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结肠
原始研究
角鲨烯环氧氧化酶驱动癌细胞增殖，促进肠道生态失调，加速结直肠癌的发生
  1. Chuangen李1，
  2. 勇王2，
  3. Dabin刘1，
  4. 黄志春1，
  5. Olabisi Oluwabukola Coker1，
  6. 张翔1，
  7. 长安刘1，
  8. 云飞周1，
  9. 心直口快的刘1，
  10. 魏康3.，
  11. 嘉辉图3.，
  12. 宋振英4，
  13. 6月于1
  1. 1香港中文大学深圳研究院李嘉诚健康科学研究所消化疾病研究所、消化疾病国家重点实验室药物及治疗学系，香港中文大学，香港特别行政区,中国
  2. 2基础医学院实验动物科学系“，，陆军医科大学，重庆,中国
  3. 3.转化肿瘤学国家重点实验室解剖与细胞病理学研究室，香港中文大学，香港特别行政区,中国
  4. 4李光前医学院，南洋理工大学、新加坡
  1. 对应到于俊博士，香港中文大学医学及治疗学系，香港，香港;junyu在{}cuhk.edu.hk

摘要

客观的脂代谢异常是结直肠癌(CRC)的一个标志。角鲨烯环氧化酶(Squalene epoxidase, SQLE)是胆固醇生物合成中的限速酶，在CRC中表达上调。在这里，我们的目的是确定SQLE的致癌功能及其与肠道微生物群在促进结直肠肿瘤发生中的相互作用。

设计分析了来自两个队列的相邻正常组织和CRC配对(n=202)。通过将Rosa26-lsl-Sqle小鼠杂交到Cdx2-Cre小鼠，获得结肠特异性的Sqle转基因小鼠(Sqle tg)。收集粪便进行宏基因组学和代谢组学分析。

结果在结直肠癌中，SQLE信使RNA和蛋白表达上调(p<0.01)，预示结直肠癌患者生存较差。SQLE通过诱导细胞周期进程和抑制细胞凋亡促进CRC细胞增殖。在氮氧甲烷诱导的CRC模型中，与野生型小鼠相比，Sqle tg小鼠的肿瘤发生增加(p<0.01)。整合宏基因组学和代谢组学分析揭示了富含致病菌的Sqle tg小鼠肠道生态失调，这与次生胆汁酸增加有关。与次生胆汁酸的有害影响一致，Sqle tg小鼠的肠道屏障功能受损，紧密连接蛋白Jam-c和occludin减少。将Sqle tg小鼠粪便移植到无菌小鼠，与对照组小鼠粪便相比，肠道屏障功能受损，细胞增殖受到刺激。最后，我们证明了特比萘芬(一种SQLE抑制剂)可以通过与奥沙利铂和5-氟尿嘧啶协同作用来抑制结直肠癌的生长，从而被重新用于结直肠癌。

结论本研究表明，SQLE通过细胞内在效应和肠道微生物-代谢物轴的调节介导肿瘤发生。SQLE是结直肠癌的治疗靶点和预后标志物。

  • 结肠直肠癌
  • 结直肠肿瘤
  • 结肠微生物区系

数据可用性声明

应合理要求提供数据。所有数据均可根据要求从通讯作者处获得。

http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/

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http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl-2021-325851

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    本研究的意义

    关于这个问题我们已经知道了什么?

    • 脂质代谢异常是结直肠癌(CRC)的一个标志。

    • CRC中胆固醇代谢经常上调，但其功能及其与肠道微生物群的潜在相互作用仍不清楚。

    新的发现是什么?

    • 角鲨烯环氧化酶(SQLE)在CRC中过表达，高表达预示着较差的生存率。

    • 结肠靶向Sqle转基因基因在小鼠中的表达促进偶氮甲烷诱导的结直肠癌的发生。

    • 综合宏基因组学和代谢组学分析表明，结肠特异性Sqle转基因小鼠具有失调的微生物组与丰富的致病菌，这与增加次生胆汁酸的产生有关。

    • 紧连接蛋白Jam-c和occludin被抑制的Sqle转基因小鼠肠道屏障功能被破坏。

    • 将转基因Sqle小鼠粪便移植到无菌小鼠体内可促进结肠细胞增殖和肠道屏障破坏。

    • 在体内和体外，SQLE抑制剂特比萘芬与化疗协同抑制结直肠癌生长。

    在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?

    • 靶向sql -肠道微生物组轴是CRC预防和治疗的潜在策略。

    简介

    结直肠癌(CRC)是世界上第三大常见癌症，在癌症死亡率方面排名第二。儿童结直肠癌的发病率和死亡率在年轻人中仍在增加，特别是在低收入和中等收入国家。晚期结直肠癌伴转移患者预后较差，耐药严重降低了化疗的疗效。因此，识别CRC发病机制中的新基因以开发有效的治疗方法是非常重要的，无论是单独治疗还是联合化疗。

    异常的脂质代谢越来越被认为是许多癌症的标志特征，包括CRC。肥胖和血脂都是结直肠癌的危险因素。1 2流行病学研究还表明，膳食脂肪摄入过多会增加结直肠癌的风险。3.脂质积累通过增加活性氧和MAPK信号通路促进CRC。4脂肪酸,5个6胆固醇7 8还有胆汁酸9与结直肠癌的发病机制有关。然而，涉及CRC的脂质代谢依赖的分子机制仍然知之甚少。

    角鲨烯环氧化酶(SQLE)是胆固醇生物合成中的限速酶。最近的研究表明，SQLE在CRC中过度表达8 10 11；然而，SQLE在CRC起始和进展中的潜在作用仍存在争议。SQLE可能是促进细胞生长的致癌因子，10而6月等8表明降低SQLE可加速CRC转移。在这项研究中，我们证明了在多个CRC队列中，与邻近正常组织相比，结直肠癌中的SQLE上调，并预测了较差的患者生存率。

    为了全面解读SQLE在结直肠癌中的作用，我们首先建立了结肠特异性的SQLE转基因(tg)小鼠和SQLE敲除(KO)小鼠，并在体内证实了SQLE作为癌基因在结直肠癌中的作用。我们发现，结肠特异性的SQLE过表达促进肠道生态失调和代谢改变，从而导致肠道屏障受损和诱导结肠细胞增殖。最后，我们展示了特比萘芬，一种美国食品和药物管理局(FDA)批准的SQLE抑制剂，与5-氟尿嘧啶(5-FU)或奥沙利铂协同作用，在体外和体内抑制CRC细胞的生长。这些结果表明，在结直肠癌中，SQLE是一个可靶向的致癌因子。

    材料与方法

    人类CRC样本

    在北京大学肿瘤医院接受手术时，收集组织学证实结直肠癌的患者样本(香港队列)(n=144)。肿瘤和邻近的正常组织都立即被快速冷冻在液氮中。患者特征总结于在线补充表S1．另外一个组织微阵列(TMA)队列包括207例在香港威尔士亲王医院接受手术的CRC患者。患者特征总结于在线补充表S2．使用一个公开的队列(GSE17538)进行验证，包括232名CRC患者(在线补充表S3)．癌症基因组图谱(TCGA)队列数据集从UCSC Xena浏览器(https://xenabrowser.net/)，与50对相邻的正常和肿瘤样本进行rna测序。GDS4382由17对相邻的正常和肿瘤样本组成，由Affymetrix人类基因组U133 Plus 2.0阵列分析(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/GDSbrowser?acc=GDS4382)．

