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Neurogastroenterology
原始研究
之间的联系Brachyspira和肠易激综合征腹泻
  1. 卡罗丽娜S -贾巴尔1,2,
  2. 布伦丹·多兰1,
  3. 莉丝贝埃克伦1,2,
  4. Catharina意识1,
  5. 安娜Ermund1,
  6. Asa约翰逊1,
  7. 汉斯Tornblom2,3,
  8. 马格努斯Simren2,3,
  9. 贡纳C汉森1
  1. 1医学生物化学、生物医学研究所,瑞典哥德堡大学,哥德堡、瑞典
  2. 2Gastroeneterology和肝脏病学,卡大学医院,哥德堡、瑞典
  3. 3内科和临床营养,哥德堡大学医学研究所,哥德堡、瑞典
  1. 对应到贡纳C汉森博士。医学生物化学,哥德堡大学、哥德堡405 30日瑞典;gunnar.hansson在{}medkem.gu.se

文摘

客观的肠道感染后肠易激综合症的发病率增加,表明微生物不平衡的决定性作用。然而,分析粪便微生物群并未表现出一致的变化。在这里,我们使用宏蛋白质组学研究潜在mucus-resident微生物群之间的联系和肠易激综合症的症状。

设计粘液样本前瞻性收集的乙状结肠活检IBS患者和健康志愿者及其微生物蛋白质成分通过质谱分析。观测证实了免疫荧光、电子显微镜和实时PCR,进一步证实了在第二组,与综合分析临床特点及粘膜免疫反应。

结果Metaproteomic分析结肠粘液从潜在的致病性鉴定肽的样本Brachyspira物种在IBS患者的一个子集。使用多个诊断方法,粘膜Brachyspira殖民中检测出的19/62(31%)的IBS患者从两个未来的军团,与0/31健康志愿者(p < 0.001)。的患病率Brachyspira殖民在IBS腹泻两个组别(IBS-D)为40% (p = 0.02, p = 0.006 vs控制)。Brachyspira附件的colonocyte顶端膜在IBS患者的20%,与加速oro-anal运输有关,轻度粘膜炎症,肥大细胞激活和改变的分子通路与细菌吸收和ion-fluid体内平衡。灭滴灵治疗矛盾的提升Brachyspira搬迁到杯状细胞分泌granules-possibly代表小说细菌抗生素策略来逃避。

结论粘膜Brachyspira殖民化是更常见的在肠易激综合症和与独特的临床相关,组织学和分子特征。我们的观察表明角色Brachyspira在IBS的发病机制,尤其是IBS-D。

  • 肠易激综合症
  • 细菌粘附
  • 细菌的发病机理
  • 粘液

数据可用性声明

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http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/

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http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl - 2020 - 321466

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    本研究的意义

    已知在这个问题上是什么?

    • 肠道感染后肠易激综合症发病率增加,暗示可能诱发微生物微扰的作用。

    • 粪便微生物群的研究未能证明一致的改变与IBS症状有关。

    有什么新发现吗?

    • 这项研究是第一个比较微生物群落的结肠内黏液层IBS患者和健康志愿者。

    • 殖民的结肠上皮表面由致病性或黏液层Brachyspira物种中检测出40%的IBS患者腹泻但不健康的人。

    • Brachyspira有关肠易激综合症与独特的临床,组织学和分子特征,表明它应该被视为一个单独的诊断实体。

    • 治疗矛盾导致的搬迁Brachyspira成杯状细胞分泌颗粒。

    它会如何影响临床实践在可预见的未来吗?

    • 的存在Brachyspira可以用来确定一个IBS患者的不同子集,谁可能对根除治疗。

    • 的搬迁Brachyspira成杯状细胞粘液颗粒可能代表了一种新颖的细菌策略来逃避抗生素,这可能为我们理解其他持续或复发性粘膜感染。

    介绍

    肠易激综合症的发病率急剧增加肠胃炎发作后,暗示可能诱发微生物微扰的作用。1不过,先前的调查并未表现出一致的肠道菌群和肠易激综合症症状之间的联系。2 3

    肠道微生物群组成的研究绝大多数依靠粪便材料。然而,这些样本在很大程度上反映了腔的微生物群落,这是空间上分开的结肠上皮细胞通过道粘液屏障和潜在的免疫细胞。4相比之下,某些物种中发现了一个利基外黏液层,以丰富的黏液O聚糖。5因此,粪便和mucus-associated细菌代表独特的人群,后者更有可能影响上皮细胞。特别是,细菌内黏液层中的存在可能导致上皮压力和免疫激活。在这里,我们进行了metaproteomic内黏液层的分析样本IBS患者和健康人,调查潜在mucus-resident微生物群之间的联系和肠易激综合症的症状。

    材料和方法

    研究设计

    18 - 65岁的病人满足罗马III标准IBS前瞻性地包括在二/三级护理单元(卡医院,哥德堡,瑞典)2012年6月到2018年4月。健康的志愿者招募通过广告和筛选问卷和访谈排除肠胃疾病和并发症。排除标准中列出在线补充文件。IBS患者根据罗马III标准子类型和布里斯托尔粪便形成规模,如下:IBS腹泻(IBS-D), IBS便秘(IBS-C),肠易激综合症和混合排便习惯(IBS-M)和unsubtyped IBS腹泻或便秘(IBS-U)。所有参与者提供书面知情同意。

    所有参与者(IBS n = 62,健康n = 31)接受乙状结肠镜检查与抽样的活检methanol-Carnoy未来组织学、免疫组织化学和实时PCR分析(图1)。Carnoy的固定剂使最优保存黏液层和组织核酸。6全面的临床描述,包括评估oro-anal渡越时间(OATT)和直肠敏感性,IBS患者中进行。

    Graphical summary of the study design. Schematic representation of the different phases of the study. In-depth profiling of clinical, histological and molecular characteristics (phase 4) was performed in participants where Brachyspira colonisation could be confirmed/rejected with high confidence, typically based on consistent results from two different methods. Quantification of mucosal immune cells by histology was performed in a representative subset of participants with good-quality biopsy sections, whereas analysis of the human mucus proteome was largely restricted to participants from the explorative cohort. The figure was created with BioRender.com.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    图形化的研究设计的总结。研究不同阶段的示意图表示。深入分析临床、组织学和分子特征(阶段4)在参与者的表现Brachyspira殖民可以确认/拒绝高信心,从两种不同的方法通常基于一致的结果。进行量化的粘膜免疫细胞组织学与高质量的切片部分参与者的代表性的子集,而人类粘液蛋白质组的分析主要是局限于参与者从探究的队列。这个数字是创建BioRender.com。

