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摘要
客观的程序性死亡1及其配体1 (PD-1/PD-L1)免疫疗法有望用于晚期肺癌的治疗，但其有效率有待提高。肠道菌群在免疫治疗致敏和免疫应答中起着至关重要的作用人参已被证明具有免疫调节潜力。在本研究中，我们旨在研究人参多糖(GPs)和αPD-1单克隆抗体(mAb)联合治疗是否可以通过调节肠道菌群来增敏反应。
设计给予同基因小鼠模型GPs和αPD-1单抗，通过粪便微生物群移植(FMT)和16S PacBio单分子实时(SMRT)测序评估联合治疗对肠道微生物群的增敏抗肿瘤作用。为了评估免疫相关代谢物，对血浆样本进行了代谢组学分析。
结果我们发现GPs通过增加微生物代谢产物戊酸和降低L-kynurenine以及Kyn/Trp的比值来增加对αPD-1单抗的抗肿瘤反应，这有助于抑制调节性T细胞和诱导T细胞eff复合处理后的细胞。此外，微生物分析表明，丰度Parabacteroides distasonis而且拟杆菌vulgatus在临床中，抗pd -1阻断反应者高于无反应者。此外，联合疗法通过将无反应的肠道菌群重塑为有反应的肠道菌群，使接受FMT微生物的6只无反应小鼠对PD-1抑制剂的反应变得敏感。
结论我们的研究结果表明，GPs联合αPD-1单抗可能是一种提高非小细胞肺癌患者抗pd -1免疫治疗敏感性的新策略。肠道菌群可以作为一种新的生物标志物来预测抗pd -1免疫治疗的反应。
- 癌症
- 耐药性
- 生命起源以前的
- 益生菌
- 癌症免疫生物学
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本研究的意义
关于这个问题我们已经知道了什么?
肠道菌群在形成全身免疫系统中起着至关重要的作用，并且对临床前肿瘤模型和癌症患者中靶向CTLA-4和程序性死亡1及其配体1 (PD-1/PD-L1)通路的抗癌免疫治疗的有效性具有重大影响。
非小细胞肺癌(NSCLC)患者对抗pd -1免疫治疗的应答率低于25%，膳食补充剂可能会影响肠道微生物群和抗pd -1免疫治疗的应答。
人参多糖(GPs)是人参中含量最丰富的成分之一人参，对免疫调节和抗肿瘤作用有重要影响。
本研究的意义
新的发现是什么?
GPs增强了Lewis肺癌小鼠αPD-1单克隆抗体(mAb)的抗肿瘤作用。
GPs和αPD-1单抗联合治疗可增加活化的CD8+T细胞数量和减少Foxp3+外围的调节性T细胞数量，与犬尿氨酸/色氨酸比值的降低一致。
16S PacBio SMRT测序检测到，对派姆单抗有应答者和无应答者的NSCLC肠道菌群多样性明显不同，且有两种差异丰富的菌群。Parabacteroides distasonis而且拟杆菌vulgatus被发现。
GPs和αPD-1单抗的联合治疗将肠道微生物群的组成从无应答者重新塑造为应答者，这恢复了移植PD-1无应答粪便样本的小鼠对αPD-1单抗的反应。
在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?
肠道菌群状态，如α多样性，可作为预测非小细胞肺癌患者抗pd -1免疫治疗反应的生物标志物。
gp代表了一类新的益生元，可增强NSCLC患者对抗pd -1免疫治疗的反应。
p . distasonis而且b . vulgatus可作为抗pd -1免疫治疗的佐剂。
简介
肺癌是世界上发病率和死亡率最高的癌症。1大约80%-85%的肺癌是非小细胞肺癌(NSCLCs)。程序性死亡抑制剂1 (PD-1)及其配体PD-L1是缺乏EGFR或ALK致敏突变的转移性NSCLC的有效治疗方法。2 - 6然而，即使这些生物标志物被用作金标准，反应率(<25%)仍然不能令人满意，甚至导致超进展性疾病(HPD)。7 8因此，仍然需要对大多数晚期NSCLC患者进行更有效的一线治疗，并需要预测性生物标志物来识别可能受益于新疗法的患者。9广泛的研究已经确定了PD-1/PD- L1途径抑制剂与其他治疗或具有免疫调节作用的药物的新组合，这些药物可能增强抗肿瘤反应。10 11最近，肠道菌群在癌症免疫治疗中引起了极大的热情。如脆弱拟杆菌，叫多形拟杆菌，双歧杆菌属，Akkermansia muciniphila而且Faecalibacteriumsp .已被证明在临床前肿瘤模型和癌症患者中对癌症免疫治疗有良好的反应。12 - 15因此，调节肠道菌群的策略已被提出用于治疗癌症患者，并作为新的反应预测生物标志物。
