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摘要
目标与设计人类干细胞来源的肝细胞样细胞(HLCs)显示出作为分离HCV生命周期和病毒诱导发病机制的真实模型的巨大潜力。然而，适度的HCV复制，可能是由于强大的先天免疫反应，限制了它们的广泛使用。为了克服这些限制并剖析HCV控制的机制，我们分析了干扰素(IFN)系统在HLCs中的关键成分的表达，评估了不同HCV菌株的允许性，并通过药物干预阻断了先天免疫信号。
结果转录分析显示，HLCs组成性地表达RLRs的信使RNA和IFN通路的成员。此外，转染双链RNA模拟聚(I:C)后，HLCs上调ifn和典型干扰素调节基因(IRGs)。hcs感染Jc1-HCVcc只产生有限的病毒子代。相比之下，感染p100，一个jc1衍生的病毒种群，具有增强的复制适应度和对IFN的部分抗性，导致强大但短暂的病毒血症。病毒滴度随着IRG诱导达到峰值而下降。添加ruxolitinib，一种JAK/STAT抑制剂，允许慢性感染，并将p100感染性病毒滴度提高到1×105洁净/毫升。IRGs在感染hcs中的表达谱显示了hcv依赖的转录变化，类似于hcv感染的原代人肝细胞，但不同于Huh-7.5细胞。停用鲁索利替尼恢复了先天免疫反应，并导致HCV清除。
结论这种真实的人类细胞模型非常适合于检测急性和慢性宿主-HCV相互作用，特别是ifn触发的抗病毒效应因子功能和HCV感染的先天免疫控制机制。
- 干细胞
- 肝细胞
- 丙肝病毒
- 免疫反应
- 干扰素
这是一篇开放获取的文章，根据创作共用署名非商业(CC BY-NC 4.0)许可证发布，该许可证允许其他人以非商业方式分发、混音、改编、在此基础上进行构建，并以不同的条款许可其衍生作品，前提是正确引用原始作品，给予适当的荣誉，任何更改都已注明，并且使用是非商业性的。看到的:http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/．
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本研究的意义
关于这个问题我们已经知道了什么?
干细胞来源的肝细胞样细胞(HLCs)是一种相对成熟的肝细胞模型。
hcs对HCV感染具有许可性，但感染效率较低。
原代人肝细胞易受HCV感染，然而，快速去分化和供体间变异使分析复杂化。
新的发现是什么?
将hcs与细胞培养适应的p100 HCV群体接种，可以完全有效地复制病毒。
HLCs通过强大的先天免疫反应清除急性HCV感染，这与在原代成人肝细胞中观察到的反应相当。
阻断JAK/STAT信号通路允许HCV慢性感染hcs，对先天免疫反应进行时间依赖性实验控制，从而分析介导病毒清除的效应函数。
在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?
我们的研究结果建立了干细胞来源的HLCs和p100感染作为研究急性和慢性宿主- hcv相互作用的可靠模型。
他们为HCV感染的个性化细胞培养模型开辟了道路，可能为未来的个性化感染药物提供关键见解。
简介
尽管有有效的直接作用抗病毒药物(DAAs)， HCV感染仍然是一个全球性的健康问题，约有7000万慢性感染患者。1 2HCV疫苗的开发是一个重要的研究目标，它有助于全面了解HCV保护性免疫的特征以及病毒先天和适应性免疫逃避的机制。这些方面已通过体外HCV繁殖模型进行了深入研究，主要依赖于Huh-7.5肝癌细胞系的使用。值得注意的是，Huh-7.5细胞编码有缺陷的维甲酸诱导基因I (RIG-I)，因此表现出迟钝的先天免疫，3.这使得它们不适合研究与HCV清除或持久性相关的先天免疫机制。原代人肝细胞(PHHs)培养通常允许体外感染HCV4并代表了一个更成熟的模型来分析先天性免疫对HCV感染的反应。5个6然而，PHHs存在重要的局限性:有限的可用性，供体特异性的许可性差异，体外培养的短时间和去分化。
人多能干细胞(胚胎干细胞(hESCs)或诱导干细胞(hiPSCs))可以在体外分化为复制肝细胞关键特征的细胞。7这些细胞被称为肝细胞样细胞(HLCs)，对HBV是允许的，8 9丙肝病毒10 - 13和戊肝病毒14体外感染。在接种含有JFH1 (Gt2a)复制机制的细胞培养衍生的HCV (HCVcc)后，15HLCs可产生可检测的细胞内HCV RNA复制，但只能产生有限和短暂的感染性子代病毒。一般认为主动的先天免疫是这种急性HCV感染的原因。16日至18日