    在一个随机选择的参与者(子集第一/探险的队列,IBS n = 22日健康n = 14),粘液收集从体外乙状结肠活检和质谱(MS)分析。这个探究的阶段的目标是双重的:形容metaproteomic组成内黏液层的IBS患者和健康人,并生成假设追求人口在整个研究。患者的鼻涕/组织样本细菌检测到女士(n = 9),或者,在某些情况下,其他方法(n = 3),进行了重复乙状结肠镜检查,对电子显微镜活检取样,粘液收集和/或常规临床组织病理学。

    metaproteomic分析确定了假定的之间的联系Brachyspira属和肠易激综合症。这个协会是在进行验证探险的队列剩余的研究中,老百姓造成第二组,包括40 IBS患者和17个健康人- - - - - -使用实时PCR和免疫荧光。采样和分析,只要有可能,以令人眩目的参与者的身份执行。缺失的数据由于技术故障或次优活检标本中列表在线补充表S1。

    病人和公众参与

    患者没有参与规划、设计或评估本研究。

    Patient-reported症状

    参与者记录的频率和布里斯托尔规模一致性排便的帷幕,结构化的日记。IBS患者完成了IBS严重性评分系统(IBS-SSS)问卷以及光学症状严重程度评分(在线补充文件)。7 8

    Oro-anal渡越时间

    OATTs评估为60/62(97%)患有肠易激综合症(在线补充文件)。

    直肠敏感性

    直肠敏感性评价45/62 IBS患者(73%),使用一个电子恒压器(在线补充文件)。

    粘液集合

    乙状结肠镜检查进行事先肠道准备。每个参与者两个活检(探究的队列n = 36岁,第二组n = 4)在含氧运输,冰冷的克雷布斯缓冲区,安装在我们的内部开发的体外粘液测量室和允许为1小时分泌粘液。9粘液当时收集的温柔刮(在线补充图S1)。自外,容易移动,黏液层丢失在采样和传输、样品微生物蛋白质含量被认为是反映内心的黏液层。

    女士和数据处理

    粘液样本准备根据女士的修改版本Filter-Aided样品制备(FASP)协议。10Nano-liquid chromatography-tandem女士进行Q-Exactive工具(热)。肽被确定使用仙女座搜索引擎集成到MaxQuant (V.1.3.0.5)和软件(V.2.2)吉祥物。11搜索是对所有执行回顾了人类的真细菌序列SwissProt-UniProt数据库(2016年2月)。最低一个独特的肽阈值所需的1%是蛋白质鉴定。细菌属家庭/识别阈值通常被定义为≥3蛋白质,每个被至少一个独特的、家庭/ genus-specific肽。中提供了详细信息在线补充文件。

    组织学和免疫组织化学

    每个参与者一个活检(群)在methanol-Carnoy固定,石蜡包埋,切片。组织部分沾)、阿尔新蓝/周期性acid-Schiff (AB-PAS),甲苯胺蓝,革兰氏染色剂与抗体或荧光显微镜(在线补充文件)。固有层和牙龈上皮内免疫细胞数量统计五个大功率领域)或甲苯胺中部分由两到三个独立观察员。

    透射电子显微镜法

    透射电子显微镜分析活检从10个参与者中详细说明在线补充文件。

    DNA隔离和实时PCR分析

    DNA methanol-Carnoy-fixed隔绝,石蜡包埋组织的概述在线补充文件。在特定的参与者,DNA也从新鲜冷冻活检和/或粪便分离材料(在线补充文件)。Brachyspira物种被确定使用融化曲线的方法。12为了进一步验证我们的观察,复合水解调查分析具体的Brachyspira aalborgi / hominis和Brachyspira pilosicoli设计(在线补充文件)。

    16 s rDNA测序

    16 s rDNA测序的粪便样本进行描述的在线补充文件。

    粘液穿透性分析

    粘液穿透性被共焦显微镜评估,使用荧光珠作为替代标记物细菌(在线补充文件)。9

    抗生素处理中间的研究

    前四IBS患者被诊断为上皮细胞的研究Brachyspira殖民/感染一天三次服用500毫克甲硝哒唑为14天。13是临床治疗的基本原理,干预是开放的和不受控制的。治疗前患者IBS-SSS完成问卷调查,2,4,6,8周,6、12和15个月后开始抗生素。他们的排便习惯写日记从2周之前,直到8周后,治疗,和2周后6个月和12个月灭滴灵治疗,分别。患者接受乙状结肠镜检查活检取样组织学、免疫组织化学和PCR 6周治疗后,收集粪便样本probe-based PCR分析6周,抗生素治疗后6个月和1年。

    统计数据

    确切概率法是用于分类数据。连续数据,韦尔奇t或Mann-Whitney U测试被用于双官能团的比较,根据数据分布Kolmogorov-Smirnov验证的测试。克鲁斯卡尔-沃利斯检验被用于多组比较。P值是双面的。意义阈值(0.05)是根据Bonferroni调整/ Holm-Bonferroni方法在多个(> 2)比较。数据分析与GraphPad棱镜(v . 8)。

    结果

    研究人群

    一个图形提供了研究设计的总结图1。在一次探险的群22 IBS患者和健康对照组14内黏液层样本收集的乙状结肠活检和宏蛋白质组学分析,揭示一个试探性的之间的联系Brachyspira和肠易激综合症。这种联系是通过组织学证实、电子显微镜、免疫荧光和有针对性的实时PCR分析,并进一步研究在第二批40 IBS患者和17个健康个体,用免疫荧光法和PCR。临床和人口特征两个组别中编译表1。个体的数量/比例分析归纳了每个方法表1;participant-level数据提供了在线补充数据文件S1。缺失的数据列表在线补充表S1,由肠易激综合症诊断和分层Brachyspira殖民统治的地位。人口因素没有IBS患者和健康人之间的差异(表1)。

    把这个表:
    表1

    研究群

    细菌蛋白质更频繁地发现IBS患者的粘液

    使用严格的标准,确定细菌粘液从9/22 IBS患者(41%)和1/14(7%)健康对照组(p = 0.05;在线补充图S2A)。最常发现细菌家族是假单胞菌科在线补充图S2B-D)。蛋白质从Brachyspiraceae家庭,属Brachyspira肠易激综合症患者被发现在3/22(14%)而不是任何控件(在线补充图S2C, D)。

    的Brachyspira属包括公认的人类病原体与肠道螺旋体病有关。在这种情况下,暂时与腹泻和腹痛,Brachyspira穿透了黏液层,经常殖民colonocyte顶端膜。12 - 15因此,我们调查关注潜在的联系Brachyspira和肠易激综合症。数量的确定每个家庭编译在肽和蛋白质在线补充表S2和Brachyspira多肽/蛋白质识别在线补充表S3。