人参在亚洲已被广泛使用数千年，不仅作为药物，而且作为膳食补充剂。长期服用人参提取物已被证明可以通过增加大鼠肠道微生物群的丰度来调节双歧杆菌属，Allobaculum，乳酸菌，梭状芽胞杆菌而且Parasutterella．16全等报道称，人参全提取物特异性地提高了其丰度粪肠球菌，这是由于其长链脂肪酸代谢物肉豆蔻酸具有抗肥胖作用。17人参含有许多活性成分，包括人参皂苷、精油、肽聚糖、多糖、含氮化合物、脂肪酸和酚类化合物。18在这些成分中，人参多糖(GPs)已被证明具有免疫调节功能，如激活巨噬细胞，T细胞和自然杀伤细胞。此外，GPs改善肠道代谢，调节肠道菌群，特别是促进生长乳酸菌种虫害和拟杆菌两种代谢人参皂苷的细菌。19日20然而，gp的治疗潜力在癌症免疫治疗中还没有得到很好的探索。本研究的主要目标是确定gp的协同抗肿瘤作用，并研究其潜在作用是否与肠道菌群调节及其相关治疗机制有关。
方法
老鼠实验
8-12周龄的C57BL/6J小鼠和人源化PD-1敲入小鼠(HuPD-1)在澳门科技大学中药质量研究国家重点实验室动物设施独立通风的笼子中饲养。
大约5×105Lewis肺癌(LLC)细胞和5×104将B16-F10细胞皮下接种于小鼠右侧。将24只不同窝龄小鼠平均分为4组:Vehicle (PBS处理)、αPD-1单克隆抗体(mAb)(250µg/只，克隆:RMP1-14, Bio X Cell)、GPs (200 mg/kg)和GPs + αPD-1单抗组。在肿瘤接种和注射αPD-1单抗后，于第9天肿瘤体积约为50 mm时，每日口服GPs治疗，每3天注射5次3.．肿瘤体积和体重每3天测量一次。
抗体和流式细胞仪
在实验结束时，采集血液、脾脏和肿瘤进行流式细胞术分析。根据制造商说明书，使用LP分离试剂盒(Miltenyi Biotec, Germany)分离固有层单个核细胞(lpmc)。最初，通过在预消化溶液中摇动组织，上皮内淋巴细胞(iel)从黏膜中被破坏。然后，使用温和的MACS解离剂将LP组织进一步进行酶处理和机械解离成含有LPMCs的单细胞悬浮液。
对于FACS分析，单细胞悬液用以下抗体进行染色:PerCP抗小鼠CD45, APC抗小鼠CD3, FITC抗小鼠CD4, PE/Cy7抗小鼠CD8 (Biolegend，克隆30-F11;克隆17A2，克隆RM4-5，克隆53-6.7，分别来自美国)。细胞内染色时，用PMA (50 ng/mL)、离子霉素(1µg/mL)和BD高尔基STOP在37℃刺激细胞4-6小时T．固定并渗透后，用APC/Cy7抗鼠干扰素(IFN)-γ、PE/Dazzle 594肿瘤坏死因子(TNF)-α、PE抗鼠颗粒酶B (GZMB)、PE抗鼠FoxP3、PerCP/Cy5.5抗鼠ROR-γt和PE抗小鼠白介素- 17a (Biolegend，克隆XMG1.2、克隆506346、克隆259D、克隆MF-14、克隆Q31-378、克隆TC11-18H10.1，分别美国)染色。流式细胞仪分析使用FACSArial III流式细胞仪(BD，美国)。使用FlowJo软件(V.10.4, FlowJo，美国)分析数据。
血浆中短链脂肪酸和色氨酸的代谢组学分析
小鼠血样在3000rpm下离心15 min，收集上清液。然后使用超高效液相色谱-质谱(UPLC-MS)对样品进行衍生和分析。血浆中的短链脂肪酸(SCFAs)、l -犬尿氨酸和l -色氨酸是按照前面描述的修改方案测定的。21日22
组织病理学评分和免疫组化染色
解剖肿瘤组织和结肠，部分植入4% PFA 48小时。石蜡包埋组织切片(5µm)用H&E染色进行形态学检查。采用免疫组化试剂盒(K8002;Dako, Glostrup，丹麦)根据制造商的协议。玻片在徕卡光学显微镜下扫描和观察(徕卡生物系统成像，美国)。
粪便菌群转移实验
将来自6个NR的粪便颗粒均质于10 mL无菌盐水中。然后，将200µL的悬液灌给每只6-8周龄的无菌小鼠。此外，在每只动物的皮毛上再加100 μL。GF小鼠灌胃粪便样本3次，持续2周。GF小鼠在第三军医大学(重庆，中国)和中山大学第一附属医院与辐照食物和蒸压水的无菌隔离器中饲养。粪便菌群移植(FMT)两周后，接种肿瘤细胞，并按上述方法用GPs和/或αPD-1单抗治疗小鼠。
iel的rna测序
如前所述，对iel进行了轻微修改。23总RNA按照RNeasy Plus Micro Kit (Qiagen, Germany)的指示提取。详细的测序和差异表达分析方法描述在线补充方法．
粪便DNA提取及16S rRNA测序
根据制造商的说明，分别使用QIAamp PowerFecal DNA试剂盒(Qiagen, Hilden，德国)或Shoreline Complete StrainID试剂盒(Shoreline Biome，美国)提取患者和小鼠粪便样本的总基因组DNA。在1%琼脂糖凝胶上检测DNA浓度和纯度。Amplicon库使用PacBio SMRTbell Express Template Prep Kit V.3.0 (PacBio)创建，并根据制造商的建议在澳门科技大学的PacBio Sequel系统上测序。使用SBanalyzer V.3.0 (Shoreline Biome)对映射到Athena数据库的所有reads进行分类识别。24利用QIIME 2进行进一步分析。
统计分析
