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文摘
客观的肿瘤的分子分类学是个性化的基础医学和正在成为非常重要的治疗目的。四transcriptomics-based分类系统的胰腺导管腺癌(PDAC)存在,始终确定亚型的高度积极PDACs官腔特性,包括ΔNp63表达与上皮主监管机构GATA6的损失。我们调查了精确的分子事件驱动PDAC进展和基础项目的出现。
设计我们综合分析patient-derived转录组数据集和机械组织样本实验使用小说dual-recombinase鼠标模型Gata6删除在喀斯特的后期阶段G12D简况(Gata6胰腺肿瘤发生LateKO)。
结果这种综合human-to-mouse方法表明,GATA6损失是必要的,但不充分,对于ΔNp63的表达和基底计划在病人和老鼠。随之而来的损失HNF1A HNF4A,可能通过表观遗传沉默,需要完整的表现型开关。此外,Gata6删除在老鼠身上转移率大幅提高,与肺转移的倾向。通过RNA-Seq分析的主要细胞从老鼠肿瘤分离,我们表明,Gata6抑制肿瘤细胞可塑性和免疫逃避,patient-derived数据一致,这表明Gata6作为屏障获得充分发展基础和转移表型。
结论我们的工作提供了一种机械的分子基础表型之间的联系和转移和有价值的临床工具调查PDAC的最激进的亚型。因此,这些数据是重要的对于理解pathobiological特性的异构性胰腺癌的老鼠和人类。
- 胰腺癌
- 分子机制
- 上皮分化
数据可用性声明
RNA-Seq加入数量:PRJEB37700。
这是一个开放的分布式依照创作共用署名4.0条Unported (4.0) CC许可,允许他人复制、分配、混音、转换和发展这项工作为任何目的,提供了最初的工作是正确地引用,执照的链接,并表明是否变化。看到的:https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。
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本研究的意义
已知在这个问题上是什么?
多个transcriptomics-based研究已经确定了官腔胰腺导管腺癌的亚型(PDAC)尤其是预后不良。
亏损GATA6 PDAC细胞与改变分化有关,包括异位表达基底KRT14等标记。
ΔNp63转录因子的异常表达可以推动基础转录表达的计划。
有什么新发现吗?
失去GATA6表达式是必要但不充分的表达ΔNp63和基底表型。
伴随的沉默HNF4A HNF1A,可能通过表观遗传机制,需要全面的表型。
Gata6删除在建立小鼠肿瘤倾向于基底和转移表型,肺取向,在下一代的喀斯特模式G12D借PDAC。
GATA6表达与功能的老鼠和人类PDAC细胞的免疫逃避。
它会如何影响临床实践在可预见的未来吗?
GATA6相结合的分析方法,食物和TP63表达patient-derived PDAC样品将提供一个更精确的分类。
恢复古典PDAC表型可能不仅减少转移潜力,但也会增加肿瘤细胞的免疫识别。
介绍
肿瘤的分子分类学港口个性化医学的发展潜力巨大。在胰腺导管腺癌(PDAC),分子分类显示多个亚型的存在独特的生物和临床行为和可能特定的漏洞。四PDAC分类法提出了直到现在,不同数量的子组和命名法。1 - 4所有分类识别的PDAC亚型细胞身份丢失的特性,与明显恶化患者生存。这种亚型,称为“quasi-mesenchymal”,2“官腔”,3“扁平”,1“纯粹的基础”4或“基底A / B”5在分类显示,而均匀的基因表达谱。6我们会参考这个PDAC亚型“基底”。更好的理解这个激进的PDAC亚型的分子司机会改善病人的管理中一个几乎总是致命的恶性肿瘤。
转录因子GATA6,腺泡细胞分化的重要调节器7和抑制喀斯特G12V不至于在小鼠肿瘤发生,8经典的亚型中高度表达的吗2并通过启动子甲基化沉默在鳞状上皮肿瘤。1我们确认GATA6迷失在PDACs的子集,与一个官腔分化,揭示底层机制。9GATA6沉默导致epithelial-to-epithelial转变(即一个简单的上皮细胞复层上皮的表达标记)和epithelial-to-mesenchymal过渡(EMT)而过度诱导mesenchymal-to-epithelial过渡(遇到),支持其核心作用在决定PDACs的表型。8 9持续、失去GATA6-as单个biomarker-identified基底肿瘤中相应的基因签名一样有效地转移PDAC患者的队列。10
