因子反应丧失:定义、流行病学和管理．Clin Transl胃肠醇2016；7：e135．doi: 10.1038 / ctg.2015.63
    2. ↵
      2. 莱文广告，
      3. Wildenberg我，
      4. 范登布林克GR
      ．抗tnf治疗炎症性肠病的作用机制．ECCOJC2016；10：989- - - - - -97．doi: 10.1093 / ecco-jcc / jjw053
    3. ↵
      2. BathonJM，
      3. 马丁RW，
      4. 她RM，等
      ．依那西普与甲氨蝶呤治疗早期类风湿关节炎的比较．N英语J医学2000；343：1586- - - - - -93．doi: 10.1056 / NEJM200011303432201
    4. ↵
      2. 她R，
      3. VencovskyJ，
      4. 范Vollenhoven射频，等
      ．每4周certolizumab pegol单药治疗失败的类风湿性关节炎患者的疗效和安全性:FAST4WARD研究．安·大黄2009；68：805- - - - - -11．doi: 10.1136 / ard.2008.099291
    5. ↵
      2. SandbornWJ，
      3. FeaganBG，
      4. Stoinov年代，等
      ．Certolizumab pegol用于治疗克罗恩病．N英语J医学2007；357：228- - - - - -38．doi: 10.1056 / NEJMoa067594
    6. ↵
      2. SandbornWJ，
      3. Hanauer某人，
      4. 卡茨年代，等
      ．依那西普治疗活动性克罗恩病:一项随机、双盲、安慰剂对照试验．胃肠病学2001；121：1088- - - - - -94．doi: 10.1053 / gast.2001.28674
    7. ↵
      2. 西NR，
      3. Hegazy一个，
      4. 欧文斯BMJ，等
      ．Oncostatin M驱动肠道炎症，并预测炎症性肠病患者对肿瘤坏死因子中和治疗的反应．Nat地中海2017；23：579- - - - - -89．doi: 10.1038 / nm.4307
    8. ↵
      2. 因特网一个，
      3. BalschunT，
      4. KarlsenTH，等
      ．IL10、ARPC2和多个其他位点的序列变异有助于溃疡性结肠炎的易感性．Nat麝猫2008；40：1319- - - - - -23．doi: 10.1038 / ng.221
    9. ↵
      2. 因特网一个，
      3. 麦戈文DPB，
      4. 巴雷特JC，等
      ．全基因组荟萃分析增加到71个确认的克罗恩病易感位点．Nat麝猫2010；42：1118- - - - - -25．doi: 10.1038 / ng.717
    10. ↵
      2. 库恩R，
      3. LohlerJ，
      4. RennickD，等
      ．白细胞介素10缺乏的小鼠会发生慢性小肠结肠炎．细胞1993；75：263- - - - - -74．0092 - 8674 . doi: 10.1016 / (93) 80068 - p
    11. ↵
      2. 格洛克开头的，
      3. KotlarzD，
      4. BoztugK，等
      ．炎症性肠病和影响白细胞介素-10受体的突变．N英语J医学2009；361：2033- - - - - -45．doi: 10.1056 / NEJMoa0907206
    12. ↵
      2. ZigmondE，
      3. BernshteinB，
      4. 弗里德兰德G，等
      ．巨噬细胞限制性白介素-10受体缺乏，而不是IL-10缺乏，导致严重的自发性结肠炎．免疫力2014；40：720- - - - - -33．doi: 10.1016 / j.immuni.2014.03.012
    13. ↵
      2. ShouvalDS，
      3. Biswas一个，
      4. Goettel晶澳，等
      ．先天免疫细胞中的白介素-10受体信号通路调节黏膜免疫耐受和抗炎巨噬细胞功能．免疫力2014；40：706- - - - - -19．doi: 10.1016 / j.immuni.2014.03.011
    14. ↵
      2. RennickDM，
      3. 堡毫米，
      4. 戴维森新泽西
      ．IL-10的研究-/-老鼠:概述．白细胞生物学1997；61：389- - - - - -96．doi: 10.1002 / jlb.61.4.389
    15. ↵
      2. 麦克雷提单，
      3. 莱文广告，
      4. Wildenberg我，等
      ．Fc受体介导的效应功能有助于抗tnf单克隆抗体在炎症性肠病小鼠模型中的治疗反应．ECCOJC2016；10：69- - - - - -76．doi: 10.1093 / ecco-jcc / jjv179
    16. ↵
      2. Bloemendaal调频，
      3. 莱文广告，
      4. Wildenberg我，等
      ．具有糖工程fc区域的抗肿瘤坏死因子增加了结肠炎小鼠的疗效．胃肠病学2017；153：1351- - - - - -62．doi: 10.1053 / j.gastro.2017.07.021
    17. ↵
      2. Vos联队，
      3. Wildenberg我，
      4. Duijvestein米，等
      ．抗肿瘤坏死因子-α抗体以Fc区依赖的方式诱导调控巨噬细胞．胃肠病学2011；140：221- - - - - -30.．doi: 10.1053 / j.gastro.2010.10.008
    18. ↵
      2. Vos联队，
      3. Wildenberg我，
      4. Arijs我，等
      ．英夫利昔单抗诱导的调节性巨噬细胞参与体内和体外的愈合．肠炎2012；18：401- - - - - -8．doi: 10.1002 / ibd.21818
    19. ↵
      2. 美国格柏公司JS，
      3. 莫瑟DM
      ．通过结扎巨噬细胞Fc γ受体逆转脂多糖毒性．J Immunol2001；166：6861- - - - - -8．doi: 10.4049 / jimmunol.166.11.6861
    20. ↵
      2. 卢卡斯米，
      3. 张X，
      4. PrasannaV，等
      ．巨噬细胞fcgamma结扎后ERK激活导致IL-10位点染色质改变．J Immunol2005；175：469- - - - - -77．doi: 10.4049 / jimmunol.175.1.469