HCV基因组通过形成病毒双链(ds)RNA进行复制，这是病毒复制的标志，由细胞模式识别受体(PRRs)感知。其中包括toll样受体(TLRs)，特别是TLR3检测核内体dsRNA，19RIG-I样受体(RLRs) RIG-I20 21和MDA520 22 23检测细胞质dsRNA并通过连接蛋白MAVS发出信号。一旦触发，这些prr诱导干扰素调节因子(IRF)3易位和干扰素(IFN)的产生。当I型或III型IFN与细胞表面受体结合时，JAK/STAT信号级联激活了许多控制HCV感染的干扰素调节基因(irg)的转录。24日25日之前描述的具有抗hcv作用的irg包括PRRs MDA5和RIG-I，26研究小组1527和MXA。28为了改善HEV，先前已经描述了HLCs中JAK/STAT信号通路的调制14和丙肝病毒16日至18日感染，但报告的结果相互矛盾。17改善病毒复制的另一种方法是使用HCVcc病毒种群，在huh7衍生细胞系中选择更高的病毒复制。其中，通过在Huh-7.5细胞中长期传代分离出一种最近被定性为jc1衍生的HCVcc病毒群(称为p100);p100表现出较高的复制能力和对IFN的部分抗性。29 30
在这里，我们用亲本和适应性HCVcc感染HLCs，并监测急性感染期间的先天免疫反应。我们将它们的先天免疫反应与PHHs和Huh-7.5细胞的先天免疫反应进行了比较，并研究了药物干预来调节它，以使该模型更易于处理，更有价值地破译基于ifn的抗病毒效应功能和参与病毒清除或持久性的细胞机制。
结果
HLCs具有可诱导的肝细胞样先天免疫
使用标准程序产生hlc (网上补充数字S1和S2)．12日31日他们表达了关键的病毒PRRs, IFN受体和参与IFN途径的基因(在线补充图S3)．HLCs可以通过它们的RLRs感知dsRNA，导致IRF3易位，ifn的产生和随后的irg诱导，使其成为分析HCV先天免疫反应的潜在有价值的模型(在线补充图S4)．
HCVcc p100感染HLCs及IRGs诱导
用适应p100 HCV病毒群的细胞培养物感染HLCs (图1一个)，与Jc1亲本病毒相比，病毒复制增强(在线补充图S5)．DAAs完全消除了子代p100病毒的产生(网上补充数字S5及S6)．有趣的是，使用ruxolitinib(一种JAK/STAT途径抑制剂，JSi)治疗，导致hcl中p100病毒复制升高(网上补充数字S5及S6)及PHHs (在线补充图S8提示细胞先天免疫在HCV急性p100感染HLCs和PHHs中起重要作用。
HCV p100感染干细胞来源的肝样细胞(HLC)的时间和JAK/ stat依赖控制在溶剂(红色)、Telaprevir(直接作用抗病毒药物(DAA)，蓝色)或ruxolitinib (JAK/STAT途径抑制剂(JSi)，绿色)存在的情况下，不处理HLCs(黑色)或接种p100(感染多样性(MOI): 1)。(A)感染HLCs上清液中感染性病毒产生的动力学。(B)选择干扰素调节基因(irg)的时间依赖性和治疗依赖性诱导，通过RT-qPCR监测，并相对于未感染细胞表达。(C)对p100接种的hcs进行ISG15和HCV NS5A免疫染色。(D) c组ISG15染色的平均荧光强度定量(E) p100感染HLCs的HCV NS5A和干扰素调节因子(IRF)3共染色，7 dpi。(F) I型和III型干扰素(IFN)诱导HCV p100感染hcs。给出3次独立实验的标准差均值，有统计学意义:*p<0.05;* * p < 0.01。