最近的出版物表明,基底表型是由广泛的外遗传性改变,特别是在superenhancers,由ΔNp63控制,11 - 13较短的同种型TP63转录因子标记复层上皮细胞的基底层。有趣的是,GATA6本身被确认为基底patient-derived细胞被superenhancer失去了控制14和EZH2-driven表观遗传沉默GATA6参与PDAC de-differentiation,15表明GATA6损失可能是嵌在基底计划而不是开车。
这里,我们旨在阐明GATA6损失是否导致PDAC或基底表型的后果。通过结合分析patient-derived样品和转录组数据集,用PDAC细胞,体外实验和下一代喀斯特G12D借鼠标PDAC模型Gata6删除在肿瘤发生的后期阶段,我们表明,GATA6损失是必要的,但不充分,在PDAC基底的外观项目。HNF1A和HNF4A差别伴随对这些需要完整的表型开关。此外,Gata6亏损肿瘤出现前的病变(PanINs)支持在老鼠身上转移的发展,可能通过促进肿瘤细胞的可塑性和免疫逃逸。我们证明一个上皮/祖转录网络作为屏障对肿瘤进展,分子之间的联系,并提供一个基底体内基因计划和PDAC转移扩散。
结果
GATA6损失是必要的表达式的基础项目
我们分析了五PDAC转录组数据集和分子分类显示,GATA6表情一直在低分化亚型(quasi-mesenchymal低2p = 0.008,官腔3p = 5.54平台以及鳞状1p = 1.57 e-11 pure-basal4p < 2 e-16,基底A / B5p < 0.0001) (图1一个)。自从ΔNp63建议在PDAC驱动基础转录项目,11日12我们探讨其与GATA6 4/5的数据集(Collisson排除由于样本量低)+ TCGA PAAD数据集。TP63表达式与GATA6表达式在4/5数据集(负相关图1 b,在线补充图1)。此外,ΔNp63-target基因16在GATA6明显丰富其中调节低肿瘤(下四分位数)在3/5数据和显示,其余2(倾向图1 c,在线补充图1 b),支持ΔNp63-dependent项目是诱导GATA6时丢失。我们之前显示GATA6损失PDAC associates的异位表达基底KRT14标志在一个小patient-derived样本的集合。9我们测量GATA6 TP63和KRT14表达,免疫组织化学(包含IHC)在一个独立的大组60 formalin-fixed石蜡包埋组织从PDAC切除术(图1 d)。GATA6表达了> 10%的肿瘤细胞在23/60(38.3%)的患者。此外,KRT14 GATA6完全表达低p = 1.64 e-09肿瘤(16/23,69.6%)和TP63表达在14/23 (60.1%)GATA6检测低GATA6和10/37 (27%)高肿瘤(p = 0.014) (在线补充图2)。值得注意的是,GATA6高/ TP63pos肿瘤只有小的TP63-positive细胞灶,更多的详细分析,发现位于包含GATA6-negative化生的病变细胞9/10例(在线补充图2 b、黑色箭头)。此外,我们比较的频率基底GATA6顶部和底部之间的表型表达四分位数(GATA6高,GATA6低)五PDAC数据集分类和观察GATA6只有2/207高/基底情况下(在线补充图1 c)。这些数据清楚表明GATA6损失对于基底表型的表达是必要的。
GATA6损失是必要的表达官腔计划。(A)分析GATA6 mRNA表达胰腺导管腺癌(PDAC)数据集transcriptomics-based分子分类。(B) TP63和GATA6 mRNA表达之间的相关性表明PDAC数据集。(C)基因集的浓缩的ΔNp63目标基因在基因调节GATA6低与GATA6高肿瘤在指定的数据集。(D)代表GATA6的图像高和GATA6低PDAC。TP63)和免疫组织化学染色,GATA6 KRT14。酒吧= 200µm规模。(E)的表达GATA6ΔNp63(红色箭头)和KRT14控制(Ctrl)和GATA6-overexpressing (G6) BxPC3细胞,免疫印迹分析的蛋白质溶解产物。Vinculin作为加载控制。(F)的表达一组经典和基底基因GATA6-overexpressing BxPC3细胞与Ctrl细胞相比,衡量RT-qPCR。结果显示平均±标准差至少n = 3生物复制。* p > 0.05。(G)的表达GATA6ΔNp63(红色箭头)和控制(shCtrl)和GATA6-silenced KRT14 (shG6) PaTu8988S细胞,免疫印迹分析的蛋白质溶解产物。GAPDH作为加载控制。 FRD, false discovery rate. NES, normalised enrichment score.