    结肠特异性Sqle转基因小鼠模型

    Sqle tg小鼠(Rosa26-pCAG-loxp-stop-loxp-SQLE)是我们之前建立的。12为了促进SQLE的结肠特异性表达，将SQLE tg小鼠与Cdx2-Cre杂交ERT2老鼠。为了激活SQLE过表达，首先在6周龄的SQLE tg小鼠腹腔注射他莫昔芬(100 mg/kg，腹腔注射)，每日4次，以激活CreERT2．为了诱导Sqle tg小鼠结直肠癌的发生，我们采用化学诱导的CRC模型。简而言之，氮氧甲烷(AOM, 10 mg/kg，腹腔内)给药小鼠6次，每周1次。第一次注射AOM后24周处死小鼠。记录肿瘤的数量和大小。所有组织立即储存在10%福尔马林或−80°C的冰箱中。组织学评分后，H&E染色由病理学家盲目的样本性质。

    基因敲除小鼠模型

    采用CRISPR/Cas9技术生成全体Sqle KO小鼠。杂合子Sqle KO小鼠(Sqle+ /−由于纯合子KO小鼠无法存活，故采用aom -右旋糖酐硫酸钠(DSS)模型。为了诱导CRC, Sqle+ /−野生型小鼠在6周龄时腹腔注射AOM 1次(10 mg/kg，腹腔注射)。注射AOM后1周，给予DSS处理3个周期(饮用水中加入2%，持续5天)，每个周期之间休息2周。第一次注射AOM后80天处死小鼠。测量了肿瘤的数量和大小。所有组织立即储存在10%福尔马林或−80°C的冰箱中。

    异种移植模型

    SW1116和LOVO细胞表达空载体或SQLE质粒(1×1074周龄Balb/c裸鼠左背皮下注射0.1 mL PBS细胞。用数字卡尺测量皮下肿瘤大小。4周后，处死小鼠并进行检查。用于药物治疗研究的HT29细胞(1×107在0.1 mL PBS中皮下注射裸鼠背侧细胞。小鼠随机分组，分别接受:(1)空白对照;特比萘芬(80 mg/kg，口服，每日);(3) 5-FU (30 mg/kg，腹腔注射，每周2次);(4)奥沙利铂(10mg /kg，腹腔注射，每周1次);(5)特比萘芬+5- fu和(6)特比萘芬+奥沙利铂。监测肿瘤大小，4周后处死小鼠。

    体内肠通透性试验

    为了测定小鼠体内肠通透性，小鼠饥饿过夜，异硫氰酸荧光素(FITC)-右旋糖酐(Sigma)经口服灌胃(44 mg/100 g体重)。4 h后麻醉小鼠，心脏穿刺采血，处死小鼠。从全血中分离血清，稀释后用荧光分光光度法(BioTek)测定FITC荧光，激发和发射分别为485 nm和528 nm。以连续稀释的fitc -葡聚糖为标准品。

    散弹式宏基因组测序

    从Sqle tg小鼠和野生型同窝小鼠采集粪便，用PowerFecal DNA分离试剂盒提取粪便。使用Nextera XT适配器生成扩增文库，并使用HiSeq Illuminex 2500进行测序，获得每个样品DNA (125 bp)成对端读，深度为10G碱基对。在本研究中，所有粪便宏基因组都使用了相同的注释管道。数据分析采用BWA和SAM工具进行宿主DNA去除和reads质量过滤。13日14在此之后，Kraken2和Bracken使用高质量的reads来获得物种级别的分类学分析。15日16种级细菌的差异丰度用R包DESeq2进行。17调整后p<0.05和log2(倍数变化)>1的细菌种数被认为具有统计学意义。主坐标分析使用R包phyloseq和vegan进行。18

    统计分析

    所有统计检验均使用SPSS (Version 19.0)或GraphPad Software进行。数据以均数±标准差表示。用重复测量方差分析分析细胞活力测定和肿瘤生长速度评价。采用配对双尾学生t检验分析临床特征对两组间SQLE信使RNA (mRNA)表达及比较的影响。用Pearson χ分析临床特征对SQLE蛋白表达的影响2或者费雪精确检验。为了评估SQLE与预后之间的相关性，总生存期(OS)定义为从手术日期到死亡日期的持续时间。采用Kaplan-Meier分析，建立OS曲线。采用Cox比例危险回归分析对OS进行多因素分析。为确定SQLE对OS的显著性，采用log-rank检验。P值<0.05为有统计学意义。

    中提供了其他方法在线补充信息．

    结果

    SQLE在CRC患者中过表达

    我们分析了三个独立CRC队列(香港内部队列、TCGA和GDS4382)中SQLE的mRNA表达。香港队列的临床特征显示在在线补充表S1．通过定量PCR (qPCR)检测，与邻近正常组织相比，原发性CRC中SQLE mRNA高度上调(n=141, p<0.0001) (图1一个)．SQLE mRNA表达与晚期肿瘤、淋巴结、转移分期及远处转移有显著相关性(p<0.05) (p<0.05) (在线补充表S1)．在TCGA中验证其过表达(n=50;p<0.0001)和GDS4382队列(n=17;p < 0.001) (图1一个)．在蛋白水平上，免疫组化(IHC)验证了与邻近正常组织相比，CRC肿瘤中SQLE蛋白的过表达(p<0.01) (图1 b)．因此，在CRC中，SQLE过表达式是一个经常发生的事件。