在鲁索利替尼存在或不存在的情况下，p100 HCV急性感染HLCs时，同时监测感染滴度、ifn和选定的irg的产生。在感染后的最初几天(pi)，感染滴度逐渐增加，达到104鲁索利替尼治疗和鲁索利替尼未治疗感染HLCs的FFU/mL (图1)．然而，在接下来的几天里，在未处理的细胞中，滴度下降，有时在d11pi不再检测到传染性，而在鲁索利替尼处理的HLCs中，感染性病毒粒子的产生没有下降，滴度高达105FFU/mL在d11pi。在感染的HLCs中，IRG信使RNA (mRNA)诱导(图1和图2)和蛋白质表达(图1 c - d而且在线补充图S6C)在前4天pi保持在较低水平，随后诱导迅速爆发，与>感染性病毒滴度下降100倍相关。IRF3核易位有时可在HCV ns5a阳性的hcs中观察到(图1 e)， I型和III型IFNs的上调伴随IRGs的上调和HCV清除率(图1 f)．值得注意的是，当用鲁索利替尼治疗感染的HLCs时，即使观察到IFN mRNA的诱导，也很少，这表明JAK/ stat依赖的反馈对于在该系统中完全诱导I型和III型IFN mRNA是必要的。重要的是，鲁索利替尼治疗不影响肝成熟水平或hcv相关宿主因子在hcs中的表达(在线补充图S7)．当phh感染HCV p100并使用鲁索利替尼(ruxolitinib)治疗时，也获得了类似的数据(在线补充图S8)．
干细胞来源的肝细胞样细胞(HLCs)中p100 HCV复制的调控。在p100 hcv感染的HLCs中产生感染后代(A)转染小干扰RNA (siRNA)对抗STAT1和STAT2， (B)与抗ifn -受体(抗IFNAR)抗体预孵育，(C)与未处理或Ruxolitinib (JSi)处理的HLCs相比，用PKR抑制剂C16处理。(D)接种后9天，观察感染的hcs，无论是否用C16和/或JSi处理。(E)干扰素调节基因(IRGs)在用C16或JSi处理或未处理的HLCs中的诱导。给出独立实验SD为2 (A, B)或4 (C)的均值，有统计学意义:*p<0.05;* * p < 0.01。
用siRNA转染HLCs对抗STAT1，而不是STAT2 (图2一个)，以及使用抗IFN受体(IFNAR)抗体阻断IFN受体复合物(图2 b)增加了感染性子代病毒的产生，证实抑制IFNAR信号通路可增强HCV p100感染hcs。
我们之前报道过，与Jc1感染相比，p100 HCV感染导致PKR激活增强。29此外，其他研究小组推测PKR的激活可能是通过抑制ifn和irg的翻译来实现的。尺码因此，我们使用PKR抑制剂奥辛多尔-咪唑C16研究PKR激活对HLCs p100感染的影响。35C16处理在接种后第4天降低p100复制，提示PKR的前病毒效应(图2 c - d)．然而，在稍后的时间点，伴随大量irg的诱导(图2 e)， C16不再抑制感染。这些结果提示PKR激活在控制hcs的p100 HCV感染方面具有时间依赖性的作用。
p100感染HLCs的RNA-Seq分析
为了全面评估hcv介导的先天免疫激活，我们对感染的HLCs进行了RNA-Seq分析，使用或不使用ruxolitinib或telaprevir，并将其与未感染的HLCs进行比较。通过将reads映射到hg19参考基因组并进行归一化以进行实验之间的比较，量化细胞mrna的表达水平。单个基因的归一化表达值表示为每千碱基转录的Reads数，每百万映射Reads (RPKM)。分析在感染的、非jsi处理的细胞的感染滴度下降的时间点进行(在线补充表S1， GEO加入GSE132606)。
途径分析显示IFN反应和其他先天免疫途径是HCV感染hcs最显著的失调途径(图3一) (在线补充图9A-C)（联机补充表S2和S3)．在鲁索利替尼或DAA治疗后，没有免疫相关通路被富集，这表明hcv触发的先天免疫反应通路占主导地位，并突出了这些通路的复制依赖性触发。
RNA-Seq分析p100感染的干细胞来源的肝细胞样细胞(HLCs) (HCV)，与未感染的HLCs相比，用10µM telaprevir(直接作用抗病毒药物(DAA))或ruxolitinib (JAK/STATpathway inhibitor (JSi))处理或未处理。(A)根据基因本体(GO)富集分析工具，上调通路最多。直方图显示用Bonferroni校正计算的p值。虚线表示p值为0.05。(B)每种条件下选择干扰素调节基因(IRGs)的诱导，用log表示10与未感染的hcs相比，“每千碱基转录数，每百万映射数”(RPKM)值的倍增变化。所研究的irg的全部列表可以在在线补充图S10A．(C)未感染HLCs、p100感染HLCs和用JJSi或telaprevir (DAA)治疗的感染HLCs中选定irg的RPKM排名。
