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目标微rna (MicroRNA)配置文件已经在几个biospecimens评估与常见疾病的饮食可能产生相当大的影响。我们旨在描述具体如何饮食与粪便的miRNome纯素食者,素食者和杂食动物,这是如何反映在肠道微生物组成,因为这是探索仍然不佳。
设计我们进行小RNA和猎枪在粪便样本中宏基因组测序和饮食记录从120年健康的志愿者,为不同的饮食和均匀分布的匹配性和年龄。
结果我们发现49 microrna在素食者中差异表达,迟的,素食者和杂食者(p < 0.05)和确认趋势的种microrna的表达水平与一个独立的群体相比,素食者和严格素食者45杂食动物。两个microrna与脂质代谢有关,mir - 636和mir - 4739,是non-omnivorous饮食时间指数呈现负相关,独立于主体的年龄。十七个microrna相关(迟的,|ρ| > 0.22,p < 0.05),估计摄入的营养,尤其是动物蛋白质,磷,有趣的是,脂质。在杂食动物,高普氏菌和Roseburia和更低的拟杆菌丰度比素食者和严格素食者被观察到。脂质代谢相关mir - 425 - 3 - p和mir - 638表达水平与微生物物种的丰度增加有关,如Roseburiasp, CAG 182和Akkermansia muciniphila,具体不同的饮食。综合分析确定25 microrna 25类群和7膳食营养明显歧视(接受者操作特征曲线下的面积= 0.89)的三个饮食。
结论凳子microrna的概要文件与特定的饮食和支持脂质作为一个驱动程序的角色的表观遗传变化和肠道host-microbial分子相互作用。
- 饮食
- 分子遗传学
- 结肠微生物区系
数据可用性声明
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本研究的意义
已知在这个问题上是什么?
采用素食或纯素食饮食的摄入量较低有关相关慢性疾病的危险因素,如心血管疾病和癌症。然而,它仍然是有争议的这种饮食是否总是健康和推荐。
饮食组件可以调节肠道微生物的组成和功能和作为细菌生长的基质代谢可能影响宿主的健康。
host-gut相互作用可以调节饮食的影响。小分子核糖核酸(microrna)粪便中可能直接调节特定细菌基因的表达和影响肠道微生物的生长,因此在基本维持正常肠道微生物群。
有什么新发现吗?
饮食与凳子miRNome杂食动物,素食者和严格的素食主义者,和几个microrna描述特殊的签名不同的饮食方法。
mir - 636和mir - 4739,在脂质代谢中有重要作用,展示表达水平负相关的持续时间non-omnivorous膳食制度,独立于年龄。此外,目标的凳子microrna调节素食或纯素食主题丰富脂质和叶酸代谢。
素食和素食者的特点是高凳子mir - 425 - 3 - p水平,一个microrna与脂质代谢有关,其含量在凳子上的相对丰度与特定的微生物类群,包括Akkermansia muciniphila。
凳子microrna的概要文件和微生物组成,加上饮食营养,可以准确区分不同的饮食和加强host-gut微生物相声的证据。
本研究的意义
它会如何影响临床实践在可预见的未来吗?
这些发现是向前迈出的重要一步的说明涉及宿主和微生物活动的分子机制与饮食相关组件吸收和新陈代谢。
在监测遵守特定的饮食制度,营养素的摄入量应该仔细检查,非侵入性的转化方法粪便microrna的分析可以很容易实现。
肠道微生物组的综合分析和粪便microrna可能为设计更准确的个性化饮食模式提供见解和建议,旨在预防/治疗慢性疾病。
介绍
饮食习惯和生活方式紧密相关的因素以及社会生活和文化,和都是严格与健康。饮食和营养代表相关的风险因素不同的代谢和脂肪变性和非酒精脂肪肝等慢性疾病,动脉硬化和癌症。1高层消费红肉,加工肉类和动物脂肪与癌症风险的增加有关,包括结直肠癌(CRC),2而高摄入膳食纤维被认为是保护因素。3
越来越多的研究表明,素食(VT)和纯素食(VN)饮食模式与最相关的含量明显低于相关慢性疾病的危险因素(如身体质量指数(BMI)或血脂和血糖水平)的顺向风险降低缺血性心脏病或癌症的发病率或死亡率。4然而,很难辨别是否健康优势归因于VNs可以全面管理系统甚至温和肉食者遵循健康的饮食。此外,仍有必要阐明这些联系的确切分子机制。到目前为止,只有很少的研究也进行了严格的试验比较杂食的,VT和VN科目不同实验小组。少数可用,调查的分子机制参与膳食成分吸收,生成细胞培养和动物模型。5
在过去的几年里,小分子核糖核酸(microrna),小非编码rna调节基因表达在转录后水平,详细研究了重要的监管机构改变人类疾病,包括癌症6和神经退行性疾病。7饮食营养和特定组件涉及调制的microrna的表达在体外/体内模型,因此,在所有miRNA-mediated分子机制。8基于一种microrna的候选方法,我们进行了试点研究粪便/健康志愿者血浆样品用不同的饮食习惯,发现其中微分microrna的表达水平。9不同的研究报告粪便microrna的表达和胃肠道功能紊乱之间的关系,10包括CRC。11日12然后,粪便样本可以代表一个合适的非侵入性的代理组织评估发生在转录和外遗传性改变坚持不同的饮食方案。然而,许多问题仍然没有解决有关饮食质量和数量的组件需要调节microrna的表达在人类身上。13最近,我们澄清了某些特定的microrna的表达之间的关系和包含特定的饮食营养健康的个体。14
饮食组件可以调节肠道微生物的组成和功能15日16和饮食富含纤维和穷人在动物性产品(VN / VT政权,地中海式饮食)可能驱动特定类群的选择。17日至19日同时,越来越多的研究报道协会肠道微生物与几个胃肠失调和non-gastrointestinal疾病,包括糖尿病、20.炎症性肠病21和癌症。22