    Squalene epoxidase (SQLE) is upregulated in colorectal cancer (CRC) and its expression predicts poor survival. (A) SQLE messenger RNA (mRNA) expression was determined in paired tumour and adjacent normal tissues from Hong Kong (HK) cohort (Beijing, n=144), The Cancer Genome Atlas (TCGA) cohort (n=50) and the GDS4382 cohort (n=17). Paired two-tailed Student’s t-test was used to calculate p value. (B) SQLE protein expression was determined in paired tumour and adjacent normal tissues (n=10) by immunohistochemistry (IHC). Paired two-tailed Student’s t-test was used to calculate p value. Scale bars, 50 µm. (C) Kaplan-Meier curve analysis revealed that patients with CRC with high SQLE mRNA has significantly lower 5-year survival as compared with patients with low SQLE mRNA in HK cohort (left). Cox regression analysis (right). (D) SQLE mRNA expression is associated with poor survival by Kaplan-Meier curve (left) and Cox regression analysis (right) in GSE17538 cohort. (E) Tissue microarray (TMA) analysis demonstrated that patients with CRC with high SQLE protein expression have significantly lower 5-year survival, as evidenced by Kaplan-Meier curve (left) and Cox regression analysis (right). Nuclear staining of 10% was used as the cut-off value. *P<0.05; **p<0.01; ***p<0.001. AJCC, The American Joint Committee on Cancer; TNM, tumour, node, metastases.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    角鲨烯环氧化酶(SQLE)在结直肠癌(CRC)中上调，其表达预示着较差的生存率。(A)在配对肿瘤和邻近正常组织中测定了SQLE信使RNA (mRNA)的表达，分别来自香港(HK)队列(北京，n=144)、癌症基因组图谱(TCGA)队列(n=50)和GDS4382队列(n=17)。采用配对双尾Student 's t检验计算p值。(B)通过免疫组化(IHC)检测配对肿瘤和相邻正常组织(n=10)中SQLE蛋白的表达。采用配对双尾Student 's t检验计算p值。比例尺，50µm。(C) Kaplan-Meier曲线分析显示，在HK队列中，与低SQLE mRNA的患者相比，高SQLE mRNA的CRC患者的5年生存率显著降低(左)。Cox回归分析(右)。(D)通过Kaplan-Meier曲线(左)和Cox回归分析(右)，GSE17538队列中SQLE mRNA表达与生存率差相关。(E)组织芯片(TMA)分析显示，高表达SQLE蛋白的CRC患者5年生存率明显较低，Kaplan-Meier曲线(左)和Cox回归分析(右)证明了这一点。 Nuclear staining of 10% was used as the cut-off value. *P<0.05; **p<0.01; ***p<0.001. AJCC, The American Joint Committee on Cancer; TNM, tumour, node, metastases.

    在结直肠癌患者中，SQLE过表达与不良预后相关

    鉴于其在CRC中频繁过表达，我们评估了SQLE在人类CRC中的临床意义。在香港队列中，Kaplan-Meier曲线显示，高SQLE mRNA水平与结直肠癌患者生存率差相关(p<0.05) (图1 c)．多因素Cox比例风险回归分析一致显示，高SQLE mRNA表达是与CRC患者疾病特异性生存差相关的独立预后因素(p<0.05;人力资源1.832;95%置信区间1.113至3.113)(图1 c)．我们验证了GSE17538队列中SQLE mRNA的预后意义(n=232) (在线补充表S3采用Kaplan-Meier曲线(p<0.05)和单变量Cox比例风险回归分析(p<0.05) (图1 d)．

    为了确定SQLE是否在蛋白质水平上预测患者预后，我们对207例CRC病例进行了IHC (图1 e)．对有关SQLE蛋白水平的临床特征进行评估，发现与美国癌症联合委员会分期(p<0.01)、淋巴结转移(p<0.01)和远处转移(p<0.001)有显著相关性(在线补充表S2)，提示SQLE可能参与肿瘤的进展。事实上，通过Kaplan-Meier曲线分析，高SQLE蛋白表达与CRC患者的生存率差相关(p<0.001) (图1 e)，并采用多因素Cox比例风险回归分析(p<0.05;人力资源1.951;95%置信区间1.225至2.391)(图1 e)．我们的数据共同表明，SQLE mRNA和蛋白表达是预测CRC患者生存不良的独立预后因素。

    SQLE促进CRC细胞生长

    为了确定SQLE在人CRC中的致癌作用，我们在CRC细胞LOVO和SW1116中过表达SQLE (图2一个)，且内源性SQLE级别较低(在线补充图S1)．表达SQLE促进细胞生长，两种细胞生长曲线均显示(p<0.01) (图2一个)和菌落形成试验(p<0.01) (图2 b)．相反，我们对CRC细胞HT29和DLD1进行了SQLE敲除(在线补充图S1)，具有较高的内源性SQLE表达式(图2 c)．SQLE短发夹(sh) RNA抑制细胞活力(p<0.01) (图2 c)和菌落形成(p<0.01) (图2 d)与shControl细胞相比。其次，在裸鼠模型上研究了SQLE的致瘤作用。将稳定表达空载体或SQLE的LOVO和SW1116细胞分别皮下注射于裸鼠左右背侧。如图2 e， SQLE过表达显著增加了LOVO (p<0.01)和SW1116 (p<0.01)异种移植瘤体积。SQLE耗竭也抑制了原发性crc衍生类器官的增殖(图2 f)．同时，SQLE促进CRC细胞在体外和体内的生长。

    Squalene epoxidase (SQLE) promotes colorectal cancer (CRC) cell proliferation. (A) SQLE overexpression in LOVO and SW1116 cells promoted cell viability and (B) colony formation. (C) Knockdown of SQLE in HT29 and DLD1 cells significantly suppressed cell viability and (D) colony formation. (E) SQLE promotes tumour growth in vivo. SW1116 and LOVO cells (5×106 cells/tumour) transfected with SQLE or control vector were injected to nude mice aged 4 weeks. Tumour growth was significantly faster in SQLE overexpressing cells as compared with controls. (F) SQLE is overexpressed in two primary CRC organoids, and knockout of SQLE suppressed their growth. The significance of the difference between growth curves was determined by repeated-measures analysis of variance. Difference in colony formation was determined by two-tailed Student’s t-test. *P<0.05; **p<0.01; ***p<0.001; ****p<0.0001. All experiments were conducted 3 times in triplicate.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    角鲨烯环氧化酶(SQLE)促进结直肠癌(CRC)细胞增殖。(A)在LOVO和SW1116细胞中过表达SQLE促进细胞活力和(B)集落形成。(C)在HT29和DLD1细胞中敲低SQLE显著抑制细胞活力和(D)集落形成。(E) SQLE促进体内肿瘤生长。SW1116和LOVO细胞(5×106将转染SQLE或对照载体的细胞/肿瘤)注射到4周龄裸鼠体内。与对照组相比，SQLE过表达细胞的肿瘤生长明显更快。(F) SQLE在两个主要的CRC类器官中过表达，敲除SQLE抑制了它们的生长。通过重复测量方差分析确定生长曲线间差异的显著性。菌落形成的差异由双尾学生t检验确定。* P < 0.05;* * p < 0.01;* * * p < 0.001;* * * * p < 0.0001。所有试验均进行3次，每次重复3次。

    在CRC细胞系中，SQLE抑制细胞凋亡并促进细胞周期进展

    接下来，我们确定了SQLE在CRC细胞系中的细胞动力学效应。通过膜联蛋白V/7-氨基放线菌素D法检测过表达SQLE对LOVO和SW1116细胞凋亡的抑制作用(图3一)．在表达SQLE的SW1116和LOVO细胞中，caspase-3、caspase-7和聚adp -核糖聚合酶(PARP)的裂解(活性)蛋白表达减少进一步证明了SQLE对细胞凋亡的抑制作用(图3 b)．相反，敲低SQLE可促进HT29和DLD1细胞凋亡的诱导(图3 c)，同时cleaved - caspase-3、caspase-7和PARP (图3 d)．我们通过流式细胞仪分析细胞周期分布，发现过表达SQLE的LOVO和SW1116细胞增加了S期细胞的数量，同时G1期细胞数量减少(图3 e)．与这一观察结果一致，SQLE过表达增加了增殖细胞核抗原(PCNA)、周期蛋白D1和CDK4的蛋白表达，但抑制了细胞周期抑制剂p21的表达Cip1p27Kip1p53 (图3 f)．相反，在HT29和DLD1细胞中，下调SQLE可导致G1细胞周期阻滞(图3 g)，表明SQLE加速了G1-S的进展。下调SQLE基因可抑制PCNA、cyclin D1和CDK4，促进细胞周期抑制剂的表达(图3 h)．总的来说，SQLE通过抑制细胞凋亡和激活细胞周期进程来促进CRC的生长。