理解GATA6之间的层次关系和ΔNp63基底表型的规定,我们在BxPC3过表达GATA6,与高水平的ΔNp63 PDAC细胞系。11日12GATA6ΔNp63蛋白质的过度导致减少40% (p = 4.15 e-04)和减少30%的信使rna (p = 0.03) (图1 e,在线补充图2 d)。一致,使用逆转录qPCR紧随其后(RT-qPCR)我们观察到upregulation古典(背景,HNF4A FOXA1)基底的差别,对这些基因的标记(ΔNp63、KRT14 KRT5, FAT2, S100A2, PTHLH);KRT14强烈降低mRNA (p = 6.3 e-06)和蛋白质水平(p = 1.42 e-06) (图1 e, F,在线补充图2 d)。有趣的是,我们没有观察到明显的变化,增殖,迁移或人工基底膜体外入侵(没有显示)。相反,ΔNp63和KRT14蛋白质略PaTu8988S细胞诱导后(古典)GATA6混战(在线补充图2 e)。GATA6表达PaTu8988S shG6细胞类似于基准面BxPC3细胞,而在后一种接近内生GATA6超表达PaTu8988S细胞(图2 c在线补充)表明GATA6表情实验操作的范围仍在内源性生理水平。
RNA-Seq公布数据的再分析12表明TP63淘汰赛BxPC3细胞显著诱导GATA6表达式(形容词p = 0.02),而ΔNp63过度PaTu8988S细胞只导致一个小,不重要,减少GATA6 mRNA (在线补充图2 f)。ChIP-Seq来自同一刊物显示TP63峰值GATA6下游转录开始网站(没有显示),可能指示直接镇压。缺乏GATA6峰值附近(< 10 kb) PaTu8988SΔNp63 TSS的细胞,9表明间接监管。之间的交叉TP63 ChIP-Seq BxPC3山峰12和GATA6 ChIP-Seq PaTu8988S山峰9显示有限的重叠(GATA6峰值的0.8%,10.7%的TP63山峰),这表明两个转录因子控制在基底与古典细胞单独的项目。有趣的是,只有1 3802 GATA6远峰(> 50 Mb的TSS)位于萨默维尔地区确定为“鳞状元素”等12(图2 g网络补充)。这些数据表明,虽然重要,无论是GATA6损失还是ΔNp63表情足以驱动一个完整的PDAC细胞表型转换和支持合作的参与转录调控模型。
GATA6合作与HNF1A HNF4A维持古典表型
识别关键的分子事件的下游GATA6损失,我们分析了PanCuRx数据集,包括最大的所有阶段系列PDAC样本,从而更好地代表PDAC比数据只包括可切除的肿瘤患者人群。我们比较GATA6低/基底(n = 41)和GATA6低/古典(n = 21)肿瘤。基因集富集分析(GSEA)透露,HNF1A和HNF4A假定的目标基因丰富GATA6调节转录的低/古典肿瘤(图2一个)。因此,HNF1A和HNF4A mrna在GATA6更高低/经典的肿瘤,与基底的(图2 b和在线补充图3)。同样,KRT14pos地区的患者的肿瘤显示HNF4A蛋白质水平降低,而KRT14负的区域(图2 c)。值得注意的是,失去GATA6表达与KRT14更广泛和更明显的样本pos地区,相比之下,HNF4A减少。
伴随HNF1A和HNF4A后基底表型的表达需要GATA6的损失。(A)浓缩基因集的情节包含假定的HNF1A和HNF4A目标基因在比较基底(低bas)和non-basal GATA6 (low-CLA)低PanCuRx队列的肿瘤。(B)的表达HNF1A, HNF4A GATA6 PanCuRx不同组的病人的数据集。* * * p < 0.05, p < 0.001, * * * p < 0.0001。(C)代表KRT14和HNF4A染色的图像在胰腺导管腺癌(PDAC)样本。下面图片显示KRT14负的/ HNF4A高(棕色纸箱)和KRT14pos/ HNF4低(橙盒)地区。酒吧规模:500µM。(D)的表达HNF4A和TP63 AsPC1和SUIT-2 HNF4A混战。Vinculin作为加载控制。(E) H3K27me3分布沿HNF4A轨迹在patient-derived xenografts-derived细胞系的三类。(F)拟议的模型:GATA6是主要的看门人的古典表型;HNF1A和HNF4A可以阻止完整的基础项目,但一旦失去,ΔNp63-driven基底项目是充分表达和驱动器PDAC发展转移。负反馈调节由ΔNp63可能有助于稳定基底表型。罗斯福,错误发现率。满足,mesenchymal-to-epithelial过渡;NES,正常化浓缩的分数。
古典/祖AsPC1和SUIT2细胞12比PaTu8988S GATA6较低表达,而HNF1A特别是HNF4A很高,因此叫他们代表一个模型吗低/古典肿瘤(在线补充图2 b)。HNF4A混战足以诱导表达ΔNp63 AsPC1和两个SUIT2细胞克隆,SUIT2 - 007和SUIT2 - 028,支持,HNF4A代表一个障碍GATA6基底下游表型(图2 d)。
