你在这里

条文本

菜单条
结肠
原始研究
一线治疗下不可切除的转移性结直肠癌循环肿瘤DNA的基因组时间异质性
  1. 风王1，2，
  2. You-Sheng黄1，2，3.，
  3. Hao-Xiang吴1，2，
  4. Zi-Xian王1，2，
  5. 应金1，2，
  6. Yi-Chen么1，2，
  7. Yan-Xing陈1，2，3.，
  8. 齐赵1，2，3.，
  9. 陈师傅4，
  10. 明明他1，2，
  11. Hui-Yan罗1，2，
  12. Miao-Zhen邱1，2，
  13. 王是唯一1，2，
  14. 奉化市王1，2，
  15. 明洋许4，
  16. 虹宇李1，2，
  17. 瑞华徐1，2
  1. 1中山大学肿瘤中心肿瘤内科，华南肿瘤国家重点实验室，肿瘤医学协同创新中心，中山大学，广州，广东，中华人民共和国
  2. 2胃肠癌精准诊疗研究单位“，，中国医学科学院，广州，广东，中华人民共和国
  3. 3.生物信息学平台，中山大学癌症中心，广州，广东，中华人民共和国
  4. 4研究及发展科，HaploX生物技术，深圳，广东，中华人民共和国
  1. 对应到许瑞华教授，中山大学肿瘤中心肿瘤内科，华南肿瘤国家重点实验室，中山大学肿瘤医学协同创新中心，广东广州;xurh在}{sysucc.org.cn；王峰博士，中山大学肿瘤中心肿瘤内科，华南肿瘤学国家重点实验室，中山大学肿瘤医学协同创新中心，广东广州;wangfeng在}{sysucc.org.cn

摘要

客观的循环肿瘤DNA (ctDNA)测序越来越多地应用于结直肠癌患者的临床管理。然而，治疗过程中ctDNA的基因组异质性及其对临床结果的影响在很大程度上仍然未知。

设计我们进行了一项前瞻性队列研究(NCT04228614)的171例不可切除的转移性结直肠癌(mCRC)患者，他们接受了一线治疗，并前瞻性地收集了基线时患者的血液样本，直到疾病进展或最后一次随访。

结果来自63例患者的配对基线组织和血浆样本的RAS/BRAF改变显示出良好的一致性(81.0%，51/63)。经过一段时间的一线治疗(从基线到最后一次液体活检的中位时间为4.67个月)，42.6%(26/61)的RAS突变患者清除了RAS, 50.0%(5/10)的BRAF突变患者清除了BRAF, 3.6%(3/84)和0.7%(1/135)的患者在ctDNA中出现了新的RAS或BRAF突变。血浆RAS/BRAF清除的患者表现出与RAS/BRAF野生型患者相似的无进展生存期(PFS)和总生存期(OS)，而预后远好于RAS/BRAF突变型患者。获得新的RAS/BRAF突变的患者与保持RAS/BRAF突变的患者预后相似，且PFS和OS较保持RAS/BRAF野生型的患者短。

结论这项前瞻性、连续和大规模的ctDNA分析研究揭示了mcrc相关体细胞变异的时间异质性，这在临床实践中应得到特别关注，血浆RAS/BRAF突变状态的改变可以导致生存结局的巨大变化。

  • 结直肠癌
  • 癌症遗传学
  • 结直肠癌基因

数据可用性声明

如有合理要求，可提供资料。

http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/

这是一篇开放获取的文章，根据创作共用署名非商业(CC BY-NC 4.0)许可证发布，该许可证允许其他人以非商业方式分发、混音、改编、在此基础上进行构建，并以不同的条款许可其衍生作品，前提是正确引用原始作品，给予适当的荣誉，任何更改都已注明，并且使用是非商业性的。看到的:http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/．

http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl-2021-324852

数据来自Altmetric.com

    请求的权限

    如果您希望重用本文的任何或全部内容，请使用下面的链接，该链接将带您到版权清除中心的RightsLink服务。您将能够快速获得价格和即时许可，以多种不同的方式重用内容。

    本研究的意义

    关于这个主题我们已经知道了什么?

    • 转移性结直肠癌(mCRC)的治疗策略是随着分子诊断水平的提高而发展的，随着时间的推移，患者体内的分子异质性可能导致首线和后线治疗的失败。

    • mCRC中的血浆RAS突变清除越来越多地被用作选择符合抗egfr再挑战条件的患者的生物标志物。

    • 需要进一步探索循环肿瘤DNA (ctDNA)中mcrc相关体细胞变异的时间异质性。

    新的发现是什么?

    • 一线治疗一段时间后，血浆RAS和BRAF清除率分别为42.6%和50.0%，而ctDNA中的RAS和BRAF获得率分别为3.6%和0.7%。

    • 血浆RAS或BRAF突变状态的改变与生存结果的剧烈变化相关。

    • ERBB2扩增，NTRK融合和其他可用于临床试验的靶点，包括KRASG12C, BRAFnonV600E， PTEN, NF1, MTOR, MET, CDK12, CDKN2A, FGFR1/2/3在大多数患者中保持一致。

    在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?

    • 这项前瞻性、连续和大规模的ctDNA分析研究揭示了mCRC的基因组时间动态和异质性，并为使用ctDNA测序捕获动态体细胞突变谱和预测mCRC患者的预后提供了坚实的证据和见解。

    简介

    结直肠癌(CRC)是全球癌症相关死亡的第二大原因，其发病率在许多国家呈上升趋势。1 2随着药物开发的进展，化疗、靶向药物(如抗表皮生长因子受体(EGFR)和抗血管内皮生长因子(VEGF)治疗)和免疫检查点抑制剂在很大程度上重塑了转移性结直肠癌(mCRC)的治疗，这需要根据患者的分子特征对其进行精确分层。3 - 5