    Squalene epoxidase (SQLE) suppresses cell apoptosis and promotes cell cycle progression in colorectal cancer (CRC) cells. (A) SQLE overexpression suppressed apoptosis in LOVO and SW1116 cells, as determined by annexin V/7-aminoactinomycin D (7-AAD) staining and flow cytometry analysis. (B) Western blot analysis indicated that SQLE overexpression suppressed the expression of cleaved PARP, caspase-3 and caspase-7. (C) Knockdown of SQLE in HT29 and DLD1 cells induced apoptosis by the annexin V/7-AAD assay. (D) SQLE knockdown increased cleaved PARP, caspase-3 and caspase-7 expression. (E) SQLE overexpression in LOVO and SW1116 cells led to a decrease of G0/G1 phase cell population concomitant with an increase of S phase cell population, as assessed by propidium iodide (PI) staining and flow cytometry. (F) SQLE overexpression enhanced the expression of PCNA, cyclin D1 and CDK4 that promotes G1 phase progression, while suppressing the expression of G1 gatekeepers p21Cip1, p27Kip1 and p53. (G) SQLE knockdown in HT29 and DLD1 cells led to accumulation of cells in G0/G1 phase with decreased S phase cell population. (H) SQLE silencing inhibited PCNA, cyclin D1 and CDK4, while inducing p21Cip1, p27Kip1 and p53 expression. The difference between two groups was determined by two-tailed Student’s t-test. *P<0.05; **p<0.01. All experiments were conducted 3 times in triplicate.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
    图3

    角鲨烯环氧化酶(SQLE)在结直肠癌(CRC)细胞中抑制细胞凋亡并促进细胞周期进展。(A)通过膜联蛋白V/7-氨基放线菌素D (7-AAD)染色和流式细胞术分析，SQLE过表达抑制LOVO和SW1116细胞凋亡。(B) Western blot分析表明，过表达SQLE抑制了cleaved PARP、caspase-3和caspase-7的表达。(C)通过annexin V/7-AAD法抑制HT29和DLD1细胞中的SQLE诱导细胞凋亡。(D) SQLE敲除增加了裂解PARP、caspase-3和caspase-7的表达。(E)在LOVO和SW1116细胞中过表达SQLE导致G0/ G1通过碘化丙啶(PI)染色和流式细胞术评估，S期细胞数量增加。(F) SQLE过表达增强了促进G1期进展的PCNA、cyclin D1和CDK4的表达，同时抑制了G1门卫p21的表达Cip1p27Kip1和p53。(G)在HT29和DLD1细胞中敲低SQLE导致细胞在G0/ G1S期细胞数量减少。(H)沉默SQLE抑制PCNA、cyclin D1和CDK4，同时诱导p21Cip1p27Kip1p53表达。两组之间的差异由双尾学生t检验确定。* P < 0.05;* * p < 0.01。所有试验均进行3次，每次重复3次。

    结肠特异性转基因SQLE在小鼠中的表达加速结直肠癌的发生

    为了确定SQLE在体内结直肠肿瘤发生中的相关性，我们通过将Rosa26-Sqle tg小鼠与Cdx2-Cre杂交构建了结肠特异性的SQLE tg小鼠ERT2老鼠(图4一)．结肠特异性过表达的Sqle被他莫昔芬注射激活，这允许结肠上皮中的Cre活化(图4 b)．为了启动结直肠肿瘤发生，我们每周给野生型和Sqle tg小鼠注射10mg /kg AOM，共6周(图4 b)．在第一次注射AOM后180天，处死小鼠并分析结肠。如图4 c与野生型小鼠相比，Sqle tg小鼠表现出更高的肿瘤发生率(10/10 vs 6/10)、肿瘤数量(p<0.01)和肿瘤负担(p<0.01)，这表明Sqle在CRC肿瘤发生过程中具有致癌作用。H&E染色组织学检查证实，在Sqle tg小鼠的结肠中形成了CRC，同时结肠发育不良和高度发育不良小鼠的比例增加(图4 d)．与这些发现一致的是，在CRC中，SQLE的致癌功能由Ki-67评分所证明的细胞增殖增加所证明(图4 e)，但通过末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记(TUNEL)评分(图4 f)与野生型小鼠比较。为了鉴定在Sqle tg小鼠中差异表达的基因，我们对Sqle tg小鼠及其野生型同窝小鼠的结肠组织进行了癌症途径PCR分析。Mki67、Ccnd2、E2f4等细胞周期进展标志物为上调基因，促凋亡基因Casp9、Casp2下调，证实了Sqle在结直肠癌成瘤过程中促进细胞增殖、抑制凋亡的作用(图4 g)．

    Colon-specific squalene epoxidase (Sqle) transgenic (tg) expression promotes colorectal tumourigenesis in mice. (A) The construction of colon-specific, conditional Sqle tg mice. Sqle transgene was introduced into the Rosa26 locus with Loxp sites flanking a STOP codon at 5’-end. These mice were then crossed to Cdx2-CreERT2 mice to obtain colon-specific Sqle tg mice. At 6 weeks of age, tamoxifen injection was given (100 mg/kg, intraperitoneally) for 4 times (one dose/day). Western blot analysis confirmed SQLE overexpression in colon tissues. (B) SQLE promotes chemically induced colorectal cancer (CRC). Sqle tg mice aged 6 weeks and wild-type (WT) littermates (n=10 per group) were injected with tamoxifen (100 mg/kg, intraperitoneally, 4 times), followed by azoxymethane (AOM) injection (10 mg/kg, intraperitoneally) for 6 times (once per week). Mice were sacrificed at week 24. (C) Colon-specific Sqle overexpression significantly increased the tumour number and burden in the colon (n=10 in each group). (D) Histological examination performed by a pathologist blinded to the nature of the samples confirmed that SQLE promoted tumour development, as the ratio of high grade of dysplasia in Sqle tg mice was 70%, while the corresponding ratio in WT mice was 20%. (E) Ki-67 staining showed that colon tissues of Sqle tg mice had higher cell proliferation as compared with WT mice. (F) TUNEL staining revealed that Sqle tg mice colon had reduced apoptosis as compared with WT mice. (G) Cancer Pathway PCR array analysis of colon tissues from Sqle tg and WT mice, which were first injected with tamoxifen (100 mg/kg, intraperitoneally, 4 times) and then sacrificed after 3 months. (H) The construction of CRISPR/Cas9-induced whole body Sqle knockout (KO) mice. Downregulation of SQLE in heterozygous Sqle KO mice colon was confirmed by western blot analysis. (I) Sqle KO mice and WT littermates were subjected to AOM-DSS regimen to induce CRC. Sqle KO mice developed significantly less colon tumours as compared with WT mice (n=5 in each group). The difference between two groups was determined by two-tailed Student’s t-test.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
    图4