我们之前报道的最全面的表观基因组学数据用于一组基底和古典patient-derived异种移植(PDX)派生的细胞系。14我们再加工的原始数据比较外基因标记GATA6,HNF1A和HNF4A在GATA6位点低/基底(n = 4), GATA6低/古典(n = 5)和GATA6高/古典(n = 5)细胞系。值得注意的是,当我们发现了一个显著的异染色质标记H3K27me3积累HNF4A在Gata6轨迹低/基底细胞,轨迹不是epigenetically Gata6沉默低/经典的(图2 e,在线补充图4)。GATA6显示出类似的模式但H3K27me3主要是丰富TSS的上游(在线补充图4)。HNF1A没有高度标有H3K27me3 GATA6吗低/基底细胞(在线补充图4)。
H3K27ac和TSS H3K4me3模式的所有三个基因在GATA6符合更高的转录低/古典和Gata6高/古典细胞,也就是说,这两个标记的浓缩的活性染色质在GATA6低或缺席低/基底,除了1.037细胞,而在所有其他细胞(高在线补充图4 b, C)。这些数据表明,GATA6和hnf epigenetically沉默在基底细胞,而经典的细胞保留hnf表达即使GATA6很低。重要的是,尽管GATA6的子集高/ HNF1A低和GATA6高/ HNF4A低肿瘤出现在所有patient-derived数据集,这些肿瘤基底,进一步支持,GATA6足以保持经典特性和随之而来的损失GATA6和hnf所需的基底表型出现。
发展下一代小鼠模型删除Gata6在PanINs
我们之前的Gata6删除在肿瘤起始加速喀斯特G12V借胰腺肿瘤发生。8然而,喀斯特G12V;Gata6P /−−老鼠研制的一般分化良好的肿瘤和Krt14-negative(没有显示)。歧视与肿瘤相关的影响开始从那些与肿瘤进展相关,我们求助于下一代小鼠模型。为此,我们繁殖Gata6液态氧/液态氧老鼠17与双重组酶老鼠携带Pdx1-Flp,FSF-KRasG12D,FSF-R26CreERT218和R26双19等位基因,产生肯德基老鼠(喀斯特、Flp Cre)。这个新模型允许分开喀斯特的激活G12D表达和Gata6删除(图3一)。
有条件的下一代小鼠模型Gata6删除。(一)等位基因的示意图表示用于生成Gata6LateKO小鼠模型。(B)代表)图像细致谨慎的胰腺Pdx1-Flp和喀斯特FSF-G12D鼠标。比例尺:2毫米。(C)图片显示)和GFP的表达和Gata6,在胰腺的放大区域B所示(虚线)。黑色箭头:细胞Gata6较低。酒吧规模:100µM。(D)代表Gata6的图像LateKO他莫昔芬后胰腺管理、显示),GFP和Gata6表达式。酒吧规模:100µM。(E)代表两个Gata6的胰腺的图像Ctrl和两个Gata6LateKO小鼠肿瘤大小与变量。(F)量化Gata6的肿瘤区域Ctrl(n = 37)和Gata6LateKO(n = 42)老鼠。(G)量化每高倍率在Gata6 Ki67-positive细胞Ctrl(n = 22)和Gata6LateKO(n = 36)老鼠。(H)年龄为Gata6验尸Ctrl(38例)和Gata6LateKO老鼠(n = 44)。统计学意义对检查F-H Mann-Whitney U测试。
Flp-dependent重组效率相差很大,从< 5% > 90%的胰腺,而且没有观察到恶性病变在pancreata < 30%的复合,以包含IHC GFP的记者(没有显示)。我们在分析只老鼠,包括Flp-mediated重组达到至少30%的胰腺上皮细胞。20周的年龄,肯德基老鼠开发整个胰腺多个低级和高级PanIN彩色GFP阳性病变(图3 b, C)。在Gata6wt老鼠,Gata6发现在大多数上皮细胞。偶尔,Gata6表达式在PanINs减少(图3 c,黑色箭头)表明自发Gata6损失可能发生在这个时间点。因此,我们服用它莫西芬(TMX)约20周的年龄诱导的删除Gata6在喀斯特G12D并生成Gata6表达细胞LateKO肯德基老鼠。成功TMX-induced重组被Gata6验证包含IHC Gata6LateKO老鼠(图3 d)。绿色荧光蛋白表达在Gata6留存负的细胞,这表明在胰腺细胞GFP是高度稳定。重要的是,没有在Gata6发现重组loxP / loxP老鼠不接收TMX,评估Gata6包含IHC(未显示),从而排除泄漏。老鼠牺牲在65周或者当垂死挣扎。从82年一群老鼠,Gata6 43LateKO和39控件(Gata6Ctrl);后者包括28 Gata6wt / wt和3 Gata6wt / loxP老鼠接受TMX和8 Gata6loxP / loxP老鼠不接收TMX。Gata6Ctrl和Gata6LateKO老鼠发达高度异构的不同大小的肿瘤,肿瘤大小无显著差异或观察Ki67阳性细胞密度(图3比)。实验设计不允许Kaplan-Maier生存分析,我们没有观察到Gata6LateKO老鼠成为垂死的明显早于控件(图3 h)。
Gata6损失肿瘤倾向于基底表型、转移和肺取向