然后对我们的数据集进行了417个irg的分析，包括112个与HCV和其他黄病毒感染相关的irg。24 - 26日所分析的irg及其在HCV感染中的差异表达的总列表可在在线补充图S10A而且在线补充表S4．在受感染的HLCs中，417个分析的irg中有46个上调了两倍以上(图3 b，“HCV”)，与对照细胞(图3 b,“NINF”)。其中包括IRF7和IRF9，以及之前被描述为限制HCV感染的irg (IFI27, IFI44L, IFITM1, IFITM3, ISG15, MXA，低聚腺苷酸合成酶系统成分OAS1, OAS2和OAS3, OASL, RSAD2 (viperin)和BST2 (tetherin))。用telaprevir处理感染细胞后，IRG的上调被强烈抑制(图3 b， ' DAA ')或ruxolitinib (图3 b，“JSi”)，证实了在感知复制病毒RNA时，JAK/STAT和IFN通路对诱导irg及其后续抗病毒作用至关重要。
mRNA表达序列分析证实，HCV感染后，HLCs上调了许多irg (图3 c)，特别是具有抗hcv特性的irg在对照细胞中仅以极低水平表达(RPKM <0.05) (图3 c，红点)。HCV感染诱导了一些irg的表达，这些irg不依赖于JAK/STAT信号，或仅部分依赖于JAK/STAT信号，因为鲁索利替尼治疗p100接种的HLCs并没有完全消除它们的诱导。这组mrna包括OASL、RTP4和IFIT2 (在线补充图S10而且图3 c(绿色圆点)。此外，RLRs RIG-I和MDA5的诱导依赖于JAK/STAT信号，这可能解释了为什么ruxolitinib治疗会影响hcv依赖的I型和III型IFN mrna的诱导(图1 f) (在线补充表S4B, C)．
HLCs的先天免疫与PHHs的先天免疫相当
然后，我们将irg在hcl中的表达和诱导与Huh-7.5细胞和PHHs中的表达和诱导进行了比较(在线补充图S9D-F)，使用其他地方报道的综合RNA-Seq数据集(Tegtmeyer B和Vieyres G等，手稿在修改中;GEO加入:GSE132548)。如上所述，HCV感染后，HLCs上调46个IRGs, PHHs和Huh-7.5细胞分别上调159个和53个IRGs (图4一) (在线补充表S4和S5)．在HLCs中上调的46个irg中，有43个在PHHs中也上调(图4 a - c)，而感染Huh-7.5细胞中上调的irg与HLCs和PHHs中上调的irg大多不同(图4 b, C)．三种模型中均有10个irg上调，其中包括PRR MDA5 (IFIH1)、MX1和ISG15。HCV感染时HLCs中IRGs上调的模式和强度与PHHs中观察到的IRGs上调的相关性更好(r=0.3124)，而与Huh-7.5细胞中IRGs上调的相关性更强(r=0.0562) (图4 d)．Huh-7.5的IRG上调与PHHs的反应相关性也很低(r=0.0133)。重要的是，与PHHs和HLCs相比，Huh-7.5细胞中IRGs的基础和诱导表达水平都非常低(图4 e)．综上所述，这些结果证实Huh-7.5细胞是分析HCV先天免疫反应的一个较差的模型。另一方面，HLCs是HCV原生宿主细胞(PHH)先天免疫激活的良好替代模型。
干扰素调节基因(IRGs)在干细胞来源的肝细胞样细胞(HLCs)与原代人肝细胞(PHHs)与Huh-7.5中的表达及其对HCV感染的诱导(在线补充表S4)．HCV Jc1分别以MOI 1接种PHHs和Huh-7.5细胞。接种后72小时收集细胞，进行转录组分析。(A, B)研究的417个IRGs在HCV感染中的折叠变化，PHHs和Huh-7.5，根据它们在HCV感染的HLCs中的过表达进行排名。图B显示了46个irg在hlc中上调超过两倍(在线补充表S5)．#表示HLCs中三个irg上调，PHHs中未上调。(C) IRGs在感染HLCs、Huh-7.5和PHHs中过表达的维恩图。(D) HLCs、PHHs或Huh-7.5之间HCV感染表达倍数变化的相关性。虚线表示2的折叠变化。红点是在两种细胞模型中上调的irg，并在相邻的表格中列出。显示Pearson相关系数r。(E) irg的转录本每千碱基平均Reads Per Kilobase，每百万mapped Reads (RPKM)值在感染的hcs中上调了两倍以上，在hu -7.5和phh中表达，对照或感染。
实验控制HCV p100清除慢性HLC感染