    组织学和免疫组织化学蛋白质组确认Brachyspira识别

    在这三个蛋白质组患者Brachyspira识别,螺旋体可以呈现在顶端膜AB-PAS染色(图2 a, B)。透射电子显微镜显示Brachyspira人口殖民上皮表面,微绒毛之间的连接(图2 c, D)。这些观察结果进一步证实了immunofluorescent染色Brachyspira抗血清(图2 e)。14当免疫荧光分析扩展到整个探险的队列,Brachyspira殖民colonocyte膜(膜相关螺旋体病)中检测出三个额外的IBS患者。在其他情况下,Brachyspira观察粘液,偶尔入侵内层(图2 f)。相比之下,所有健康志愿者样本为阴性Brachyspira。

    Histology, immunohistochemistry and transmission electron microscopy demonstrated the presence of Brachyspira at the colonic epithelial surface. (A) Alcian blue-periodic acid-Schiff (PAS) stain showing Brachyspira bacteria at the apical membrane. Scale bar: 10 µm. (B) Representative Alcian blue-PAS stain from a patient with IBS without Brachyspira. Scale bar: 25 µm. The right-hand images represent zoomed sections from the left panel. (C) Transmission electron micrographs showing Brachyspira attaching to the epithelial surface between the (shorter and less electron-dense) microvilli. Scale bar: 1 µm. (D) Transmission electron micrograph from a patient without Brachyspira. Scale bar: 1 µm. (E) Sections from three patients with IBS where Brachyspira species were detected by proteomics, stained with Brachyspira antiserum (red) and co-stained for mucus with anti-CLCA1 (green). DNA was counterstained with Hoechst (blue). Scale bars: 50 µm. (F) In certain patients, Brachyspira colonisation was restricted to mucus. From left to right: (1) bacteria at a distance from the epithelium, visualised by DNA stain (Hoechst); (2) immunostaining for Brachyspira; (3) merge of images showing Brachyspira (red), mucus (anti-CLCA1, green) and DNA (Hoechst, blue) staining of nuclei and bacteria, demonstrating co-localisation of Brachyspira and DNA staining for bacteria in the outer mucus layer. (4) Brachyspira (red) and other bacteria (blue) could also be observed in the inner mucus layer, as indicated by arrows. Scale bars: 25 µm.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    组织学、免疫组织化学和透射电子显微镜的存在Brachyspira在结肠上皮表面。(一)阿尔新blue-periodic acid-Schiff (PAS)染色显示Brachyspira细菌在顶端膜。比例尺:10µm。(B)代表阿尔新blue-PAS IBS患者没有污点Brachyspira。比例尺:25µm。右边的图片代表从左面板放大部分。(C)透射电子显微图显示Brachyspira附加到上皮表面之间(更短和更少的电子致密)微绒毛。比例尺:1µm。(D)透射电子显微照片从一个病人Brachyspira。比例尺:1µm。(E)部分从三个肠易激综合症患者Brachyspira物种是由蛋白质组学检测,染色Brachyspira抗血清的粘液(红色)和co-stained anti-CLCA1(绿色)。DNA是复染色与赫斯特(蓝色)。酒吧规模:50µm。在某些患者(F),Brachyspira殖民仅限于粘液。从左到右:(1)细菌在距离上皮,呈现由DNA染色(赫斯特);(2)免疫染色Brachyspira;(3)合并的图像显示Brachyspira(红色),粘液(anti-CLCA1、绿色)和DNA(赫斯特、蓝色)核染色和细菌,展示co-localisationBrachyspira对细菌和DNA染色外黏液层。(4)Brachyspira(红色)和其他细菌(蓝色)也可以观察到内黏液层,如箭头所示。规模的酒吧:25µm。

    值得注意的是,六个人与膜相关的常规组织学评估螺旋体病未能识别这种情况在任何病人。进一步研究为什么之间的关联Brachyspira和IBS此前从未被观察到,16 s rDNA的粪便样本进行测序由多个方法(四个螺旋体病诊断患者在线补充数据文件S2);这种方法还未能发现Brachyspira在所有情况下。

    结肠活检证实的有针对性的分析在IBS螺旋体病患病率高

    两种不同的方法对目标实时PCR分析活检材料被用于结合免疫荧光建立螺旋体病患病率在两个组别。12日14在整个研究人口的流行Brachyspira殖民在IBS是31%(19/62例),没有病例发现在31日健康对照组(p < 0.001)。减少假阳性结果的风险,后续分析关注的是案件要么是积极的,或者一直为阴性Brachyspira根据≥2的方法。这些标准被满足80/93(86%)的参与者;50 IBS患者和30名健康个体。这一限制,总体患病率Brachyspira殖民在IBS是28% (14/50;p < 0.001;图3一)。Brachyspira在IBS-D患病率是42%,高度一致的结果两个群体(44%和40%;p = 0.01都比较健康的志愿者;在线补充表S4)。

    Prevalence of intestinal spirochetosis in IBS, and association between species and colonisation pattern. (A) Overall prevalence rates of Brachyspira colonisation in healthy individuals and in different IBS subtypes. (B) Prevalence of membrane-associated spirochetosis. In (A) and (B) data from the entire study population (both cohorts) are shown; these are based on agreement between at least two independent diagnostic methods. Membrane-associated spirochetosis was diagnosed by immunohistochemistry, with Brachyspira colonisation confirmed by at least one additional method. Patients with mucus-associated spirochetosis are not included in the analysis in (B). (C) Comparison of the distribution of Brachyspira species among patients with membrane-associated and mucus-associated spirochetosis. Groups were compared by Fisher’s exact test: *p≤0.05 **p≤0.01 ***p≤0.001. IBS-C, IBS with constipation; IBS-D, IBS with diarrhoea; IBS-M, IBS with mixed bowel habits; IBS-U,unsubtyped IBS without diarrhoea or constipation.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
    图3

    在IBS肠道螺旋体病患病率,物种和殖民模式之间的联系。(一)总体患病率Brachyspira在健康个体和IBS不同亚型殖民。(B)膜相关螺旋体病的患病率。在(A)和(B)数据从整个研究人口(群)所示;这些是基于协议至少两个独立的诊断方法。膜相关螺旋体病诊断,免疫组织化学Brachyspira殖民至少证实了一个额外的方法。患者mucus-associated螺旋体病不包括在分析(B), (C)分布的比较Brachyspira物种之间的膜相关患者和mucus-associated螺旋体病。组比较确切概率法:* p≤0.05 * * p≤0.01 * * * p≤0.001。IBS-C, IBS便秘;IBS-D, IBS腹泻;IBS-M IBS与混合排便习惯;IBS-U, unsubtyped IBS腹泻或便秘。

