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幽门螺杆菌
原始研究
幽门螺杆菌感染对癌症免疫疗法的疗效有不利影响
  1. 保罗·奥斯特1，
  2. 劳里Vaillant1，
  3. Erika莉娃1，
  4. Brynn麦克米兰1，
  5. 克里斯蒂娜Begka1，
  6. 卡洛琳Truntzer2，
  7. Corentin理查德3.，
  8. 海洋M Leblond4，
  9. Meriem Messaoudene3.，
  10. Elisavet Machremi1，
  11. 埃默里克Limagne2，
  12. 弗朗索瓦Ghiringhelli2，
  13. 伯特兰Routy3.，
  14. 格里高利Verdeil4，
  15. 多米尼克•仿犊皮1
  1. 1胃肠病学和肝病科服务，洛桑大学瓦杜瓦大学中心医院，洛桑、瑞士
  2. 2内科肿瘤学系，乔治中心François勒克莱尔，第戎、法国
  3. 3.Montréal大学(CRCHUM)研究中心，医学系血液学-肿瘤学学部，蒙特利尔大学保健中心(CHUM)，蒙特利尔，魁北克、加拿大
  4. 4肿瘤学系，洛桑大学瓦杜瓦大学中心医院，洛桑、瑞士
  1. 对应到Dominique Velin博士，瑞士洛桑大学瓦杜瓦大学中心医院消化内科和肝病科;dominique.velin在{}chuv.ch

摘要

客观的在这项研究中，我们确定是否幽门螺杆菌（幽门螺旋杆菌)感染会降低癌症免疫疗法的疗效。

设计使用小鼠模型，我们评估了免疫检查点抑制剂或基于疫苗的免疫疗法是否有效减少肿瘤体积幽门螺旋杆菌来华的老鼠。在人类中，我们评估了幽门螺旋杆菌程序性细胞死亡蛋白1 (PD-1)阻断疗法在非小细胞肺癌(NSCLC)患者中的血清阳性和疗效

结果在移植了MC38结肠腺癌或B16-OVA黑色素瘤细胞的小鼠中，接受抗细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4和/或程序性死亡配体1或抗癌疫苗治疗的非感染小鼠的肿瘤体积明显小于感染小鼠。我们观察到肿瘤特异性CD8的数量和激活状态下降+用癌症免疫疗法治疗的感染小鼠肿瘤中的T细胞独立于肠道微生物组组成。此外，通过体外共培养实验，我们观察到感染小鼠的树突细胞促进肿瘤特异性CD8水平降低+T细胞增殖。我们在两个独立队列中进行了回顾性的人类临床研究。在第戎的队列中，幽门螺旋杆菌血清阳性被发现与抗pd -1治疗的NSCLC患者生存率降低相关。生存中位数幽门螺旋杆菌血清阳性患者为6.7个月，而血清阴性患者为15.4个月(p=0.001)。此外，在蒙特利尔队列中，幽门螺旋杆菌血清阳性被发现与抗pd -1治疗的NSCLC患者无进展生存期明显降低相关。

结论我们的研究首次揭示了胃菌群影响对癌症免疫疗法的反应幽门螺旋杆菌血清学将成为个性化癌症免疫治疗的有力工具。

  • 幽门螺杆菌
  • 癌症
  • 免疫疗法
  • 癌症免疫生物学

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http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl-2020-323392

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    本研究的意义

    关于这个问题，我们已经知道了什么?

    • 以往的临床前和临床研究表明，大肠菌群和小肠菌群影响癌症免疫治疗的疗效。

    新的发现是什么?

    • 我们的研究首次揭示了胃菌群幽门螺杆菌受感染的宿主影响对癌症免疫疗法的反应。

    在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?

    • 幽门螺旋杆菌血清学将成为个性化癌症免疫治疗的有力工具。

    简介

    免疫检查点抑制剂(ICIs)的目的是重新激活免疫系统以对抗癌细胞。然而，尽管取得了前所未有的结果，大多数患者对ICIs没有反应，一些个人因素与耐药性有关，如肠道菌群的组成和肿瘤免疫环境。1

    Vetizou等2抗细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4 (CTLA4)阻断剂对小鼠的抗肿瘤作用依赖于CTLA4的存在脆弱拟杆菌，叫多形拟杆菌而且Burkholderiales在肠道菌群中。其他研究小组已经在肠道中发现了额外的免疫增强细菌，如Akkermansia muciniphil, Faecalibacterium prausnitii而且双歧杆菌属与免疫治疗无效者相比，对免疫治疗有反应者中存在着不同的物种。3 4更重要的是，人类数据清楚地表明，肠道微生物组的组成对抗癌免疫疗法的有效性有相当大的影响3 - 5抗生素的使用降低了程序性细胞死亡蛋白1 (PD-1)封锁疗法的疗效。6矛盾的是，在已发表的研究中，没有一个共同的细菌类群被明确确定为ICI反应的关键指标和/或调节剂。1这可能是由于与微生物组分析相关的技术问题，也可能是由于饮食和生活方式等地理因素。另一种可能是，仅对患者粪便样本的分析可能忽略了关键信息。确实是小肠7和/或胃菌群也可能深刻影响对ICIs的反应。

    幽门螺杆菌（幽门螺旋杆菌)，它在世界上50%人口的胃粘膜上定植，积极操纵宿主组织，建立免疫抑制环境，维持慢性感染。8幽门螺旋杆菌抑制CD4的效应器功能+T细胞,8 9树突状细胞(dc)9 - 12和巨噬细胞8促进调节性T细胞(treg)的产生10以及骨髓来源的抑制细胞。13先前的观察表明，全身炎症性疾病如哮喘、狼疮、炎症性肠病和嗜酸性粒细胞性食管炎与此呈负相关幽门螺旋杆菌人群中的感染14日至17日在动物模型中也是如此。21页这表明,幽门螺旋杆菌可缓解不平衡的系统免疫反应。的负面影响幽门螺旋杆菌对大量与抗肿瘤免疫相关的免疫细胞类型的-介导免疫调节允许重要的考虑幽门螺旋杆菌感染可能降低对癌症免疫疗法的反应。