    结肠特异性角鲨烯环氧化酶(Sqle)转基因(tg)表达促进小鼠结直肠肿瘤发生。(A)结肠特异性、条件性小鼠的构建。Sqle转基因基因被引入到Rosa26位点，Loxp位点位于5 '端一个STOP密码子的两侧。然后将这些小鼠与Cdx2-Cre杂交ERT2小鼠获得结肠特异性的Sqle tg小鼠。6周龄时给予他莫昔芬注射液(100 mg/kg，腹腔注射)4次(1次/天)。Western blot分析证实了SQLE在结肠组织中过表达。(B) SQLE促进化学诱导的结直肠癌(CRC)。6周龄的小白鼠和野生型同窝小鼠(每组n=10只)分别注射他莫西芬(100 mg/kg，腹腔注射，4次)，接着注射氮氧甲烷(10mg /kg，腹腔注射)，6次(每周1次)。第24周处死小鼠。(C)结肠特异性Sqle过表达显著增加结肠肿瘤数量和负担(每组n=10)。(D)由病理学家进行的组织学检查，对样品的性质视而不见，证实了SQLE促进肿瘤发展，因为在SQLE tg小鼠中，高度发育不良的比例为70%，而在WT小鼠中，相应的比例为20%。(E) Ki-67染色显示，与WT小鼠相比，Sqle tg小鼠结肠组织具有更高的细胞增殖能力。(F) TUNEL染色显示，与WT小鼠相比，Sqle tg小鼠结肠细胞凋亡减少。 (G) Cancer Pathway PCR array analysis of colon tissues from Sqle tg and WT mice, which were first injected with tamoxifen (100 mg/kg, intraperitoneally, 4 times) and then sacrificed after 3 months. (H) The construction of CRISPR/Cas9-induced whole body Sqle knockout (KO) mice. Downregulation of SQLE in heterozygous Sqle KO mice colon was confirmed by western blot analysis. (I) Sqle KO mice and WT littermates were subjected to AOM-DSS regimen to induce CRC. Sqle KO mice developed significantly less colon tumours as compared with WT mice (n=5 in each group). The difference between two groups was determined by two-tailed Student’s t-test.

    敲除小鼠的SQLE抑制结直肠癌的发生

    接下来，在基于CRISPR/ cas9的全身SQLE KO小鼠中确定SQLE对CRC发育的影响。我们生成杂合的Sqle小鼠(图4 h)，并建立AOM-DSS化学致癌模型(图4我)．如图4我与野生型同窝小鼠相比，Sqle KO小鼠结肠肿瘤数量减少(p<0.05)。总的来说，我们在Sqle tg小鼠和Sqle KO小鼠中的研究结果都证实了Sqle在体内结肠直肠肿瘤发生中的致癌功能。

    SQLE促进胆固醇从头生物合成

    SQLE是胆固醇生物合成的第二限速酶。因此，我们评估了其对胆固醇生物合成途径的影响。在LOVO和SW1116细胞中，过表达SQLE可增加胆固醇生物合成基因(HMGCS1、HMGCR、MVK、PMVK、MVD、IDI1、FDPS和FDFT1)的mRNA表达(在线补充图S2)，而SQLE敲除则产生相反的效果(在线补充图S3)．Western blot分析显示，过表达SQLE细胞或SQLE tg小鼠HMGCR、FDFT1和FDPS蛋白水平升高，而低表达SQLE细胞或SQLE tg小鼠HMGCR、FDFT1和FDPS蛋白水平升高+ /−小鼠降低了这些基因的蛋白质水平(在线补充数字S2和S3)．这些数据表明，SQLE促进de novo胆固醇生物合成途径，从而促进CRC细胞增殖。

    转基因小鼠出现肠道生态失调

    除了SQLE对CRC细胞的内在影响外，我们还探讨了SQLE是否对结肠微环境有影响。肠道菌群失调是结直肠肿瘤发生的一个新病因。19因此，我们想知道肠道生态失调(至少在一定程度上)是否在体内介导了Sqle的致癌作用。对采集自3月龄的Sqle tg小鼠和野生型小鼠的粪便进行鸟枪宏基因组分析。beta多样性分析没有显示出Sqle tg小鼠与野生型小鼠的单独聚类(图5一个)，而alpha多样性指数在Sqle tg中呈现下降趋势(p=0.093) (图5一个)．我们在物种水平上测定了Sqle tg和野生型小鼠的细菌组成的变化，并揭示了两组之间具有显著丰度差异的离群细菌物种(fold change >2;p < 0.05) (图5 b)．有趣的是，我们观察到病原菌种类的显著富集，如脱磷孤菌属fairfieldensis，红球菌属erythropolis，流产布鲁氏菌而且衣原体muridarum在Sqle tg小鼠中富集，而保护性细菌则减少，包括链霉菌属violaceusniger而且假单胞菌spLeaf58（图5 c)．这些关键菌种的变化通过qPCR (图5 d)．这些结果表明，在体内过表达Sqle可促进肠道生态失调。

    Colon-specific squalene epoxidase (Sqle) transgenic (tg) expression in mice dysregulate gut microbiota and metabolites. (A) Metagenomic sequencing was performed on stool obtained from Sqle tg mice and wild-type (WT) littermates at 3 months after tamoxifen injection. Principal component analysis (PCA) of bacteria composition between Sqle tg (n=8) and WT (n=9) mice (left). Alpha-diversity showed a decreasing trend in Sqle tg mice (right). (B and C) Volcano plot and heat map analysis revealed 29 enriched bacteria, including pathogenic bacteria, Desulfovibrio fairfieldensis, Rhodococcus erythropolis, Brucella abortus and Chlamydia muridarum, and 34 depleted bacteria such as Streptomyces violaceoruber, Pseudomonas sp Leaf58 in Sqle tg mice. (D) Quantitative PCR (qPCR) validation of key bacterial species altered in Sqle tg mice. (E) Global metabolomics profiling was performed on stool samples from Sqle tg mice and WT littermates at 3 months of age. PCA analysis of metabolite profiles (n=9 for each group). (F and G) Volcano plot and heat map analysis revealed nine enriched metabolites such as deoxycholic acid (DCA), lithocholic acid (LCA), taurodeoxycholic acid (TDCA) and chenodeoxycholic acid (CDCA); plus 64 depleted metabolites in Sqle tg mice as compared with WT littermates. (H) Targeted metabolomic analysis of secondary bile acids by liquid chromatography-mass spectrometry. *P<0.05; **p<0.01.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5
    图5

