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附言
信
信任是好的,控制好:技术因素血液中微生物分析
  1. 罗伯特Schierwagen1,
  2. 卡米拉Alvarez-Silva2,
  3. 佛罗伦萨的仆人3,
  4. Jonel Trebicka1,
  5. 本杰明Lelouvier3,
  6. Manimozhiyan Arumugam2
  1. 1平动肝脏病学,内科,Universitatsklinikum / Goethe-Universitat,法兰克福、德国
  2. 2诺和诺德基金会基本代谢研究中心,哥本哈根大学,哥本哈根、丹麦
  3. 3Vaiomer SAS,Labege、法国
  1. 对应到内科医学博士Jonel Trebicka,平移肝脏病学部门我Universitatsklinikum / Goethe-Universitat,法兰克福,德国;Jonel.Trebicka在{}kgu.de

http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl - 2019 - 319123

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    我们同意霍农等1研究血液微生物与潜在文物是一个主要的技术挑战。至少有三个重要挑战必须解决:

    1. 低数量的血液中细菌的DNA。2

    2. 大量的PCR抑制剂。

    3. 细菌DNA污染环境、试剂和耗材。

    测量,减少和控制细菌污染物是优化的关键元素的分子管道用于我们的学习3以及八发表研究血液微生物。2 4 - 7研究从索尔特等8和劳伦斯等9是有用的了解细菌污染物的负担工作时细菌丰度较低的样本。在出版前,2 10我们所描述的程序和执行的控制解决这些污染。必须小心当使用一个固定的列表的细菌污染物,污染,每个实验都有自己的负担。因此,在不同条件下两种不同的实验,不会有相同的污染物。什么是至关重要的,因为由霍农指出等是包括在每个实验和分析消极的控制。虽然没有明确之前提到过,我们的研究3包括以下负面的控制:

    1. 萃取-控制(水在DNA提取步骤)。

    2. PCR -控制在PCR的第一步(水)。

    我们现在的数据从这些控制实验。丰富的16 s核糖体RNA基因以定量PCR (qPCR)显示超过1000倍的血液样本之间的差异,提取负控制(图1一个)。血液样本也明显地表现出较高属丰富(图1 b)和不同微生物组成(图1 c)与消极的控制。因此,技术污染造成的影响甚微。虽然我们不能排除的一小部分测量细菌的DNA与污染,污染物之间的低和相对同质样本和不应影响执行的统计测试。

    (A) qPCR-based 16S rRNA gene abundances are significantly higher in buffy coat samples than negative controls (H2O—Ext) based on Mann-Whitney U test. Median 20 800 versus 3 copies/µL; mean 24 160 versus 67.2 copies/µL. (B) Buffy coat samples exhibit significantly higher genus richness than negative controls (H2O—PCR and H2O—Ext) based on Kruskal-Wallis test followed by Dunn’s post hoc tests. (C) Principal coordinate analysis of the 16S rRNA gene sequencing data using Bray-Curtis dissimilarity measure shows clear separation of buffy coat samples from negatives controls (H2O—PCR and H2O—Ext). H2O—Ext: molecular grade water added in an empty tube, extracted and analysed (qPCR and/or sequencing) at the same time as the samples. H2O—PCR: molecular grade water added in an empty tube and amplified and sequenced at the same time as the extracted DNA of the samples. Statistical significance—*p<0.05; ***p<0.001; ****p<0.0001. qPCR, quantitative PCR; rRNA, ribosomal RNA.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    (一)qPCR-based 16 s rRNA巴菲外套样品中基因丰度明显高于负控制(H2O-Ext)基于Mann-Whitney U测试。中位数800和3份/µL;平均24 160和67.2 /µL副本。(B)巴菲属丰富外套样品表现出显著高于消极控制(H2O-PCR和H2O-Ext)基于克鲁斯卡尔-沃利斯检验邓恩的事后测试紧随其后。(C)的主坐标分析16 s rRNA使用Bray-Curtis不同基因测序数据测量显示清晰的分离的淡黄色的外套样本底片控件(H2O-PCR和H2O-Ext)。H2O-Ext:分子级水添加到一个空管,提取并分析(qPCR和/或测序)同时作为样本。H2O-PCR:分子级水添加到一个空管放大和测序的同时提取的DNA样本。统计学意义- * p < 0.05;* * * p < 0.001;* * * * p < 0.0001。qPCR定量聚合酶链反应;核糖体RNA,核糖体RNA。