刘和他的同事们23表明粪便microrna直接调节特定细菌基因的表达,影响肠道微生物的生长,因此必要的维护正常的肠道微生物群。此外,肠道微生物组的综合分析和小非编码rna在人类粪便可能为设计提供见解在CRC更准确的诊断工具。12肠道菌群与microrna可能交互调节宿主基因表达。24然而,肠道微生物之间存在的相互作用和microrna的表达谱的存在一个特定的饮食制度仍然是未知的。
在目前的研究中,microrna的概要文件和肠道微生物之间的关系长期饮食制度是根据不同的探索。小非编码RNA序列进行粪便和血浆样本中120名健康志愿者杂食性,VT和VN饮食习惯。此外,肠道微生物被猎枪宏基因组分析。测序结果与详细信息综合验证问卷和特定的营养摄入的食物阐明分子的存在来描述一个特定的饮食制度。
DESeq2分析,我们发现49 microrna在凳子上差异表达的迷走神经刺激法和VTs与杂食动物(Os)突出相比p < 0.05)。有趣的是,差异表达microrna的饮食人群参与脂质和叶酸代谢的规定,脂肪细胞分化和与肥胖和obesity-connected糖尿病。这些microrna的组合、微生物类群和营养明确区分主体根据他们的饮食(接受者操作特征曲线下面积(AUC) = 0.89)。
方法
提供的详细方法在线补充材料的手稿。
研究人口招聘和饮食信息
一群120健康人(72女性和48岁男性),归类为VTs,迷走神经刺激法和操作系统,招募在自愿的基础上在都灵(意大利)2017年5月到2019年7月。合格的受试者被包括在研究中根据以下选择标准:相关的饮食政权随访1年多,没有消费的抗生素在抽样前的前三个月,没有使用阿司匹林或其他消炎药月抽样前,没有证据表明肠道和其他病症,没有怀孕和哺乳期。三个科目使用抗高血压药物和只有一个用一种降低胆固醇的药物。研究对象包括同样比例的VT, VN和O,性别与年龄匹配(图1一个)。人体测量数据收集了所有科目的抽样。无与伦比的45杂食的健康个体的独立团体(31妇女和14人),凳子小RNA-Seq数据(在同一个实验室和执行相同的协议/管道的分析)也可用于microrna的资料验证。
(一)研究的工作流程;(B)雷达情节报告每周摄入特定的相对水平根据膳食养生食品和饮料的自我报告的问卷;(C)估计营养摄入比素食者(VT,左面板)和纯素食者(VN,右面板)对杂食性饮食(O) MUFAs,单不饱和脂肪酸;欧米伽,多不饱和脂肪酸。
所有的参与者都签署了知情同意书。的设计研究中,知情同意和协议是经当地伦理委员会批准。
所有招募受试者填写验证自行食物频率问卷(FFQ)评估通常的饮食,生活方式和个人历史数据,按照欧洲癌症与营养前瞻性调查史诗研究标准。25FFQ由248个问题的188种不同的食品,包括照片和两个或三个样品定大小的盘子或引用标准份量。个人营养食品的成分是来自意大利食物成分表26平均每日摄入的营养素和微量元素为每个志愿者估计。
生物样本的集合
自然疏散粪便样本来自所有志愿者之前指示赛尔夫收集标本在家里。粪便收集在核酸收集和运输管与RNA / DNA稳定的解决方案(一起Biotek Corp .)和存储在−80°C到RNA和DNA提取。27
收集血液样本为EDTA和血清凝活化剂管,根据标准放血过程,当志愿者了粪便样本的实验室。EDTA管离心机在×1000 g 10分钟在室温和等离子体被整除,储存在−80°C。血清管离心机在×10分钟在室温下4000克、整除和存储在−80°C。一个整除的血清维生素B12的用于分析和铁蛋白。血液样本之间的时间采购和血浆/血清存储还不到3个小时。
从凳子和血浆总RNA的提取
总RNA从凳子是用粪便中提取总RNA净化设备(一起Biotek Corp .)如Tarallo所述等。12
总RNA提取200µL等离子miRNeasy血浆/血清迷你包(试剂盒、希尔登,德国)使用QiaCube器(试剂盒)后,制造商的说明和研究中所描述的费列罗等27和Sabo等。28
微RNA RNA浓度被量子位量化分析工具(表达载体)。
从凳子上提取的总DNA
QIAamp DNA的DNA提取了凳子MiniKit(试剂盒)根据制造商的指示和Tarallo所描述的研究等12和托马斯•等。22量子位的量化进行了DNA荧光计(量子位DNA海关化验设备;英杰公司)。
小核糖核酸测序和生物信息学分析
图书馆准备小RNA (sRNA)与NEBNext成绩单进行多路小核糖核酸库预备组Illumina公司(美国新英格兰生物学实验室协议E7330)中描述的研究费列罗等。27对于每一个样本,250 ng RNA被用作起始物料准备库。
获得序列库受到Illumina公司测序管道和50周期sequencing-by-synthesis HiSeq 2000(美国Illumina公司)(与Genecore设施EMBL的合作,海德堡,德国)。
小核糖核酸测序分析使用前面描述的方法。12读取通过适配器的质量控制是将序列使用Cutadapt V.1.10。修剪读取映射对人类microrna的序列从miRBase V.2229日使用BWA V.0.7.1230.使用默认设置。汇总统计的数据和校准报告在线补充表1 a, B。人类microrna注释和量化使用两种方法称为“知识”和“定位”Tarallo中描述的方法等。12microrna的武器来自“定位”分配方法在斜体表示。
微分表达式分析DESeq2 V.1.22.2 R包31日利用似然比测试函数模型中的协变量包括年龄和性别。一个microrna的被定义为差异表达(DEmiRNA)如果与Benjamini-Hochberg (BH)调整p值< 0.05,支持超过15读至少一个的饮食组。集DEmiRNAs从人类微疾病重叠与注释数据库(HMDD) V.3.2,32考虑与每个microrna的前体和数据库相关的注释注释相关的胃肠道癌症、代谢紊乱、免疫细胞,或心血管疾病。
猎枪宏基因组和生物信息学分析
图书馆是准备使用Nextera DNA库准备工具包(Illumina公司)和测序的Illumina公司HiSeq平台研究中描述的托马斯等。22