    21. ↵
      2. 加洛P，
      3. GoncalvesR，
      4. 莫瑟DM
      ．IgG密度和巨噬细胞Fc (γ)受体交联对吞噬作用和IL-10产生的影响．Immunol列托人2010；133：70- - - - - -7．doi: 10.1016 / j.imlet.2010.07.004
    22. ↵
      2. 读年代，
      3. 帕里F
      ．通过耗竭调节性T细胞诱导免疫缺陷小鼠炎症性肠病．Curr Protoc Immunol2001；第15章．im1513s30 doi: 10.1002/0471142735.
    23. ↵
      2. Wildenberg我，
      3. 莱文广告，
      4. Ceroni一个，等
      ．苯并咪唑促进抗tnf介导的巨噬细胞诱导，增强小鼠模型的治疗效果．克罗恩氏结肠炎2017；11：1480- - - - - -90．doi: 10.1093 / ecco-jcc / jjx104
    24. ↵
      2. KoelinkPJ，
      3. Wildenberg我，
      4. 施迪LW，等
      ．在炎症性肠病动物模型中开发可靠、有效和反应灵敏的内窥镜和组织学评分系统．克罗恩氏结肠炎2018；12：794- - - - - -803．doi: 10.1093 / ecco-jcc / jjy035
    25. ↵
      2. 唐纳利RP，
      3. DickensheetsH，
      4. FinbloomDS
      ．单核吞噬细胞中白细胞介素-10信号转导途径及基因表达的调控．干扰素细胞因子1999；19：563- - - - - -73．doi: 10.1089 / 107999099313695
    26. ↵
      2. 李B，
      3. 高隆P，
      4. Malireddi地基处理，等
      ．在t细胞介导的结肠炎中，Il-10参与巨噬细胞改变Th17细胞因子依赖性和致病性．Nat Commun2015；6：6131．doi: 10.1038 / ncomms7131
    27. ↵
      2. KotlarzD，
      3. 贝尔R，
      4. 基于D，等
      ．白细胞介素-10信号通路缺失与婴儿炎症性肠病:诊断和治疗的意义．胃肠病学2012；143：347- - - - - -55．doi: 10.1053 / j.gastro.2012.04.045
    28. ↵
      2. KojouharoffG，
      3. 汉斯W，
      4. ObermeierF，等
      ．中和肿瘤坏死因子(TNF)而非IL-1可减轻小鼠慢性右旋糖酐硫酸钠诱导的结肠炎炎症．临床试验免疫1997；107：353- - - - - -8．doi: 10.1111 / j.1365-2249.1997.291-ce1184.x
    29. ↵
      2. Noti米，
      3. CorazzaN，
      4. 穆勒C，等
      ．TNF通过诱导局部糖皮质激素合成抑制急性肠道炎症．J实验医学2010；207：1057- - - - - -66．doi: 10.1084 / jem.20090849
    30. ↵
      2. 黑尔LP，
      3. 格里尔PK
      ．一种具有溃疡性结肠炎样特征的炎症性肠病和炎症相关结肠癌的新小鼠模型．《公共科学图书馆•综合》2012；7：e41797．doi: 10.1371 / journal.pone.0041797
    31. ↵
      2. 天施耐德J，
      3. Seibold我，
      4. Saxer-SekulicN，等
      ．CD4缺乏TNFR2表达（+T细胞会加剧实验性结肠炎．欧元J免疫2009；39：1743- - - - - -53．doi: 10.1002 / eji.200839132
    32. ↵
      2. Bloemendaal调频，
      3. KoelinkPJ，
      4. 范Schie卡，等
      ．TNF-anti-TNF免疫复合物通过fc依赖机制抑制炎症巨噬细胞分泌IL-12/IL-23．克罗恩氏结肠炎2018；10．doi: 10.1093 / ecco-jcc / jjy075
    33. ↵
      2. Verhaar美联社，
      3. Wildenberg我，
      4. 德·维尔德AA，等
      ．米特福辛抑制炎症性肠病小鼠模型炎症．肠炎2013；19：1- - - - - -82．doi: 10.1097 / MIB.0b013e3182917a2b
    34. ↵
      2. AtreyaR，
      3. 齐默米，
      4. 巴奇B，等
      ．抗肿瘤坏死因子(TNF)抗体通过TNF受体2和肠道CD14⁺巨噬细胞诱导炎性肠病患者t细胞凋亡．胃肠病学2011；141：2026- - - - - -38．doi: 10.1053 / j.gastro.2011.08.032
    35. ↵
      2. HebuterneX，
      3. 莱曼米，
      4. BouhnikY，等
      ．certolizumab pegol治疗中重度回结肠克罗恩病患者黏膜病变的内镜改善．肠道2013；62：201- - - - - -8．doi: 10.1136 / gutjnl - 2012 - 302262
    36. ↵
      2. RutgeertsP，
      3. 钻石RH，
      4. 巴拉米，等
      ．在克罗恩病相关粘膜溃疡的愈合方面，英夫利昔单抗的定期维持治疗优于间歇性治疗．Gastrointest Endosc2006；63：433- - - - - -42．doi: 10.1016 / j.gie.2005.08.011
    37. ↵
      2. RutgeertsP，
      3. 范典藏G，
      4. SandbornWJ，等
      ．阿达木单抗诱导和维持克罗恩病患者的粘膜愈合:来自扩展试验的数据．胃肠病学2012；142：1102- - - - - -11．doi: 10.1053 / j.gastro.2012.01.035
    38. ↵
      2. Nunberg我的，
      3. 沃纳l，
      4. KopylovU，等
      ．克罗恩病患者IL-10受体介导的单核细胞抑制受损．儿科胃肠醇营养品2018；66：779- - - - - -84．doi: 10.1097 / MPG.0000000000001795
    39. ↵
      2. ShouvalDS，
      3. Biswas一个，
      4. 康本产品，等
      ．白细胞介素1β介导小鼠和白细胞介素10受体缺乏患者的肠道炎症．胃肠病学2016；151：1100- - - - - -4．doi: 10.1053 / j.gastro.2016.08.055