所有数据均以均数±均数表示，组间差异采用双向方差分析(ANOVA)或单向方差分析(one-way ANOVA)进行分析。差异显著的临界p值设为0.05。采用GraphPad Prism V.8.0.2 (San Diego, California, USA)进行统计分析。p<0.05为差异有统计学意义。
结果
联合治疗可增强αPD-1单抗在荷瘤小鼠模型中的抗肿瘤作用
为了研究GPs是否能增强αPD-1单抗的抗肿瘤作用，我们首先评估了C57 BL/6J小鼠的肿瘤生长和进展情况。分别在肿瘤接种后第0天和第9天开始给小鼠口服GPs灌胃和注射αPD-1单抗(图1一个)．抗肿瘤作用最初是通过肿瘤体积和肿瘤重量(图1 b, C)．联合治疗后，常规携带llc的小鼠对αPD-1单抗的反应增加，肿瘤进展减少(在线补充图1A)．第24天，与Vehicle和αPD-1mAb单独治疗组相比，联合治疗组的肿瘤生长抑制率分别为75.2%和65.1%。相应地，小鼠的存活时间显著延长(图1 d)．这些结果表明，联合治疗可以提高αPD-1单抗在含llc小鼠体内的抗肿瘤作用。我们还在具有LLC细胞的HuPD-1小鼠中观察到这种增强的抗肿瘤作用(图1 e, F)和B16-F10荷瘤小鼠(在线补充图1B,C)．
GPs增强了αPD-1单抗在常规和人源PD-1敲入(HuPD-1) llc小鼠中的抗肿瘤作用。(A) GPs + αPD-1单抗治疗llc小鼠的示意图。(B)各组均显示肿瘤生长曲线。常规C57 BL/6J小鼠在肿瘤接种后第0天注射GPs，第9天腹腔注射αPD-1单抗。(C)常规携带llc小鼠的肿瘤重量。(D)常规llc小鼠的生存曲线。(E)在huPD-1敲入llc小鼠模型中显示各组肿瘤生长曲线。(F) HuPD-1敲入荷瘤小鼠的肿瘤重量。数据代表一个或三个独立的实验，每组n= 5-10。误差柱表示平均值±SEM。 Tumour growth curves were assessed by two-way ANOVA with Sidak correction. Tumour weight was assessed by one-way ANOVA. Log-rank (Mantel-Cox) tests were performed for survival data. *P<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. ANOVA, analysis of variance; GPs, ginseng polysaccharides; LLC, Lewis lung cancer; mAb, monoclonal antibody; PD-1, programmed death 1.
在活的有机体内联合治疗的抗肿瘤效果与增强免疫力有关
为了确定联合治疗对免疫系统的影响，我们使用流式细胞术分析了外周血、脾脏和肿瘤组织的免疫变化。我们观察到CD8+/ CD4+与单用αPD-1单抗组相比，联合组外周血组织(血液和脾脏组织)和肿瘤组织(图2一个)．CD8中功能性细胞因子IFN-γ、TNF-α和gzmb的产生+T细胞在周围组织和肿瘤组织中均有增加(图2罪犯, (在线补充图2)，显示联合用药的有益效果。同时，我们也观察到FoxP3的下调+调节T (Treg)细胞在外周和肿瘤组织中的表达(图2 e)．免疫组化在肿瘤组织中得到了一致的结果(图2 f - k)．这些结果表明，联合治疗可能通过激活CD8而起作用+T细胞和抑制treg的功能。
细胞毒性CD8+联合治疗后，T细胞数量增加，而Treg细胞数量减少。在常规携带llc的小鼠中，在肿瘤接种后24天，用αPD-1单抗、GPs或GPs和αPD-1单抗的组合治疗小鼠。研究人员分析了血液、脾脏和肿瘤中的免疫细胞。(安妮)CD8+/ CD4+血液、脾脏和肿瘤组织中CD8 +T细胞和FOXP3 CD4+ T细胞之间的T细胞比例、IFN-γ、TNF-α、颗粒酶B (GZMB)的表达。(F) ×400倍率下肿瘤组织中CD4、CD8、IFN-γ、TNF-α和GZMB的代表性IHC谱。比例尺=50µm。(G-K)利用image J软件(NIH)和ImmunoRatio Plugin定量分析每个野区阳性面积。数据以15个字段的平均值表示，用平均值±标准差表示(n=6)。所有实验都重复两到三次。每个符号代表一种单独的动物。数据为均数±标准差，采用单因素方差分析。*P<0.05， ** P< 0.01， *** P< 0.001。方差分析; GPs, ginseng polysaccharides; IFN-γ, interferon-γ; IHC, immunohistochemistry; LLC, Lewis lung cancer; mAb, monoclonal antibody; TNF-α, tumour necrosis factor-α; Treg, regulatory T cells.
