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客观的慢性胰腺炎(CP)是一个fibroinflammatory综合症导致器官功能障碍,慢性疼痛,增加患胰腺癌和相当大的发病率。由于缺乏特定的生物标志物,诊断是根据症状和具体但不敏感成像功能,防止早期诊断和适当的管理。
设计我们进行了3型研究多变量预测个体预后根据三脚架的指导方针。签名区分CP和控制(n = 160)被确定使用气相色谱分析-质谱法和液相色谱串联质谱法对乙二胺四乙酸(EDTA)等离子体和验证在独立的群体。
结果朴素贝叶斯算法确定八6本体类的代谢物。算法训练和计算最优的否决后,分类根据代谢签名检测CP曲线下面积(AUC)为0.85 (95% CI 0.79 - 0.91)。外部验证在两个独立的组(n = 502)导致相似的精度检测CP与non-pancreatic控制EDTA-plasma (AUC 0.85 (95% CI 0.81 - 0.89))和血清(AUC 0.87 (95% CI 0.81 - 0.95))。
结论这是第一个研究,识别和独立验证在血浆和血清代谢组学特征诊断CP的大,潜在群体。结果可以提供基础的发展首先对CP常规实验室测试。
- 脂质代谢
- 肝脏代谢
- 胰腺疾病
- 慢性胰腺炎
- 肝硬化
数据可用性声明
数据可能会从第三方获得,不公开。数据鉴定病人数据,这可从相应的作者在相应的应用程序重用在研究目的只有。
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本研究的意义
已知在这个问题上是什么?
慢性胰腺炎的发病率和死亡率大大增加患者的影响。
没有blood-based,是或plasma-based生物标志物存在慢性胰腺炎的诊断。
有什么新发现吗?
在一个两步识别和验证研究慢性胰腺炎的生物标志物的签名被质谱(气相色谱-光谱法和液相色谱串联质谱)。
从三组670例和控制,在620年确定代谢物,8小组发现区分慢性胰腺炎与non-pancreatic高精度控制。
这是第一个研究,识别和独立验证代谢生物标记签名在大,慢性胰腺炎的诊断潜在群体。
它会如何影响临床实践在可预见的未来吗?
这项研究的结果可以提供发展的基础首先对慢性胰腺炎常规实验室测试。
介绍
慢性胰腺炎(CP)是一种炎症综合征1重复的事件导致的胰腺纤维化组织替代,器官功能障碍和慢性疼痛。2多个目的和风险因素导致CP在人类的发展,其中包括无节制的饮酒,3烟草烟雾和各种各样的遗传倾向。4 - 6影响高危患者发展外分泌胰腺功能不全导致消化不良,以及内分泌机能不全,导致糖尿病类型3 c和胰腺癌。7慢性疼痛、消化不良和脆性糖尿病通常会导致生活质量显著降低,增加医疗利用率和减少寿命。8 - 11
尽管多个目的和发病机制大多数CP患者将开发一个类似的临床和组织病理学表型。12当前的指导方针后,CP的诊断是由当满足以下条件:反复发作的胰腺疼痛与淀粉酶和脂肪酶的活动,记录上升和成像的证据,如胰腺钙化,CP的组织学证据,明确胰管形态的变化与消化不良或严重不正常的胰腺功能测试。2 13 - 15敏感性和特异性成像的CP变量和舞台的依赖。非侵入性的生物标志物的诊断CP尚未建立并保持一个未满足临床需要。此外,目前不可能识别高危病人,或者在CP的早期阶段,由于缺乏可靠的生物标志物。16虽然大量的基因组研究在大型军团已经确定越来越多的基因修饰符和风险因素,17 18转录组或proteome-based方法未能产生强劲的CP诊断工具。
对代谢组学特征的潜在作用,包括lipidomics CP的体液作为诊断工具。我们最近发现和验证一个代谢组学特征区分胰腺癌和CP。19这促使寻找生物标志物特征可以区分CP和控制包括患者non-pancreatic条件。