主机使用人类的序列被污染去除过程从人类微生物组项目。33生读quality-trimmed (phr得分< 25)和丢弃了读取短于60个基点SolexaQA + +软件。34读取获得的数量为每个样品报告在线补充表1 c。通过使用MetaPhlAn 3进行了分类分析。35通过HUMAnN 3.0功能配置。36
microrna的表达之间的集成,营养摄入和类群
R包mixOmics受雇为一体的三个数据集(分类档案,microrna的表达谱和饮食信息),使用数据集成分析生物标志物发现使用潜在的组件(暗黑破坏神)模型。37数据集是集成正常化后(规模R函数)和删除接近于零的变量(nearZeroVarR的函数包脱字符号)。
统计分析
所有统计分析软件V.4.0.4使用R。饮食和生活方式的分析共使用χ执行主体人群2测试分类变量。连续,克鲁斯卡尔-沃利斯和Wilcoxon rank-Sum进行测试。
DEmiRNA表达之间的相关性分析和营养摄入量使用枪兵的方法执行。使用BH方法执行多个测试校正和相关性与调整后的p值< 0.05被认为是具有统计学意义。
广义线性回归模型(GLM)是计算使用全球语言监测机构协变量R函数来评估主体的相关性在解释观察到的凳子DEmiRNA水平。DEmiRNA水平被视为模型的因变量而受试者年龄、性别、体重指数、身体活动、腰围和季节的样本集合被认为是作为模型的自变量。一协变量被认为是有关DEmiRNA表达如果p值< 0.05。DEmiRNA之间的关系表达式,估计摄入的营养评估计算的全球语言监测机构调整年龄、性别和体重指数。GLM的意义是计算对一个空模型使用野生在方差分析R函数实现。模型与p值< 0.05被认为是具有统计学意义。营养的贡献相关联的模型被认为是显著的,如果p值低于0.05,低于计算的贡献性,年龄和体重指数模型。
分类精度的特性确定的暗黑破坏神分析使用10倍交叉验证方法与随机森林分类器实现Weka V.3.8.5 (https://www.cs.waikato.ac.nz/ml/weka/)。被评估的AUC的分类效率。
microrna的目标功能富集分析
功能富集分析使用RBiomirGS V.0.2.1238考虑到验证的目标:(1)DEmiRNAs连贯地差异表达VT和VN对O;(2)microrna与集群的营养或显著相关(3)类群;(4)从暗黑破坏神DEmiRNAs分析。VN之间的log2FC和调整p值计算和O饮食被用作输入的工具。基因集的特点是一个调整p值低于0.05被认为大大丰富。
结果
研究对象和饮食特点
总共有120名志愿者,分为40 Os, 40 VTs和40迷走神经刺激法,包括在这项研究中。研究对象的特点和设计中描述的研究表1和图1一个,分别。受试者在杂食性动物,显示略高BMI(公斤/米2)与其他群体相比(O: 23.6±3.9, VT: 21.9±2.6, VN: 21.8±2.9公斤/米2在所有比较p < 0.05)和腰围(O: 83.8±11.6, VT: 78.1±8.6, VN: 78.9±8.8厘米,在O vs VT, p < 0.05) (表1)。天的样品收集在不同的分布式VT和VN对O个人对不同季节的(p < 0.05)(数据没有显示)。
所有的饮食和生活方式的特征是详细报道在线补充表2。在血清铁蛋白的浓度显著降低在VT / VN O (p < 0.01和p < 0.05),而维生素B12低VT的其他两组。从188项列表中包含在史诗的问卷调查,分析集中在描述最具代表性的营养膳食制度的差异(食用肉类、加工肉类、鱼、奶酪和乳制品、面包和面食、蔬菜和水果)。特定的相对每周摄入食物和饮料的报道主题问卷调查总结图1 b和在线补充图1。明显高于摄入营养成分如维生素C,β-carotene和纤维被发现与o .相反VN相比,在相同的比较,显著降低维生素D,观察动物蛋白质,维生素A和胆固醇在VN (图1 c)。在VT, O的差异不太明显但符合那些观察到VN:唯一的明显区别是在VT减少多不饱和脂肪酸的摄入与O(相比图1 c)。分布的大量营养素和微量营养素摄入量之间的三个饮食组表示在线补充图1 b。
根据不同的饮食凳子microrna的概要文件
粪便RNA样本测序后,平均64 681读(0.83%)是已知人类microrna的序列对齐和中等数量的253年,321年和310年凳子microrna在O检测,分别VT和VN (在线补充表1)。在这些microrna中,145(59.43%)表示在所有三个饮食组(在线补充表3)。
褶皱变化(表示为log2FC) microrna的表达水平的VT和VN与O显著相关(ρ= 0.62,p < 0.0001),显示一个连贯的趋势(图2一个,上半部分)。
(一)散点图报告产生的log2FC microrna的表达之间的相关性比较VT和O或VN使用斯皮尔曼相关系数的计算方法。报告上面板中的所有microrna发现两个比较;只有DEmiRNAs在较低的面板。(B)沮丧情节报告凳子DEmiRNAs重叠的数量/具体执行的三个比较。(C)线情节的报告中表达凳子DEmiRNAs分布在三个饮食组。基于log2FC microrna分为表达下调和调节计算VN和o . (D)之间的散点图报告的凳子DEmiRNAs表达式的正常表达水平降低与non-omnivorous饮食政权及其持续时间的关系。(E)之间的相互作用的网络表示凳子DEmiRNAs(圈)和营养(菱形)。节点的大小成正比的总节点度。每条边代表一个显著相关(p < 0.05)也支持由age-corrected sex-corrected和BMI-corrected GLM分析。相关系数由颜色和边缘宽度。 O, omnivore; VN, vegan; VT, vegetarian