    共有43个IBS患者和27控制已从免疫荧光分析决定性的结果,这可能是由至少一个额外的方法验证。膜相关螺旋体病被发现在21%(9/43)的患者肠易激综合症而不是在任何控制(p = 0.01;图3 b)。膜相关螺旋体病的患病率是IBS-C IBS-D为38%和0% (p = 0.05)。队列和IBS亚型患病率分层的编译在线补充表S4A-D。个人和不同方法的结果相结合Brachyspira识别患者的确诊提供了螺旋体病在线补充表S5。

    不同生态位的偏好,b . aalborgi / hominis和b . pilosicoli

    根据实时PCR的物种歧视,50%的患者螺旋体病被殖民b . pilosicoli;其他人要么b . aalborgi或密切相关的、未经证实的物种b . hominis。12膜相关螺旋体病有关b . aalborgi / hominis在78%的情况下,而b . pilosicoli占83%的识别仅限于粘液(p = 0.04;图3 c),这表明这些物种通常占领不同的细分市场。

    膜相关螺旋体病肠易激综合症患者的临床定义了一个独特的子集

    为临床特点的分析和免疫反应,两个群体被合并。分析仅限于参与者≥2方法一致的结果Brachyspira识别(n = 80)或负面的结果实时PCR没有其他测试执行(n = 3)。肠易激综合症患者的人口分布与没有螺旋体病没有显著差异,总也没有和组件IBS-SSS成绩或直肠敏感性(表2,图4一,在线补充图S3A, B)。7相比之下,光学膜相关螺旋体病症状严重程度分数显著降低(图4一)。8量化腹泻症状,大便得分,代表平均粪便的和频率和布里斯托尔规模一致性,为每个参与者了。膜相关螺旋体病的这个分数高于肠易激综合症患者Brachyspira和控制(p = 0.02和<分别为0.001;图4 b)。单独的凳子比较频率和一致性所示图4 c。Oro-anal交通也加速膜相关螺旋体病与其它肠易激综合症患者相比(p = 0.03;图4 d)。

    Individuals with membrane-associated spirochetosis constitute a clinically distinctive subgroup of patients with IBS. (A) Patient-reported IBS symptom severity according to the IBS Severity Scoring System (IBS-SSS) did not differ between patients with and without spirochetosis. However, Extra-colonic Symptom Scores were lower in membrane-associated spirochetosis (Mann-Whitney U=11.5; p<0.001). (B) Stool scores (summed average stool frequency and average Bristol scale consistency) were higher in membrane-associated spirochetosis than in patients with IBS without Brachyspira, indicating more diarrhoeal symptoms (U=68.0; p=0.02). In (A) and (B) individual observations are overlaid by the median and interquartile range. The significance threshold was adjusted by the Bonferroni method. *p≤0.025, ***p≤0.001. (C) Average stool frequency and consistency for controls and the different patient groups. Results for patients with IBS with diarrhoea (IBS-D) without Brachyspira (n=11) are separately displayed, as well as included in the category of all patients with IBS without spirochetosis. (D) Oro-anal transit times (OATT) for patients with IBS with versus without Brachyspira. OATT were shorter in membrane-associated spirochetosis as compared with IBS without spirochetosis (p=0.05) and patients with IBS without Brachyspira colonisation of the epithelial membrane (p=0.03; Welch-corrected t=2.3). For (C) and (D) bars represent the mean and error bars the SE of the mean (SEM); groups were compared by unpaired Welch’s t-tests. For all analyses of clinical characteristics, the two study cohorts were merged. The analysis was restricted to participants where Brachyspira colonisation could be confirmed or rejected by at least two independent methods or cases where real-time PCR was negative for Brachyspira with no conclusive results from other methods.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
    图4

    个人与膜相关螺旋体病构成IBS患者临床独特的子群。(A) Patient-reported IBS症状严重程度根据肠易激综合症的严重程度评分系统(IBS-SSS)患者没有差异,没有螺旋体病。然而,Extra-colonic膜相关螺旋体病症状评分较低(Mann-Whitney U = 11.5;p < 0.001)。(B)粪便分数(总结平均粪便频率和平均布里斯托尔规模之间的一致性的)在膜相关螺旋体病是高于肠易激综合症患者Brachyspira,显示更多的腹泻症状(U = 68.0;p = 0.02)。在(A)和(B)个人观察由中间值和四分位范围覆盖。意义阈值是由Bonferroni调整的方法。* * * * p≤0.025, p≤0.001。(C)平均粪便频率和一致性控制,不同的患者群体。结果肠易激综合症患者腹泻(IBS-D)Brachyspira(n = 11)分别显示,以及包含在所有的类别没有螺旋体病,肠易激综合症患者。(D) Oro-anal交通时间(OATT)对IBS患者和没有Brachyspira。OATT在膜相关短螺旋体病与IBS相比没有螺旋体病(p = 0.05)和肠易激综合症患者Brachyspira殖民的上皮膜(p = 0.03;Welch-corrected t = 2.3)。(C)和(D)条代表均值和误差的SE意味着(SEM);组比较未配对韦尔奇的t。对于所有的临床特点分析,两组研究合并。的分析局限于参与者Brachyspira殖民可以证实或拒绝了至少两个独立的方法或实时PCR是负数的情况Brachyspira没有决定性的结果与其他方法。

    把这个表:
    表2

    肠易激综合症患者的人口统计学和临床特点,没有肠道螺旋体病

    Brachyspira殖民与改变与膜相关的分子途径改造和ion-fluid体内平衡

    描绘在螺旋体病症状背后的潜在机制,主机粘液蛋白质组分析(S3在线补充数据文件)。全球增长与细菌粘附和入侵相关的蛋白质,尤其是Arp2/3复杂,观察患者的蛋白质组学Brachyspira识别(图5一个)。此外,炎症mediators-complement因素,inflammasome和immunoproteasome组件,特别是immunoglobulins-were强烈诱导。因此,最丰富的生物通路与抗体介入吞噬作用有关基因本体论(在线补充图S4A)。覆盖与基因和基因组的京都百科全书(KEGG)通路库显示明显的相似之处与肠道感染、志贺氏菌病和沙门氏菌病等(图5 b)。