    脚注

    • PJK和FMB贡献相同。

    • 调整通知这篇文章在Online First发表后已被更正。已添加隶属关系8。

    • 贡献者PJK、FMB、LW、MEW、EWMV和MvR进行了实验，并对数据进行了分析和讨论。AKG, ABvtW, GRAMD 'H和GRvdB对数据进行了讨论。TLG和BL提供LysMcreIl10rafl/flRag1KO小鼠，并讨论了数据。JSV提供FcgRKO/Rag1KO小鼠并讨论数据。HK, SV, AAtV和CYP提供了患者样本并讨论了数据。GRvdB和PJK监督了这项研究。PJK, FMB和GRvdB在所有作者的输入下撰写了手稿。

    • 资金这项工作得到了詹森疫苗和预防BV的詹森预防中心(詹森强生制药公司的一部分，位于荷兰莱顿)和荷兰健康(生命科学与健康顶级部门)的无限制研究拨款的支持。

    • 相互竞争的利益AKG和ABvtW是杨森疫苗和预防公司的员工，GRvdB目前是罗氏公司的员工。CYP获得了武田的研究支持，武田、艾伯维和Dr. Falk Pharma的演讲费，以及武田在这项工作之外的顾问费。其他作者声明与这项工作没有利益冲突。

    • 患者发表同意书不是必需的。

    • 伦理批准阿姆斯特丹联合医院医学伦理委员会(METC 2009_113)和鲁汶医院机构审查委员会(B322201213950/S53684)批准了这项研究。

    • 出处和同行评审不是委托;外部同行评审。

    • 数据可用性声明所有与研究相关的数据都包含在文章中或作为补充信息上传。