调节性T细胞(Tregs)是免疫抑制肿瘤微环境中的主要参与者，这通常与不良预后和生存有关。25临床研究发现，由于FoxP3增殖增加，抗pd -1治疗后，一组患者可能经历快速癌症HPD风险增加+Treg细胞，阻碍免疫治疗的应用。26日27日在我们的研究中，GPs联合αPD-1 mAb可降低FoxP3的比例+外周和肿瘤均有treg，这可能有助于预防HPD。总之，这些数据表明联合治疗增强了抗肿瘤免疫效果。
联合治疗可预防肠道菌群失调
为了调查口服GPs是否会改变肠道菌群，我们对所有治疗组的粪便样本进行了16S PicBio SMRT测序。经联合处理后，微生物组成发生改变，微生物丰度发生变化Muribaculum与αPD-1单抗单独组相比显著增加(图3 a, B)．我们还观察到Muribaculaceae比较GP组和Vehicle组(在线补充图3)，这表明全科医生可能有潜力丰富丰富的Muribaculaceae．为了进一步阐明肠道菌群与抗肿瘤作用之间的因果关系，我们评估了使用抗生素治疗的llc小鼠的肿瘤生长，发现抗生素治疗降低了抗肿瘤疗效(图3 c, D)．在维持肠道免疫方面，结肠组织病理学评价显示，联合治疗可减少炎症细胞在结肠的浸润(图3 e, F)．
联合治疗通过调节肠道菌群和增强肠道免疫力来维持肠道稳态。(A)不同处理组前15个属的相对丰度。(B) αPD-1单抗与联合组差异丰富类群的LEfSe分析。Mann-Whitney U检验的阈值参数设置为p=0.05，多类分析=all against all。LDA评分>2.0。(C)四组分别用载体、αPD-1单抗、GP及GP和αPD-1单抗联合处理的肿瘤生长曲线，分别在肿瘤接种后第9天，在肿瘤接种前2周给药抗生素(ABX)，一直持续到实验结束。(D) abx处理的荷瘤小鼠的肿瘤重量。每组数据n=6，具有代表性。(E, F)评估llc小鼠结肠的组织形态学和炎症评分。0分:结肠黏膜正常，上皮完整; score 1: scattered inflammatory cell infiltrates in the mucosa; score 2: diffuse mucosal infiltrates without submucosal spreading and intact epithelial layer; score 3: moderate infiltration of inflammatory cells into mucosa and submucosa with epithelial hyperplasia and goblet cell loss; score 4: marked inflammatory cell infiltrates in mucosa and submucosa accompanied by crypt abscesses and loss of goblet cells and crypts; score 5: marked inflammatory cell infiltrates within the mucosa spreading to the submucosa going along with crypt loss and haemorrhage. Original magnification ×100; scale bars 100 µm; black arrowhead-inflammatory cell infiltrates within mucosa (solid) and submucosa (dotted); yellow arrowhead-goblet cell loss. (G, H) Heatmaps showing differential genes and gene ontology (GO) functional analysis in IELs of small intestine between αPD-1 versus combination group and GP versus combination group. (I, J) Heatmaps showing differential genes and GO functional analysis in IELs of small intestine between GP versus combination group and GP versus combination group. Top 20 significantly enriched go terms in cellular compares, molecular function and biological process are presented. GO terms with padj <0.05 are significant enrichment. (K, L) Levels of RORγt+结肠固有层Treg和Th17细胞。数据以均数±标准差表示，采用Mann-Whitney U检验或Kruskal-Wallis检验分析。* * * P < 0.05, P < 0.01。GPs，人参多糖;上皮内淋巴细胞;路易斯肺癌有限责任公司;单克隆抗体mAb;Treg，调节性T细胞。