材料和方法
研究设计
我们进行了3型研究多变量预测个体预后根据三脚架的指导方针。20.共有670名患者和控制在三个军团和前瞻性的分析做了回顾。诊断CP的是如果一个或更多的临床和影像学标准由Mayerle描述等7和没有其他诊断的可能性更大。相似的年龄和性别分布之间的病人和控制是未遂。图1和表1识别和验证军团组成概述。
研究设计。生物标志物签名确认在代谢组学的数据识别研究中,比较患者慢性胰腺炎(CP)和控制患者。这些数据被用作训练集的算法。参与者的第一个独立验证研究招募了和他们的样本数据作为测试集。第二验证研究中,参与者被招募的独立。在这项研究中,肝硬化(LC)患者作为对照组。
识别研究病例对照队列中执行大学咨询中心和包括80 CP患者和80名non-pancreatic疾病控制小,non-pancreas-related全身麻醉下手术(表1和在线补充方法)。
第一验证研究,144 CP患者和204 non-pancreatic控制连续招募了来自三个不同的大学咨询中心。
第二验证研究,验证了该方法的鲁棒性进行使用血清代替血浆样本,CP,肝硬化患者和健康献血者在第四个转诊中心登记。在这一群人,一些血液样本样品质量较低,被他们的血糖水平极低(< 2800µmol / L),连续被排除在分析之外。样本49 CP患者57例肝硬化患者和56个健康献血者被包括在最终的分析中。
临床信息在性别、年龄和体重指数(BMI)被记录了下来。此外,疾病病因学、信息疾病持续时间、钙化、内分泌机能不全和酶补充记录(如果有)。可以找到所有群体特征表1。
所有的参与者加入之前给他们的书面知情同意。进一步研究细节和样品的相关信息处理中可以找到在线补充材料和方法。
代谢产物分析
所有样本分析MxP全球分析和MxP脂质。MxP全球分析了采用(1)气相色谱分析-质谱法(gc - MS)使用安捷伦6890气相色谱仪耦合到一个安捷伦5973 mass-selective探测器,(2)液相色谱串联质谱(质/ MS)使用安捷伦1100高液相色谱系统耦合到一个应用生物系统公司API 4000三重四极质谱仪,之前已经详细描述。研讨会
多达1449种代谢物中发现研究根据样本矩阵和分析技术。代谢物来自10个不同的本体类和由838种已知代谢物和611年未知谱特性。只有那些符合特定的质量标准的代谢物中描述24包含在进一步的统计分析。此外,血浆样品进行质量评估使用MxP Biofluids质量控制试验(见我们的专利申请WO2015145387A1)。25
统计数据
所有代谢物分析数据之前log10-transformed进一步分析实现近似正态分布。R V.3.3.4是用于数据分析,明白了在线补充方法使用的R包列表(在线补充表S1)。
探索性的多变量分析(主成分分析PCA), log10-transformed数据的识别和验证的研究为中心,扩展单元方差,和缺失值分析(见之前估算在线补充方法)。
log10-transformed、缩放和估算比率从第二个验证研究中也使用PCA,单独呈现,因为不同的样本矩阵。TIBCO Spotfire V.7.12.0 PCAs用来想象。
区分CP患者和控制取决于他们的代谢,朴素贝叶斯模型安装使用log10-transformed median-imputed、集中和扩展的数据识别研究。基于生物医学专家小组(见提名在线补充方法)。一个算法训练与选定的面板上的数据代谢物。拟合模型评估了10倍交叉验证。最优系数测定,最佳截止基于灵敏度为0.8的标准是为了计算病人进行分类。