我们使用Krt5和Krt14表达式代替鼠标PDAC基底表型,自从Tp63染色没有给出可靠的结果(没有显示)。表达的标记是高度整合(p = 4.64 e-08,在线补充图5)。Krt5/14的比例pos肿瘤在Gata6更高LateKO老鼠比Gata6Ctrl老鼠(28/44(63.6%)和16/38 (42.1%))(图4一)。重要的是,在Gata6Ctrl老鼠,15/16 Krt5/14pos肿瘤是Gata6负的(Gata6损失)。当比较基于Gata6表达肿瘤,43/63 (68.2%)Gata6负的肿瘤(Gata6LateKO+ Gata6损失)和Gata6只有1/19pos基础(Krt5/14 (5.2%)pose-06) (p = 3.4,图4一)。没有显著差异肿瘤Gata6之间的等级Ctrl和Gata6LateKO老鼠,而Gata6负的经常和基底肿瘤明显等级2和3 (在线补充图5 b分别为0.0132和0.034,p =)。这最终证实GATA6损失是必要的但不能满足基底表型的表达。
Gata6损失肿瘤导致官腔表型和增加转移性潜在lung-specific取向。(A)表达Gata6和Krt14 Gata6代表Ctrl和Gata6LateKO胰腺导管腺癌,检测到包含IHC(左)和量化Krt5和Krt14表达的肿瘤分类通过基因型(Gata6Ctrln = 38和Gata6LateKOn = 44)或(Gata6 Gata6表达式posn = 19岁,Gata6负的n = 63)。* * * * p < 0.05, p < 0.001。酒吧规模:200µm。(B)代表)的图像在Gata6肝脏和肺转移Ctrl和一个Gata6LateKO鼠标和量化Gata6转移发生Ctrl(38例)和Gata6LateKO老鼠(n = 44)。* * p < 0.01。比例尺:5毫米左/中心,100年µm正确。(C)的分布转移到肝脏(LiMet)或在Gata6肺(吕美特)LateKO老鼠。(D)量化的钙粘蛋白包含IHC Gata6LateKO肝脏(n = 19)和肺(n = 30)转移,* * p < 0.01。
患者基底PDACs有更糟糕的结果。1 - 4 9你的生活会,我们观察到更多Gata6LateKO小鼠明显疾病进展的迹象,反映在更多比Gata6转移(30/43,69.8%)Ctrl控制(8/39,20.5%)(p = 8.5 e-06,图4 b)。重要的是,所有8 Gata6Ctrl小鼠转移Gata6负的肿瘤(小学和转移性)。Gata6负的肿瘤也更增生性,见Ki67染色(p = 2.93 e-04,在线补充图5 c)。这些数据表明,Gata6是一种有效的抑制小鼠喀斯特的转移G12D借PDAC。
在Gata6LateKO老鼠,15/30(50%)只有肺转移,4/30(13.3%)只有肝转移和11/30(36.7%)都(图4 c)。这个结果与发现的病人,肝是最常见的转移。20.有证据表明,肿瘤细胞是异构和必须,此外,高度塑料形成转移。21日22这种程度的塑性影响的organotropism PDAC转移性细胞,通过细胞不能完全恢复上皮表型殖民优先肺部。23在Gata6LateKO小鼠肝脏转移明显更多的钙粘蛋白pos比肺转移由包含IHC检测(16/19,84.2%钙粘蛋白posLiMet;2/30,6.7%钙粘蛋白pos吕美特p = 3.69 e-08) (图4 d,在线补充图5 d)。这个观察是一致的数据显示无法觉察的钙粘蛋白在细胞主要来源于肺转移24并且可能表明Gata6LateKO细胞更有限的能力有效地激活上皮计划。
Gata6LateKO原发性肿瘤细胞更增生性和chemoresistant
我们成功建立了主要从Gata6细胞系posGata6 (n = 5)LateKO(n = 15)和Gata6损失(n = 6)肿瘤。虽然Gata6pos和Gata6LateKO细胞株是均匀Gata6正面和负面,分别Gata6损失行显示一个更异构表达式模式(图5一个)。ΔNp63 mRNA在Gata6更高LateKO和Gata6损失细胞(图5 b)和一个类似的趋势观察一组基底标记(Runx3, S100a2和Krt14)但不是古典/祖标记(Pdx1 Hnf4a,在线补充图6)表明这些细胞体外保存一些基础功能。Gata6LateKO和Gata6损失细胞增殖明显多于Gata6pos细胞(图5 c)。肯德基的迁徙能力细胞高度观察变量和无统计学差异,尽管一些Gata6LateKO和Gata6损失细胞迁移潜力高显示(在线补充图6 b)。没有区别观察体外入侵能力(图6 c在线补充)。
主细胞Gata6LateKO肿瘤更增生性和chemo-resistant体外。(一)代表的免疫荧光图像主要肯德基从Gata6分离的肿瘤细胞pos,Gata6LateKO和Gata6损失老鼠。上图:表达Gata6(绿色)。底部:合并Gata6(绿色),钙粘蛋白(红色)和DAPI染色(蓝色)。(B)的表达ΔNp63衡量retrotranscription + qPCR (RT-qPCR)。(C)基本肯德基表示组织细胞增殖,表示为褶皱播种后48小时细胞数量的增加。Gata6posn = 4, Gata6LateKOGata6 n = 15日损失n = 5。(D) H3K27ac浓缩在ΔNp63启动子,被ChIP-qPCR肯德基在初级细胞。数据被表示为%的输入染色质。Gata6posn = 4, Gata6LateKOn = 7, Gata6损失n = 3。(E)图形代表初级肯德基的IC50值测量细胞在细胞毒性分析研究者用和吉西他滨治疗。Gata6posn = 4, Gata6LateKOn = 8, Gata6损失n = 6。(中)每个点代表至少三个独立实验的平均值为每个肿瘤细胞系。* * * p < 0.05, p < 0.01。