    Spirochetosis was linked to distinct mucosal responses at the molecular and cellular level. (A) Volcano plot showing host mucus proteome alterations in samples where Brachyspira was detected by metaproteomics (n=6, vs n=18 samples from individuals without Brachyspira). The transformed p values were obtained by Welch’s t-tests. (B) Top five predicted Kyoto Encyclopaedia of Genes and Genomes (KEGG) pathways based on mucus protein enrichment in individuals with metaproteomic Brachyspira identifications. Proteins at least twofold upregulated with a p value <0.10 were included in the analysis. Pathway p values were obtained through a modified version of Fisher’s exact test (EASE score), using DAVID bioinformatics tool. IML, inner mucus layer. (C) Host mucus proteome alterations in samples (n=17) from patients where Brachyspira could be detected by two independent methods (some of whom were negative for Brachyspira in the mass spectrometry analysis). (D) Increased immune cell infiltration of the lamina propria of patients with membrane-associated spirochetosis compared with patients with IBS without Brachyspira (Mann-Whitney U=17.0; p<0.001). The graph shows results from patients with membrane-associated spirochetosis (n=9), mucus-associated spirochetosis (n=5), patients with IBS without Brachyspira (n=21) and healthy volunteers (n=15). (E) Plasma cell counts were increased in spirochetosis (membrane-associated spirochetosis vs IBS without Brachyspira: U=9.0; p<0.001). (F) Plasma cells (black arrows) in an H&E-stained sigmoid colon section from a patient with membrane-associated Brachyspira (white arrows). Scale bar: 25 µm. (G) Mast cell expansion in the lamina propria of patients with spirochetosis (membrane-associated spirochetosis vs IBS without Brachyspira: U=19.5; p<0.001). The graph shows results from 9 patients with IBS with membrane-associated spirochetosis, 3 patients with mucus-associated spirochetosis, 33 patients with IBS without Brachyspira and 15 healthy volunteers. (H) Correlation between subepithelial mast cell numbers and pain (summed pain frequency and intensity scores from the IBS Severity Scoring System questionnaire). The line was fitted using linear regression analysis. Spearman’s rho: 0.63 (95% CI: 0.02 to 0.90). Immune cells were counted in five high-power fields (MAG ×600) in H&E or toluidine blue (mast cells) stained sigmoid colon sections; individual observations are overlaid by the median and IQR. Groups were compared by the Mann-Whitney U test: **p≤0.01, ***p≤0.001. (I) Upstream activation of cytokines in patients with proteomic Brachyspira identifications, predicted from Ingenuity Pathway Analysis of the host mucus proteome. Data were analysed through the use of IPA (Qiagen, https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis). Minimum twofold upregulated proteins with a p value <0.15 were included in the analysis. P values for cytokine prediction were obtained by Fisher’s exact test. CEACAMs, carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule; IC, immune cell; PC, plasma cell.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5
    图5

    螺旋体病与不同的粘膜反应在分子和细胞水平。(A)火山情节显示主机粘液蛋白质组改变样品的地方Brachyspira被宏蛋白质组学检测(n = 6,与n = 18个样本个体没有Brachyspira)。转换后的p值通过韦尔奇的t。(B)基因和基因组的五大预言京都百科全书(KEGG)途径基于粘液蛋白浓缩与metaproteomic个人Brachyspira识别。至少两个调节蛋白质与p值< 0.10包括在分析中。路径p值是通过一个修改版的确切概率法(缓解分数),大卫使用生物信息学工具。安恩科技内黏液层。(C)主机粘液蛋白质组改变样品(n = 17)从病人Brachyspira可以检测到两个独立的方法(其中一些人是负面的Brachyspira在质谱分析)。(D)的免疫细胞浸润增加患者的固有层膜相关螺旋体病与肠易激综合症患者Brachyspira(Mann-Whitney U = 17.0;p < 0.001)。图显示的结果患者膜相关螺旋体病(n = 9), mucus-associated螺旋体病(n = 5),肠易激综合症患者Brachyspira(n = 21)和健康志愿者(n = 15)。(E)浆细胞计数增加螺旋体病(膜相关螺旋体病和肠易激综合症Brachyspira:U = 9.0;p < 0.001)。(F)浆细胞(黑色箭头)H&E-stained乙状结肠部分患者膜相关Brachyspira(白色箭头)。比例尺:25µm。(G)的固有层柱状细胞扩张螺旋体病(膜相关螺旋体病和肠易激综合症患者Brachyspira:U = 19.5;p < 0.001)。图表显示的结果从9与膜相关螺旋体病肠易激综合症患者,患者3 mucus-associated螺旋体病,肠易激综合症患者33Brachyspira和15名健康志愿者。(H)牙龈肥大细胞数量之间的相关性和疼痛(总结疼痛频率和强度从IBS严重性评分系统问卷得分)。这条线是使用线性回归分析。斯皮尔曼的ρ:0.63(95%置信区间CI: 0.02 - 0.90)。免疫细胞数在5大功率领域(MAG×600))或甲苯胺蓝(肥大细胞)彩色乙状结肠部分;各个观测值和差的覆盖。Mann-Whitney U组比较的测试:* * * * * p≤0.01, p≤0.001。(我)上游激活患者细胞因子的蛋白质组Brachyspira识别,预测从独创性通路主机粘液蛋白质组的分析。数据分析通过使用异丙醇(试剂盒,https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis)。最低两个调节蛋白质与p值< 0.15包括在分析中。细胞因子P值预测被确切概率法获得。CEACAMs,癌胚antigen-related细胞粘附分子;集成电路,免疫细胞;电脑,浆细胞。

    其他明显的特异表达蛋白质与鸟苷酸环化酶/ cGMP (guanylin,在线补充图S4B)和生长抑素(SST PCSK1N;在线补充图自己)信号,以及丙酮醛解毒(GLO1 PARK7;在线补充图S4D)。Guanylin是鸟苷cyclase-C的内源性配体(GC-C),也被称为热稳定肠毒素受体。16GC-C信号变弱,而生长激素抑制素促进流体再吸收。17甲基乙二醛是一种微小的人类糖酵解的副产品,以及有毒代谢物的几个肠道细菌物种。18而guanylin和相关蛋白质甲基乙二醛毒性在螺旋体病增加,生长激素抑制素水平降低(在线补充图S4B-D)。

    患者的蛋白质组学Brachyspira标识,表明致密膜殖民化,glycocalyx desmosomal蛋白质减少,表明多级粘膜屏障削弱(图5一个)。膜改造不太引人注目的迹象个人没有,或片状,上皮殖民(图5 c,在线补充图S4E)。相比之下,炎症介质根据殖民模式没有显著差异。