iel在维持屏障功能和降低感染易感性和免疫病理方面起着至关重要的作用。为了研究联合治疗是否会影响IELs，我们采用rna测序方法检测小肠中IELs的转录组变化。与αPD-1单抗单独组相比，上皮内保护基因(CLCA3、Zg16、Pla2g10、Agr2、Guca2a和Tff3)的表达28 - 30代谢相关基因(Dgat2和Ces2a)31日32联合治疗组S100A6表达显著上调。相反，免疫球蛋白可变区重链基因(Ighv1-64、Ighv6-6、Ighv5-4、Ighv1-55、Ighv1-50和Ighv1-26)、免疫球蛋白可变区轻链基因(Iglv2)、免疫球蛋白kappa可变基因(Igkv4-68)、Lrrk2、Camsap2、Myo5a、Bmf、Slc29a3和Mios的表达在联合治疗小鼠的els中下调(图3 g)．基因本体论(GO)分析显示，这些差异表达基因主要与溶酶体、分泌颗粒和能量代谢相关，可以保护肠道屏障的完整性(图3 h)．与单独使用GP组相比，我们观察到联合使用GP组的免疫应答评级基因上调(图3 i, J)．
RORγt+Treg细胞可以在肠道中被诱导，以应对微生物的刺激。33r γt之间的平衡+Treg细胞和Th17细胞有助于维持肠道稳态。为了观察对肠道的保护作用，我们检测了RORγt的比例+结肠LP中的Treg细胞和Th17细胞。如预期的那样，RORγt的比例增加+联合治疗组Treg细胞和Th17细胞比例减少(图3 k, L)．
联合处理增加了SCFA丰度，并异常调节吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)活性
RORγt+treg是由微生物群通过SCFAs诱导的。33SCFAs是一种重要的代谢产物，可以作为能量来源，防止肠上皮细胞和淋巴细胞因营养饥饿而发生自噬。34宿主中的SCFAs不局限于肠道;它们也可以传播到血液中，从而以g蛋白偶联受体(GPCR)依赖的方式或通过抑制组蛋白去乙酰化酶(HDAC)的表观遗传活性与靶组织中的多个细胞进行通信。35因此，SCFAs可能介导微生物群对癌症免疫的贡献。为了研究SCFAs的影响，我们使用超高效液相色谱-质谱(UPLC/MS)检测了动物血浆中SCFAs(乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸和己酸)的产生。有趣的是，我们发现除乙酸外，αPD-1单抗处理后所有SCFAs的丰度都有所增加;值得注意的是，与αPD-1单抗单独治疗组相比，联合治疗组缬氨酸的丰度显著增加(图4 g)．
联合处理后，SCFAs含量增加，IDO活性降低。采用超高效液相色谱-质谱法检测血浆中的SCFAs、脂肪酸和氨基酸。(A-G)含llc模型小鼠中乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、己酸等SCFAs相对丰度。(H-J) l -犬尿氨酸、l -色氨酸和犬尿氨酸/色氨酸的相对峰面积。(K) ×400倍镜下LLC肿瘤组织中IDO的代表性IHC谱。比例尺=50µm。(L)使用image J软件(NIH)和ImmunoRatio Plugin定量分析每个野区的阳性面积。数据以15个字段的平均值表示，用平均值±标准差表示(n=6)。数据采用单因素方差分析或学生t检验进行分析。*P<0.05， ** P< 0.01， *** P< 0.001。 ANOVA, analysis of variance; IHC, immunohistochemistry; UPLC-MS, ultra-performance liquid chromatography and mass spectrometry; LLC, Lewis lung cancer; SCFAs, short-chain fatty acids;