    结果

    幽门螺旋杆菌在临床前模型中，感染降低了癌症免疫疗法的有效性

    为了检验是否幽门螺旋杆菌感染降低了ICIs的有效性，我们首先评估是否幽门螺旋杆菌降低了使用MC38结肠腺癌模型的抗ctla4治疗的疗效在线补充图S1A)．有趣的是，接受抗ctla4治疗的非感染小鼠的肿瘤体积明显小于对照组幽门螺旋杆菌来华的老鼠(图1一个)．接下来我们评估了幽门螺旋杆菌降低抗ctla4 /程序性死亡配体1 (PD-L1)联合治疗的疗效22(见在线补充图S1B)．所示图1 b，接受抗ctla4 /PD-L1治疗的非感染小鼠肿瘤体积明显小于感染小鼠。这些结果表明幽门螺旋杆菌-感染的小鼠对CTLA4单独或联合抗pd - l1的反应较弱。此外，通过使用B16-OVA黑色素瘤模型，我们评估是否幽门螺旋杆菌降低基于疫苗的癌症免疫疗法的疗效。将卵巢癌特异性CD8转染荷瘤小鼠+用CpG乳化的OVA肽(siinfkl)免疫T细胞(OT-1细胞)23(见在线补充图S1C)．值得注意的是，接种疫苗的非感染小鼠的肿瘤体积明显小于接种疫苗的感染小鼠(图1 c),证明幽门螺旋杆菌-受感染的小鼠对抗癌疫苗的反应较差。此外，我们还观察到胃粘膜的感染情况幽门螺杆菌猫属（h .猫属),一个幽门螺杆菌缺乏若干毒力因子的种幽门螺旋杆菌如Cag致病性岛和空泡性细胞毒素(VacA)，24不会减低抗癌疫苗的效力(图1 d)或抗ctla4治疗(图1 e)．最后，我们评估了幽门螺旋杆菌感染对原位肿瘤免疫治疗效果的影响。我们选择了azoxy甲烷(AOM)/葡聚糖硫酸钠(DSS)结肠癌模型，因为最近的研究表明，抗ctla4治疗减少了该模型中的肿瘤负担(见在线补充图S1D)．25值得注意的是，接受抗ctla4治疗的非感染小鼠的结肠肿瘤数量明显低于对照组幽门螺旋杆菌来华的老鼠(图1 f)．总之，我们提供证据证明幽门螺旋杆菌在胃菌群中特别危害癌症免疫疗法的疗效。

    Helicobacter pylori infection decreases the effectiveness of cancer immunotherapies in preclinical models. (A) Mice were injected with MC38 colon adenocarcinoma cells and intraperitoneally injected with anti-CTLA4 (αCTLA4) or IgG2b isotype as control. At day 19, tumour volumes of non-infected (NI) and infected (INF) mice treated with anti-CTLA4 therapy were significantly different (p<0.01, two-way analysis of variance (ANOVA)). Experimental groups included seven mice. (B) MC38 tumour growth kinetics of NI and INF mice treated with anti-CTLA4/PD-L1 (αCTLA4/αPD-L1) combination therapy. Anti-CTLA4/PD-L1 treatment resulted in tumour rejection in seven of eight NI mice, whereas anti-CTLA4/PD-L1-treated INF mice showed tumour rejection in two of six mice. At day 21, the tumour volumes of NI and INF mice treated with anti-CTLA4/PD-L1 antibodies were statistically different (p=0.009, two-way ANOVA). Experimental groups included five to eight mice. (C) B16-OVA tumour growth kinetics of NI and INF mice treated with an anti-cancer vaccine (VAC) or phosphate-buffered saline (PBS) as a control. Vaccination resulted in decreased tumour growth in NI mice, however, did not efficiently limit tumour growth in INF mice. At day 20, tumour volumes of vaccinated NI and INF mice were statistically different (p<0.05, two-way ANOVA). Experimental groups included five to eight mice. (D) B16-OVA tumour growth kinetics of NI and H. felis (H.f)-infected mice treated with an anti-cancer vaccine or PBS as a control. Vaccination resulted in statistically significant decrease in tumour growth in NI and H.f-infected mice (p<0.001, two-way ANOVA). Experimental groups included nine to ten mice. (E) MC38 tumour growth kinetics of NI and H.f-infected mice treated with anti-CTLA4 (αCTLA4) therapy. Anti-CTLA4 treatment resulted in decreased tumour growth in both NI and H.f mice. At day 19, the tumour volumes of NI and H.f mice treated with anti-CTLA4 antibodies were not statistically different (p=0.65, two-way ANOVA). Experimental groups included six mice. (F) Number of colon tumours of NI and H. pylori INF-infected mice treated with anti-CTLA4 (αCTLA4) or IgG2b isotype as control. Anti-CTLA4 injection resulted in decreased tumour number in NI mice but not in INF mice. At sacrifice, tumour numbers of anti-CTLA4-injected NI and INF mice were statistically different (p<0.0013, Mann-Whitney test). Experimental groups included ten mice. For the experiments described in figure 1A–F, the infectious status of each individual mouse was confirmed at sacrifice by performing rapid urease tests and/or colony forming units on the stomach (see online supplemental figures S2A–F). CTLA4, cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4; PD-L1, programmed death ligand 1.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    幽门螺杆菌在临床前模型中，感染降低了癌症免疫疗法的有效性。(A)小鼠注射MC38结肠腺癌细胞，腹腔注射抗ctla4 (αCTLA4)或IgG2b同型作为对照。第19天，抗ctla4治疗的非感染小鼠(NI)和感染小鼠(INF)的肿瘤体积有显著差异(p<0.01，双向方差分析(ANOVA))。实验组包括7只小鼠。(B)抗ctla4 /PD-L1 (αCTLA4/αPD-L1)联合治疗NI和INF小鼠MC38肿瘤生长动力学。抗ctla4 /PD-L1治疗在8只NI小鼠中有7只出现肿瘤排斥反应，而抗ctla4 /PD-L1治疗的INF小鼠在6只小鼠中有2只出现肿瘤排斥反应。第21天，使用抗ctla4 /PD-L1抗体治疗的NI和INF小鼠的肿瘤体积有统计学差异(p=0.009，双向方差分析)。实验组包括5到8只老鼠。(C)以抗癌疫苗(VAC)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)作为对照的NI和INF小鼠B16-OVA肿瘤生长动力学。接种疫苗可降低NI小鼠的肿瘤生长，但不能有效限制INF小鼠的肿瘤生长。 At day 20, tumour volumes of vaccinated NI and INF mice were statistically different (p<0.05, two-way ANOVA). Experimental groups included five to eight mice. (D) B16-OVA tumour growth kinetics of NI andh .猫属（H.f)感染的小鼠用抗癌疫苗或PBS作为对照。接种疫苗导致NI和NI的肿瘤生长在统计学上显著下降H.f-感染小鼠(p<0.001，双向方差分析)。实验组包括9到10只老鼠。(E) NI和MC38肿瘤生长动力学H.f-感染小鼠用抗ctla4 (αCTLA4)治疗。抗ctla4治疗可降低NI和肿瘤的生长H.f老鼠。第19天，NI和H.f使用抗ctla4抗体治疗的小鼠无统计学差异(p=0.65，双向方差分析)。实验组包括6只小鼠。(F) NI和结肠肿瘤的数量幽门螺旋杆菌以抗ctla4 (αCTLA4)或IgG2b同型处理的inf感染小鼠作为对照。注射抗ctla4可减少NI小鼠的肿瘤数量，但对INF小鼠无影响。在牺牲时，注射了抗ctla4的NI和INF小鼠的肿瘤数量有统计学差异(p<0.0013, Mann-Whitney检验)。实验组包括10只小鼠。中描述的实验图1 f，每只小鼠的感染状态在牺牲时通过在胃上进行快速脲酶试验和/或集落形成单位来确认(见在线补充图S2A-F)．CTLA4，细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4;PD-L1，程序性死亡配体1。