    螺旋体病与轻度粘膜炎症和肥大细胞激活

    组织学显示适度增加固有层免疫细胞(p < 0.001),特别是浆细胞(p < 0.001),与IBS相比,膜相关螺旋体病Brachyspira(图5 d-f)。上皮内/牙龈嗜酸性粒细胞也增强(p = 0.002;在线补充图S5A, B)。全部结果的微分计算粘膜免疫细胞提供了在线补充表S6A B。

    引人注目的是,总激活肥大细胞在IBS患者更丰富Brachyspira基于甲苯胺蓝染色(图5克,在线补充图S5C, D)。牙龈肥大细胞计数与腹痛螺旋体病(密切相关图5 h,在线补充图S5E),但不是在IBS患者Brachyspira。在蛋白质组学分析、蛋白质肥大细胞类胰蛋白酶chymase和/或beta-hexosaminidase更普遍的粘液螺旋体病的患者(p = 0.09),而酶参与组胺代谢更丰富(p = 0.04与IBS患者没有进行比较Brachyspira;在线补充图S5F,S3在线补充数据文件)。基于整体粘液蛋白质组的改变,细胞因子CD40LG,使用IL13上游和IL4被预测为主要监管机构(图5我)。综上所述,我们的观察表明,免疫反应Brachyspira感染Th2-driven为主。

    Brachyspira殖民与粘液屏障失败和地下室由其他细菌入侵

    粘液的主要成分时,MUC2粘蛋白,倾向于更丰富的螺旋体病,密不透风的粘液减少的厚度(图6,在线补充图S6A)。此外,细菌入侵的地窖和杯状细胞是偶尔发现(图6 b, C,在线补充图S6B-D)。这些观察结果不匹配Brachyspira染色(在线补充图S6E)。相反,至少一些入侵的细菌革兰氏阳性,这是验证通过染色anti-lipoteichoic酸(图6 c, D)。

    Brachyspira colonisation was associated with mucus barrier failure. (A) Impenetrable mucus thickness tended to be reduced in patients with spirochetosis (p=0.11; Mann-Whitney U test). Toluidine blue (B) and Gram (C) staining of sigmoid colon sections from patients with spirochetosis showed bacterial invasion of crypt lumina and goblet cells. Some of the invading bacteria appeared Gram positive. Scale bars: 10 µm. (D) Section from a patient with spirochetosis stained with anti-lipoteichoic acid (green) and counterstained for DNA with Hoechst (blue), showing Gram-positive bacteria inside crypts. Scale bar: 25 µm.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图6
    图6

    Brachyspira殖民与粘液屏障失败。(A)令人费解的粘液厚度往往是减少患者的螺旋体病(p = 0.11;Mann-Whitney U测试)。甲苯胺蓝(B)和克(C)染色螺旋体病患者乙状结肠部分显示细菌入侵地穴腔,杯状细胞。一些入侵的细菌革兰氏阳性出现。规模的酒吧:10µm。(D)部分患者螺旋体病沾anti-lipoteichoic酸(绿色)和复染色的DNA与赫斯特(蓝色),显示隐窝内革兰氏阳性细菌。比例尺:25µm。

    抗生素治疗Brachyspira有关肠易激综合症可能与部分临床改善随着时间的推移

    基于当前的建议,四膜相关螺旋体病的患者接受了甲硝哒唑治疗(在线补充表S7)。13虽然最初的反应是变量,3例患者可能列为长期反应者,以减少总体IBS-SSS分数> 50分1年治疗后(图7 a, B)。7特别是,疼痛、腹胀和肠易激综合症干扰的生活质量降低(图7 c,在线补充图S7A, B)。排便习惯不满和粪便一致性并没有决定性地改善(在线补充图S7C, D)。然而,在两个反应,大便频率明显减少了后处理,而第三应答器正常频率在基线(图7 d,在线补充图S7E)。

    Three in four patients with spirochetosis experienced partial clinical improvement following antibiotic treatment. (A) Three patients had a sustained clinical response, defined as a reduction of their overall scores from the IBS Severity Scoring System (IBS-SSS) of at least 50 points, after 15 months. (B) Overall IBS-SSS scores at baseline and at 1, 6 and 15 months post-treatment. (C) Summed IBS-SSS pain frequency and intensity values at baseline and at 15 months post-treatment. (D) Violin plot of stool frequency at baseline and 1 year post-treatment. The midline represents the median and the upper and lower lines the interquartile range (25th and 75th percentile). Time points were compared through a two-way analysis of variance, with the horizontal bar on top referring to the overall comparison of stool frequency before and after treatment (F=7.0; p=0.01). Subsequent intraindividual comparisons were performed by Mann-Whitney U tests, with an adjusted significance threshold of 0.0125.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图7
    图7

    四分之三的患者螺旋体病经验的局部抗生素治疗后临床改善。(A) 3例患者有持续的临床反应,定义为减少他们的整体成绩的IBS严重性评分系统(IBS-SSS)至少50分,后15个月。(B)整体IBS-SSS分数在基线和1 6和15个月治疗。(C)总结IBS-SSS疼痛频率和强度值在基线和治疗后的15个月。(D)小提琴的大便频率在基线和治疗后的1年。中线代表了上下线中间值和四分位范围(第25和第75百分位)。时间点通过双向方差分析比较,在单杠上指大便频率的总体比较治疗前后(F = 7.0;p = 0.01)。随后的个体内的比较由Mann-Whitney U测试,调整的意义阈值为0.0125。

    螺旋菌搬迁到隐窝和杯状细胞的抗生素

    在所有四个情况下,AB-PAS染色的组织部分的间隙Brachyspira从上皮6周治疗后(图8)。结肠活检和粪便样本的实时PCR证实大幅减少Brachyspira(在线补充表S8A, B)。

    Invasion of spirochetes into crypts and goblet cells post-treatment. (A) Alcian blue-periodic acid-Schiff stain of (from left to right) patients 1–4 before and 6 weeks after the completion of treatment. Staining with Brachyspira antiserum (red) revealed a persistent, faint/patchy staining of the apical membrane after treatment in the non-responder ((B), patient 4) and in patient 1 (C). Furthermore, Brachyspira (red) was observed in crypt lumina and goblet cells in all cases, as shown for patients 1 (C), 2 (D), 3 (E) and 4 (see online supplemental figure S8). (F) Brachyspira (red) co-localised with anti-MUC2 staining (green) inside goblet cells. The figure shows images of the same area that were obtained from adjacent sections, manually fitted and superimposed. (G) Brachyspira (red) penetrating into the crypt base. In all immunofluorescent images, nucleic acids were counterstained with Hoechst (blue). Scale bars in (F) are 10 µm, all other scale bars 25 µm. (H) There was a reduction of subepithelial/intraepithelial eosinophils post-treatment in all cases.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图8
    图8