    近年来，新一代测序(NGS)技术的快速发展使其在临床应用上成为可能。通过NGS检测可操作或预后的体细胞变异对指导CRC的治疗决策具有重要意义。6例如，体细胞RAS突变是抗egfr治疗的主要耐药指标，并预测较差的生存结果。7体细胞BRAFV600E突变也是不良预后因素，也是三联疗法(BRAF抑制剂、MEK抑制剂和抗egfr单克隆抗体)的批准适应症。8虽然mCRC的治疗策略随着分子诊断的改进而发展，但随着时间的推移，对第一和后续治疗线的耐药性是由患者体内的分子异质性引起的。9日10

    回答这些问题的主要障碍是重复组织活检的不可行性和肿瘤组织的时空异质性。11日12液体活检允许检查循环肿瘤DNA (ctDNA)，由于肿瘤细胞的分解，它被释放到血液中。13经过大量的研究，液体活检已经可以应用于临床实践。14日15近日，美国食品和药物管理局(fda)批准Guardant360 CDx作为首个用于转移性非小细胞肺癌的NGS液体活检伴发诊断测试。16这标志着一个用液体活检进行突变检测的新时代。

    新兴研究表明，ctDNA分析有潜力应用于CRC患者的全程管理，包括早期诊断、最小残留疾病评估、可行的靶点检测和转移性环境下的治疗反应监测。14日17例如，我们最近报道了ctDNA甲基化谱可用于CRC筛查。18一些研究小组也提供了证据支持ctDNA可以反映术后微小残留疾病的存在。月19 - 21日此外，ctDNA序列检测可能有助于监测治疗效果，ctDNA的早期变化可作为临床反应的标志。22日23日ctDNA可以追踪RAS克隆来监测耐药性或接受抗egfr再挑战的潜力。24然而，关于ctDNA在全身治疗下CRC体细胞突变的演变及其临床意义的研究尚缺乏。

    我们进行了一项前瞻性和观察性研究，招募了系统性therapy-naïve mCRC患者，并采用连续ctDNA检测来监测一线治疗期间体细胞变异的时间异质性，并调查与临床结果的潜在相关性。

    结果

    患者基线特征

    文中给出了研究流程图图1．共有171例不可切除的mCRC患者被纳入研究。患者基线时的临床特征列于在线补充表S1．基线RAS和BRAFV600E分别有74例(43.3%)和11例(6.4%)患者检测到ctDNA突变。一线治疗中，94例(55.0%)患者接受化疗+贝伐单抗，51例(29.8%)患者仅接受化疗，25例(14.6%)患者接受化疗+西妥昔单抗，仅1例(0.6%)患者确认微卫星高度不稳定状态接受免疫治疗。观察到转移部位和ctDNA基线水平之间有很强的相关性(在线补充图S1)．中位最大变异等位基因频率(VAF)(最大体细胞等位基因频率(MSAF))在只有肝脏的患者中显著较高(29.6%;IQR(12.4%-48.1%)或淋巴结(41.6%;IQR, 20.3%-56.1%)，而只有肺部的患者(1.2%;IQR, 0%-4.7%)或非肝肺(1.1%;IQR, 0.7% ~ 2.1%)转移部位。

    Flowchart of study design and patient selection. ctDNA, circulating tumour DNA; mCRC, metastatic colorectal cancer; NED, no evidence of disease; WES, whole-exome sequencing.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    研究设计和患者选择流程图。ctDNA，循环肿瘤DNA;mCRC，转移性结直肠癌;无疾病迹象;WES，全外显子组测序。

    配对基线血浆和组织的突变一致性

    在63例基线血浆和组织样本配对的患者中，我们比较了ctDNA样本(通过NGS检测)和相应组织样本(全外显子组测序，WES)之间体细胞变异(非同义单核苷酸变异(SNVs)和indels)的一致性(图2一个；在线补充表S2)．进一步分析表明，在378个肿瘤相关基因中，SNVs/indels的患病率(在线补充表S3ctDNA NGS组中所包含的)与基线时在肿瘤组织中观察到的正相关(R2= 0.91;p < 0.001;图2 b)．肿瘤组织中RAS突变率为46.0% (n = 29)， ctDNA突变率为47.6% (n = 30)V600E肿瘤组织突变率9.5% (n = 6)， ctDNA突变率7.9% (n = 5)。因此，RAS/BRAF的总体协议V600E血浆与组织的差异为81.0% (51/63)，RAS和BRAF差异为17.5%(11/63)和1.5% (1/63)V600E状态，分别(图2 c)．在仅有肝转移的患者中，RAS符合率为90.0%(18/20)。肝外病变患者RAS符合率为79.1%(34/43)。在线补充图S2)．这些数据显示肿瘤组织样本和ctDNA样本之间具有良好的基因水平一致性，但在RAS和BRAF中存在一些不一致性V600E突变。

    Concordance analysis of baseline mutations in paired plasma and tumour tissue samples among 63 patients. (A) Genomic profiling of some high-frequency mutations between baseline tissue samples and plasma samples (nonsynonymous single-nucleotide variants and indels). The top bar represents the number of mutations a patient carried; the side bar represents the number of patients who carried a certain mutation. (B) Correlation analysis between mutation frequencies of 378 genes from the NGS panel in circulating tumour DNA (ctDNA) samples versus tissue samples (Spearman’s rank correlation). (C) Comparison of RAS and BRAFV600E mutations in tissue samples and plasma samples. MUT, mutant; P, plasma; T, tissue; WT, wild type.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    63例患者配对血浆和肿瘤组织样本基线突变的一致性分析。(A)基线组织样本和血浆样本之间一些高频突变的基因组分析(非同义单核苷酸变异和indels)。顶部的柱状图表示患者携带的突变数量;侧栏表示携带某种突变的患者数量。(B)循环肿瘤DNA (ctDNA)样本中NGS组378个基因突变频率与组织样本的相关性分析(Spearman秩相关)。(C) RAS和BRAF的比较V600E组织样本和血浆样本的突变。傻瓜,突变体;P,等离子体;T,组织;WT，野生型。

    一线治疗下血浆ctDNA的基因组进化

    为了研究一线治疗下的基因组进化，我们收集了一系列血浆样本，并参考了肿瘤知识库(OncoKB)，该知识库提供了癌症改变的循证治疗意义，并生成了CRC中可操作靶点的图片(图3一)．在145例进行性疾病(PD)前连续采集血浆样本的患者队列中，从基线ctDNA收集到PD前最后一次液体活检样本收集的中位时间为4.67个月(范围1.40-14.50个月;图3 b)．