除短链脂肪酸外，我们还测量了52种氨基酸和脂肪酸代谢物的变化(在线补充图4A)．我们观察到，与αPD-1单抗单独组相比，联合治疗组的色氨酸代谢对这些代谢产物的贡献最大，l -犬尿氨酸和Kyn/Trp比值(以IDO活性表示)显著降低，但l -色氨酸没有降低(在线补充文件4A-D，图4 h-j)．结果表明，联合治疗可能与IDO活性有关。为了进一步研究IDO在肿瘤组织中的活性，我们进行了免疫组化染色，发现联合组IDO表达下调(图4 k)．为了确定GPs对肠道微生物色氨酸代谢的影响，我们用GPs在体外批量发酵系统中对人类粪便样本进行了meta发酵。有趣的是，我们发现，在好氧和厌氧发酵条件下，GPs显著增加了l -色氨酸的产量，减少了l -犬尿氨酸的产量，以及犬尿氨酸/色氨酸的比值(在线补充表1)，表明gp可以通过肠道微生物影响色氨酸代谢。
在派姆单抗治疗的NSCLC应答者和非应答者中存在不同的肠道微生物群组成
入选16例中国NSCLC患者，并接受抗pd -1阻断治疗。这些患者中有10例被澳门江湖医院的一名医生归类为应答者(Rs)， 6例被归类为非NRs (NRs)。这些患者的临床病理特征列于在线补充表2)．所有患者随访超过30个月，并通过CT扫描监测他们的反应状态(在线补充图5A-C)．
为了研究肠道微生物组的组成是否与抗pd -1免疫治疗相关，收集了基线粪便样本并进行16S PacBio SMRT测序。肠道微生物群落的α多样性表明，Rs的丰富度和均匀度高于NRs (图5一个)．在物种水平上，我们观察到拟杆菌vulgatus在Rs中占榜首，以及三种肠道微生物的过度代表:Parabacteroides distasonis(p = 0.04),细菌LF-3(p = 0.02)wadsworthensis HGA0223(p = 0.09;图5 b-g, (在线补充文件5D-G)．有趣的是，这些细菌的丰度在反应和生存率更好的患者中增加。
通过16S PacBio SMRT测序，比较应答者(Rs)和无应答者(NRs)肠道菌群多样性。(A) Rs (n=10)和n=6)组的Shannon指数。(B)在物种水平上，前10个物种相对丰度的直方图。(C)使用派姆单抗治疗前，Rs和NRs之间检测到的差异丰富类群的LEfSe分析。阈值参数设置为p=0.05进行Mann-Whitney检验，多类分析=all against all。线性判别分析(LDA)评分>2.0。(D-G) Rs和NRs的差异菌群。数据以均数±标准差表示，采用Mann-Whitney U检验分析。
GPs恢复了非rs粪便移植的llc小鼠对αPD-1 mAb治疗的反应
在我们最初的研究中，我们发现GPs增强了αPD-1单抗在llc负载小鼠中的抗肿瘤作用。GPs是否能逆转人类对αPD-1单抗治疗的反应尚不清楚;因此，我们设计了一个FMT实验来研究它。将6只NRs的粪便菌群转移到GF小鼠体内。当定植时，小鼠被接种LLC肿瘤细胞。然后，对小鼠进行与之前使用的相同的小鼠治疗方案(图6)．正如预期的那样，与NRs相似，我们发现小鼠对αPD-1单抗治疗具有耐药性。有趣的是，当用GPs + αPD-1单抗治疗小鼠时，这种反应恢复了。联合治疗显著延缓肿瘤生长(图6 b)．流式细胞仪分析和免疫组化谱显示CD8的比例+/ CD4+T细胞和CD8中IFN-γ、TNF-α和GZMB的产生+血液和肿瘤中的T细胞均增加(图6氟、氯)．我们还观察到联合治疗组Treg细胞更少，这与治疗效果的改善有关(图6克)．同时，我们测定了小鼠血浆中色氨酸和犬尿氨酸的含量，发现联合治疗后，Kyn/Trp比值降低(图6 j)．同时，我们还观察到联合治疗后肿瘤组织中IDO表达降低(图6 k, L)．综上所述，这些数据表明，GPs可以使llc小鼠对αPD-1单抗的反应变敏感。
GPs在LLC荷瘤小鼠移植的无应答菌群中恢复对αPD-1单抗的应答。(A) FMT实验示意图。(B)各组肿瘤生长曲线。肿瘤生长曲线采用双向方差分析和Sidak校正进行评估。(c g) CD8+/ CD4+CD8 +T细胞与Foxp3之间的T细胞比例、IFN-γ、TNF-α、颗粒酶B (GZMB)的表达+CD4+血液、脾脏和肿瘤组织中的T细胞。(H) ×400倍镜下肿瘤组织中CD4、CD8、IFN-γ、TNF-α和GZMB的代表性IHC谱。比例尺=50µm。(一)利用image J软件(NIH)定量分析每亩阳性面积。数据以15个字段的平均值表示，以平均值±标准差表示(n=3)，采用单因素方差分析。每个符号代表一种单独的动物。*P<0.05， ** P< 0.01， *** P< 0.001。(J)从NRs转移菌群的小鼠血浆中犬尿氨酸/色氨酸比值。(K)定植小鼠肿瘤组织中IDO的代表性IHC谱。(L)用image J软件(NIH)定量分析IDO表达的每场阳性面积。 (M) Relative abundance ofBacteroridesαPD-1单抗组和联合组。的相对丰度拟杆菌vulgatusαPD-1单抗组和联合组。的相对丰度Parabacteroides distasonisαPD-1单抗组和联合组。方差分析;GPs，人参多糖;干扰素-γ干扰素-γ;单克隆抗体mAb;包含IHC,免疫组织化学;NR的人;肿瘤坏死因子-α。