49 microrna显著差异表达的三个饮食组sex-adjusted和年龄调整微分表达式分析(在线补充表3)。对于这些DEmiRNAs,褶皱变化比较的VT和O和VN和O有紧密的关联(ρ= 0.84,p < 0.0001) (图2一个较低的面板)。15 DEmiRNAs VT和VN(表达有差异图2 b)和显示一个连贯的表达趋势:11日调节和4表达下调与O .相比考虑49 DEmiRNAs的中值表达,表达水平逐渐变化观察从O VN VT显示中间这些分子的表达水平在凳子上(图2 c)。GLM调整饮食组、性别、年龄、体重指数、腰围、身体活动和样本收集显示BMI的季节,和年龄和季节的样品收集在解释很大程度上造成了凳子的水平,分别为11和8 DEmiRNAs 49 (在线补充表3 b)。有限数量的DEmiRNAs显著性的影响(一个microrna的),身体活动(一个microrna的),腰围(三个microrna)。纠正DESeq2分析样本集合的季节或BMI证实38和30 DEmiRNAs 49,分别为(在线补充表3 c)。
表达水平的五年DEmiRNAs显著降低而增加的non-omnivorous饮食(p < 0.05) (在线补充表3 d;图2 d)。其中,mir - 636,mir - 4488 - 3p和mir - 4739也显著下调VT / VN与O(相比在线补充图2上半部分)。在这方面,只有的表达水平mir - 4488 - 3p与实足年龄与此同时具有负相关性(在线补充图2之间的关系,较低的面板),加强mir - 636和mir - 4739下调non-omnivorous膳食政权的程度。
之间的相关系数聚类分析估计营养摄入的水平并且标识的所有凳子microrna强调两个主要组成的集群30和8个microrna营养丰富有显著相关性(例如,膳食纤维、植物油脂和植物蛋白)或减少(如动物脂肪、动物蛋白和钠)在VT和VN,分别为(在线补充图2 b)。22个microrna在那些被确认为差异表达在VT / VN与O(相比在线补充表4)。进一步探索营养摄入量估计之间的关系和凳子DEmiRNA水平,GLM回归分析调整性别、年龄和体重指数进行了揭示56 miRNA-nutrient协会支持的分析(图2 e,在线补充表4 b)。相关的营养特点是最多的DEmiRNAs植物脂质(8 microrna),紧随其后的是动物脂质(七个microrna)和总/动物蛋白质和磷(6 microrna)。相反,在所有DEmiRNAs, mir - 8053水平与最多的养分(n = 9),其次是mir - 4277和mir - 1260 - a - 3 - p(为n = 8)。56 miRNA-nutrient协会,28日协会涉及营养没有特定的饮食制度如动物蛋白/脂质相干甚至还考虑了三个饮食组分开。
HMDD注释的分析显示,12的49个凳子DEmiRNAs被前兆特征序列与一个特定的疾病表型的不同研究(n = 191) (在线补充图3和在线补充表3 e)。
验证一组独立的杂食动物的粪便样本
表达谱的49个凳子DEmiRNAs也调查的一个独立队列45 O分析在另一个项目(见方法部分)。DEmiRNAs都在凳子上发现的验证组和强烈的水平与40 O的调查研究中(ρ= 0.82,p < 0.0001) (在线补充图3 b和在线补充表3 f)。41的49 DEmiRNAs被验证为显著差异表达在凳子上这些O对象相比,VT或VN (图3 c在线补充和在线补充表3 f)。此外,这些验证的log2FC microrna在两者之间呈正相关的比较(ρ= 0.80和0.79,VT vs vs O, O和VN分别;p < 0.0001)。非标准的八个microrna, 7个特征是一个连贯的log2FC比较两组的至少一个操作系统。
等离子体microrna的概要文件与饮食
平均2 124 450(30.70%)等离子体小RNA序列读取对齐microrna的序列(在线补充表1 b)。血浆样本的特点是低分数的读取地图上未标明的人类注释(平均2.36%)相比,凳子(平均60.75%)。平均数量的382年、384年和385年microrna血浆样本中发现O,分别VT和VN。大部分的microrna在等离子体中发现(n = 252, 89%)通常发现在所有三个饮食组。
不同于microrna的概要文件在粪便样本,血浆样品中未发现DEmiRNAs比较不同膳食组(在线补充表5)。在49 DEmiRNAs在凳子上数据的分析,获得6个(mir - 181 - c - 3 - p, mir - 425 - 3 - p, mir - 641 - 3 - p, mir - 143 - 3 - p,mir - 1260 - a - 3 - p,mir - 4508 - 3 - p)也在等离子体中发现样品(在线补充表5 b)。其中,只有mir - 143 - 3 - p的特点是高,但仍与不同表达水平相比,VT O和VN。没有凳子DEmiRNAs明显与相同的microrna的表达水平的血浆样品。
在其他microrna在血浆样本,发现mir - 362 - 3 - p显示正相关比较血浆和凳子表达水平最高(ρ= 0.31,p < 0.0001)let-7a-1-3p是不同biospecimens之间的负相关性(ρ=−0.34,p < 0.0001) (在线补充表5 c)。
XenomiR粪便和血浆中表达水平
休非人microrna的存在(xenomiRs)评估通过分析human-unmapped读取的分数。186年平均粪便样本,从地图上未标明的读取设置读取(0.005%)被分配到xenomiRs,在等离子体,映射率略高(平均1290阅读,0.87%的human-unmapped读)(在线补充表1)。只有两个xenomiRs (gga - mir - 1692和gma-MIR6300)检测到高于阈值的表达式用于我们的分析。gma-MIR6300的凳子上水平,有趣的是,在大豆基因组注释(大豆),显著提高(p < 0.05)在VT和VN对O (在线补充表6)。xenomiR,没有发现在人类microrna序列相似性,而同源序列的基因组中观察到其他食用蔬菜和水果(如茄属植物lycopersicum,茄属植物tuberosum和Cucumis梅洛)(在线补充表6)。相反,在等离子体样品,发现了11 xenomiRs, chi-mir-30d(注释·卡普拉狐臭的基因组)的特点是最多的读取。所有11 microrna注释一个动物(c .狐臭的背带吊裤带,野猪,大西洋鲑或Gadus morhua)。然而,鉴于这些microrna与同源序列的同源性高的人类,一个真正的循环水平的这些分子是不可靠。实际上观察到的阅读可以测序相关的部分相应的microrna的前兆。