验证生成的病人分类模型,该算法应用于log-10-transformed,集中和扩展数据从第一个验证集。第一验证数据集的比例,确定数据集的平均值和SD被应用。预测分数计算为每个病人和病人分类根据他们的得分高于或低于截止值。截止之前建立的生物标志物识别数据集上应用数据从第一个验证集没有培训,和性能测量曲线下的面积(AUC)、敏感性和特异性。信心水平的AUC使用副法线计算模型接受者操作特征(ROC)曲线。进一步的信息预测模型和统计分析可以发现更多细节在线补充文件。
测试这种分类算法的有效性和相应的截止血清样本矩阵,而不是等离子体时,它也应用log10-transformed分开,集中和扩展数据从第二个验证数据集以同样的方式。
独立,一个简单的线性模型(多元方差分析(MANOVA))计算使用“疾病”、“年龄”、“身体质量指数”和“性别”作为独立变量和log10-transformed代谢物分析数据从所有三个因变量分别研究。每个数值独立变量分析之前。
在第二个验证研究中,BMI值没有可供所有参与者。包含的BMI作为MANOVA混杂因子,失踪的BMI值估算。显著性水平是5%。代谢物的数量的多个测试问题解决了计算错误发现率(罗斯福)使用Benjamini和业务方法。26罗斯福的截止被设定为20%。
进步的标准
我们的研究的目的是设计一个生物标志物可以区分CP患者和控制的AUC至少0.8。此外,所需的特异性灵敏度高于因为指南强调诊断CP带来很大的负担,可能诱发惯用的病人。对于一个成功的验证,我们预期性能的置信区间(AUC)培训和测试集之间的重叠。
结果
代谢组学分析样本CP患者和non-pancreatic控制
代谢组学数据进行了严格的质量控制从等离子体115 505种已知和未知代谢物后样品,和498年血清样本的已知和118年未知代谢物仍进行统计分析。大部分的代谢物可以检测血浆和血清样本。他们分布在本体类所示图2。
类内代谢物分布本体类和数量分析在识别研究和第一验证研究。
多元统计CP和控制患者的歧视
我们调查是否CP和控制患者的代谢通常可以被分离在一个无人管理的多元统计方法。
在所有血浆样本数据进行主成分分析。组的最佳分离得到的主成分1和2 (PC),占整个数据集的方差的12%和7%,分别为(图3一)。两组显示主要重叠但CP患者样本PC1倾向较低的分数,这是对一个异构群体高个人间变化由于不同的生活方式,药物和并发症。
多变量分析。(A)主成分分析(PCA)得分图识别研究和第一个验证集(EDTA等离子体)。对照组的最佳分离(灰色)和CP组(琥珀)观察vs PC2策划主成分(PC) 1。在一起,这些电脑占观测数据集内总变异的19%。(B) PCA得分第二验证研究的情节设置(血清)。明显分离对照组(灰色),CP组(琥珀色),以及观察肝硬化组(蓝色)策划PC1 vs PC2。虽然有一些重叠CP和肝硬化组、对照组明显与其他两个分离。在一起,这些电脑占观测数据集内总变异的34%。CP,慢性胰腺炎;EDTA(乙二胺四乙酸。
在PCA获得第二个验证研究中,肝硬化患者添加作为第三诊断组除了CP和控制(图3 b)。最好的分离群体再次观察PC1和PC2(观察到的方差的21%和13%)。值得注意的是,一个几乎完全分离的从其他两个对照组观察。CP患者往往有更高的分数PC2肝硬化患者,导致可见这些团体之间的分离。
虽然并不常见的验证群体进行主成分分析,它是在这种情况下表明代谢组概要文件和CP的分布与对照组病人识别研究和第一验证研究非常相似,证明这两个研究中,虽然进行了独立,实际上是可比的。第二个验证研究的PCA产量很好地概述如何代谢轮廓的肝硬化患者与CP患者的代谢和控制。
生物标志物的发现和培训
观察到的分离倾向我们多元的方法编译一个生物标志物的可能性签名表示,允许区分CP和控制患者。