    入侵螺旋体隐窝和治疗后的杯状细胞。(A)阿尔新blue-periodic acid-Schiff染色(从左到右)患者治疗前和治疗结束后6周1 - 4。染色与Brachyspira抗血清(红色)显示一个持久、模糊/片状染色的顶端膜治疗后的人(病人(B), 4) 1 (C)和耐心。此外,Brachyspira(红色)在地下室腔,杯状细胞在所有情况下,如图所示为病人1 (C), 2 (D), 3 (E)和4(见在线补充图S8)。(F)Brachyspira(红色)与anti-MUC2 co-localised杯状细胞内染色(绿色)。图中显示图像的同一地区获得相邻部分,手动安装和叠加。(G)Brachyspira(红色)渗透到地下基地。在所有immunofluorescent图像、核酸与赫斯特复染色(蓝色)。规模的酒吧(F) 10µm,所有其他酒吧25µm规模。(H)有一个减少牙龈上皮内嗜酸性粒细胞/后处理在所有情况下。

    然而,免疫染色的结果Brachyspira在活检获得6周post-metronidazole并不令人鼓舞。虽然从表面上皮螺旋体基本上都消失了,Brachyspira入侵的地窖和杯状细胞粘液颗粒在所有4名患者(图8 b-g,在线补充图S8A)。革兰氏染色法没有说明相似的革兰氏阳性细菌后处理(搬迁在线补充图S8B),这表明一个特定的而不是一般的反应。

    而整体粘膜免疫细胞治疗后数保持不变,减少浆细胞,肥大细胞和嗜酸性粒细胞计数(在线补充图S8C-F,图8 h)。综上所述,细胞成分出现偏离一个Th2-like Th1-like模式可能反映了Brachyspira转移到一个细胞内的生活方式。

    讨论

    肠胃炎发作后肠易激综合症的发病率的上升表明微生物扰动作为一个潜在因素。1然而,对IBS粪便微生物群的研究没有证明可再生的变化。2在这个调查,可能致病Brachyspira物种被确定在结肠粘膜肠易激综合症患者的31%但不健康的人。Brachyspira依附于上皮刷状缘是观察到每一个第五IBS患者和腹泻,加速oro-anal过境、轻度粘膜炎症和肥大细胞激活。因此,Brachyspira殖民定义了一个相当大的和独特的子群的IBS患者可能对抗生素治疗。然而,灭滴灵治疗矛盾导致螺旋菌入侵隐窝和杯状细胞。因此,我们的观察表明角色Brachyspira在IBS-D发病机理还敦促谨慎关于抗生素治疗肠易激综合症。

    而Brachyspira物种在兽医的病原体,人类报告螺旋体病和症状之间的关系是矛盾的。15个月19号变量,频繁的部分,对治疗的反应有了争议。13 15 20潜在的人类病原Brachyspira文化物种是出了名的困难。因此,通常依赖于组织学诊断,垂直的附件Brachyspira顶端膜可能表现为一种独特的“边缘”。14日15月19 - 21日24报道肠道螺旋体病的患病率从0.5%到3%不等的工业化国家。13日15研讨会在这里,基于结果从两个独立的潜在群体,Brachyspira观察接触患者20% - -40%的上皮IBS-D但不是主要便秘患者或健康人群。

    虽然之前的出版物提出了IBS和肠道螺旋体病之间的联系,这是第一次报告的患病率增加Brachyspira肠易激综合症的殖民化。21IBS-D患者常规进行纸张——/结肠镜检查和组织学。此外,16 s rDNA测序的粪便样本已经完成几项大规模研究。2 3因此,它可能会奇怪,这种联系应该未被发现。这里相反,最初的观察是通过无偏metaproteomic粘液样本的分析,证实了免疫染色和有针对性的PCR分析。相比之下,常规组织学和粪便16 s rDNA测序检测失败Brachyspira在这些病人。标准16 s扩增子测序识别的能力Brachyspira物种最近受到引物不相容。25这强调了创新的重要性和互补的方法来识别小说肠道微生物群和人类疾病之间的关联。

    的影响Brachyspira附件的上皮和底层组织传统上被认为是最小的。15日24这里,深入分析宿主粘膜炎症介质反应揭示了一个惊人的增长,与膜相关的蛋白质改造。公正的功能注释分析映射这些改变通路与细菌粘附和吞噬作用有关,检测机械相似肠道感染沙门氏菌和志贺氏菌病等。组织学证实温和但独特的炎症反应,与扩张的浆细胞、嗜酸性粒细胞和肥大细胞。细胞组成,细胞因子与上游预测基于蛋白质组学分析,表明,炎症可能Th2-driven为主。还需要进一步的研究来建立一个因果关系螺旋体病和伴随的粘膜炎症。尽管如此,我们的观察Brachyspira作为一个潜在的人类病原体,而不是仅仅是一个无害的共生体。

    腹泻时曾被与螺旋体病有关,尚未探索的关连。15日19主机响应分析的基础上,确定了实现协同几个分子变化可能引起腹泻。首先,改造的顶端膜可能会减少可用的表面流体再吸收。第二,明显增加粘液丰富的guanylin膜相关螺旋体病。Guanylin顶端GC-C受体的配体,也是热稳定的目标大肠杆菌肠毒素。16GC-C信号变弱吸收的钠NHE3 (SLC9A3)氯化和促进分泌囊性纤维化跨膜电导调节(雌性生殖道),导致受损的液体吸收。16因此,激活突变GC-C IBS-D的是一种罕见的原因。16此外,内生GC-C信号诱导某些肠道感染,可能导致病原体的清除。26另一个潜在的引起的腹泻可能降低生长激素抑制素信号,所显示蛋白质组学分析。生长激素抑制素促进肠道液体吸收,可能通过NHE8 (SLC9A8),和用于治疗难治性腹泻。17Somatostatin-producing细胞非常容易幽门螺杆菌有关的炎症和可能可以想象也是特别受到螺旋体病的影响。最后,从激活肥大细胞组胺分泌可能促进secretomotor腹泻。27总之,本研究确定了一些机械的线索螺旋体病之间的关系和IBS-D,支持这个意想不到的生物相关性的观察。

    抗生素治疗的患者螺旋体病与缓解腹痛,腹胀,暗示Brachyspira可能导致IBS症状腹泻。肥大细胞激活曾与IBS-related腹痛,尽管报告是相互矛盾的。28 29在这项研究中,粘膜肥大细胞计数是选择性地增加Brachyspira有关肠易激综合症和关联与腹痛患者得分螺旋体病但不是在肠易激综合症Brachyspira。因此,有争议的肥大细胞和肠易激综合症症状之间的联系可能会在一定程度上取决于Brachyspira殖民统治的地位。