    幽门螺旋杆菌-介导的免疫抑制的癌症免疫疗法是独立的幽门螺旋杆菌-诱导的粪便微生物群的修饰

    我们调查是否幽门螺旋杆菌-介导的免疫抑制依赖于肠道菌群组成的调节。评价肠道菌群在幽门螺旋杆菌-诱导免疫抑制，我们进行了三种类型的实验。作为第一种方法，我们进行了合租实验。由于小鼠的食粪行为，同舍小鼠的粪便菌群组成非常相似。然而，合租不允许幽门螺旋杆菌从受感染的新生/成年小鼠到未受感染的传播(见在线补充图S2A)．使用B16-OVA黑色素瘤模型，我们观察到接种疫苗的非感染小鼠的肿瘤体积明显小于接种疫苗的感染小鼠(图2一个)．同样，在MC38模型中，感染小鼠对抗ctla4治疗的反应较弱(数据未显示)。接下来，我们在接种疫苗免疫治疗前和期间对肠道菌群进行了16S rRNA基因测序(见在线补充图S1C)．我们观察到非感染和感染小鼠肠道菌群在稳态下的差异(图2 b)，证实了Kienesberger的工作等．26值得注意的是，我们发现幽门螺旋杆菌感染导致细菌定植减少Lachnospiraceae而且Erysipelotrichaceae属和增加细菌定植双歧杆菌属属(图2 c)．与未感染小鼠相比，感染小鼠表现出更高的α多样性。非常有趣的是，阿尔法多样性的增加在幽门螺旋杆菌-受感染的人与匹配的人进行比较幽门螺旋杆菌消极的控制。27矛盾的是，高alpha多样性和高流行率双歧杆菌属通常在小鼠中观察到，小鼠在免疫治疗后产生良好的抗癌免疫反应。1 28有趣的是，在基于疫苗的免疫治疗环境下，未感染和感染小鼠的粪便微生物群相似(图2 d)．最后，我们移植了来自幽门螺旋杆菌使用B16-OVA黑色素瘤模型进行癌症免疫治疗在线补充图S1E)．我们观察到，与未接种疫苗的小鼠相比，接种了疫苗的未感染小鼠，移植了感染小鼠的粪便，保持了有效控制肿瘤生长的能力(图2 e)．总的来说，共居住实验，16S rRNA基因测序和粪便移植证明了这一点幽门螺旋杆菌-介导的免疫抑制的癌症免疫疗法是独立的幽门螺旋杆菌-诱导的粪便微生物群的修饰。

    Helicobacter pylori-mediated immunosuppression of cancer immunotherapies is independent of the H. pylori-induced modification of the faecal microbiota. (A) Co-housing experiments, non-infected (NI) (n=9) and H. pylori-infected (INF) (n=10) mice were subcutaneously injected with B16-OVA tumour cells and vaccinated. Vaccination (VAC) showed very limited tumour growth inhibition in INF mice. At days 27 and 30, the tumour volumes of vaccinated NI and INF mice were statistically different (p<0.001, two-way analysis of variance (ANOVA)). At sacrifice, we performed rapid urease tests on the stomach of NI and INF co-housed mice. We only detected H. pylori infection in INF and not in NI mice, confirming that co-housing does not allow for H. pylori transmission (see online supplemental figures S2A). (B) Shannon, Inverse Simpson and Bray-Curtis based Non-metric Multidimensional Scaling (NMDS) analysis of 16S rRNA gene sequencing of the intestinal microbiota before the initiation of the vaccine-based immunotherapy. 16S rRNA analyses were performed in non-co-housing conditions. At steady state, INF mice displayed higher alpha diversity compared with NI mice (p=0.02, Mann-Whitney test). (C) 16S rRNA gene sequencing of the intestinal microbiota before the initiation of the vaccine-based immunotherapy. Differential abundance analysis performed at the genus taxonomic level comparing 16S rRNA sequencing of INF vs NI mice at steady state. Only bacteria with an adjusted p value <0.05 are displayed (Benjamini-Hochberg method). (D) Shannon, Inverse Simpson and Bray-Curtis based Non-metric Multidimensional Scaling (NMDS) analyses of 16S rRNA gene sequencing of the intestinal microbiota during vaccine-based immunotherapy. The faecal microbiota of INF and NI mice were similar on day 8 post CpG/OVA vaccination (no statistical difference, Mann-Whitney test). (E) Faecal transplantation of INF faeces into NI or INF recipient mice. Recipient mice were treated with antibiotics and orally administered with 100 mg of faeces from INF mice on a daily basis for 5 days. Two weeks after the last oral gavage, vaccine-based immunotherapy was initiated on B16-OVA tumour-bearing mice (online supplemental figures S1E). Remarkably, vaccinated NI mice transplanted with INF faeces (n=9) are still capable to very efficiently control tumour growth compared with non-vaccinated (PBS) counterparts (n=7) (p<0.001, two-way ANOVA). Additionally, vaccinated NI mice transplanted with INF faeces (n=9) show better tumour growth control compared with vaccinated INF mice transplanted with INF faeces (n=4) (p<0.001, two-way ANOVA). We observed that faecal transplantation of INF faeces to NI recipient mice do not allow for H. pylori infection (online supplemental figures S2C). (F) Antibiotherapy (ATB) does not increase the efficacy of anti-cancer vaccination. Mice were infected with H. pylori during the neonatal period and treated with ATB at 6 weeks of age. One-month post ATB, mice were engrafted with B16-OVA melanoma cells and vaccinated (online supplemental figures S1F). We observed that the eradication of H. pylori infection by ATB (online supplemental figure S2B) did not substantially increase the efficacy of cancer vaccination (p<0.05, two-way ANOVA). For panels A–D and F, data shown are representative of two independent experiments. For the experiments described in figure 2A–D, the infectious status of each individual mouse was confirmed at sacrifice by performing rapid urease tests and/or colony forming unit on the stomach (see online supplemental figures S2A–C).
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    幽门螺杆菌-介导的免疫抑制的癌症免疫疗法是独立的幽门螺旋杆菌-诱导的粪便微生物群的修饰。(A)共住实验，无感染(NI) (n=9)和幽门螺旋杆菌-感染(INF)小鼠(n=10)皮下注射B16-OVA肿瘤细胞并接种疫苗。接种疫苗(VAC)对INF小鼠的肿瘤生长抑制非常有限。在第27和30天，接种NI和INF小鼠的肿瘤体积有统计学差异(p<0.001，双向方差分析(ANOVA))。在祭祀时，我们对NI和INF共饲养小鼠的胃进行了快速脲酶试验。我们只检测到幽门螺旋杆菌INF小鼠感染而NI小鼠不感染，证实合住不允许幽门螺旋杆菌传播(见在线补充图S2A)．(B)疫苗免疫治疗开始前，基于Shannon、Inverse Simpson和bry - curtis的肠道菌群16S rRNA基因测序非度量多维标度(NMDS)分析。在非共住条件下进行16S rRNA分析。稳态时，INF小鼠α多样性高于NI小鼠(p=0.02, Mann-Whitney检验)。(C)疫苗免疫治疗开始前肠道菌群16S rRNA基因测序。在属分类水平上进行差异丰度分析，比较稳定状态下INF与NI小鼠的16S rRNA测序。只有调整后的p值<0.05的细菌被显示(Benjamini-Hochberg法)。(D)基于Shannon、Inverse Simpson和bry - curtis的基于非度量多维标度(NMDS)的疫苗免疫治疗期间肠道菌群16S rRNA基因测序分析。接种CpG/OVA疫苗后第8天，INF和NI小鼠的粪便菌群相似(Mann-Whitney检验，无统计学差异)。(E)将INF的粪便移植到NI或INF受体小鼠。 Recipient mice were treated with antibiotics and orally administered with 100 mg of faeces from INF mice on a daily basis for 5 days. Two weeks after the last oral gavage, vaccine-based immunotherapy was initiated on B16-OVA tumour-bearing mice (在线补充图S1E)．值得注意的是，与未接种疫苗(PBS)的小鼠(n=7)相比，接种了INF粪便移植的NI小鼠(n=9)仍然能够非常有效地控制肿瘤生长(p<0.001，双向方差分析)。此外，移植INF粪便的接种NI小鼠(n=9)与移植INF粪便的接种INF小鼠(n=4)相比，肿瘤生长控制更好(p<0.001，双向方差分析)。我们观察到INF的粪便移植到NI受体小鼠不允许幽门螺旋杆菌感染(在线补充图S2C)．(F)抗生素疗法(ATB)不会增加抗癌疫苗的疗效。小鼠感染了幽门螺旋杆菌在6周龄时给予ATB治疗。ATB后一个月，小鼠移植B16-OVA黑色素瘤细胞并接种(在线补充图S1F)．我们观察到根除幽门螺旋杆菌感染ATB (在线补充图S2B)并没有显著提高癌症疫苗接种的有效性(p<0.05，双向方差分析)。对于面板A-D和F，所示数据代表两个独立的实验。中描述的实验图2所示模拟，每只小鼠的感染状态在牺牲时通过在胃上进行快速脲酶试验和/或集落形成单元来确认(见在线补充图S2A-C)．