    Genomic temporal heterogeneity in plasma circulating tumour DNA under first-line treatment among 145 patients. (A) Evidence-based actionable targets in colorectal cancer (CRC) referring to the Oncology Knowledge Base database. The outer ring represents the different levels of evidence for the actionable targets, and the inner part represents the different treatments according to the corresponding targets. (B) Time from baseline plasma sample collection to the last liquid biopsy before progressive disease (PD). (C) Genomic profiling of the most commonly mutated genes and actionable targets in CRC between baseline and post-chemotherapy (postCT) plasma samples. The top bar represents the number of mutations a patient carried; the side bar represents the number of patients who carried a certain mutation; and the bottom bar represents patient characteristics, including age, sex, smoking history, tumour location, metastatic site at baseline, best response and first-line chemotherapy regimen. (D) The clearance and acquisition rates of standard-of-care targets and top mutant genes after treatment. (E) The shift of actionable targets for clinical trials after treatment. amp, amplification; BL, baseline; CR, complete response; MSI, microsatellite instability; NE, not evaluable; PR, partial response; SD, stable disease; TMB, tumour mutation burden.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
    图3

    145例一线治疗患者血浆循环肿瘤DNA的基因组时间异质性(A)参考肿瘤学知识库数据库的结直肠癌(CRC)循证可行动靶点。外圈表示可操作目标的不同证据级别，内圈表示根据相应目标的不同处理。(B)从基线血浆样本采集到进展性疾病(PD)前最后一次液体活检的时间。(C)基线和化疗后(后ct)血浆样本之间CRC中最常见突变基因和可操作靶点的基因组分析。顶部的柱状图表示患者携带的突变数量;侧柱表示携带某种突变的患者数量;底部柱状图代表患者特征，包括年龄、性别、吸烟史、肿瘤位置、基线转移部位、最佳反应和一线化疗方案。(D)治疗后标准治疗靶点和顶级突变基因的清除率和获得率。(E)治疗后临床试验可操作目标的转移。 amp, amplification; BL, baseline; CR, complete response; MSI, microsatellite instability; NE, not evaluable; PR, partial response; SD, stable disease; TMB, tumour mutation burden.

    对PD前的基线和最后一次液体活检之间的顶级突变基因和crc相关可操作变异的综合比较显示，在治疗一段时间后，大多数基因的突变频率总体下降(图3 c)．对于标准治疗(SOC)靶点，42.6%(26/61)的RAS突变患者清除了RAS突变，其中5例(5/61,8.2%)的患者清除了可检测到ctDNA的RAS。50.0%(5/10)的BRAF突变患者清除了BRAF突变，3.6%(3/84)和0.7%(1/135)的患者出现了新的RAS或BRAF突变(图3 d)．值得注意的是，在我们的队列中，一线治疗期间RAS状态的改变相当稳定(在线补充图S3)，表明动态遗传变化对个体患者来说是一个稳定的事件。此外，3例患者中有1例在治疗后失去了ERBB2扩增，而所有患者都没有获得新的ERBB2扩增。与SOC靶标不同，临床试验的可操作变体，包括KRASG12C, BRAFnonV600E， PTEN, NF1, MTOR, CDK12, CDKN2A, FGFR1/FGFR2/FGFR3的改变在12.4%(18/145)的患者中发生改变，但在大多数(127/145,87.6%)患者中保持一致(图3 e)．基线或治疗后未检测到NTRK融合。

    根据血浆RAS和BRAF变化的临床结果V600E

    为了进一步评估RAS和BRAF突变在反映预后方面的重要性，我们分析了RAS动态变化和BRAF状态之间的关系图3 d以及临床结果。

    值得注意的是，在我们的队列中，ctDNA水平与一线治疗期间的肿瘤负担呈正相关(在线补充图S4A, B)．145例患者中位ctDNA基线水平为14.0% (IQR, 2.0% ~ 47.4%)，显著高于PD前最后一次活检时的0.5% (IQR, 0% ~ 4.0%) (p<0.001)。在线补充图S4C)，显示治疗一段时间后ctDNA水平显著下降。因此，在进行生存分析时，调整了ctDNA水平的变化。

    RAS或BRAF清除患者的中位无进展生存期(mPFS)分别为12.8个月(95% CI 10.2至未达到(NR))和NR (95% CI 18.9至NR)，这与mPFS 13.2个月(95% CI 10.8至16.4;p=0.980)和11.5个月(95% CI 10.4 ~ 13.3;p=0.196)，但显著优于RAS突变患者的mPFS(7.9个月;95% CI 5.1 ~ 10.9;p=0.002)或BRAF突变体(6.4个月;95% CI 3.2对NR;p = 0.002;图4一，表1)．同样，RAS或BRAF清除患者与RAS野生型患者的中位总生存期(mOS)相似(NR (95% CI 22.7 ~ NR) vs 31.4 (95% CI 26.0 ~ NR);p=0.906)或BRAF野生型(NR (95% CI为20.8 ~ NR) vs 26.7个月(95% CI为22.7 ~ NR);p=0.869)，而维持RAS或BRAF突变的患者的mOS较短，为14.5个月(95% CI 12.7 to NR;p=0.006)和11.4个月(95% CI 5.6;P =0.022)，分别为(图4 b，表1)．

    Kaplan-Meier estimates of progression-free survival (PFS) (A) and overall survival (OS) (B) in patients stratified according to different changes in plasma RAS status under first-line treatment Statistical significance was determined by Wald test of the multivariable Cox models. The change in the circulating tumour DNA (ctDNA) fraction of cfDNA, estimated by maximum somatic allele frequency, was included as a variable. mPFS, median progression-free survival; mOS, median overall survival; MUT, mutant; ref, reference; WT, wild-type.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
    图4