同样，我们研究了联合治疗是否可以调节移植自NRs肠道菌群的LLC荷瘤小鼠的肠道菌群。令人兴奋的是，我们发现在组合组，丰度拟杆菌,特别是b . vulgatus而且p . distasonis均显著高于αPD-1单抗组和Vehicle组(图6 m, O, (在线补充文件6A-C)．经时间过程16S rRNA测序证实，GF培养条件下无细菌污染(在线补充文件7A-B)．这些结果表明，联合治疗可能会重塑肠道菌群，使其从NRs向Rs的方向转变，从而提高αPD-1单抗治疗的敏感性。
讨论
PD-1抑制剂是有效的癌症免疫治疗各种类型的癌症。然而，响应率还需要大幅度提高。目前正在进行大量使用联合疗法的临床试验，以寻找增强敏化的方法。以前也有报道称，GPs是免疫调节的辅助药物。周等证明全科医生可以恢复肠道内稳态，特别是通过促进两种主要代谢细菌的生长，乳酸菌spp和拟杆菌通过增强宿主免疫功能，逆转过度疲劳和急性冷应激表型。36拟杆菌对CTLA-4单抗治疗胃肠道毒性有保护作用。13在本研究中，我们首次观察到GPs联合αPD-1单抗可以增加scfa产生菌的数量，Muribaculum在LLC荷瘤小鼠中增敏αPD-1单抗的抗肿瘤作用。Muribaculum第一个属是在Muribaculaceae它也被命名为细菌性的S24-7。S24-7是主要的拟杆菌门据报道，与更好的免疫治疗反应有关。37然而，在人类实验对象中，家庭类杆菌还有属拟杆菌是主要的拟杆菌门成员。38此外，困难的文化S24-7进一步研究有限。39本研究认为其抗肿瘤作用可归因于CD8的增强+功能性T细胞和通过改变肠道微生物群而下调Treg细胞。
微生物代谢物是微生物群与免疫细胞之间交流的中介。短链脂肪酸是由微生物降解多糖产生的。αPD-1单抗治疗后SCFAs是否影响宿主生理仍不清楚。野村证券等观察到，在接受尼伏单抗治疗的实体癌患者中，R组粪便中SCFAs的丰度高于NR组。这些结果表明，SCFAs的增加意味着更长的无进展生存时间。40在本研究中，我们还观察到，αPD-1单抗处理后，包括丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸和己酸在内的所有SCFAs均有所增加。特别是，与单独使用αPD-1单抗相比，GPs和αPD-1单抗联合治疗后，血浆中通常较低的戊酸酯明显升高。然而，相对较少的研究集中在戊酸盐。我们认为戊酸酯可能作为HDAC抑制剂延缓肿瘤进展，上调免疫应答。41 42进一步的研究将探讨戊酸酯是否对αPD-1单抗反应具有潜在的治疗作用，以及微生物群是否与这种作用有关。
IDO活性被认为是抗pd -1治疗耐药的一种可能机制，几种联合疗法已经进入临床试验。43-45虽然IDO-1抑制剂epacadostat (ECHO-301/KEYNOTE-252试验)与pembrolizumab联合使用，尽管最近在黑色素瘤患者中由于多种原因，46IDO-1仍然是一个很有前途的免疫检查点，它与Treg细胞活化的减弱有关。47较高的Kyn/Trp比值可诱导Treg产生，抑制Teff细胞的产生，以及较差的存活率。48 49之前的一项研究表明，人参皂苷可以降低小鼠血浆中犬尿氨酸的浓度和Kyn/Trp的比值，50但全科医生是否也有类似的效果尚不清楚。我们在体外他们对健康供者的粪便样本进行了发酵，发现在有氧和无氧条件下，色氨酸水平增加，犬尿氨酸水平降低。此外，与单独的αPD-1单抗处理相比，联合处理通过降低小鼠的犬尿氨酸而不是色氨酸来降低Kyn/Trp比值。这一结果与αPD-1单抗反应增强和生存时间延长相一致。此外，外周Treg的数量也随着犬尿氨酸的减少而减少。我们还观察到从NRs转移的微生物群降低了GF小鼠的IDO活性。总的来说，GPs可能通过降低IDO活性来改善对PD-1抑制剂的反应。
以往的研究表明，不同人群获得的与PD-1抑制剂反应相关的微生物不同，主要集中在西方人身上。这是否与地理差异有关还有待观察。金等纳入了37例接受nivolumab治疗的中国晚期NSCLC患者和使用第二代测序的患者，发现了富集Alistipes putredinis，双歧杆菌longum而且普氏菌copri在有反应的病人中，然而Ruminococcus_unclassified在无反应患者中富集。51在这里，我们首先使用16S PacBio SMRT测序检测了肠道微生物群对亚洲NSCLC患者对派姆单抗的反应的影响。结果显示富集b . vulgatus而且p . distasonis在Rs。b . vulgatus而且p . distasonis是两种共生的健康细菌。52p . distasonis已被证明可以通过诱导IFNγ+CD8+T细胞。53 54属拟杆菌增强CTLA-4阻断剂治疗的黑色素瘤患者的抗肿瘤作用并减轻胃肠道毒性。13