    根除幽门螺旋杆菌抗生素治疗引起的感染不会增加基于疫苗的免疫治疗的疗效

    我们评估是否根除幽门螺旋杆菌的抗生素治疗引起的感染逆转了幽门螺旋杆菌-诱导的癌症免疫疗法疗效下降。在受感染的小鼠中，给药抗生素并不能有效地挽救以疫苗为基础的癌症免疫疗法的疗效(图2 f)．加上已知的抗生素对癌症患者免疫疗法疗效的不利影响，6 29这一结果提示抗生素治疗幽门螺旋杆菌感染很可能是提高癌症患者免疫疗法疗效的一个糟糕选择。

    幽门螺旋杆菌危及肿瘤特异性免疫反应

    我们接下来研究了幽门螺旋杆菌免疫系统的功能。用流式细胞仪分析CD8的绝对细胞数和活化状态+和CD4+非感染和感染小鼠脾脏和淋巴结中稳定状态下的T细胞、treg、迁移和驻留DC1细胞、DC2细胞、单核细胞来源的dc、巨噬细胞和单核细胞。我们还分析了血液中的T细胞亚群和单核细胞。我们确认,幽门螺旋杆菌感染不影响上述细胞类型的数量和激活状态在线补充图S3和S4)．确定没有影响幽门螺旋杆菌在稳定状态的免疫细胞上，我们接下来评估是否幽门螺旋杆菌在癌症的背景下影响前面描述的免疫细胞。我们观察到非感染和感染小鼠的血液、脾脏、非引流淋巴结和肿瘤引流淋巴结(分别为ndLNs和tdln)和肿瘤(s)中免疫细胞的绝对数量相似在线补充图S5)．重要的是，从上述MC38荷瘤小鼠的器官/组织/肿瘤中分离出的免疫细胞的流式细胞术分析表明，存在幽门螺旋杆菌单独作用无法显著影响与抗肿瘤免疫相关的免疫细胞群在线补充图S6和S7)．最后，我们分析了接受抗ctla4治疗的MC38荷瘤小鼠的免疫细胞。我们观察到，在未感染和感染的小鼠之间，肿瘤浸润免疫细胞的数量相似在线补充图S8)．此外，CD4细胞的绝对数量和激活状态+和CD8+未感染和感染小鼠的肿瘤、tdln、ndLNs和血液中的T细胞相似在线补充图S8数据没有显示)。值得注意的是，与接受抗ctla4治疗的非感染小鼠相比，我们观察到感染小鼠的肿瘤中髓样细胞数量显著减少，特别是激活单核细胞数量有减少的趋势在线补充图S8)．这些结果让人想起饭田的工作等，30.这表明肠道菌群可以调节单核细胞衍生细胞进入肿瘤的浸润，影响对癌症治疗的反应。

    癌症免疫疗法的疗效取决于肿瘤特异性免疫反应的产生。接下来我们评估了幽门螺旋杆菌首先，通过研究从肿瘤中提取的OT-1细胞的绝对细胞数量和分化状态，以及接种B16-OVA荷瘤小鼠的ndLNs和tdln的效应功能。我们观察到感染小鼠的ndLNs和tdln中肿瘤特异性T细胞的数量和激活状态下降(图3一)．LN中OT-1细胞数量的减少部分是由于与未感染的对照组相比，在感染小鼠的LN中观察到的排出接种部位的OT-1细胞的疫苗诱导增殖较低(图3 b)．此外，我们观察到感染小鼠肿瘤中活化的OT-1细胞数量减少(图3一)．值得注意的是，肿瘤和tdln中发现了相似的OT-1细胞数量和激活状态h .猫属-感染或未感染的小鼠(见在线补充图S9A)．最后，通过体内杀伤实验，我们观察了接种后OT-1细胞的细胞毒活性幽门螺旋杆菌-感染的小鼠比未感染或h .猫属来华的老鼠(见图3 b而且在线补充图S9B)．总的来说，我们的数据表明，疫苗启动的肿瘤特异性免疫反应在幽门螺旋杆菌来华的老鼠。