    根据血浆RAS状态的不同变化分层的一线治疗患者的无进展生存期(PFS) (A)和总生存期(OS) (B)的Kaplan-Meier估计，多变量Cox模型的Wald检验具有统计学意义。循环肿瘤DNA (ctDNA) cfDNA部分的变化，由最大体细胞等位基因频率估计，被作为一个变量包括在内。mPFS，中位无进展生存期;mOS，中位总生存率;傻瓜,突变体;参考,参照;WT,野生型。

    查看该表:
    表1

    BRAF不同改变患者的无进展生存期(PFS)和总生存期(OS)的估计V600E一线治疗

    相比之下，新的RAS或BRAF突变患者的mPFS分别为6.1个月(95% CI 2.2至NR)和8.7个月(95% CI NR至NR)，这与保持RAS或BRAF突变患者的mPFS相似(7.9个月，p=0.350;6.4个月，p=0.774)，在数值上短于RAS或BRAF野生型患者的mPFS(13.2个月，p=0.014;11.5个月，p=0.179;图4一，表1)．RAS或BRAF获得患者的mo无差异(15.0个月(95% CI 11.3至NR);NR (95% CI NR to NR))与保留RAS或BRAF突变的患者(14.5个月，p=0.262;11.4个月，p=0.996)。然而，获得RAS突变的患者的mOS比保持RAS野生型的患者短(31.4个月，p=0.003;图4 b)．

    疾病进展后血浆ctDNA的基因组进化

    面对二线临床决策，我们追踪了20例PD后血浆样本的mCRC的临床变异动态(自基线起的中位时间间隔，6.57个月;范围:1.07-12.20个月)一线治疗后(图5一个)．对于SOC靶点，44.4%(4/9)的RAS突变患者出现RAS清除，无一人出现BRAF清除，27.3%(3/11)和5.3%(1/19)的患者出现新的RAS或BRAF突变。所有20例PD患者ERBB2均为野生型(图5 b)．此外，对于临床试验变异，只有1名患者获得了新的NF1突变，而95.0%(19/20)的患者随着时间的推移没有表现出任何变化(图5 c)．

    Genomic temporal heterogeneity under a period of first-line regimen after progressive disease among 20 patients. (A) Genomic profiling of the top mutant genes and actionable targets in colorectal cancer between baseline and progressive disease plasma samples. The top bar represents the number of mutations a patient carried; the side bar represents the number of patients who carried a certain mutation; and the bottom bar represents patient characteristics, including age, sex, smoking history, tumour location, metastatic site at baseline, best response and first-line chemotherapy regimen. (B) The prevalence of clearance and acquisition of standard-of-care targets and the top mutant genes after progression. (C) The shift of actionable targets for clinical trials after progression. CR, complete response; PD, progressive disease; PR, partial response; SD, stable disease.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5
    图5

    20例进展性疾病患者在一线治疗方案下的基因组时间异质性。(A)基线和进展性疾病血浆样本之间的结直肠癌顶级突变基因和可操作靶点的基因组分析。顶部的柱状图表示患者携带的突变数量;侧柱表示携带某种突变的患者数量;底部柱状图代表患者特征，包括年龄、性别、吸烟史、肿瘤位置、基线转移部位、最佳反应和一线化疗方案。(B)进展后标准治疗靶点和顶级突变基因的清除和获得率。(C)进展后临床试验可操作靶点的转移。CR，完全响应;PD，进行性疾病;PR，部分反应; SD, stable disease.

    与此同时，最佳应答的ctDNA水平(中位数MSAF, 0.1%;IQR, 0%-1.0%)显著低于基线时(中位MSAF, 8.5%;差,2.7% - -55.9%;p<0.001)和疾病进展(中位MSAF, 10.4%;差,0.7% - -27.9%;p = 0.002)。ctDNA水平在部分缓解或疾病稳定的患者中下降，而在观察到PD时升高，允许在缓解评估中使用ctDNA检测(在线补充图S5)．

    此外，为了确定EGFR抗体(EGFR- ab)治疗耐药的潜在机制，我们分析了6名接受EGFR- abs作为一线方案的患者的基线和PD血浆样本之间的遗传变化(在线补充图S6)．与基线样本相比，4例PD患者的RTK-RAS通路和PI3K通路相关基因发生了最特殊的基因改变，包括RAS、BRAF、ALK、HGF、NF1和PIK3CG的突变和MET的扩增。正如最近的研究所描述的，我们还检测到几种可能赋予EGFR-Ab抗性的基因改变的获得，25 - 28如ATM突变、SMAD2和CCNE1扩增。GATA2是ras突变非小细胞肺癌细胞的必要转录因子，29在一名PD患者中检测到。在对EGFR-Abs耐药的患者中观察到SYNE1、IKZF1和TERT扩增的新突变。总的来说，这些结果表明抗egfr耐药的机制可能是复杂的，可能不能用单一基因改变的存在来解释。需要更大的患者队列来验证这些潜在的机制。

    讨论

    在目前的研究中，我们观察到肿瘤组织样本和匹配的血浆ctDNA样本检测到的体细胞突变具有良好的一致性，这表明ctDNA在mCRC全身治疗期间检测体细胞变异的可靠性。斯特里克勒等表明CRC的ctDNA分析可用于检测与其他独立队列中肿瘤样本测序所观察到的频率相当的体细胞突变。15在这项研究中，我们提供了更确凿的证据，表明ctDNA分析可以作为组织分析的替代方法，并且可以准确地捕捉原发肿瘤的体细胞突变谱。这些结果表明，对于mCRC患者，ctDNA分析可能是一种可靠的选择，可以深入了解体细胞突变情况，以指导治疗决策。此外，重复组织活检进行基因组分析是不切实际的。因此，后续治疗决策必须依赖档案肿瘤组织，而档案肿瘤组织不能反映原发肿瘤和转移病灶的动态演变。30 -肿瘤组织测序和ctDNA分析的良好一致性也表明后者是可靠的，可用于临床疾病过程中的动态和实时检测，特别是当患者面临治疗失败并需要进一步治疗时。