肠道微生物组成和功能和粪便microrna
肠道微生物分类组成不同根据不同的饮食模式。在不同的丰富的类群,普氏菌copri和Roseburiasp。182年CAG显示丰富VT / VN与O相比,高拟杆菌dorei(目前Phocaeicola dorei)在O (p < 0.05;图3一)。
(一)箱形图显示三个细菌物种的相对多度中不同普遍饮食组。* Wilcoxon rank-sum p < 0.05。(B)热图报告中的代谢途径不同的流行的代表metagenomic饮食组的概要文件。(C)条图显示每个DIABLO-selected变量在每个组件的装载重量。的颜色表明饮食组变量的最大水平。(D)之间的co-variability Co-inertia分析量化三个数据集(分类组合、microrna的膳食营养)。形状代表每个主题的投影坐标。质心之间对于一个给定的样本数据集由开始的箭头表示同样的位置在每个数据集样本的提示箭头。箭头的长度成正比,数据从不同的块之间的分歧。(E)热量地图对象的层次聚类分析的结果基于判别变量被暗黑破坏神。 (F) Box plots reporting the relative abundances of two bacterial species whose levels are significantly different in stool of subjects characterised by higher or lower expression of both miR-425-3p (top) and miR-638 (bottom). O, omnivore; VN, vegan; VT, vegetarian.
肠道功能分析的基因组与HUMAnN3执行。不同的肠道微生物组成反映在微分电位活动。O显示增加了丰富的微生物代谢途径,包括有关氨基酸的生物合成途径,生物胺或其前驱物(L-isoleucine生物合成四世,精氨酸生物合成I和II, super-pathway赖氨酸、苏氨酸和L-methionine生物合成二世,腐胺生物合成四世chorismate 3-dehydroquinate生物合成),以及生物合成的维生素(formyl-tetrahydrofolate生物合成、泛酸盐和辅酶A生物合成III)(罗斯福< 0.05;图3 b)。
之间的相关系数聚类分析细菌丰度和凳子microrna的表达水平导致不均匀的集群(图2 c在线补充)。尽管两个主要的细菌物种和microrna,只在特定的bacteria-miRNA对相关系数是显著的。细菌物种的特点是最多的microrna相关(p < 0.05)Ruminococcaceae细菌D5(相关microrna 11日),p . copri(n = 8)Phascolarctobacterium succinatutens(n = 7)。microrna与细菌物种中,10个明显差异表达VT / VN与O (在线补充表4)。
集成的microrna、微生物和饮食
暗黑破坏神模型确定一组25 DEmiRNAs 25类群和7膳食营养,一起,歧视三组(图3 c)。至于凳子DEmiRNAs, GLM调整了年龄、性别、体重指数、身体活动、腰围和样本收集的季节是应用于评估协变量类群和主题之间的关系。只有五个物种的重要贡献至少其中一个变量(在线补充表3 b)。偏最小二乘判别分析和分层聚类显示分离对象根据他们的饮食图3 d, E)。评估数据的鲁棒性在这个研究报告中区别不同的饮食组,机器学习分析使用这些功能的组合应用。分析证实,确定特征能够有效区分不同膳食组(平均AUC = 0.89)。正如所料,更高的分类精度在杂食性(AUC = 0.95)和VN (AUC = 0.94)的个人比VT (AUC = 0.79)。
两个DEmiRNAs, mir - 425 - 3 - p和mir - 638,吸引我们的兴趣,因为他们是与一个连贯的高表达在VT / VN比较与分析了O组(其中不受BMI),他们也被暗黑破坏神的判别功能不同的饮食制度,他们与营养显著相关(图2 e)。因此,这些DEmiRNAs进一步追究他们与肠道微生物组成的关系。学科内的最高四分位数mir - 425 - 3 - p表达水平(无论哪一类型的饮食)显示更高的丰富Akkermansia muciniphila, Roseburia hominis Roseburiasp。CAG 182,Oscillibactersp。57 _20,Oscillibactersp, CAG 241和r .细菌D5与最低四分位数(图3 f和在线补充图4),而Anaerotruncus colihominis和Flavonifractor plautii更丰富的主题相同的microrna的最低水平。一致,更高水平的Roseburiasp, CAG 182和r .细菌D5以及丰富的低答:colihominis被发现在主题中mir - 638的表达水平最高。
富集分析