    Helicobacter pylori jeopardises tumour-specific immune responses. (A) Absolute cell number and activation status of OT-1 CD8+ T cells isolated from the tdLN, ndLN and tumour(s) of non-infected (NI) and infected (INF) vaccinated B16-OVA tumour-bearing mice (days 10 and 15 post B16 inoculation, respectively, for LNs and tumours). Activated OT-1 cells that were defined has CD44+CD62L−. (B) Left panel: percentage of proliferating OT-1 cells in the tdLN of NI and INF mice evaluated by carboxyfluorescein succinimidyl ester staining. Right panel: in vivo cytotoxic activities of OT-1 cells in vaccinated NI and INF mice. (C) The presence of H. pylori affects the functionality of DCs. Left panel: expression of the activation marker CD86 on CD11c+CD11b−CD8a+ DCs in the tdLN of NI and INF mice. Right panel: frequency of proliferating OT-1 cells on ex vivo stimulation with DCs isolated from the spleen of NI or INF mice. Data are representative of three independent experiments (NI, n=9; INF, n=10) (p<0.05, unpaired t-test). (D) The presence of H. pylori affects innate immune responses, as determined by inflammatory cytokine (TNFα, IFNγ, IL-6 and IL-17) levels in the serum of NI and INF mice. NI and INF B16-OVA tumour-bearing mice were injected with OT-1 cells and vaccinated with OVA in CpG. The serums were recovered on days 1, 2 and 3 postvaccination. For panels A–C, data shown are representative of three independent experiments. For panel D, data shown are representative of two independent experiments. For the experiments described in figure 3A–D, the infectious status of each individual mouse was confirmed at sacrifice by performing rapid urease tests and/or colony forming unit on the stomach (see online supplemental figures S2E). DCs, dendritic cells; MFI, mean fluorescence intensity; ndLN, non-draining lymph nodes; tdLN, tumour-draining lymph node.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
    图3

    幽门螺杆菌危及肿瘤特异性免疫反应。(A) OT-1 CD8的绝对细胞数和激活状态+T细胞从非感染(NI)和感染(INF)接种B16- ova荷瘤小鼠的tdLN、ndLN和肿瘤中分离出来(分别在B16接种后第10天和第15天，用于LNs和肿瘤)。活化的OT-1细胞被定义为CD44+CD62L−．(B)左图:NI和INF小鼠tdLN中增殖OT-1细胞的百分比，用羧基荧光素琥珀酰咪酯染色评价。右图:接种过疫苗的NI和INF小鼠体内OT-1细胞的细胞毒活性。(C)的存在幽门螺旋杆菌影响数据中心的功能。左图:激活标记CD86在CD11c上的表达+CD11b−CD8a+NI和INF小鼠tdLN中的dc。右图:NI或INF小鼠脾脏分离的dc在体外刺激下OT-1细胞增殖的频率。数据代表三个独立实验(NI, n=9;INF, n=10) (p<0.05，非配对t检验)。(D)存在幽门螺旋杆菌影响先天免疫反应，这是由NI和INF小鼠血清中的炎症细胞因子(TNFα， IFNγ， IL-6和IL-17)水平决定的。NI和INF B16-OVA荷瘤小鼠在CpG中注射OT-1细胞并接种OVA。分别于接种后第1、2、3天回收血清。对于面板A-C，所示数据代表三个独立的实验。对于图D，所示数据代表两个独立的实验。中描述的实验图3模拟，每只小鼠的感染状态在牺牲时通过在胃上进行快速脲酶试验和/或集落形成单元来确认(见在线补充图S2E)．DCs,树突细胞;MFI，平均荧光强度;ndLN，非引流淋巴结;tdLN，肿瘤引流淋巴结。

    此前有报道称，肠道菌群可以调节DC功能，从而影响CD8+T细胞启动。28日31日据此，我们推断肿瘤免疫反应的降低可能与幽门螺旋杆菌全身的直流缺陷。9 - 12我们确实在B16-OVA移植后24小时内检测到感染小鼠tdln中DC1和DC2细胞的激活缺陷(图3 c)．接下来，通过体外共培养实验，我们观察到感染小鼠的脾树突状细胞促进OT-1细胞低抗原特异性增殖(图3 c)．综合来看，这些结果证明了这一点幽门螺旋杆菌减少直流激活过程，12 32它们的交叉呈现活性和危害由接种疫苗引起的肿瘤特异性免疫反应。

    最后，我们观察到在OVA/CpG疫苗接种后第1天，感染小鼠血清中炎症细胞因子的产生显著减少(图3 d)．值得注意的是，IFNγ，一种在肿瘤疫苗接种效果中起关键作用的细胞因子在线补充图S10)，在受感染小鼠的血清中显著减少(图3 d)．总之，可以得出结论，通过抑制先天免疫反应(dc交叉呈现活性和疫苗诱导的炎症细胞因子产生)，幽门螺旋杆菌降低基于疫苗的免疫疗法引发的肿瘤特异性免疫反应，导致其疗效下降。

    幽门螺旋杆菌血清阳性与NSCLC患者抗pd1免疫治疗的有效性降低相关

    我们对两组独立的非小细胞肺癌(NSCLC)患者进行了回顾性研究，以评估两者之间的相关性幽门螺旋杆菌血清阳性与癌症免疫疗法的有效性。幽门螺旋杆菌使用经验证的商业ELISA试验确定血清阳性。在第一批60名来自法国第戎的非小细胞肺癌患者中，我们发现幽门螺旋杆菌18例患者血清中检出抗原定向IgG抗体。在来自加拿大蒙特利尔的29名非小细胞肺癌患者的第二队列中，我们检测到幽门螺旋杆菌8例患者血清中检出抗原定向IgG抗体。值得注意的是，在第戎的队列中，幽门螺旋杆菌血清阳性被发现与抗pd -1治疗的NSCLC患者生存期明显降低相关(图4一, p = 0.001)。生存中位数为6.7个月幽门螺旋杆菌血清阳性患者vs血清阴性患者15.4个月。此外，在蒙特利尔队列中，幽门螺旋杆菌血清阳性被发现与抗pd -1治疗的NSCLC患者无进展生存期明显降低相关(图4 b， p<0.05)和总生存期的数值差异(9.3个月幽门螺旋杆菌血清阳性患者与血清阴性患者相比为21.7个月)。从两个接受抗pd -1治疗的独立非小细胞肺癌患者队列中获得的数据清楚地证明了这一点幽门螺旋杆菌血清阳性与抗pd -1免疫治疗的有效性较低有关。进一步的前瞻性研究将进一步验证我们的数据。最后，我们对来自第戎队列的NSCLC患者的石蜡包埋的福尔马林固定肿瘤中提取的RNA进行RNAseq分析。33虽然我们分析了有限数量的患者，但我们观察到单核细胞谱系的细胞数量显著减少(图4 c)以及感染患者肿瘤中I型干扰素、IFNγ和IL-6诱导的基因表达明显低于非感染患者(图4 d)．这些结果与临床前数据(图3 d看看在线补充图S8C1)，表明抑制先天免疫反应的方法是幽门螺旋杆菌在感染宿主中可能会降低癌症免疫疗法的疗效。30.