    基于ctDNA序列分析，我们彻底分析了在一线全身治疗到PD期间crc相关体细胞变异的时间异质性，描绘了体细胞变异转移的景观，以及它们与治疗结果的关系和对临床实践的影响。值得注意的是，在一线治疗期间，观察到CRC中反复突变基因的体细胞突变状态发生了显著变化，这支持了在做出治疗决策时需要动态和实时的ctDNA分析来捕获真实的体细胞突变谱，这将比静态的该谱视图更有利于患者。11日12

    最近，mCRC中血浆RAS突变的清除被用作选择符合抗egfr再挑战条件的患者的生物标志物，这种变化发生在2%至45%的高度可变率范围内。33-37然而，在疾病进展前，RAS在mCRC中的逆转很少被研究。在本研究中，我们密切关注ctDNA在PD前基因突变状态的逆转，我们的数据显示在PD前RAS清除率较高(42.6%，26/61)。值得注意的是，考虑到ctDNA的存在，34.4%的患者ctDNA完全清除，只有8.2%的患者ctDNA可检测到RAS清除。此外，通过一系列ctDNA检测，观察了治疗过程中RAS突变状态转变的稳定性(在线补充图S3）;证据支持存在ras突变无性系的阳性或阴性选择，而不是技术错误。在这方面，需要更多的数据来反映RAS清除以及ctDNA完全清除与否对未来治疗意义的影响，如抗egfr再挑战。

    最有趣和临床相关的发现是，血浆RAS或BRAF基因的体细胞突变状态的改变伴随着临床结果的巨大变化，其表型从RAS/BRAF突变型转变为野生型的患者的疗效和生存率都有所提高。这些观察结果表明，在预后分层和治疗决策中，最初的体细胞突变状态可能并不总是可靠的。相反，后续和实时突变状态可能对治疗疗效和患者生存有更大的影响。然而，当我们研究RAS/BRAF状态变化对预后的影响时，计算MSAF时考虑了游离细胞DNA (cfDNA)中ctDNA分数的变化，这进一步支持了血浆RAS/BRAF动态与临床结果之间的强相关性。

    同样，我们观察到在一线全身治疗失败时，体细胞突变景观发生了显著变化。这可以部分解释治疗失败的原因，并为我们确定后续治疗提供更多的信息。例如，在6名接受抗egfr治疗的患者中，抗egfr治疗失败后出现了新的体细胞改变。这些改变大多涉及RTK-RAS和PI3K通路，这可能是EGFR治疗的潜在耐药机制。然而，对这些改变的更详细的验证有望揭示对EGFR治疗的获得性耐药机制。此外，临床靶点的变化，特别是RAS和BRAF的变化，也会影响后续治疗方案的决策。这些结果强调了使用ctDNA分析动态监测的重要性，特别是在治疗失败时，对于确定最佳治疗方案。

    本研究应承认若干局限性。首先，基线时ctDNA/肿瘤RAS不一致率为17.5%。这种不一致的最合理的原因是，在一小部分患者(16.4%)的基线血浆样本中未检测到体细胞突变，这与先前的研究一致。15 38 39ras -协和亚组的MSAF中位数显著高于ras -不协和亚组(27.3% vs 1.5%)，这在一定程度上支持了这一推测。此外，ctDNA/肿瘤不一致性水平因转移部位而异。40在我们的队列中，只有肝转移的患者的RAS符合率为90.0%，而有肝外病变的患者的RAS符合率降至79.1%。为了提高ctDNA突变检测的敏感性，突变检测技术还需要进一步改进。其次，由于BRAF的体细胞突变率较低，实际出现体细胞突变状态转移的患者数量也不足以进行统计学检验。因此，BRAF体细胞突变状态的改变对预后的影响仍然需要进一步证实，以及它对BRAF抑制剂的预测意义。第三，虽然本研究的PFS数据已经成熟，但还需要进一步的长期随访来证实OS的发现。

    总之，这项前瞻性、观察性和大规模的ctDNA分析研究为使用ctDNA测序捕获mCRCs的动态体细胞突变谱提供了进一步和坚实的证据。更重要的是，我们通过ctDNA序列分析揭示了mcrc相关体细胞变异的时间异质性，这在临床实践中应该得到特别关注，RAS或BRAF基因血浆体细胞突变状态的改变伴随着生存结局的剧烈变化。

    材料与方法

    患者及样本采集

    前瞻性队列研究(ClinicalTrials.gov标识符:NCT04228614)由中山大学癌症中心(中国广州)设计并实施。在2018年4月至2020年1月期间，共有171例无法切除的mCRC患者接受了一线治疗。有或没有原发肿瘤样本的患者血液样本在基线时依次收集，并每6-8周收集一次反应评估，直到PD或最后一次随访。临床反应和肿瘤负荷由研究人员根据实体肿瘤反应评价标准V.1.1进行评估。纳入标准为:(1)经中山大学肿瘤中心合格病理学家组织病理学或细胞学诊断为mCRC的患者;(2)基线样本采集前未接受一线治疗的患者;(3)具有合格的基线和连续血浆样本(至少产生20ng DNA)或仅具有基线血浆样本但配对的合格原发肿瘤组织(至少产生50ng DNA)的患者。在一线治疗中接受转移病灶治愈性切除或消融且无疾病证据的患者排除在最终分析之外。所有患者都同意接受机构审查委员会批准的前瞻性肿瘤基因组分析方案。本研究由中山大学癌症中心机构审查委员会批准，符合机构和/或国家研究委员会的伦理标准以及《赫尔辛基宣言》。

    患者和公众参与

    让患者或公众参与我们研究的设计、实施、报告或传播计划是不合适的，也是不可能的。

    DNA提取、文库构建和靶向测序

    DNA提取、文库构建和靶向测序的细节，包括cfDNA的NGS和组织肿瘤DNA的WES在线补充方法．

    原始数据处理和校准

    原始测序数据采用fastp V.0.18.0进行预处理;预处理包括适配器修剪，去除N碱基达到一定百分比(默认长度为5 bp)的读和含有低质量碱基(默认质量阈值≤20)超过一定比例(默认40%)的读，滑动窗口修剪。41使用默认设置的burros - wheeler Aligner V.0.7.15-r1140将干净的reads对准hg19基因组(GRCh37)。42GenCore V.0.12.0用于删除重复读取。43应用Samtools V.0.1.19对映射质量≥60的正确配对的读生成堆积文件。44