然后我们研究表观遗传变异的贡献我们的观察,因为这种机制是控制显示基底的出现在PDAC细胞表型。11日13日17ChIP-qPCR H3K27ac,开放的染色质的一个标志,显示高浓缩的ΔNp63启动子在Gata6LateKO和Gata6损失细胞(图5 d)。没有观察到显著差异的倡导者基底的一个子集(Runx3,S100a2,Krt14)和经典(Pdx1和Hnf4a)基因(在线补充图6 d)。在此基础上分析,Gata6删除不会引起广泛的改造在肯德基细胞染色质可访问性。
最后,我们评估GATA6状态之间的关系和肿瘤细胞对化疗药物的反应常用的治疗PDAC。患者低GATA6低或官腔PDAC反应糟糕5-FU-based辅助治疗。9日10一致,Gata6LateKO细胞系明显比Gata6耐研究者用pos细胞(图5 e)。与病人的发现,然而,Gata6LateKO细胞也更耐吉西他滨(图5 e)。Gata6损失细胞行为和没有明确的结论可能是好坏参半。这些观察表明,肯德基细胞系生成面板在这项研究中概括人类疾病的一些特性,包括inter-patient异质性高。
GATA6损失有利于细胞可塑性和免疫逃逸
查明潜在机制Gata6 basal-suppressive metastasis-suppressive函数,我们执行RNAseq Gata6分析pos,Gata6LateKO和Gata6损失主要的肿瘤细胞。最近multi-omics分析主要老鼠PDAC细胞识别两个transcriptomics-based集群:间充质集群C1 (Mes-C1)和上皮集群C2 (Epi-C2),包括三个subclusters C2a C2b和C2c。25参考细胞系的分析包含在我们的实验。25肯德基细胞可以分配给三个集群:C1, C2a和C2b / c。除了一个Gata6pos行了集群Epi-C2b / c和一个被分配到Epi-C2a集群。相比之下,分配给所有行要么Gata6 Mes-C1集群LateKO或Gata6损失细胞,支持GATA6的强劲anti-EMT作用(图6,在线补充图7)。八的Gata6LateKO细胞系RNAseq分析中分离出主要肿瘤已扩散至。有趣的是,从lung-tropic Mes-C1集群只包括细胞肿瘤,而Epi-C2b / c集群只包括肿瘤细胞也产生肝转移(图6)。这些数据进一步支持PDAC与强大的间充质细胞表型殖民优先肺部。
GATA6损失支持细胞可塑性和免疫逃逸。肯德基细胞(A)层次聚类根据RNAseq分析和参考细胞系。Gata6pos,Gata6LateKO和Gata6损失主要细胞被分配到集群描述Mes-C1(间质),Epi-C2a(上皮)和Epi-C2b / c(上皮)。(B)基因集富集分析Gata6之间的基因差异监管LateKO和Gata6pos细胞。(C)基因集的浓缩的MHC I介导的抗原处理和表示肯德基细胞。(D)量化GATA6 CD8α-positive T细胞高(n = 37)和GATA6低(n = 23) patient-derived肿瘤,由包含IHC检测。代表图像的CD8包含IHC CD8低和CD8高样本所示。* p < 0.05。酒吧规模:500µM。(E)相关性GATA6和CD274 (PDL-1编码)mRNA水平表示数据集。罗斯福,错误发现率。NES,正常化浓缩的分数。
我们与所有可能的执行GSEA比较。我们发现最高纯度的EMT在Gata6基因调节基因集LateKO或Gata6损失细胞与Gata6相比pos。另一方面,一个“顶端连接”基因集富集在Gata6基因调节pos与Gata6LateKO细胞(图6 b)。GSEA显示额外Gata6之间的相似之处LateKO和Gata6损失细胞,与Gata6相比pos细胞,包括浓缩的喀斯特signaling_DN的基因在调节基因。相比之下,“缺氧”,“p53途径”和代谢相关的基因表达下调(图6 b,在线补充图7 b)。此外,我们还观察到Gata6之间的显著差异LateKO和Gata6损失细胞(在线补充图7 b, C)。最后,当比较Gata6LateKO与上皮细胞或间充质特性,在Mes-Gata6 EMT显然是调节LateKO两套“MYC目标”基因,细胞cycle-related基因集和DNA-repair-related Epi-Gata6的调节LateKO(在线补充图7 d),确认Gata6LateKO细胞是多样化的。因此,胰腺细胞的异质性是定义特征不仅人类,而且使用的转基因小鼠模型这一疾病。