    Helicobacter pylori seropositivity is associated with reduced effectiveness of anti-PD-1 immunotherapy in patients with non-small cell lung cancer (NSCLC). (A) Dijon cohort: overall survival and overall progression-free survival of patients with NSCLC from the Dijon cohort (60 patients). Kaplan-Meier curves depicting the overall survival of patients with NSCLC treated with nivolumab or pembrolizumab (anti-PD-1 monoclonal antibodies). H. pylori seropositivity was found to be associated with a clearly defined decrease of NSCLC patient survival on anti-PD-1 therapy (p=0.001, Wald test as part of a univariate of Cox model). (B) Montreal cohort: overall survival and overall progression-free survival of patients with NSCLC from the Montreal cohort (29 patients). Kaplan-Meier curves depicting the overall survival of patients with NSCLC treated with nivolumab or pembrolizumab. Log-rank (Mantel-Cox) test *p<0.05. (C) H. pylori infection substantially affects myeloid cells in the tumour(s) of patients with NSCLC. RNAseq analysis was performed on the tumours of patients from the discovery cohort. MCP-counter software was used to determine the tumour infiltration of CD3+ T cells, CD8+ T cells, cytotoxic lymphocytes, NK cells, B lymphocytes, cells originating from monocytes (monocytic lineage), myeloid-derived dendritic cells, neutrophils, endothelial cells and fibroblasts. We observed that in the tumours of H. pylori seronegative patients, there was a substantially higher expression of genes expressed by cells originating from monocytes compared with H. pylori seropositive patients (p=0.01, Wilcoxon test). (D) Gene-set enrichment analyses (GSEA) were performed on the RNAseq data and revealed that H. pylori infection substantially decreases the expression of genes that are controlled by type I IFN, IFNγ and IL-6 in the tumours of patients with NSCLC undergoing immunotherapy. PD-1, programmed cell death protein 1.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
    图4

    幽门螺杆菌血清阳性与非小细胞肺癌(NSCLC)患者抗pd -1免疫治疗的有效性降低相关。(A)第戎队列:第戎队列中非小细胞肺癌患者的总生存期和总无进展生存期(60例)。Kaplan-Meier曲线描述了接受nivolumab或pembrolizumab(抗pd -1单克隆抗体)治疗的NSCLC患者的总生存率。幽门螺旋杆菌血清阳性被发现与抗pd -1治疗的NSCLC患者生存期明显降低相关(p=0.001, Wald检验是Cox模型单变量的一部分)。(B)蒙特利尔队列:蒙特利尔队列中29例NSCLC患者的总生存期和总无进展生存期。Kaplan-Meier曲线描述了接受尼伏单抗或派姆单抗治疗的非小细胞肺癌患者的总生存率。Log-rank (Mantel-Cox)检验*p<0.05。(C)幽门螺旋杆菌感染在很大程度上影响非小细胞肺癌患者肿瘤中的髓细胞。对来自发现队列的肿瘤患者进行RNAseq分析。采用MCP-counter软件检测肿瘤中CD3的浸润情况+CD8 T细胞,+T细胞，细胞毒性淋巴细胞，NK细胞，B淋巴细胞，来自单核细胞的细胞(单核细胞系)，骨髓来源的树突状细胞，中性粒细胞，内皮细胞和成纤维细胞。我们在肿瘤中观察到幽门螺旋杆菌血清阴性患者，单核细胞表达的基因表达明显高于阴性患者幽门螺旋杆菌血清阳性患者(p=0.01, Wilcoxon检验)。(D)对RNAseq数据进行基因集富集分析(GSEA)，发现幽门螺旋杆菌在接受免疫治疗的NSCLC患者的肿瘤中，感染显著降低了I型IFN、IFNγ和IL-6控制的基因表达。程序性细胞死亡蛋白1。

    讨论

    在这项研究中，我们证明了这一点幽门螺旋杆菌感染在小鼠模型中部分阻断了ICIs的活性和基于疫苗的癌症免疫治疗。机械地，我们观察到幽门螺旋杆菌抑制受感染宿主的先天和适应性免疫反应，更具体地说，抑制抗肿瘤的CD8+T细胞的反应通过改变树突状细胞的交叉呈现活性。此外，我们报告幽门螺旋杆菌血清阳性与NSCLC患者抗pd1免疫治疗的有效性降低相关。

    已经有报道说幽门螺旋杆菌-感染的小鼠有缺陷的DC激活过程。9 - 12在哮喘小鼠的胃粘膜、肠系膜淋巴结和肺中观察到这些DC缺陷。12值得注意的是,这幽门螺旋杆菌-诱导的DC低激活导致哮喘小鼠中过敏原特异性Th2细胞的激活降低。19 34 35在这项研究中，我们提供了证据幽门螺旋杆菌-诱导的DC缺陷也导致肿瘤特异性CD8的激活降低+T细胞。幽门螺旋杆菌感染不仅影响DC功能，而且影响单核细胞和/或巨噬细胞的功能。事实上，在人类中，我们观察到，在接受抗pd1治疗的感染NSCLC患者的肿瘤中，单核细胞谱系的细胞数量减少，I型干扰素、IFNγ和IL-6诱导的基因表达大幅减少(图4 c)．此外，我们观察到接受抗ctla4治疗的感染小鼠肿瘤中活化单核细胞数量有减少的趋势(在线补充图S8)以及接种疫苗的感染小鼠血清中炎症细胞因子的产生减弱(图3 d)．不同毒力因子所产生的幽门螺旋杆菌如VacA， γ-谷氨酰转肽酶，中性粒细胞激活蛋白幽门螺旋杆菌尿素酶被认为会损害髓系细胞的活性。36更多的实验将决定这些幽门螺旋杆菌-衍生因子是降低癌症免疫疗法有效性的关键。

    我们的研究中有一个信息丰富而令人困惑的发现，那就是根除幽门螺旋杆菌抗生素治疗的感染不会恢复幽门螺旋杆菌-诱导的对癌症免疫治疗的低反应性。这可能是非特异性抗生素治疗介导的免疫增强细菌和/或减少的结果幽门螺旋杆菌全身的新生儿印记37免疫系统的一种病毒，即使在它被消灭后仍然存在。这种持续调节免疫系统功能的新生儿印迹已经在小鼠中报道过。38 39由此，根除幽门螺旋杆菌使用一种不影响微生物群的策略，如接种疫苗，很可能是不成功的，因为免疫系统已经被预先烙印了。