朴素贝叶斯算法的结果和生物医学专业知识应用于识别研究小组八代谢物(表2)被提名。使用的最佳计算截止0.479的预测评分,发现生物标志物签名CP相比,控制患者的AUC 0.85 (95% CI 0.79 - 0.91),在解释道在线补充表S2)。特异性是0.86和0.71的敏感性(表3);ROC曲线看图4一。
性能检测生物标志物特征的慢性胰腺炎。接受者操作特征曲线下面积(AUC)的生物标志物特征区分从控制慢性胰腺炎。(一)识别研究(EDTA等离子体)(B)首次验证研究(EDTA等离子体)(C)第二效度研究(血清)。EDTA(乙二胺四乙酸。
生物标志物在独立验证的群组研究中进行验证
生物标志物的签名是在第一次测试验证研究,由乙二胺四乙酸(EDTA)血浆样本348名患者。截止和代谢物的系数值的识别研究,并诊断性能评估。发现控制患者相比(CP)的AUC 0.85 (95% CI 0.81 - 0.89)。这与特异性的0.66和0.84的灵敏度(表3)。auc的CIs的研究几乎是相同的,表明生物标志物表现强劲到足以成功地转移到第一个验证研究。ROC曲线所示图4 b。
取得稳定性能的验证研究中,我们测试了CP生物标志物的签名是否有效的在不同的上下文并进行了第二次验证研究,包括代谢组学数据从162个人。在这一群人,我们使用血清样本,肝硬化患者作为额外的控制。
截止和代谢物系数又从识别研究转移到第二个验证研究没有培训,和诊断性能评估。AUC CP和控制为0.87 (95% CI 0.81 - 0.95)。这个词显示相当大的重叠的AUC CI识别研究中,指示成功的性能在第二验证。特异性灵敏度0.89和0.78 (表3)。ROC曲线所示图4 c。生物标志物的签名就足够健壮与血清样本的工作。
该算法应用于肝硬化样本时,结果是更类似于CP组比献血者组。
多元统计分析中的生物标志物面板三个研究群体
单独分析的三个数据集显示选择的八个代谢物都显著改变plasma-based研究CP患者与对照组(p < 0.05;罗斯福< 0.2),其中6也在是学习。方差分析结果(fold-changes)代谢产物所示的面板表4。提供FDR-corrected p值(q值)在线补充表S3。值得注意的是,fold-changes在相同的所有研究的范围。一个显著特征是非常小的p值面板代谢物在第一验证研究。由于更大的样本数量在这项研究中,统计显著性较高的代谢物也小群体之间的浓度水平的变化。此外,PCAs第二验证研究表明,组织同质低于第一验证研究,导致更高的MANOVA p值。
的计算预测分数显示面板代谢物的相对重要性,β-胡萝卜素和玉米黄质产生最高的影响(表4)。箱线图显示面板的inter-individual可变性代谢物水平(图5 a -在不同的研究。他们说明为什么类胡萝卜素,被选为最重要的代谢产物的算法,当他们歧视团体之间最好。然而,单一的代谢产物无法区分CP和控制。只有计算的生物标志物面板产生足够准确的诊断。年龄和体重指数的分布在生物标志物签名所示在线补充图S1。
箱线图的代谢物水平的三项研究中的生物标志物特征,由集团。CP,慢性胰腺炎。
讨论
在我们的证据概念后生物标志物研究三脚架的指导方针20.我们首次展示签名由8代谢物的六种不同的本体类可以成功区分CP和控制与可接受的精度(AUC > 0.8)在血清和EDTA-plasma样本。
没有推荐blood-based生物标志物的诊断CP在医学指南。2提出了一些蛋白质或microrna可能占用这个角色,但在更大的群组研究中仍缺乏验证研究。28 29这些生物标志物分析验证诊断使用由周质谱分析进行了综述等诊断准确性,但大多是未知的。30.在啮齿动物的研究采用自发和药物诱导的CP模型提出重大改变胰腺代谢物,包括能源生产、合成代谢、脂质合成和活性氧解毒途径。31日32小,由于其非均质性不确定核MR-spectroscopy-based人类研究发现柠檬酸和腺苷水平变化在尿液和3-hydroxybutyrate, trimethylamine-N-oxide、乙酸、丙酮、乙酰甘氨酸、异亮氨酸,甘油三酯和血清肌苷含量。33 34这促使我们进行试验与研究设计更适合生物标志物的发展。