microrna的目标富集分析探索是否独立集相关的凳子microrna确定在本研究中(例如,所有确认DEmiRNAs调节或表达下调,microrna被暗黑破坏神和microrna与细菌物种或营养摄入)预测控制常见的生物过程。927功能方面明显丰富迟的,(p < 0.05)从每组的microrna认为目标基因(在线补充表7),68年至少有三个方面丰富microrna的设置与此同时(图4一)。66年,丰富的microrna调节VN / VT,建议相关的抑制过程(负系数图4一)。特别条款中多余地丰富最多的microrna集(5套)KEGG_One_carbon_pool_by_folate和GO_Regulation_of_gluconeogenesis_by_regulation_of_transcription_from_rna_polymerase_ii_promoter。具体来说,KEGG metabolic-related术语中,One_carbon_pool_by_folate和Glyoxylate_and_dicarboxylate_metabolism是最代表的分析(图4 b)。这些术语丰富的凳子DEmiRNAs调节VN / VT还microrna被暗黑破坏神和与更高的营养摄取中观察到VN和VT。最后,Arachidonic_acid_metabolism是唯一KEGG metabolic-related术语丰富的DEmiRNAs下调VN / VT。
(A)点图显示功能项的统计显著性目标确定为丰富的不同组的凳子microrna饮食组之间的差异表达(DEmiRNAs),被暗黑破坏神,与营养相关团体或与一群细菌物种。点的大小正比于意义,而颜色代码是指由RBiomirGS系数计算。负相关系数过程预测下调基于microrna的表达变化。只在至少两个方面丰富microrna的组织报道。(B)表报告KEGG代谢方面丰富不同的microrna的团体的目标。黄衫军的酒吧代表RBiomirGS系数计算。正面(红色)或负面(蓝色)系数预测基于microrna的表达变化。
分析粪便DEmiRNA肠道组织样本中表达和表观遗传状态
最后,我们评估的表达水平凳子DEmiRNAs TissueAtlas肠道组织中使用的数据。39分析证实19 DEmiRNAs 22在肠道也可检测(在线补充表8)。特别是,mir - 143 - 3 - p是DEmiRNA特点是结肠癌样本中表达水平最高(平均z分数= 2.40),而另一些人则喜欢mir - 638, mir - 425 - 3 - p和mir - 636检测到在小肠和结肠/ TissueAtlas的不同组织样本库。
此外,由于基因的表观遗传状态轨迹可以代表一个可靠的代理的主动/压抑的转录状态,DEmiRNA编码基因的表观遗传状态是表观基因学的评估项目。40分析证实了转录活跃的表观遗传状态41的49个凳子DEmiRNAs至少在一个样本的类型分析(在线补充表8 b)。具体来说,结肠粘膜与最多的epigenetically活跃DEmiRNA位点(n = 26),其次是十二指肠粘膜(n = 23),小肠和结肠平滑肌组织(n = 18)。分析证实,在结肠平滑肌样本,染色质状态相关的强势在mir - 143编码转录位点前后一致地与先前的观察。41
讨论
在目前的研究中,我们探讨了120名健康受试者的粪便miRNome坚持VN, VT或杂食性动物,报道,microrna的表达水平受饮食影响,可能与肠道微生物群组成和功能之间的关系。49 microrna显著差异表达他们三个饮食组和15中显示一致的表达趋势upregulation VT和VN差别或对这些与两个独立组相比o .这些结果表明逐步适应miRNome来响应特定的饮食疗法,可能因此表观遗传和宏基因组的变化发生在肠道,这反映在凳子上。人类和小鼠模型的研究已经表明,长期饮食变化驱动主机表观基因组和人类肠道微生物群的稳定的修改。42 43在这方面,在我们的研究中,两个凳子DEmiRNAs (mir - 636和mir - 4739)显示的时间差别明显对这些non-omnivorous饮食,独立于VT / VN主题的年龄。mir - 636,一个基因内的microrna的编码SRSF2轨迹,发现血液中表达下调/肥胖受试者的血清和脂肪组织44相反,调节与肥胖和糖尿病肾病年轻的学科。45 46一般来说,这种microrna似乎与减肥。Garcia-Lacarte和他的同事们,47例如,发现mir - 636 hypomethylated和代谢综合征患者中高度响应的减肥方案。microrna的差别大概,对这些观察到在VT和VN可能与低脂饮食,最终更保护肥胖和糖尿病的风险。
mir - 4739已被报道为中心在监管网络由长非编码RNANEAT1。48NEAT1工作作为一个microrna的海绵和压制糖尿病肾病的扩散和纤维化。49因此,的作用NEAT1作为一个自然downregulator mir - 4739可能模仿VT或VN饮食。此外,mir - 4739与脂肪形成的诱导分化有关的人类骨髓基质细胞通过针对低密度脂蛋白受体相关蛋白3 (LRP3)。50一些代谢相关的基因,包括SHMT1和MKNK2,已经被注解为拥有最多的验证交互mir - 636和mir - 4739。SHMT1编码丝氨酸hydroxymethyltransferase 1,一个关键的蛋白质参与一个碳代谢。51相反,MKNK2,编码MAPK互动丝氨酸/苏氨酸激酶2,最近与脂肪细胞的脂质代谢有关。52尽管需要更多的数据来支持一个microrna的表达调制长期植物性饮食,我们的数据突显出,在凳子上可以检测microrna调节代谢过程,如脂质,主要受不同的饮食方法。