    突变调用、过滤和注释

    去除重复reads后，全血对照样本平均覆盖深度为1000×，肿瘤组织平均覆盖深度为250×， cfDNA样本平均覆盖深度为2000×。对于ctDNA-NGS，用VarScan2 V.2.3.8检测snv和短插入/缺失(indels);最小读取深度为200,VAF阈值设置为0.1%。45在配对的正常样本(外周血淋巴细胞)中，保留至少5个独特reads的体细胞变异(SNVs或indels)，每条链上至少有一个，等位基因突变频率小于0.5%。此外，我们通过使用健康受试者的cfDNA样本进行背景抛光，排除了任何snv (在线补充方法)．采用人工视觉检查步骤，通过GenomeBrowse (http://www.goldenhelix.com)．对于组织WES，三个调用者中至少有两个(VarScan2，45TNscope46和Mutect247)，按3个标准进行筛选:(1)VAF≥8%;(2)测序深度≥8的区域;(3)序列读取支持变体调用≥2。所有snv /indel都使用ANNOVAR (annotation Variation, V.2018-04-16)进行标注。48CNVkit V.0.9.3用于ctDNA拷贝数变异(CNV)检测49；CNV分析采用挖掘机2 V.1.1.2，50采用GeneFuse V.0.6.1进行结构变异检测。51

    基因组改变的选择

    包括体细胞变异(SNVs或indels)，以比较肿瘤组织和血浆ctDNA之间的突变一致性。为了探索CRC治疗下的基因组进化，使用OncoKB对基因改变进行了致癌变异筛选，OncoKB是一个全面的精心策划的数据库，提供了关于患者肿瘤中存在的个体体细胞突变和具有潜在临床应用价值的结构改变的详细的循证信息。52具有一级或二级证据的目标，包括KRAS, NRAS和BRAFV600E突变以及NTRK融合和ERBB2扩增被定义为SOC可操作变异。四级证据的目标，包括KRASG12C, BRAFnonV600E(G464, G469A, G469R, G469V, K601, L597)， PTEN, NF1, MTOR, CDK12, CDKN2A, FGFR1/FGFR2/FGFR3突变以及MET融合，被作为临床试验的变异(图3一)．为了研究EGFR抗体的潜在耐药机制，我们记录了所有新的基因改变。

    统计分析

    每个基因的血浆与原发肿瘤突变状态的一致性分析基于总体一致百分比、敏感性(阳性一致百分比)和特异性(阴性一致百分比)。计算每个病例的MSAF，并用于提供血液中ctDNA分数的估计值。53PFS定义为从入组到疾病进展、死亡或随访结束的时间，以先到者为准。OS时间从诊断为IV期疾病之日起至死亡或最后一次随访之日。对于生存试验，使用Kaplan-Meier方法分析PFS和OS。不同组间PFS或OS比较采用log-rank检验。建立了一个多变量Cox比例风险模型，以调整cfDNA中ctDNA部分变化的影响。变量间的相关性采用斯皮尔曼秩相关系数进行评估。双侧p<0.05被认为有统计学意义。采用R (V.4.0.1)进行统计学分析。