在此基础上，我们研究了GPs联合αPD-1单抗是否能逆转反应状态。我们将6个NRs的粪便转移到GF小鼠，以研究肠道微生物群对携带llc的小鼠的影响。令人兴奋的是，我们发现了大量的b . vulgatus而且p . distasonis与αPD-1单抗组或Vehicle组相比，联合治疗后均显著增加。这一发现表明，在接受NR供体粪便微生物群的受体小鼠中，GPs通过将NRs的肠道微生物群重塑为Rs的肠道微生物群，使αPD-1单抗治疗的结果变得敏感。我们的GPs作为一种膳食补充剂上市，我们相信我们的研究可以加速GPs的临床转化。接下来,是否b . vulgatus而且p . distasonis是PD-1抑制剂耐药性的关键调控因子，将被进一步研究。
综上所述，我们发现GPs通过增强CD8增强αPD-1单抗的抗肿瘤作用+T细胞功能和降低treg的抑制作用，这可能是通过重塑肠道微生物群和色氨酸代谢来解决的。此外，我们发现p . distasonis而且b . vulgatus在中国NSCLC中过高。此外，联合治疗增加了B. vulgatus和P. disasonis并恢复了NR患者FMT定植的GF小鼠对αPD-1单抗的反应。总的来说，我们的新发现总结和说明图7 a, B．我们的数据表明，GPs可以作为NSCLC患者的膳食补充剂，以提高免疫治疗的疗效。
GPs联合αPD-1单抗可通过恢复肠道菌群来提高应答率。(A) GPs通过增强CD8 T细胞功能，增加IFN-γ和TNF-α的产生，降低循环系统中Treg的抑制作用，增强了αPD-1单抗的抗肿瘤作用，这可能是通过重塑肠道微生物群，从而影响色氨酸代谢和SCFAs来解决的。联合处理可丰富菌体的丰度Muribaculum给带有llc的小鼠。联合治疗可上调CLCA3、TFF3、AGR2、Zg16、Pla2g10和Guca2a等上皮保护基因的表达。代谢产物SFCAs和犬尿氨酸经转运进入循环系统，增强免疫功能，抑制肿瘤生长，延长生存期。(B)联合治疗恢复肠道菌群，有助于将肠道菌群从无应答恢复为应答，从而增强对αPD-1单抗的应答。发现16S SMRT测序Parabacteroides distasonis而且拟杆菌vulgatus对派姆单抗有应答者的丰度更高。通过粪便菌群移植(FMT)将无反应的肠道菌群移植到无菌小鼠，定植后接种LLC肿瘤细胞，对小鼠进行联合治疗。大量的B. vulgatus和P. disasonis16S PacBio SMRT测序发现联合组与αPD-1单抗组和对照组比较。同时，联合治疗通过增强CD8功能显著抑制肿瘤生长+T细胞，增加IFN-γ， TNF-α和颗粒酶B的产生，减少Treg细胞。GPs，人参多糖;干扰素-γ干扰素-γ;路易斯肺癌有限责任公司;单克隆抗体mAb;包含IHC,免疫组织化学;关系的人;SFCAs，短链脂肪酸;肿瘤坏死因子-α。
数据可用性声明
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伦理语句
患者发表同意书
伦理批准
本研究经澳门江湖医院批准进行。动物研究的伦理批准由澳门科技大学、第三军医大学和中山大学第一附属医院提供。所有实验都按照委员会批准的机构动物护理指南和协议进行。
致谢
我们非常感谢澳门科技大学附属大学医院病理科为我们准备石蜡切片。我们还感谢陆军医科大学提供无菌小鼠和Biocytogen提供HuPD-1小鼠。
参考文献
脚注
JH, DL和YW贡献相同。
贡献者EL-HL, YC, HW, JH和ZJ设计了这项研究。JH、JY、ZJ、JL、XF、YZ、YX、HL、WW、YF、JL、AS、JC、JL、MY、LW、LL、RL进行实验。EL-HL、YC、DL、YW、WH、IK、HL、XY、YX、J-LW、QW、PY对数据进行分析。ZJ和XF进行了FACS分析。EL-HL, JH, YC, HW, ZJ和LL撰写了手稿。所有作者审阅并批准了手稿。
资金本工作得到了澳门科技发展基金(项目编号:0096/2018/A3, 001/2020/ALC)和国家自然科学基金海外与港澳学者合作研究基金项目(项目编号:81828013)的资助。
相互竞争的利益没有宣布。
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