在这项研究中发现一些其他的凳子DEmiRNAs特异表达在不同的疾病,从HMDD检索,数据库的实验支持人类microrna的疾病协会。mir - 143是DEmiRNA与注释(101)研究的最多,其次是mir - 124(44研究),mir - 425(11个研究)和mir - 638(10研究)。有趣的是,在我们的研究中,所有这些microrna在凳子上调节的VT / VN相比,o . mir - 143是一种进化保守作为bicistronic microrna的转录RNA和mir - 145在一个集群中。mir - 143 / mir - 145是众所周知的肿瘤抑制microrna在几个癌症特异表达类型,包括CRC。53持续低水平的mir - 143 - 3 - p在凳子的CRC患者被观察到11日12及其在凳子upregulation VT / VN支持降低癌症风险观察这些饮食习惯有关。54 55这两个microrna一些基本目标紧密连接蛋白。56尽管如此,mir - 143 - 3 - p调节器的脂肪细胞的分化57和减少水平的microrna的观察肥胖个体与正常体重控制在两个独立的研究。58 59mir - 143 / mir - 145集群在肠道上皮细胞的再生有重要作用通过调节胰岛素生长因子信号通路。60有趣的是,在结肠炎小鼠模型,管理两个益生菌,乳酸菌酵母和l .唾液链球菌结肠损伤和改善,与此同时,增加mir - 143在结肠组织中表达。61年相反,mir - 124活跃在结肠组织和相关的炎症反应,调节信号的调制传感器和转录激活3和乙酰胆碱酯酶。62 63mir - 124 - 5 - p是经常CRC组织中表达下调。64年在VT / VN凳子,增加这样的microrna的表达水平调节肠道上皮细胞的炎症反应和维护一致的植物性饮食的已知的抗炎作用。65年
在过去的十年里,宏基因组深度增加了我们的知识的肠道微生物的组成和功能,以及它是如何由外部因素。66年然而,我们所知,只有少数研究在人类已经探索了主机microrna作为调停人的角色或肠道微生物组的扶少团团员。242019年,美德和同事67年表明,mir - 181在白色脂肪细胞的肥胖小鼠和基因敲除小鼠更容易高脂肪的饮食。在相同的研究中,作者表明,microrna的表达是影响鼠标的肠道微生物群的变化。mir - 181也观察到调节餐后时期的大量饱和脂肪餐在健康人外周血单核细胞,68年支持一个链接的microrna与脂质代谢。有趣的是,在我们的研究中,mir - 181 - c - 3 - p凳子水平逐步增加从O VN与估计动物脂质摄取呈负相关(斯皮尔曼ρ=−0.22)。微分表达式各种lipid-related microrna在凳子VT / VN表明膳食脂肪摄入量的变化可能推动有效的表观遗传变异在肠道,正如前面提出的。69年在low-lipid膳食干预研究中,这些microrna的凳子水平可以代表一个有效的非侵入性的参数来评估病人的依从性和响应的饮食。
在目前的研究中,肠道微生物分类组成不同的饮食模式,p . copri和Roseburiasp。182年CAG在VT /更高的丰度比o . VN有趣的是,答:muciniphila丰度与饮食和microrna与最近的观察一致。24答:muciniphila是一个著名的有益微生物参与粘蛋白代谢的水平减少一些疾病,包括溃疡性结肠炎和代谢紊乱。70年以前的证据报道,人类microrna能直接目标基因的细菌。具体地说,刘和他的同事们71年表明人类粪便的口服miR-30c小鼠模型的直接针对多发性硬化疾病症状的改善答:muciniphilaβ-galactosidase coding-gene,进而增加了肠道细菌丰度。尽管miR-30c-5p与低凳水平在我们的研究人群,在凳子上更丰富的VT / VN。
值得注意的是,高凳子mir - 425 - 3 - p水平,VT / VN microrna的调节,丰富的显著相关答:muciniphila在我们的研究中。这显著下调血清microrna的观察hyperlipidemic主题与健康对照组相比。72年此外,其他成熟microrna来源于mir - 425位点,mir - 425 - 5 - p,能够应对在小鼠小肠和抑制脂质挑战3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA合酶编码(HMGCS2),脂质代谢的关键酶。73年最后,mir - 425 - 5 - p在脂肪细胞过度以前相关的脂肪生成的监管和脂解作用。74年这些数据进一步加强我们的假设的角色不同膳食摄入的脂质在VT / VN饮食的司机一致的microrna的肠道内调制。水平更高的凳子mir - 425 - 3 - p和mir - 638也显著相关Roseburia和r .细菌D5,这在我们的队列在VT / VN更丰富,条理清楚地与先前的观察。18 75这些数据可能是一个重要的进一步证据host-microbial交互由饮食和表观遗传因素如microrna。从这个意义上说,我们的结果在microrna能反映肠道微生物群的变化在食物脂肪的作用下在Chadaideh最近审阅的和卡莫迪。76年
在目前的研究中,三个调查小组,饮食信息记录在史诗的分析调查问卷确认每周食品消费和预期的差异估计每日营养摄入量。饮食营养和特定组件已经涉及调制的microrna的表达体外/体内模型,因此,在所有miRNA-mediated分子机制。13在这项研究中,植物油脂的营养与最多的凳子DEmiRNAs有关,与动物脂质(即mir - 425 - 3 - p, mir - 638, mir - 8063和mir - 4277),但后者表现出相反的趋势。这一结果与先前的证据是一致的活性脂质调节microrna的表达在不同的组织,包括肠道,77年脂肪细胞,78年和等离子体。79年
进行功能富集分析来识别候选人下游信号和代谢途径,可能会影响到一个肠道microrna的表达调制,这是反映在粪便样本。这一分析证实了确认凳子DEmiRNAs和营养代谢之间的关系。与脂肪酸代谢相关条款(即Glyoxilate_and_dicarboxylate_metabolism和Phosphatidylglycerol_metabolic_process)和那些与叶酸代谢相关的(如一个碳池叶酸,叶酸代谢和蝶呤和Tetrahydrofolate代谢过程)经常被观察到在凳子的microrna的目标调节VT / VN。特别是基因MTHFD2编码线粒体双官能methylenetetrahydrofolate脱氢酶/ cyclohydrolase被预测为目标的两个凳子microrna调节VT / VN (mir - 425 - 3 - p, mir - 4277) (在线补充表7)。估计膳食摄入的叶酸也与这些microrna的凳子的水平在我们的分析。microrna在调节叶酸代谢的活动之前已经观察到其他人。80年我们可以假定,mir - 425 - 3 - p和mir - 4277可能形成负面反馈循环的养分含量增加VT / VN。有趣的是,mir - 425 - 3 - p是包含在列表microrna受核转录因子的活性红色的两个相关因子2 (Nrf2),81年转录因子参与调节新陈代谢nutrient-sensing通路的下游,其胃肠道活动是关键的开发和维护。82年