    我们的临床研究在两个独立的中心进行，一个位于欧洲，另一个在北美。来自两个队列的结果清楚地表明PD-1免疫疗法的疗效较低幽门螺旋杆菌血清阳性的NSCLC患者。从这一结果在前瞻性研究中得到证实的角度来看，它有两个重要的临床意义。第一，血清学检测幽门螺旋杆菌血清阳性可能是预测ICIs对非小细胞肺癌患者疗效的有力工具。未来的临床研究将确定是否同样的相关性幽门螺旋杆菌血清阳性和癌症免疫疗法的有效性降低可以扩展到患有其他形式癌症的患者。第二，这可能是非常有用的考虑幽门螺旋杆菌血清阳性作为一种混杂因素，可能会妨碍患者粪便样本中细菌类群的识别，影响对ICIs的阳性或阴性反应。同样的,幽门螺旋杆菌血清阳性也可能排除任何临床利益带来的粪便微生物群移植的icii治疗患者。40-42

    总之，我们的研究与公认的微生物组在癌症免疫治疗效果中发挥的主要作用一致。1然而，我们的研究首次揭示了胃菌群影响对ICIs的反应幽门螺旋杆菌在癌症免疫疗法的背景下，血清学将是对患者个性化治疗的有力工具。

    材料和方法

    老鼠

    CD45.2+C57BL/6小鼠来自法国Charles River (Ecully, France)， CD45.1+OT-1 C57BL/6小鼠由Gregory Verdeil博士(洛桑大学)提供。小鼠在特定的无病原体条件下繁殖。所有动物实验均按照州动物保护法进行。

    幽门螺旋杆菌感染

    幽门螺旋杆菌P49是一种适应于小鼠和小鼠的人类临床分离物h .猫属写明ATCC 49179株43在添加10%胎牛血清(FBS)的脑心灌注(BHI)中培养。小鼠在新生期(4日龄和5日龄)两次感染2.5×108H．幽门P49菌或一次带5×107h .猫属(5日龄)。将20 μ L的BHI灌胃给菌。对照组取20 μ L的BHI。在合住实验中，属于同一窝的新生儿被感染幽门螺旋杆菌或以BHI作为对照，然后在同一笼断奶。受感染和未受感染的窝鼠接受了相同的治疗。

    的评估幽门螺旋杆菌殖民

    尿素酶快速检测(Cleartest Servoprax，德国)和定量幽门螺旋杆菌如前所述，菌落形成单位用于评估感染状态。44

    MC38肿瘤细胞

    Greta Guarda教授(瑞士洛桑生物化学研究所)提供了MC38结肠腺癌细胞。细胞在添加10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的罗斯威尔公园纪念研究所(RPMI)培养基中培养，37℃，5% CO2．

    B16-OVA肿瘤细胞

    表达OVA蛋白(B16-OVA)的B16-F10小鼠黑色素瘤细胞由Gregory Verdeil博士提供。23RPMI中添加10%胎牛血清，1%青霉素/链霉素，1 mM丙酮酸钠，10µg/mL G418, 37℃，5% CO培养2．

    MC38肿瘤模型与ICI治疗

    MC38肿瘤细胞(5×105)皮下注射到成年男性CD45.2切除后的侧腹皮肤+新生小鼠感染幽门螺旋杆菌或以BHI作为对照。小鼠接受100 μ L PBS，分别是IgG2b同型(克隆MPC-11, BioXCell)或抗小鼠抗ctla4(克隆9D9, BioXCell)单独或与抗小鼠抗pd - l1(克隆10F)联合使用。9G2, BioXCell)在肿瘤移植后第7、10、13和16天。第一针注射抗体200µg，后三针注射抗体100µg。从肿瘤植入后第7天开始，使用游标卡尺根据长度和宽度测量肿瘤体积，此后每2-3天测量一次在线补充图S1A, B)．

    AOM/DSS结肠癌模型与ICI治疗

    感染和非感染C57BL/6小鼠在8周龄时腹腔注射AOM。45小鼠口服三轮DSS。最后一次给药后10天，小鼠注射100 μ g抗ctla4抗体(5次，间隔3天)，最后一次注射抗ctla4抗体后7天献祭(见在线补充图S1D)．献祭时，我们计算结肠内肿瘤的数量。25

    癌症疫苗接种模型

    B16-OVA黑色素瘤细胞(2×105细胞)皮下注射到CD45.2成年女性剃毛的腹部皮肤+新生小鼠感染幽门螺旋杆菌或h .猫属或接受BHI治疗。六天后，CD45.1+OT-1 CD8+用CD8a从淋巴结和脾脏分离T淋巴细胞+T细胞分离试剂盒(MACS, Miltenyi Biotec GMBH, Solothurn，瑞士)。OT-1 CD8+T细胞(1×106)通过静脉注射过继转移到受体小鼠体内。第二天，10µg Ova peptide (siinfkl)和50µg CpG(由Gregory Verdeil博士(洛桑大学)提供)在100µL PBS中皮下注射到肿瘤部位，以免疫小鼠。抗IFNγ中和抗体(250 μ g/剂量，XMG1.2克隆，BioXcell)在OVA+CpG接种当天和24小时后腹腔注射，以评价IFNγ在疫苗诱导的肿瘤控制中的生物学作用(见在线补充图S1G)．从肿瘤植入后第7天开始，使用游标卡尺根据长度和宽度测量肿瘤体积，此后每2-3天测量一次在线补充图S1C)．在肿瘤移植后15天处死小鼠进行流式细胞术分析。

    抗生素治疗

    幽门螺旋杆菌通过口服两种抗生素(阿莫西林(28.6 mg/kg/天)和克拉霉素(14.3 mg/kg/天)和质子泵抑制剂奥美拉唑(400 μmol/kg/天)的组合来根除感染(见在线补充图S1F)．46疗程为7 d。消灭的效果是通过牺牲来控制的在线补充图S2B)．

    粪便移植

    成年感染小鼠和非感染小鼠分别用恩诺沙星、阿莫西林和克拉维酸治疗3周47每日口服感染小鼠粪便100 mg，持续5天。48在最后一次给药两周后，我们开始B16-OVA黑色素瘤模型(见在线补充图S1E)．

    CFSE标记

    OT-1 CD8+从OT-1小鼠的淋巴结和脾脏中收集T细胞，在温PBS中洗涤两次，然后与羧荧光素琥珀酰咪酯(CFSE, Enzo生命科学，洛森，瑞士)在温PBS (2 μ M)中稀释10分钟，37°C。细胞在冷PBS中洗涤一次，在添加10%胎牛血清的RPMI中洗涤两次。49cfse标记细胞用于体内OT-1 CD8+T细胞增殖实验和体外交叉呈现试验。