有趣的是,主要组织相容性复合体(MHC)类我基因H2-d1和H2-k1和immunoproteasome基因Psmd8是最重要的表达下调基因Gata6LateKO细胞,这表明Gata6损失可能诱发免疫逃逸,从而支持高转移潜能。生活会,基因集的MHC I介导的抗原处理和表示“明显丰富Gata6中基因表达下调LateKO细胞(图6 c)。包含IHC GATA6分析低病人肿瘤显示显著减少渗透相比GATA6 CD8α+ T细胞高肿瘤(图6 d)。扩大这些观察,我们探讨了可用patient-derived数据集的证据GATA6参与免疫逃逸。布里奥的队列显示最一致的结果:MHC I-mediated抗原加工、表示和估计大量的CD8 + T细胞26在GATA6显著降低低肿瘤(在线补充图8 a, B)。此外,T细胞激活检查站PDL-1(编码的CD274基因)与GATA6表达式在3/5数据集(负相关图6 e和在线补充图8 c)。有趣的是,CD274和几个基因相关抗原处理和表示(PSMD8,PSMD9,B2M)GATA6峰值启动子在我们执行的ChIP-Seq PDAC细胞,9这表明GATA6直接监管的一个子集。没有显著降低肿瘤浸润在Gata6 Cd8 +细胞观察LateKO老鼠与Gata6相比Ctrl,但这一趋势是观察当比较转移与non-metastatic肿瘤(在线补充图8 d)。综上所述,我们的数据表明,GATA6损失PDAC可以促进免疫逃逸,有利于转移。
讨论
Transcriptomic-based肿瘤分类显示重要PDACs之间的差异和共同点。详细了解分子事件驱动不同的表型,特别是高度侵略性的基底,将会增加成功的几率基本知识转化为临床干预。
在这里,我们表明,失去GATA6上皮的主要监管机构的身份,是必要的,但不充分,收购patient-derived基底表型的样品和下一代小鼠模型中Gata6删除当时引起喀斯特G12D借高档PanIN (Gata6形成LateKO)。
多行GATA6基底表型损失的证据联系。1 2 9 10我们的数据从Gata6LateKO老鼠最终作为分子识别GATA6看门人限制细胞可塑性维持PDAC lineage-specific项目。GATA6损失是必要的,允许表达式基础项目,但额外的下游或平行事件是必需的。patient-derived样品分析表明,HNF1A和HNF4A可能作为进一步分子壁垒保持古典基因计划GATA6表达式时丢失,可能通过一个共享的规定的基因子集。GATA6 HNF1A, HNF4A都参与胰腺癌谱系的细胞命运决定在开发和古典/祖PDACs中高度表达。1次尤其是HNF4A,最近被压抑显示支持经典表型basal-related基因SIX1 SIX4,等等。31日然而,Hnf4a删除在鼠标PDAC瀑样并不足以诱导完整的基底表型,建议GATA6和HNF4A重叠,但不完全相同的角色在维护家族的身份31日这GATA6具有更强的antibasal功能。patient-derived样品一致,GATA6损失总是更广泛和更明显比HNF4A损失,支持按层次结构在向basality PDAC进展(图2 e)。Non-basal GATA6低肿瘤患者中显示中级GATA6表达式,表明存在一个阈值低于HNF1A, HNF4A表达式是输了,建立了完整的基础课程。不存在这样一个阈值在小鼠肿瘤模型中,两个地方Gata6等位基因丢失在基因组水平。因此,hnf表达的损失很可能多个监管事件的结果。重要的是,HNF4A在GATA6 epigenetically沉默吗低/基底PDX-derived细胞,这表明外遗传性下游GATA6丧失的改造是一个至关重要的事件,让整个classical-basal开关。更重要的是,我们的工作建议的层次结构,食物作为第二个障碍保护细胞谱系的身份,/损失GATA6差别可能取决于对这些损失。越来越多的证据表明,classical-basal表型是一个连续体,多种转录因子提供上下文相关的方式。更系统分析需要精确地描述这些和其他血统的互反关系PDAC身份因素。
GATA6和ΔNp63控制PDAC表型之间的关系是复杂的。我们的数据和可用数据的再分析表明,无论是GATA6损失还是ΔNp63足以表达一个完整的表现型开关,但是这两件事是必要的和有证据表明cross-regulationΔNp63的允许差别GATA6对这些基因的表达,进而有助于保持GATA6抑制。类似的监管关系可能是真的HNF4A HNF1A,揭示这些转录因子之间复杂的相互作用和支持的存在continuum-rather二分法的表型。
而体内发现和观察到的相关性在patient-derived样本高度一致,体外调制GATA6和ΔNp63表达的细胞株产生了变量的结果表明高上下文相关的影响包括基质和免疫系统的作用。特别是,BxPC3喀斯特wt,从而代表PDAC患者的一种罕见的子集。我们观察到的不同行为BxPC3(这项工作)和L3.6pl细胞(在我们以前的工作9后GATA6过度可能反映突变喀斯特的贡献。这些差异可能表明BxPC3 L3.6pl细胞系不忠实地代表的复杂性官腔PDACs。事实上,只有3/6 PDX最初定义为官腔14BxPC3的H3K27ac模式和L3.6pl共享。11我们小组主要老鼠肿瘤细胞系代表一个有价值的工具,用于了解基底表型,增加了PDX-derived前面描述的细胞。14镇压basality上皮计划由GATA6内在,食物,可能其他转录因子。还有待确定的调整是否失去了压制性壁垒将恢复表型,一旦建立。不同级别的表观遗传调控可能会决定这样的可逆性。