    螺旋体病与粘液屏障失败,减少glycocalyx组件和零星的墓穴被其他属入侵。此外,有迹象显示增强粘膜反应细菌代谢物丙酮醛可能不会产生的Brachyspira。甲基乙二醛与内脏过敏,例如,通过伤害感受器离子通道TRPA1的感应。18 30因此,不适当的主机与共生的微生物群可以加重症状患者的螺旋体病,可能部分解释临床情况的变化。

    几项研究已经报道的积极影响non-absorbable抗生素在IBS患者的一个子集。2 31在我们的调查中,四分之三的螺旋体病的患者经历了部分,但持续、灭滴灵治疗后症状缓解。响应与改进的目标参数,如大便频率和肥大细胞数量。结果从这个小规模的、非盲干预显然必须小心解释。的影响Brachyspira根除在IBS有望成为未来的话题,适当的动力,安慰剂对照试验。

    我们的观察初步表明,分层与螺旋体病的IBS患者抗生素治疗可能导致提高响应率。尽管如此,有明显的警告,包括兽医报告的增长阻力问题。32在这项研究中,治疗必须停止由于螺旋菌搬迁到杯状细胞。有关,Brachyspira在地下基地抗生素也被检测到,可能直接影响干细胞水库。因此,除了抗生素治疗策略可能被认为是治疗IBS-associated螺旋体病。这些可能包括短期泻药治疗,铋碱式水杨酸盐或益生菌和益生元,单独使用或作为佐剂对抗生素。

    而细菌入侵的杯状细胞粘液颗粒抗生素是一种新的现象,这部分让人想起杯状细胞相关抗原段落(差距)。33在老鼠身上,差距调节的活细菌易位结肠上皮细胞失调,例如在灭滴灵治疗。33然而,时间流逝,因为抗生素治疗和大规模的Brachyspira搬迁,而支持一个改编的螺旋体。因此,某些Brachyspira大概有一个取向殖民粘液granules-a特征,可能是青睐的抗生素治疗。尽管甲硝哒唑容易扩散进入细胞,密集颗粒内容可能会限制其访问Brachyspira。未来的研究应该调查抗生素是否促进类似的适应性在其他致病或共生的细菌物种。

    这项研究有一些局限性。次优的活检标本和技术故障导致一小部分缺失数据对某些方法,虽然没有参与者类别之间的系统性偏差。最重要的是,这项研究的观察自然不允许我们建立一个因果关系Brachyspira和肠易激综合症的症状。其他悬而未决的问题关注的潜在贡献流行病学因素Brachyspiracolonisation-including抗生素治疗,这可能是更频繁的在IBS患者和感染后肠易激综合症的风险增加有关。1的确切分子机制Brachyspira宿主相互作用还需要进一步调查。然而,随着肠道螺旋体病,主要物种b . aalborgi文化和感染是异常困难的,只有灵长类动物,缺乏实验模型来解决这个问题。14日24因此,有重大挑战克服为了充分说明的作用Brachyspira在IBS-D发病机理。

    总之,我们报告一个小说,强烈的关联Brachyspira属和肠易激综合症。基于两个独立的结果未来的军团,粘膜Brachyspira殖民中观察到40%的患者IBS-D但不健康的人。Brachyspira有关肠易激综合症与独特的临床,组织学和分子特征,表明它应该被视为一个单独的诊断实体。因此,Brachyspira根除治疗可能产生实质性的影响总体IBS发病的负担。然而,螺旋体的侵袭性增加后处理敦促谨慎关于抗生素治疗肠易激综合症。引人注目的是,杯状细胞粘液颗粒的入侵可能代表小说抗生素细菌的生存策略,这可能会对其他轴承复发和慢性感染的粘膜表面。

    数据可用性声明

    所有数据都包含在相关研究文章或作为补充信息上传。

    伦理语句

    伦理批准

    这项研究是由哥德堡伦理审查委员会批准。

    确认

    作者要感谢格尼拉女士Naslin(卡大学医院胃肠病学和肝脏病学,哥德堡)的援助与样本收集和管理病人的随访。博士Liisa Arike(哥德堡大学医学生物化学部门)是感激地承认她的援助与质谱分析。我们还要感谢博士瓦伦蒂娜Tremaroli(哥德堡大学分子与临床医学)请提供时间和专业知识来帮助我们16 s rDNA测序分析。佬司Engstrand教授(斯德哥尔摩卡罗林斯卡医学院微生物系)被公认的慷慨的条款Brachyspira抗血清。作者感谢细胞成像中心(CCI)哥德堡大学的帮助电子显微镜的样品制备和Histocenter,哥德堡,援助与组织学部分的准备。

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    补充材料

    脚注

    • 女士,我们为了共同的高级作者。

    • 贡献者科、女士和我们最初的想法怀孕的;科、BD、勒、CW AE和AJ执行实验过程和数据分析;HT和监督主体女士报名;勒科,HT和临床资料分析,女士科起草了输入从所有作者的手稿。

    • 资金这项工作得到了国家过敏症和传染病研究所(U01AI095473),克努特和爱丽丝•瓦伦堡基金会欧洲研究委员会(ERC),瑞典研究理事会,阿发保险,IngaBritt Arne Lundberg基金会,卡大学医院(ALF),威廉和玛蒂娜·朗格基金会Adlerbert研究基金会。投资者没有参与决定发表;并没有参与这项研究的设计和执行,或准备的手稿。

    • 免责声明内容是完全的责任作者,不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。

    • 相互竞争的利益女士已经收到达能纽迪希亚无限制的研究资助研究和显示出医药、担任顾问/顾问委员会成员阿斯利康、达能、雀巢、Almirall,爱力根,天鹅座β,Glycom,夏尔,Tillotts作为一个演讲者,Menarini,武田,夏尔,爱力根,Almirall。

    • 出处和同行评议不是委托;外部同行评议。

    • 补充材料此内容已由作者(年代)。尚未审查由BMJ出版集团有限公司(BMJ)和可能没有被同行评议。任何意见或建议讨论仅代表作者(年代)和不了BMJ的支持。和责任起源于BMJ概不负责任何依赖的内容。内容包括任何翻译材料,BMJ并不保证翻译的准确性和可靠性(包括但不限于当地法规、临床指南,术语,药物名称和药物剂量),和不负责任何错误或遗漏引起的翻译和改编或否则。

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