    小鼠结肠特异性角鲨烯环氧化酶(Sqle)转基因(tg)表达失调肠道菌群和代谢产物。(A)对注射他莫昔芬3个月后的Sqle tg小鼠和野生型(WT)同窝小鼠的粪便进行宏基因组测序。Sqle tg (n=8)和WT (n=9)小鼠(左)细菌组成的主成分分析(PCA)。在Sqle tg小鼠中α -多样性呈下降趋势(右)。(B和C)火山图和热图分析显示富集菌29种，包括致病菌、脱磷孤菌属fairfieldensis，红球菌属erythropolis，流产布鲁氏菌而且衣原体muridarum，以及34种衰竭细菌，如链霉菌属violaceoruber，假单胞菌spLeaf58在Sqle tg小鼠。(D) Sqle tg小鼠关键菌种改变的定量PCR (qPCR)验证。(E)对3个月大的Sqle tg小鼠和WT窝仔的粪便样本进行全球代谢组学分析。主成分分析代谢物分布(每组n=9)。(F和G)火山图和热图分析显示9种富集代谢物，如脱氧胆酸(DCA)、石胆酸(LCA)、牛磺酸脱氧胆酸(TDCA)和鹅去氧胆酸(CDCA);与WT窝仔相比，Sqle tg小鼠的代谢产物减少了64种。(H)用液相色谱-质谱法对次生胆汁酸进行靶向代谢组学分析。* P < 0.05;* * p < 0.01。

    转基因小鼠出现肠道代谢组学改变

    由于已知一些富集的致病菌种类具有各种代谢活性，我们接下来对相同的粪便样本进行了非靶向代谢组学分析。主成分分析表明，Sqle tg的代谢组可以与野生型小鼠的代谢组分离(图5 e)．专注于差异丰富的代谢物(图5 f, G)，我们发现与野生型小鼠相比，Sqle tg小鼠的粪便中石胆酸、鹅去氧胆酸、牛磺酸去氧胆酸和去氧胆酸等次生胆汁酸含量较高(图5克)．通过靶向代谢组学分析(图5 h)．

    由于次级胆汁酸是通过肠道微生物组的作用从初级胆汁酸转化而来的，20.我们在Sqle tg小鼠中研究了肠道细菌种类和显示差异丰度的代谢物之间的相关性(图6)．我们观察到次生胆汁酸与c . muridarum这意味着它可能参与增加继发性胆汁酸。此外，4种致病菌均与关键代谢物改变呈正相关(图6)．因此，Sqle转基因表达在小鼠CRC发育过程中调节肠道微生物群和代谢物。

    Gut microbiota-metabolite axis contributes to gut barrier dysfunction in squalene epoxidase (Sqle) transgenic (tg) mice and in germ-free mice receiving faecal microbiota transplantation (FMT) from Sqle tg mice. (A) Correlation analysis revealed that pathogenic bacteria are positively correlated with altered metabolites, including secondary bile acids. (B) Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran intestinal permeability test was performed on Sqle tg mice and wild-type (WT) littermates at 3 months after tamoxifen injection, revealing that the gut barrier was impaired in Sqle tg mice. (C) Electron microscopy confirmed impaired intestinal tight junction in Sqle tg mice. (D) Western blot analysis showed that tight junction proteins Jam-c and occludin were downregulated in Sqle tg mice. (E) Muc2 messenger RNA (mRNA) was downregulated in Sqle tg mice. (F) Stool collected from Sqle tg and WT littermates was gavaged to germ-free mice aged 6 weeks. One month later, FITC-dextran was gavaged 4 hours before sacrifice to perform permeability assay. Intestinal permeability was significantly induced in germ-free mice gavaged with stool from Sqle tg mice. (G) Electron microscopy confirmed the impaired intestinal tight junction germ-free mice fed with stool from Sqle tg mice. (H) Western blot analysis showed that tight junction proteins Jam-c and occludin were downregulated in germ-free mice gavaged with stool from Sqle tg mice. (I) Germ-free mice transplanted with Sqle tg mice stool showed increased Ki-67 staining in the colon epithelium as compared with those gavaged with WT mice stool. Two-tailed Student’s t-test was used for the difference determination between two groups.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图6
    图6

    在转角鲨烯环氧化酶(Sqle)转基因(tg)小鼠和接受Sqle tg小鼠粪便菌群移植(FMT)的无菌小鼠中，肠道微生物-代谢物轴有助于肠道屏障功能障碍。(A)相关分析显示致病菌与次生胆汁酸等代谢产物改变呈正相关。(B)注射他莫西芬3个月后，对Sqle tg小鼠和野生型(WT)同窝小鼠进行异硫氰酸荧光素(FITC)-葡聚糖肠通透性试验，结果显示Sqle tg小鼠肠道屏障受损。(C)电子显微镜证实Sqle tg小鼠肠紧密连接受损。(D) Western blot分析显示，紧密连接蛋白Jam-c和occludin在Sqle tg小鼠中表达下调。(E) Muc2信使RNA (mRNA)在Sqle tg小鼠中下调。(F)从Sqle tg和WT窝仔中收集粪便灌给6周龄的无菌小鼠。1个月后，在牺牲前4小时给予fitc -葡聚糖进行渗透性测定。无菌小鼠灌胃Sqle tg小鼠粪便可显著诱导肠道通透性。(G)电子显微镜证实受损的肠道紧密连接无菌小鼠喂食Sqle tg小鼠粪便。 (H) Western blot analysis showed that tight junction proteins Jam-c and occludin were downregulated in germ-free mice gavaged with stool from Sqle tg mice. (I) Germ-free mice transplanted with Sqle tg mice stool showed increased Ki-67 staining in the colon epithelium as compared with those gavaged with WT mice stool. Two-tailed Student’s t-test was used for the difference determination between two groups.

    SQLE转基因过表达损害肠屏障功能，促进炎症反应

    次生胆汁酸是已知的脂肪毒素，其水平的升高是CRC的重要危险因素。21它们对结肠上皮细胞有毒，已知会破坏肠道屏障功能。22肠道微生物失调也与肠道屏障的破坏密切相关。23因此，我们通过fitc -右旋糖酐经上皮渗透试验比较了Sqle tg小鼠和野生型同窝小鼠的屏障功能。口服fitc -葡聚糖后，与野生型小鼠相比，Sqle tg小鼠血清中fitc -葡聚糖含量较高(图6 b)．电子显微镜(EM)证实了Sqle tg小鼠紧密连接的破坏(图6 c)．上皮紧密连接由细胞间连接蛋白复合物维持。我们通过western blot检测关键紧密连接蛋白的表达，发现与野生型小鼠相比，Sqle tg小鼠结肠中Jam-c和occludin表达下调(图6 d)．此外，在Sqle tg小鼠体内黏液的关键成分Muc2 mRNA水平下调(图6 e)．“漏肠”的一个主要后果是诱导促炎反应。根据这一观点，对Sqle tg结肠组织的炎症通路PCR阵列分析显示Cxcl3、Crp和Cxcr2等促炎因子显著上调(在线补充图S4)．这些结果表明，肠道失调-代谢物轴可能有助于Sqle tg小鼠肠道屏障功能障碍。