我们另外表明Gata6损失转移率大幅增加,因此提供分子基础计划之间的联系和PDAC的转移潜力。最近发表的转录组数据集的PDAC涵盖所有阶段证实基底之间的表型是高纯度转移性肿瘤。5全面描述原发性肿瘤细胞株隔绝鼠标显示Gata6损失可能导致更高的可塑性和免疫逃避,转移性细胞的特征。
细胞的可塑性是转移性细胞的标志之一。虽然EMT是需要启动转移扩散,所需的反向process-MET-is转移在遥远的网站和细胞的生长,不能恢复EMT不能增长转移小鼠模型。21日22可塑性的程度似乎发挥重要作用在定义的传播方式32和organotropism转移,更多epithelial-like细胞形成转移优先肝脏和更多mesenchymal-like细胞有利于肺部转移。23Gata6LateKO老鼠优先发展肺转移,主要是E-cadherin-negative,表明Gata6-KO细胞可能无法恢复到一个完全分化状态。然而,在病人,可想而知,GATA6表达式可能重新激活的选择压力下在肿瘤进化或治疗。
传播肿瘤细胞必须克服很多障碍在他们的路径转移性网站,其中免疫监视。抑制抗原处理和表示是一个肿瘤细胞的免疫逃避机制已经从病毒劫持。33 34我们观察到GATA6损失从病人和肿瘤小鼠减少抗原的表达处理和表示机械和渗透的cd8 + T细胞在GATA6减少低肿瘤的病人,可能表明一个更有效的免疫逃避。因此,Gata6淘汰赛支持T细胞介导肿瘤细胞杀死体内CRISPR筛查,33表明免疫原性基因项目是嵌入到GATA6-dependent上皮细胞身份计划。我们报告了类似的发现上皮细胞的另一个主监管机构的身份,NR5A2,积极抑制炎症基因表达项目在正常胰腺。35polycomb专制复杂2(中华人民共和国)最近被证明能促进PDAC de-differentiation和转移GATA6镇压15主见的结果表明,PRC2可以沉默MHC类抗原表达途径。34我们观察到GATA6山峰EZH2和速度启动子在我们发表ChIP-Seq,成绩单是轻微下调在RNA-Seq GATA6沉默。9这些数据点GATA6的间接作用调节抗原处理和表示机械,可能通过PRC2并建立一个意想不到的维护计划和免疫识别身份之间的联系。
总之,我们这里显示GATA6-centred基因调控网络功能的看门人细胞细胞可塑性和免疫逃避身份和街区,从而提供一个分子官腔表型之间的联系和转移。的Gata6LateKO因此小鼠模型是一种有价值的临床工具研究PDAC的最激进的亚型。
数据可用性声明
RNA-Seq加入数量:PRJEB37700。
伦理语句
病人同意出版
伦理批准
这项研究是经当地伦理委员会批准的维也纳医科大学(“Ethikkommission”协议。1753/2014)。
引用
补充材料
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补充数据
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脚注
贡献者点设计研究和获得了资金,分析了实验和准备手稿。BK执行大部分的实验和参与写作手稿。NH鼠标殖民地管理,进行实验。第六,SP和DH-B进行一些实验。JM执行一些生物信息学分析。罗依,SM和RR和分析执行RNA-Seq实验。HPD和JS的病理学评估。女士,如提供切除组织。加和劳从PDX-derived细胞外遗传性的分析数据。b和d提供了双重重组酶鼠标应变。 FXR provided the Gata6 flox mice and participated in the experimental design and manuscript preparation.
资金在实验室工作的点被授予P27361-B23支持奥地利科学格兰特(FWF)贡献从感觉Krebsforschung基金会和英格丽Shaker-Nessmann Krebsforschungsvereinigung基础。患者没有参与这项研究的设计。劳和加支持的琳达·t·约翰·a·成熟赋予创新和探索基金,西奥多·w·Batterman家族基金会,公司和国家卫生研究院的基金:R01 DK52913 R01 CA178627。工作在实验室FXR的支持,在一定程度上,由格兰特rti2018 - 101071 b - i00 (Ministerio de Ciencia Innovacion y大学,马德里,西班牙)。支持CNIO Ministerio de Ciencia Innovacion y大学作为Centro de Excelencia维罗奥乔亚,2015 - 0510。
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