签名中发现的主要力量提出了研究其鲁棒性。我们使用大、特征明显的病人群体提供充分的培训和外部验证控件。结果的可比性EDTA-plasma和血清样本强调使用的有效性分析,尽管描述个体内的高,个别间blood-metabolome的可变性。21签名产生可接受的诊断准确性的三个送给亚AUC 0.85和0.87之间的不同。值得注意的是,我们报告关于敏感性和特异性相当大的变化在第一验证研究解释为一定的异质性招聘时多个站点。这一发现的相关性需要在进一步的研究探索。
仔细检查,确定代谢物水平符合CP的病理生理概念。脂溶性维生素,抗氧化剂和微量元素已报告在CP患者相比,较低的控制。35 - 40是否缺乏β-胡萝卜素和玉米黄质(外源性化合物)是次要的吸收不良仍然是未知的。41 42我们不能发现裴之间的关联或无礼的识别队列和β-胡萝卜素的水平。然而,这些数据的解释需要谨慎,因为之前的研究已经不一致的关于裴和营养指标之间的关系。43 44这是第一个研究来描述减少β-胡萝卜素作为CP诊断标志物水平。
甘露糖和其他碳水化合物被发现是基于显著改变在gc - ms方法对急性胰腺炎代谢标志物的研究。45虽然在他们的研究中,肖等没有找到一个进一步提高急性胰腺炎反复发作后,它强调了胰腺在糖代谢中的作用在健康和疾病。
天然保湿因子和其他组件相关sphingomyelin-metabolism一直与代谢物caerulein-induced胰腺炎在老鼠身上的变化46,被发现是一个标志代谢物签名高度敏感的检测胰腺癌在之前的研究中从我们组。19水平的降低可吸收的长链饱和二十二烷酸,发现在我们的CP主题可以直接相关神经酰胺通路的神经酰胺合成酶2。47据我们所知,没有发表的研究二十二烷酸与胰腺炎。
Indol-3-acetic酸,属于群尿毒症的毒素,是一种tryptophan-derived大肠微生物群的副产品。这是生物利用度取决于肠道微生物和芳基碳氢化合物受体表达有关,48进而调节胰腺纤维化。49微生物成分敏感胰酶分泌,甚至在非临床体现CP。50同样,等离子体的马尿酸水平,另一个尿毒症的毒素,是敏感的改变肠道微生物与饮食有关,药物和疾病。51
N-acetylcytidine mRNA转录后修饰,可以产生更有效的翻译52和涉及inflammasome相关白介素(IL)在慢性炎症患者1β生产。53胰腺Inflammasome激活,但不是一个具体的过程,参与胰腺癌治疗和纤维化。54
加在一起至少代谢物的签名是由合理的参与各种流程与CP的发病机理。失败的一个生物标志物在个别病人,因此,由其他组件的补偿算法。这是支持的进一步发现,生物标志物的分数增加而出现胰腺功能不全,代孕疾病阶段。
最近的一项研究由我们美国财团62丛luminex试验用来识别潜在的生物标记物诊断CP。血液样本的41控制,20复发性急性胰腺炎(RAP)和40 CP患者发现,gm - csf IFNb,瘦素,PDGFB和抵抗素可能区分CP和控制(AUC 0.86)和抵抗素,自洽场,MIP-1a和IL-17F说唱和CP (AUC 0.77)。55尽管结果可比由于方法论上的分歧似乎不是很清楚,只有结合的标记,而不是一个单一的蛋白质允许足够的歧视。独立的验证这些数据是悬而未决。