    SQLE过表达诱导的肠道菌群失调促进无菌小鼠肠道屏障功能障碍和结肠上皮细胞增殖

    为了研究Sqle tg表达诱导的肠道生态失调是否对结肠细胞增殖有直接影响，从AOM模型的Sqle tg小鼠和野生型小鼠收集的粪便被移植到无菌(GF)小鼠中。一个月后，处死小鼠。灌胃不同大便对体重无影响。在处死前，我们进行了fitc -右旋糖酐经上皮通透性试验，结果显示，灌胃Sqle tg小鼠粪便的GF小鼠血清中fitc -右旋糖酐显著高于灌胃野生型小鼠粪便的GF小鼠(图6 f)，并由EM证实肠屏障被破坏(图6克)．与野生型粪便相比，用Sqle tg粪便灌胃的GF小鼠的连接粘附蛋白Jam-c和occludin始终下调(图6 h)．此外，Ki-67染色显示，与野生型小鼠粪便相比，Sqle tg小鼠粪便显著促进GF小鼠结肠上皮细胞增殖(图6我)．这些数据强调了sqle诱导的肠道菌群失调在损害肠道屏障功能和促进结肠细胞生长方面的功能作用。

    抑制Sqle的药理作用可提高结直肠癌化疗的疗效

    鉴于SQLE在CRC中具有致癌功能，我们接下来研究了SQLE是否可以在CRC细胞中靶向治疗。为了测试SQLE是否代表CRC的可行治疗靶点，我们用fda批准的真菌SQLE抑制剂特比萘芬(terbinafine)治疗HT29和DLD1细胞。如图7，特比萘芬剂量依赖性地抑制了HT29和DLD1细胞的生长。除了CRC细胞系外，特比萘芬显著损害了CRC主要类器官的生长(图7)．我们接下来评估特比萘芬联合奥沙利铂或5-FU的疗效，这是治疗CRC患者的常用化疗药物。我们在存在或不存在特比萘芬的情况下进行了细胞活力测定，结果表明特比萘芬使HT29和DLD1细胞对奥沙利铂和5-FU的生长抑制作用增敏(图7 b)．联合指数(CI)定量评价表明特比萘芬联合奥沙利铂(CI: 0.39-0.63)或5-FU (CI: 0.332-0.472)具有协同作用(<1)(图7 c)．细胞凋亡实验显示特比萘芬联合奥沙利铂和5-FU可协同诱导体外细胞凋亡(图7 d)．特比萘芬也增强了5- fu诱导的细胞周期阻滞(在线补充图S5)．

    Squalene epoxidase (SQLE) is a therapeutic target in colorectal cancer (CRC). (A) Terbinafine, a Food and Drug Administration-approved drug targeting SQLE, dose-dependently suppressed cell viability of HT29 and DLD1 cells, and primary CRC organoids. (B) Terbinafine co-treatment sensitised HT29 and DLD1 cells to the growth inhibitory effect of 5-fluorouracil (5-FU) or oxaliplatin. (C) Combination index (CI) indicated that terbinafine+5-FU or oxaliplatin exerted synergistic effects for the treatment of CRC cells, with CI <1. (D) Apoptosis assay showed that terbinafine+5-FU or oxaliplatin (48 hours) synergistically induced apoptosis in CRC cells. (E) Nude mice were injected subcutaneously with HT29 cells, randomised and then treated with (1) vehicle, (2) terbinafine (80 mg/kg, oral daily), (3) 5-FU (30 mg/mg, intraperitoneally, once per week), (4) oxaliplatin (10 mg/kg, intraperitoneally, twice per week), (5) terbinafine+5-FU and (6) terbinafine+oxaliplatin. Terbinafine treatment alone suppressed tumour growth significantly by ~50%. On the other hand, terbinafine combined with 5-FU or oxaliplatin showed synergistic effects in suppressing tumour size in nude mice as compared with 5-FU or oxaliplatin single treatments. The significance of the difference between tumour growth rate was determined by repeated-measures analysis of variance. **p<0.01; ***p<0.001; ****p<0.0001. All in vitro experiments were conducted 3 times in triplicate.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图7
    图7

    角鲨烯环氧化酶(Squalene epoxidase, SQLE)是结直肠癌(CRC)的治疗靶点。(A)特比萘芬，一种食品和药物管理局批准的靶向SQLE的药物，剂量依赖地抑制HT29和DLD1细胞的细胞活力，以及原发性CRC类器官。(B)特比萘芬联合治疗使HT29和DLD1细胞对5-氟尿嘧啶(5-FU)或奥沙利铂的生长抑制作用增敏。(C)联合指数(CI)显示特比萘芬+5-FU或奥沙利铂对CRC细胞有协同作用，CI <1。(D)凋亡实验显示特比萘芬+5-FU或奥沙利铂(48小时)协同诱导CRC细胞凋亡。(E)裸鼠皮下注射HT29细胞，随机分组，然后用(1)载液，(2)特比萘芬(80 mg/kg，每日口服)，(3)5- fu (30 mg/mg，腹腔注射，每周1次)，(4)奥沙利铂(10 mg/kg，腹腔注射，每周2次)，(5)特比萘芬+5- fu和(6)特比萘芬+奥沙利铂治疗。特比萘芬单独治疗可显著抑制肿瘤生长~50%。另一方面，特比萘芬联合5-FU或奥沙利铂与5-FU或奥沙利铂单独治疗相比，在抑制裸鼠肿瘤大小方面表现出协同作用。肿瘤生长速率之间差异的显著性由重复测量方差分析确定。* * p < 0.01; ***p<0.001; ****p<0.0001. All in vitro experiments were conducted 3 times in triplicate.

    为了证实特比萘芬联合5-FU或奥沙利铂抑制结直肠癌生长的协同作用，我们在裸鼠皮下建立了异种移植模型。HT29细胞(1×106)植入裸鼠背侧，分为6组:(1)对照;(2) terbinafine;(3)研究者用;(4)铂;(5)特比萘芬+5- fu和(6)特比萘芬+奥沙利铂。如图7 e单一药物治疗抑制肿瘤生长约50% (p<0.01)。重要的是，与对照相比，特比萘芬+5-FU或特比萘芬+奥沙利铂的联合治疗均可引发完全生长停滞(p<0.001)，且比单一药物治疗更有效(p<0.01)。我们的数据表明，SQLE在结直肠癌中是一个可操作的靶点，抑制SQLE可以提高结直肠癌化疗的疗效。

    讨论

    在本研究中，我们使用细胞系、结肠特异性的SQLE tg小鼠和SQLE KO小鼠模型建立了SQLE作为CRC的致癌因子。我们发现，SQLE通过细胞内在效应和肠道微生物-代谢物轴的调节介导肿瘤发生，分别驱动肿瘤细胞增殖和肠屏障功能障碍。我们进一步证明，SQLE抑制剂特比萘芬可以通过与化疗联合发挥协同作用，重新用于CRC的治疗。与我们的临床前研究结果一致，SQLE在结直肠癌中过表达，其表达预示着患者生存差，这意味着SQLE是结直肠癌的治疗靶点和预后因素。