microrna是存在于所有真核生物:一个有趣的方面是,他们可能会“穿越”从植物到动物通过食物通过胃肠道和访问宿主细胞的目标,在那里他们可以作为生物活性化合物和影响者physio-pathological条件。然而,这种cross-kingdom互动仍然是一个有争议的话题在科学界由于缺乏可用的数据。83年虽然在目前的研究中,发现了一些xenomiRs低丰度在我们的数据显示这些分子的非功能性的作用。考虑xenomiR序列可能常常是非常类似于人类的microrna并没有证据xenomiRs抵制食品加工的能力,从而阻碍了一个明确的调查。
这项研究是第一个将凳子microrna与肠道微生物群的概要文件和从饮食问卷调查估计每日营养摄入量。尽管在研究人群体重指数的显著差异,这协变量只勉强我们的结果的影响。大部分粪便DEmiRNAs标识,包括mir - 425 - 3 - p, mir - 638, mir - 636, mir - 143 - 3 - p, mir - 181 - c - p和mir - 124 - 5 - 3 - p,仍然对这个变量调整后显著差异表达。同样,尽管个人有不同的饮食习惯在过去的,校正样本集合的分析时间略微影响DEmiRNAs标识的意义。
我们也调查了microrna的血浆样本中配置文件相同的主题。然而,在这个biofluid,没有发现重大DEmiRNAs根据不同的饮食习惯。凳子上可能反映了表观遗传变化可能发生在肠道细胞由于稳定的饮食习惯,而血浆样品可以更好地反映microrna描述瞬态细胞反应与营养相关的刺激,包括循环营养、激素和微生物代谢产物。这是符合以前的观测之间的所有三个饮食组估计摄入特定的营养和一组血浆microrna。14越来越多的可用数据支持粪便miRNA级别的修改变更的代理和响应发生在肠道上皮细胞。84年事实上,粪便microrna的主要来源是由肠道上皮细胞,像刘所描述的那样等。23虽然在目前的研究中,我们没有发现microrna的评估起源的细胞,TissueAtlas和表观基因学数据的分析证实,大部分的凳子DEmiRNAs确定在当前研究中表达和活跃在肠道。有趣的是,相关的分析还显示染色质状态强势在mir - 143编码转录位点前后一致地与先前的观察。41然后,我们不能排除其他蜂窝组件的贡献的肠胃系统,包括基质和免疫隔间。尤其当试图理解host-microbiome相关相声中复杂的肠道微环境。然而,小说共培养系统和在体外模型复制肠道系统可以应用基于microrna的证据和细菌失调观察粪便样品中改善我们的理解的分子特征miRNA-mediated host-microbial交互。85年
总之,我们特此提出第一个大规模的粪便microrna与描述不同的饮食和肠道微生物种群的最先进的高通量技术。我们展示一个渐进调制的人类miRNome由于不同的饮食方案重要修改microrna参与脂质和叶酸代谢。我们的数据也提供了新颖的证据来改善我们的理解的小分子rna的作用在生理和病理条件下host-microbial相声。粪便microrna的综合分析和肠道微生物组签名可能为设计更准确的个性化饮食模式提供见解和建议针对慢性病的预防/治疗。特别是在监测遵守特定的饮食制度,营养素的摄入量应该仔细检查,非侵入性的转化方法粪便microrna测定可以预见。
数据可用性声明
所有数据都包含在相关研究文章或作为补充信息上传。原始数据是可用的要求相应的作者。
伦理语句
病人同意出版
伦理批准
Azienda Ospedaliera”党卫军。亚历山德里亚的安东尼奥·e比亚e c Arrigo”。ID: Colorectal_miRNA CEC2014。
确认
作者非常感谢所有志愿者热情地参与了这项研究。也感谢作者弗拉基米尔•贝奈斯博士(EMBL的Genecore设施、海德堡、德国)埃尔顿先生的盛情协作和建议和贾维斯赫尔曼为他宝贵的修订文本的语言。这项研究已经创建的艺术品BioRender.com。
引用
脚注
圣,广发期货和FDF共同第一作者。
推特@nsegata、@rupensa @BarbaraPardini1
英国石油公司、德和一个同样起到了推波助澜的作用。
贡献者英国石油公司、ST和一个导致的概念和设计;英国石油(BP)的女朋友,以序列,SG, ST, VP和数据的收集和组装;BP, GF,圣,房颤,FC和一个小RNA-Seq数据分析和解释;德、FDF EP和NS宏基因组数据分析和解释;圣,BP、广发、FC、DE FDF和一个手稿写;所有作者最终批准的版本。
资金这项工作是支持的基金会Umberto韦罗内西博士后奖学金2017年和2018年(收件人、圣和英国石油公司),银行的di San Paolo都灵意大利(英国石油(BP)、一个圣),北方联盟党Italiana每拉许多复样我的肿瘤(FC,英国石油公司和一个),基金会CRT(批准号2019 - 0450以序列)欧洲H2020 Oncobiome研究项目(批准号825410),和成本的行动TRANSCOLONCAN (CA17118)。德实验室收到资金从JPI HDHL-INTIMIC——知识平台的食物,饮食、肠道Microbiomics和人类健康(ID 790)格兰特和PRIN2017 (20174 fhbwr_005)授予意大利大学和研究。
相互竞争的利益没有宣布。
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