    在九个细菌属霍农上市等作为潜在污染物基于文学、消极控制测序数据清楚地表明,八不是污染物在我们的研究(图2一个)。这些都是缺席负控制或出现在显著降低比血液样本的相对比例。剩下的属,节细菌属,样品/控制(类似的相对丰度图2一个),可以被认为是一种污染物。当处理的数据,重要的是要注意,相对大量的污染物在消极的控制将被夸大了。它应该是解释与定量数据,如qPCR丰度(图1一个)。因此,它是有争议的。是否节细菌属是一个真正的污染物给我们的数据,但仍然成为可能。此外,我们还发现大肠杆菌、志贺氏杆菌相对丰度可以表明它是一种污染物,但它不是常见的血液中找到它。因此,我们不排除节细菌属和大肠杆菌、志贺氏杆菌,但他们并没有显示临床上有意义的相关性,因此没有我们的报告中讨论。3另外两个类群(Bradyrhizobium和Ralstonia)是存在于更高的比例与样品相比,消极的控制(图2 b),因此被视为可能的污染物,而不是进一步考虑。3

    Comparison of bacterial genus relative abundances in buffy coat samples and negative controls (H2O—PCR and H2O—Ext). (A) Bacterial genera listed in the letter of Hornung et al as potential contaminants, and Escherichia/Shigella. (B) Two bacterial genera that were considered as likely contaminants and discarded from our previous letter. H2O—Ext: molecular grade water added in an empty tube, extracted and analysed (qPCR and/or sequencing) at the same time as the samples. H2O—PCR: molecular grade water added in an empty tube and amplified and sequenced at the same time as the extracted DNA of the samples. qPCR, quantitative PCR.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    比较细菌属相对丰度巴菲外套样品和消极的控制(H2O-PCR和H2O-Ext)。(一)细菌属霍农信中列出等作为潜在的污染物大肠杆菌、志贺氏杆菌。(B)两种细菌属被认为是可能的污染物和丢弃从我们以前的信。H2O-Ext:分子级水添加到一个空管,提取并分析(qPCR和/或测序)同时作为样本。H2O-PCR:分子级水添加到一个空管放大和测序的同时提取的DNA样本。qPCR,定量PCR。

    最后,由皮肤细菌污染确实是一个重大的挑战在使用体积小的血液(20µL)由皮肤穿刺。然而,在这项研究中,40毫升的血液被撤回。此外,门户,肝和心房血液收集使用导管不接触皮肤。因此,皮肤的污染在我们的研究中可以忽略不计。

    总的来说,我们第二个霍农提出的担忧等,通过这封信突出所需的重要控制血液中微生物的研究。

    引用

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    脚注

    • RS和是第一作者。

    • 36提单和马分享最后的作者。

    • 贡献者范本,方法,调查和原创作品草案:RS,这样,FS, JT,提单和马。正式的分析:这样,FS, JT,提单和马。资源和可视化:这样,FS,提单和马。数据管理:提单。监督:JT,提单和马。

    • 资金作者是支持由欧盟的地平线2020研究和创新计划MICROB-PREDICT研究(825694),德国Forschungsgemeinschaft (SFB TRR57) Cellex基金会和诺和诺德基金会(NNF10CC1016515和NNF16CC0020896)。支持的研究挑战授予“MicrobLiver”数量NNF15OC0016692诺和诺德公司的基础。资助者没有影响研究设计、数据收集和分析,决定发布或准备的手稿。

    • 相互竞争的利益FS和提单是Vaiomer的员工。

    • 出处和同行评议不是委托;内部同行评议。

    • 病人同意出版不是必需的。