    我们的工作清楚地表明，在CRC中，SQLE作为肿瘤细胞固有的致癌因子发挥作用。在CRC细胞中异位表达SQLE可以通过加速细胞周期进程和抑制细胞凋亡来促进细胞增殖，而SQLE的KO则相反。为了验证SQLE在体内的作用，我们建立了结肠特异性的SQLE tg小鼠和SQLE+ /−综合评价Sqle功能增强和功能丧失在结直肠癌发生中的作用。与我们认为SQLE是一种癌基因的观点一致，在肿瘤发病率和疾病严重程度方面，结肠特异性SQLE过表达加剧了aom诱导的CRC，并且来自SQLE tg小鼠的肿瘤表现出明显更高的细胞增殖指数。相反，Sqle KO损害aom - dss诱导的CRC。SQLE的促肿瘤作用可能部分归因于诱导胆固醇生物合成，这对支持增加细胞增殖至关重要。所有这些发现共同表明，SQLE在CRC肿瘤发生过程中起致癌基因的作用。

    越来越多的证据表明，结直肠肿瘤发生涉及肿瘤细胞及其微环境的复杂相互作用。24特别是，肠道微生物群越来越被认为是结直肠癌的病原体。在此之前，我们已经证明，经口灌喂结直肠癌患者粪便的GF小鼠可显著诱导结肠细胞增殖和肿瘤发生。19然而，目前尚不清楚基因改变和肠道生态失调之间的相互作用是否在结直肠肿瘤发生中起作用。在这里，我们证明了Sqle转基因在小鼠中的表达诱导肠道生态失调，其特征是几种致病菌的富集，包括d . fairfieldensis，r . erythropolis，b .流产而且c . muridarum，与各种病理有关25日- 27日；虽然具有抗炎和抗肿瘤特性的潜在保护细菌，美国violaceusniger而且假单胞菌spLeaf58，都已耗尽。28 - 30与野生型小鼠相比，将Sqle tg粪便移植到GF小鼠可显著促进结肠上皮细胞的增殖，这意味着Sqle诱导的肠道生态失调在CRC中起着偶然的作用。这些数据表明，Sqle对肠道微生物群的影响超出了对肿瘤细胞增殖和存活的直接影响。

    研究表明，肠道内代谢物与微生物群相互影响。31代谢组学分析表明，Sqle tg小鼠粪便中次生胆汁酸的诱导。由于次生胆汁酸是微生物代谢的产物，我们综合分析了宏基因组和代谢组数据集。的确，我们发现次生胆汁酸与c . muridarum在Sqle tg小鼠体内发现一种异常致病菌。次生胆汁酸是重要的脂肪毒素，已知可诱导结肠上皮DNA损伤32促进小鼠结肠癌的形成。33与此一致的是，我们发现Sqle tg小鼠的肠道屏障功能受损，表现为肠道通透性增加，EM分析和紧密连接蛋白下调。在Sqle tg小鼠中，伴随肠道屏障完整性受损的是炎症反应，这进一步加剧了结直肠肿瘤的发生。这些结果表明，肠道失调-代谢-肠道屏障轴可能至少在一定程度上促进了体内SQLE的促肿瘤作用。

    鉴于SQLE在CRC发展中的重要作用，我们接下来评估了其作为治疗靶点的潜力。因此，我们测试了特比萘芬，一种fda批准的抗真菌感染药物，作为一种新的CRC治疗方法。与SQLE的致癌功能一致，特比萘芬阻断SQLE对CRC细胞有生长抑制作用。特别是特比萘芬联合5-FU或奥沙利铂这一CRC常用的化疗方案，在体外和体内均能协同抑制CRC的生长。我们的结果表明，特比萘芬的重新使用可能是联合化疗治疗CRC的一种策略。

    与我们的实验结果相印证的是，对独立人类CRC队列的分析显示，SQLE在CRC中过表达，其表达预示着CRC患者的生存率较差。和我们的数据一致，金等和他等他们都报道了SQLE蛋白表达预示着结直肠癌患者较差的生存率。10 11正相反，君等研究表明，高SQLE预测了IV期CRC患者的有利结果，SQLE的缺失促进了CRC细胞的转移表型。因此，SQLE可能对CRC的生长和转移有不同的影响。未来有必要利用转基因SQLE或KO小鼠研究SQLE在结直肠癌转移中的作用。

    总之，我们的工作确立了SQLE在CRC中的致癌作用。SQLE促进CRC细胞增殖和存活，并通过引起肠道菌群和肠道屏障功能障碍对肿瘤微环境产生影响。特比萘芬靶向SQLE显著提高了常规化疗的疗效，预示着其未来在CRC治疗中的临床应用潜力。

    数据可用性声明

    应合理要求提供数据。所有数据均可根据要求从通讯作者处获得。

    伦理语句

    患者发表同意书

    伦理批准

    本研究涉及人类参与者，由北京大学肿瘤医院人类伦理委员会和香港中文大学批准(ID: CREC Ref. 2019.425)。参与者在参与研究前均知情同意参与研究。所有动物研究均按照香港中文大学动物实验伦理委员会(amuwecc -20192185)批准的准则进行。

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    补充材料

    • 补充数据

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    脚注

    • CL和YW是联合第一作者。

    • 调整通知这篇文章在Online First发表后已被更正。在线补充文件1已被替换。表S4中的Human SQLE qPCR引物更正如下:Human SQLE qPCR Forward: 5 ' -GATGATGCAGCTATTTTCGAGGC-3 ';反向:5 ' -CCTGAGCAAGGATATTCACGACA-3。

    • 贡献者李传根(CL)进行实验，分析数据并起草手稿;YW为动物工作提供设施;DL和YZ提供了转基因小鼠模型并对研究进行了评论;CCW对研究和修改稿件进行了评论;OOC和Changan Liu (CL)进行了生物信息学分析;YL进行类器官实验;XZ和JJYS对研究进行了评论;WK和KFT辅助组织芯片;JY负责项目的设计、监督和稿件的修改。JY是本文的担保人。

    • 资金国家重点研发计划(No. 2020YFA0509200/2020YFA0509203)、国家自然科学基金(NSFC;81972576)、香港研资会研究基金(C4039-19GF及C7065-18GF)、香港研资会研究基金(14110819、24100520及14108718)、健康及医学研究基金(06170686及07181256)及中大校长酌情基金。

    • 相互竞争的利益没有宣布。

    • 出处和同行评审不是委托;外部同行评审。

    • 补充材料此内容由作者提供。它没有经过BMJ出版集团有限公司(BMJ)的审查，也可能没有经过同行评审。讨论的任何意见或建议仅是作者的意见或建议，不被BMJ认可。BMJ不承担因对内容的任何依赖而产生的所有责任和责任。如果内容包括任何翻译材料，BMJ不保证翻译的准确性和可靠性(包括但不限于当地法规、临床指南、术语、药品名称和药物剂量)，并且对因翻译和改编或其他原因引起的任何错误和/或遗漏不负责。