我们研究的一个潜在的弱点是CP患者和对照组无与伦比的年龄、性别和体重指数连续由于疾病异质性和招聘。CP诊断主要在中年男性营养不良的风险。12日13Non-pancreatic控件(如日间手术患者或献血者)默认包含一个不同的群体。因此,性别、体重指数和年龄并不包括在预测模型,因为我们旨在避免陷阱,仅在时代转变可能足以改变一个积极的,消极的分类,反之亦然。
这不能排除一些差异之间的代谢组是由于这些特性。然而,MANOVA统计校正了年龄、性别和体重指数,仍然显示所有选择的代谢物组之间的显著差异。这支持了我们的假设,这代谢签名能够确定CP患者(不分性别、年龄和体重指数。
我们发现开发的代谢特征区分CP和控制应用于肝硬化时更有识别力的样本。相似之处可能被解释为由于激活的纤维化和酗酒,疾病的共同特征。幸运的是,必须区分肝硬化和CP是罕见和疾病很少重叠。在第二个验证研究然而,一个几乎完全分离的从CP对照组观察。在这个组,对照组是由健康献血者non-pancreatic病人,解释了明显改善。
这种代谢的潜在临床使用签名识别的CP患者在发病的早期(CP)、原因不明的患者腹部症状和胰腺疾病的历史,但(还)没有明确的形态CP(可能CP)的迹象,或者患者的说唱发展中CP的风险。16这些组织到目前为止只有模糊诊断标准定义的国际共识。因此,我们招募的CP患者为了生物标志物的发展。提出代谢签名是否足够敏感在上述情况下需要进一步测试试验和长期随访,12理想的设计,包括疾病分期通过慢性胰腺炎预后评分分数。44代谢生物标志物是否可以区分CP和肝硬化,共享一个共同的病因学(酒精),还需要在今后的试验中得到解决。
总之,我们已经确认和验证一个质/ MS-based人类blood-metabolome签名,而成功是CP患者和健康人之间的歧视。这是否生物标志物早期诊断的临床价值CP或可用于监测疾病进展需要进一步的前瞻性研究。
数据可用性声明
数据可能会从第三方获得,不公开。数据鉴定病人数据,这可从相应的作者在相应的应用程序重用在研究目的只有。
伦理语句
病人同意出版
伦理批准
所有的研究设计和遵循赫尔辛基宣言和批准的当地所有四个参与中心的伦理审查委员会。
确认
我们感谢技术人员健康状况分析的代谢组学公司优秀的技术支持和Susanne Wiche,技术援助和多丽丝·乔丹。
引用
补充材料
脚注
公司和GB是共同第一作者。
JM和MML联合高级作者。
首先,GB同样起到了推波助澜的作用。
JM, MML同样起到了推波助澜的作用。
调整通知本文已经被修正,因为它第一次在网上发布。作者Tim Fahlbusch的名字已被纠正。
贡献者研究设计:JM, BK MML;病人和生物材料招聘:CP、TF、医学博士颗,FUW, MB,吴,RG, GB,嗯,JM MML;数据采集和统计分析:首先,BK,数控;编写委员会:首先,GB, JM, BK MML;手稿修改和批准:BK,数控,CP,医学博士,TF,颗,FUW, MB,吴,RG, JM, MML。
资金支持的德意志Krebshilfe /博士。Mildred-Scheel-Stiftung(109102),德意志Forschungsgemeinschaft (DFG马4115/1-2/3 SFB1321:项目号329628492,6395/1 1),联邦教育部和研究(BMBF GANI-MED 03 is2061a BMBF 0314107、01 zz9603, 01 zz0103, 01 zz0403, 03 zik012),威廉的桑德Stiftung(2009.039.2)和EFRE-State经济MV (v - 630 - s150 2012/132/133),养/ 14-BM-A55-0045/16 PePPP和养/ 14-BM-A55-0010/18科特布斯)。
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