    数据可用性声明

    如有合理要求，可提供资料。

    伦理语句

    患者发表同意书

    致谢

    我们感谢所有患者及其家属参与这项研究。

    参考文献

    1. ↵
      2. 西格尔RL，
      3. 米勒KD，
      4. 神萨奥尔一个，等
      ．结肠直肠癌统计，2020年．CA癌症J临床2020；70：145- - - - - -64．doi: 10.3322 / caac.21601pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/32133645
      OpenUrl CrossRef PubMed
    2. ↵
      2. 西格尔RL，
      3. 米勒KD，
      4. Jemal一个
      ．2020年癌症统计数据．CA癌症J临床2020；70：7- - - - - -30.．doi: 10.3322 / caac.21590pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/31912902
      OpenUrl CrossRef PubMed
    3. ↵
      2. DienstmannR，
      3. Vermeulenl，
      4. GuinneyJ，等
      ．结直肠癌的共识分子亚型及精准医疗的发展．Nat Rev癌症2017；17：79- - - - - -92．doi: 10.1038 / nrc.2016.126pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28050011
      OpenUrl PubMed
    4. ↵
      2. 王F，
      3. 王z x，
      4. 陈G，等
      ．大肠癌免疫治疗专家意见．癌症Commun2020；40：467- - - - - -72．doi: 10.1002 / cac2.12095pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/32945625
      OpenUrl PubMed
    5. ↵
      2. 王z x，
      3. 吴H-X，
      4. 他mm，等
      ．化疗伴或不伴抗egfr药物治疗左侧和右侧转移性结直肠癌:一项最新的荟萃分析．J Natl Compr Canc Netw2019；17：805- - - - - -11．doi: 10.6004 / jnccn.2018.7279pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/31319395
      OpenUrl PubMed
    6. ↵
      2. DienstmannR，
      3. 电影一个，
      4. Hochster海关
      ．下一代测序检测是否应该常规用于转移性结直肠癌?《柳叶刀》杂志2018；19：1434- - - - - -5．doi: 10.1016 / s1470 - 2045 (18) 30776 - 9pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30507475
      OpenUrl PubMed
    7. ↵
      2. InnocentiF，
      3. 欧F-S，
      4. 曲X，等
      ．CALGB/SWOG 80405中结直肠癌患者的突变分析确定了微卫星不稳定性和肿瘤突变负担对患者预后的新作用．J clinin Oncol2019；37：1217- - - - - -27．doi: 10.1200 / JCO.18.01798pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30865548
      OpenUrl PubMed
    8. ↵
      2. Kopetz年代，
      3. Grothey一个，
      4. YaegerR，等
      ．Encorafenib, binimetinib和西妥昔单抗在BRAF v600e突变结直肠癌中的应用．N英语J医学2019；381：1632- - - - - -43．doi: 10.1056 / NEJMoa1908075pmid:31566309
      OpenUrl CrossRef PubMed
    9. ↵
      2. Misale年代，
      3. Di NicolantonioF，
      4. Sartore-Bianchi一个，等
      ．结直肠癌对抗egfr治疗的耐药性:从异质性到趋同进化．癌症越是加大2014；4：1269- - - - - -80．doi: 10.1158 / 2159 - 8290. - cd - 14 - 0462pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25293556
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    10. ↵
      2. 王z x，
      3. 姚Y-C，
      4. 梅Z-J
      ．转移性结直肠癌治疗模式的时间变化及其与患者生存的关系:一项基于智能大数据平台的回顾性队列研究．工程2021．doi: 10.1016 / j.eng.2020.10.017
    11. ↵
      2. Dagogo-Jack我，
      3. 肖在
      ．肿瘤的异质性和对癌症治疗的耐药性．Nat Rev clinin Oncol2018；15：81- - - - - -94．doi: 10.1038 / nrclinonc.2017.166pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29115304
      OpenUrl CrossRef PubMed
    12. ↵
      2. HeitzerE，
      3. Haque是，
      4. 罗伯茨消费电子产品展，等
      ．液体活检在基因组学驱动的肿瘤学中的当前和未来展望．Nat Rev Genet2019；20.：71- - - - - -88．doi: 10.1038 / s41576 - 018 - 0071 - 5pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30410101
      OpenUrl CrossRef PubMed
    13. ↵
      2. 徐rh，
      3. 魏W，
      4. Krawczyk米，等
      ．循环肿瘤DNA甲基化标志物在肝细胞癌诊断和预后中的应用．Nat板牙2017；16：1155- - - - - -61．doi: 10.1038 / nmat4997pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29035356
      OpenUrl CrossRef PubMed
    14. ↵
      2. Dasari一个，
      3. 莫里斯VK，
      4. 爱兰歌娜CJ，等
      ．ctDNA在结直肠癌中的应用和整合:NCI结肠和直肠-肛门工作组白皮书．Nat Rev clinin Oncol2020；17：757- - - - - -70．doi: 10.1038 / s41571 - 020 - 0392 - 0pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/32632268
      OpenUrl CrossRef PubMed
    15. ↵
      2. 斯特里克勒JH，
      3. LoreeJM，
      4. AhronianLG，等
      ．结直肠癌患者游离DNA的基因组图谱．癌症越是加大2018；8：164- - - - - -73．doi: 10.1158 / 2159 - 8290. - cd - 17 - 1009pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29196463
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    16. ↵
      2. Ignatiadis米，
      3. 雪橇吉瓦，
      4. 杰弗里党卫军
      ．液体活检进入临床-实施问题和未来的挑战．Nat Rev clinin Oncol2021；18：297- - - - - -312．doi: 10.1038 / s41571 - 020 - 00457 - xpmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/33473219
      OpenUrl PubMed
    17. ↵
      2. 王Y，
      3. 王米，
      4. 吴H-X，等
      ．向癌症免疫治疗时代迈进．癌症Commun2021．doi:doi: 10.1002 / cac2.12178．[Epub印前:2021年6月24日]。pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/34165252
    18. ↵
      2. 罗H，
      3. 赵问，
      4. 魏W，等
      ．循环肿瘤DNA甲基化谱可用于结直肠癌的早期诊断、预后预测和筛查．科学翻译医学2020；12：eaax7533．doi: 10.1126 / scitranslmed.aax7533
    19. ↵
      2. 看看T，
      3. •亨利电视，
      4. 克里斯坦森E，等
      ．通过超深度测序分析I - III期结直肠癌患者的浆细胞游离DNA．JAMA杂志2019；5：1124．doi: 10.1001 / jamaoncol.2019.0528pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/31070691
      OpenUrl PubMed
    20. ↵
      2. 领带J，
      3. 科恩JD，
      4. 王Y，等
      ．局部晚期直肠癌多模式治疗期间的循环肿瘤DNA序列分析:一项前瞻性生物标志物研究．肠道2019；68：663- - - - - -71．doi: 10.1136 / gutjnl - 2017 - 315852pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29420226
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    21. ↵
      2. 陈G，
      3. 彭J，
      4. 肖问，等
      ．术后循环肿瘤DNA作为II - III期结直肠癌复发风险的标志．J Hematol Oncol2021；14：80．doi: 10.1186 / s13045 - 021 - 01089 - zpmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/34001194
      OpenUrl PubMed
    22. ↵
      2. OsumiH，
      3. ShinozakiE，
      4. 山口那津男K，等