然后，我们研究了是否有可能建立hcs的慢性、长期HCV感染。我们在前面描述过，hlc可以维持几个星期31并且可能支持HBV慢性感染。9在本研究中，我们维持HLCs 3周，只有有限的肝成熟损失(在线补充图S11)．HLCs维持活跃的脂蛋白分泌途径(在线补充图S11D)，是产生感染性子代病毒的重要宿主因子。即使在治疗3周后，Ruxolitinib对细胞的成熟水平也没有影响(在线补充图S11A,C)．
当hcs感染p100 HCV并在没有鲁索利替尼的情况下培养时，先天免疫反应的诱导在2周内清除了病毒(图5 a, B,红色)。另一方面，在鲁索利替尼治疗下，p100感染持续产生感染性病毒至少21天(图5一个，深绿色)，无IRG诱导(图5 b)．若将鲁索利替尼从培养基中除去(图5 a, C，箭头)，感染滴度随之下降(图5一个，浅绿色线)，同时感应irg (图5 c)模拟在早期时间点观察到的感染未治疗的HLCs的先天免疫反应(图5 b)．
综上所述，这些数据表明，使用鲁索利替尼可以控制对HCV感染的先天免疫反应，从而允许慢性HCV感染。实验性地停用鲁索利替尼可恢复先天性免疫和对感染的控制，使其成为监测和操纵肝细胞对HCV的先天性免疫反应的有价值的工具。
讨论
在这里，我们报道干细胞来源的HLCs代表了研究细胞对HCV反应的一种可处理的和具有免疫能力的模型。定制使用ruxolitinib，一种JAK/STAT信号通路的抑制剂，可以通过实验控制先天免疫的诱导，进而清除病毒或维持病毒。
由于低感染率和低复制水平，HCV感染在hcs中的研究具有挑战性。在这方面，利用p100，一种在Huh-7.5细胞中具有较高适应度的jc1衍生病毒种群是一个关键的改进，因为感染该病毒种群可以在HLCs中对整个病毒生命周期进行强有力的再现。目前尚不清楚p100的哪些特征在HLC培养中对介导增强的感染率起重要作用。p100的测序分析显示病毒多蛋白中有9个编码突变。29其中四个映射到NS3-4A蛋白酶复合体、NS5A磷酸化蛋白和NS5B RNA依赖的RNA聚合酶，并可能直接影响RNA复制和/或病毒dsRNA向细胞PRRs的呈现。NS5A是一种与抑制PKR功能有关的蛋白质，36可以改变pkr依赖性的先天免疫抑制。尺码与这一观点一致，Huh-7.5细胞的p100感染与PKR磷酸化增强和细胞蛋白翻译关闭有关。29用C16 PKR抑制剂治疗HLCs可减少p100在第一天的复制，这表明PKR激活可能参与了HLCs p100感染的初始建立。但在之后的时间点，C16的作用不再显著。总的来说，这些发现表明病毒决定因素控制着该模型中的感染效率，PKR的早期激活可能促进感染。更广泛地比较HCV毒株，包括来自患者的原始病毒种群，可能有助于确定对这些细胞感染至关重要的病毒特征。
之前已经讨论过调制JAK/STAT通路作为改善HLCs病毒复制的一种方法。16日至18日在这里，我们详细监测了先天免疫的诱导及其对长时间内完整复制周期的影响。为了调节JAK/STAT通路，我们使用了ruxolitinib，一种可能对处理细胞有额外影响的激酶抑制剂。然而，基因表达数据的分析排除了鲁索利替尼对HLC成熟水平或HCV复制辅助因子表达的主要影响(在线补充图S7)．我们还发现，ruxolitinib在触发RLR时特异性地阻断了ifn和irg的诱导(在线补充图S4)．最后，阻断ifnar依赖的信号，或沉默STAT1表达可增强感染(图2)．这些数据强调了干扰素在控制hcs HCV感染中的作用，并支持了ruxolitinib通过阻断JAK/STAT信号通路增强HCV感染的结论。
鲁索利替尼的时间依赖性给药提供了一些有趣的见解。当与病毒接种同时添加时，在感染的最初几天，无论有无药物存在，感染性病毒积累的动力学都非常相似，在实验之间观察到一些微小的波动(图1A、5A，网上补充数字S5及S6)．这些数据表明，在这段时间内，HCV有效逃脱或不触发依赖于JAK/ stat信号的先天免疫防御。与这一观点一致，对hcv感染的HLCs进行高灵敏度RT-qPCR分析，发现在d4pi之前，IFN和IRG mrna的诱导非常少，尽管很容易检测到从头感染病毒的产生。我们不能完全排除HCV感染在感染后立即被感知，但在太少的细胞中(如荧光显微镜所示)，图1 e而且在线补充图S5D)，由我们的化验所检测。