    体内OT-1 CD8+T细胞增殖

    成人CD45.2+C57BL/6小鼠接受2×105皮下注射B16-OVA细胞。6天后，1×106CFSE-labelled CD45.1+OT-1 CD8+T细胞通过静脉注射过继转移。次日，小鼠在肿瘤对侧皮下注射10µg OVA肽(siinfkl)和50µg CpG / 100µL PBS免疫。免疫后3天，处死小鼠，收集tdln进行流式细胞术分析。在CFSE稀释分析中，用靶向CD45.2的抗体对细胞进行染色;CD45.1;CD3和CD8，见流式细胞术切片在线补充方法获取详细信息。

    体内杀伤试验

    体内杀伤实验是通过静脉注射cfse标记的靶细胞进行的，如Trompette所述等．50简单地说，脾细胞分别装OVA肽(200 μ M)或不装OVA肽，用0.5 μ M或5 μ M的CSFE标记。将两个标记的细胞群以1:1的比例混合静脉注射到受体小鼠(见在线补充图S1H)．注射后14h，受体小鼠脾脏恢复正常，CFSE与对照组比较低和CFSE高用流式细胞术检测OT-1细胞的杀伤活性。

    CD11c+直流隔离

    脾脏的幽门螺旋杆菌-感染和非感染CD45.2+收集C57BL/6成年小鼠，用胶原酶IV (Sigma)和脱氧核糖核酸酶(Sigma)在37°C孵育20分钟。脾脏经40 μ m细胞滤网过滤，用添加10%胎牛血清(FCS)的RPMI洗涤。细胞在MACS缓冲液和CD11c中洗涤+使用Pan树突状细胞分离试剂盒(MACS, Miltenyi Biotec GMBH)分离树突状细胞。

    体外交叉呈现试验

    CFSE-labelled OT-1 CD8+T细胞(2×105)用2×10进行体外培养5CD11c+RPMI中dc添加10% FCS, 1% P/S;1 mM丙酮酸钠，0.05 mM β-巯基乙醇和10 mM HEPES存在不同浓度的OVA蛋白(Ovalbumin, EndoFit, InvivoGen)。在37°C孵育72小时后，回收细胞并用流式细胞术分析。

    血清中炎性细胞因子的定量

    使用试剂盒说明，使用LEGENDPlex小鼠炎症面板试剂盒(Biolegend, 740446)在OVA/CpG免疫后的不同时间点，测量了非感染和感染小鼠血清中的广谱细胞因子。使用LSRFortessa细胞分析仪(BD，圣何塞，加利福尼亚州，美国)获取数据，并使用Biolegend的LEGEND的plex数据分析软件进行分析。

    幽门螺旋杆菌免疫球蛋白ELISA

    幽门螺旋杆菌根据酶联免疫吸附试验(ELISA)的方案，在患者血浆中定量检测IgG抗体(幽门螺旋杆菌IgG ELISA Kit (Genesis Diagnostics)。在450nm处的光密度(OD)在microplate reader (Tecan, Infinite M200 Pro)中读取。

    统计分析

    使用GraphPad Prism V.8g，使用学生t检验(无配对，双尾)、Mann-Whitney或双向方差分析检验计算组间显著性水平。图表和图表图例注释了被测组之间的显著性水平。

    第戎不耐烦队列

    该队列包括来自法国三所大学医院的60例IIIB或IV期非小细胞肺癌患者，他们之前接受过一到两组化疗。所有患者均接受一线铂基化疗。所有患者均无表皮生长因子受体、间变性淋巴瘤激酶、B-Raf原癌基因丝氨酸/苏氨酸激酶或ROS1致癌驱动肿瘤。在进展中，他们接受每2周静脉单药给药3mg /kg的尼伏单抗。每4个周期用CT扫描评估肿瘤反应。肿瘤的收集、储存和使用得到患者的知情和书面同意。临床特征见在线补充表1．

    生存曲线

    建立单变量和多变量Cox比例风险模型，以估计95% CI的hr。在临床变量中，对年龄、性别、WHO表现状况和组织学进行评估，认为不显著(p值>0.05)。

    使用Kaplan-Meier方法估计生存概率，使用log-rank检验比较生存曲线。使用R软件进行统计分析((http://www.R-project.org/)和使用GraphPad Prism V.7.03创建的图表。

    蒙特利尔病人群

    接受ICIs治疗的转移性NSCLC患者(n=29)被前瞻性纳入(在线补充表2)．通过CRCHUM肺癌生物库(伦理协议18.085-17.035，加拿大蒙特利尔)收集这些患者的血液和粪便样本。所有患者在研究入组前都提供了知情同意。临床特征见在线补充表2．

    数据可用性声明

    资料应合理要求提供。

    伦理语句

    病人同意发表

    伦理批准

    该研究方案得到了医院伦理委员会的批准。这项研究是根据《赫尔辛基宣言》的指导方针进行的。

    致谢

    我们感谢Solange Peters教授(瑞士洛桑CHUV肿瘤科)对制定瑞士癌症研究基金会支持的提案的支持。我们感谢Aurelien Trompette在粪便移植和体内细胞毒性分析方面的专业知识和指导。

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    补充材料

    • 补充数据

      这个网络仅文件已由BMJ出版集团从作者提供的电子文件生产(s)，并没有编辑的内容。

    脚注

    • LV和ER的贡献相当。

    • 贡献者DV构思并设计了这个项目。PO、LV、ER、FG、BR、GV、DV对数据进行分析并撰写稿件。ER、PO、LV、BM、CB、CT、CR、MML、MM、EM、EL进行了实验。所有作者对数据进行了解释、讨论和修改。

    • 资金这项工作得到了瑞士癌症研究基金会(KFS-4452-02-2018, DV;KFS-4840-08-2019, GV)、Max基金会Cloëtta (GV)、Emma Muschamp基金会(DV)、卟生学基金会(EM)以及Faculté de Biologie和Médecine de Lausanne (DV)。

    • 相互竞争的利益FG获得礼来、赛诺菲、安进的口头沟通酬金，是默克雪兰诺、安进和赛诺菲的顾问委员会。其余作者声明无利益冲突。

    • 来源和同行评审不是委托;外部同行评议。

    • 补充材料本内容由作者提供。它没有经过BMJ出版集团有限公司(BMJ)的审查，也可能没有经过同行评审。讨论的任何意见或建议仅仅是那些作者(s)和不被BMJ认可。BMJ放弃从放在内容上的任何依赖产生的所有责任和责任。如果内容包含任何翻译材料，BMJ不保证翻译的准确性和可靠性(包括但不限于当地法规、临床指南、术语、药品名称和药物剂量)，并且不对翻译和改编或其他原因引起的任何错误和/或遗漏负责。