HCV p100的慢性干细胞源性肝细胞样细胞(HLC)感染及其JAK/ stat依赖性清除给出了一个具有代表性的三种实验。(A)感染HCV p100 (MOI: 0.5)的HLCs产生感染性子代病毒粒子，在没有(红色)或存在ruxolitinib (JAK/STATpathway inhibitor (JSi))的情况下培养21天，从d0pi到d21pi(深绿色)或仅从d0pi到d9pi(浅绿色，箭头表示JSi停用时间)。选择干扰素调节基因(IRGs)的表达(B)在感染的，未治疗的HLCs中，(C)在感染的，鲁索利替尼治疗的HLCs中，从d0pi到d9pi，归一化到感染的，鲁索利替尼治疗的HLCs，通过RT-qPCR评估。
显然，在体内病毒传播过程中，HCV经常克服这些肝脏固有的限制，形成慢性感染。在HLC-p100模型中，感染通常在接种后第11 - 14天被清除，除非IRG诱导的药物消融。这种差异可能与不同的HCV复制水平以及体外hcs和体内肝细胞之间先天性免疫反应的不同稳健性有关。然而，这种新型的HCV- hlc感染模型提供了独特的机会来分析ifn依赖和ifn独立的HCV控制机制对自然HCV感染和内源性表达的病毒传感器和效应物的重要性。在第二周内的先天性免疫反应与HCV Jc1感染PHHs时观察到的反应密切相关。虽然在感染的HLCs中抗- hcv先天免疫的诱导在数量上似乎低于感染的PHHs，但详细的比较通路分析表明，HLCs和PHHs中的反应在质量上是相似的(联机补充表S3)．这证实了HLCs作为研究肝细胞对HCV感染反应的体外模型的真实性。
虽然与phh合作具有很强的技术局限性，但与hPSCs合作可能是更好的实验方法的关键。例如，可以使用CRISPR/Cas9对hPSCs进行基因工程，随后在HLCs中进行分化，重现编辑后的表型。37此外，hiPSCs可以来源于具有有趣遗传背景的患者，例如，III型IFNs基因的多态性与自发清除和对治疗的反应有关。38虽然这个策略已经被提出，11到目前为止，它还没有被用于破译体外HCV感染患者特异性先天免疫反应。我们测序了我们的hPSCs感兴趣的单核苷酸多态性(在线补充图S12)．有趣的是，H9ESC与rs368234815(TT/ΔG)不利的ΔG等位基因同源，导致IFNL4的表达，并在IRGs诱导较高的患者中出现。39未来的研究涉及强烈感染hcs的p100，以及代表这些和其他位点的定制ESC或iPSC细胞，可能有助于发现控制HCV感染高度可变的过程和结果的新原则，从而指导个体化感染药物。
致谢
作者要感谢KG Chen博士和TJ Liang博士(NIH, USA)对适应单层培养的H9ESC的生成和转移;CM Rice教授(美国洛克菲勒大学)，hu -7.5细胞和9E10抗ns5a抗体;E Domingo教授(西班牙Severo Ochoa分子生物学中心)研究p100 HCV人群;Michael Engelmann, Gisa Gerold博士和HZI基因组分析研究中心提供技术支持。
参考文献
脚注
贡献者AC和TP设计研究概念，分析数据并撰写稿件。AC也进行了实验。JS和RB进行实验，分析数据并编辑手稿。FWRV提供了必要的试剂并编辑了手稿。
资金本研究由德国Forschungsgemeinschaft (DFG，德国研究基金会)-项目ID 158989968-SFB900，子项目A6和德国卓越战略- exc 2155“RESIST”-项目ID 39087428资助。
免责声明资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备中没有任何作用。
相互竞争的利益没有宣布。
患者和公众参与患者和/或公众未参与本研究的设计、实施、报告或传播计划。
患者发表同意书不是必需的。
出处和同行评审不是委托;外部同行评审。
数据可用性声明可根据合理要求提供数据:Arnaud Carpentier博士，arnaud.carpentier@twincore.de, ORCID标识0000-0002-6994-4689;Thomas Pietschmann教授，thomas.pietschmann@twincore.de, ORCID标识符0000-0001-6789-4422。
RNA-seq数据可通过NIH GEO平台公开获取(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/): GEO加入GSE132606和GSE132548。