      ．循环肿瘤DNA的早期变化是转移性结直肠癌患者化疗反应的潜在预测因子．Sci代表2019；9：17358．doi: 10.1038 / s41598 - 019 - 53711 - 3pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/31758080
      OpenUrl PubMed
    23. ↵
      2. 领带J，
      3. Kinde我，
      4. 王Y，等
      ．循环肿瘤DNA作为转移性结直肠癌患者治疗反应的早期标志物．安杂志2015；26：1715- - - - - -22．doi: 10.1093 / annonc / mdv177pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25851626
      OpenUrl CrossRef PubMed
    24. ↵
      2. SiravegnaG，
      3. MussolinB，
      4. Buscarino米，等
      ．结直肠癌患者血液中EGFR阻断的克隆进化和耐药性．Nat地中海2015；21：795- - - - - -801．doi: 10.1038 / nm.3870pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26030179
      OpenUrl CrossRef PubMed
    25. ↵
      2. MartinelliE，
      3. CiardielloD，
      4. 马提尼G，等
      ．在转移性结直肠癌中实施抗表皮生长因子受体(EGFR)治疗:挑战和未来展望．安杂志2020；31：30.- - - - - -40．doi: 10.1016 / j.annonc.2019.10.007pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/31912793
      OpenUrl PubMed
    26. ↵
      2. Porru米，
      3. Pompilil，
      4. 卡鲁索C，等
      ．靶向KRAS治疗转移性结直肠癌:当前策略和新兴机会．临床癌症研究进展2018；37：57．doi: 10.1186 / s13046 - 018 - 0719 - 1pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29534749
      OpenUrl PubMed
    27. ↵
      2. 布雷SM，
      3. 李J，
      4. 金圣，等
      ．结直肠癌患者对西妥昔单抗固有和获得性耐药的基因组特征．Sci代表2019；9：15365．doi: 10.1038 / s41598 - 019 - 51981 - 5pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/31653970
      OpenUrl PubMed
    28. ↵
      2. 马伦某人，
      3. 阿尔珀特l，
      4. 夸克哈，等
      ．针对目标人群的靶向治疗:egfr扩增型胃食管腺癌的抗egfr治疗．癌症越是加大2018；8：696- - - - - -713．doi: 10.1158 / 2159 - 8290. - cd - 17 - 1260pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29449271
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    29. ↵
      2. 库马尔女士，
      3. 汉考克直流，
      4. Molina-Arcas米，等
      ．GATA2转录网络是RAS癌基因驱动的非小细胞肺癌所必需的．细胞2012；149：642- - - - - -55．doi: 10.1016 / j.cell.2012.02.059pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22541434
      OpenUrl CrossRef PubMed 科学网
    30. ↵
      2. 王ydF4y2BaJCM，
      3. 宏伟的C，
      4. Garcia-CorbachoJ，等
      ．液体活检成熟:实现循环肿瘤DNA．Nat Rev癌症2017；17：223- - - - - -38．doi: 10.1038 / nrc.2017.7pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28233803
      OpenUrl CrossRef PubMed
    31. ↵
      2. De无论是G，
      3. 拉杰夫克里希南年代，
      4. Bebawy米
      ．液体活检在癌症诊断、监测和预后中的应用．药物科学2019；40：172- - - - - -86．doi: 10.1016 / j.tips.2019.01.006pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30736982
      OpenUrl CrossRef PubMed
    32. ↵
      2. 工头乔丹，
      3. ModakJ，
      4. Kopetz年代，等
      ．在临床试验中使用研究性活组织检查:是否充分讨论了风险和益处?J clinin Oncol2013；31：17- - - - - -22．doi: 10.1200 / JCO.2012.43.1718pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23129736
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    33. ↵
      2. 亨利J，
      3. 威利斯J，
      4. Parseghian厘米，等
      ．NeoRAS: RAS突变向RAS野生型逆转的发生率．临床肿瘤学杂志2020；38：180- - - - - -80．doi: 10.1200 / JCO.2020.38.4_suppl.180
      OpenUrl CrossRef
    34. ↵
      2. GazzanigaP，
      3. RaimondiC，
      4. NicolazzoC，等
      ．ctDNA可能扩大KRAS突变型mCRC二线治疗的治疗选择．肿瘤学年鉴2017；28：v586．doi: 10.1093 / annonc / mdx390.044
      OpenUrl
    35. ↵
      2. MoatiE，
      3. BlonsH，
      4. 故事V，等
      ．在治疗压力下血浆清除RAS突变在转移性结直肠癌中是一个罕见的事件．肿瘤2020；147：1185- - - - - -9．doi: 10.1002 / ijc.32657pmid:31472013
      OpenUrl CrossRef PubMed
    36. ↵
      2. 费尔南德斯蒙特斯一个，
      3. 马丁内斯LagoN，
      4. 德拉Cámara GómezJ，等
      ．Folfiri + panitumumab作为二线治疗突变Ras转移性结直肠癌患者，在接受一线FOLFOX/CAPOX +贝伐珠单抗治疗后转化为野生型Ras: CONVERTIX II期试验．肿瘤学年鉴2019；30.：iv23- - - - - -4．doi: 10.1093 / annonc / mdz155.088
      OpenUrl
    37. ↵
      2. RaimondiC，
      3. NicolazzoC，
      4. BelardinilliF，等
      ．血浆中Ras突变克隆的短暂消失:EGFR抑制剂在Ras突变转移性结直肠癌中的反直觉临床应用．癌症2019；11．doi:doi: 10.3390 / cancers11010042．[Epub印前:04 01 2019]。pmid:30621206
      OpenUrl CrossRef PubMed
    38. ↵
      2. Morelli国会议员，
      3. 工头乔丹，
      4. Dasari一个，等
      ．对抗egfr治疗无效的结直肠癌患者循环肿瘤DNA克隆选择模式的研究．安杂志2015；26：731- - - - - -6．doi: 10.1093 / annonc / mdv005pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25628445
      OpenUrl CrossRef PubMed
    39. ↵
      2. BettegowdaC，
      3. Sausen米，
      4. 猜疑的RJ，等
      ．早期和晚期人类恶性肿瘤循环肿瘤DNA的检测．科学翻译医学2014；6：224年ra24．doi: 10.1126 / scitranslmed.3007094pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24553385
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    40. ↵
      2. KagawaY，
      3. 邵E，
      4. Garcia-FoncillasJ，等
      ．单一转移位点结直肠癌RAS突变的液体和肿瘤组织活检一致性的联合分析:METABEAM研究．临床癌症研究2021；27：2515- - - - - -22．doi: 10.1158 / 1078 - 0432. - ccr - 20 - 3677pmid:33602686
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    41. ↵
      2. 陈年代，
      3. 周Y，
      4. 陈Y，等
      ．fastp:超快一体化FASTQ预处理器．生物信息学2018；34：i884- - - - - -90．doi: 10.1093 /生物信息学/ bty560pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30423086
      OpenUrl CrossRef PubMed
    42. ↵
      2. 李H，
      3. 德宾R
      ．快速和准确的长读对齐与Burrows-Wheeler变换．生物信息学2010；26：589- - - - - -95．doi: 10.1093 /生物信息学/ btp698pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20080505
      OpenUrl CrossRef PubMed 科学网
    43. ↵
      2. 陈年代，
      3. 周Y，
      4. 陈Y，等
      ．Gencore:一种有效的工具，用于生成一致的读取，以抑制错误和删除NGS数据的重复．BMC生物信息学2019；20.：606．doi: 10.1186 / s12859 - 019 - 3280 - 9pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/31881822
      OpenUrl CrossRef PubMed
    44. ↵
      2. 李H，
      3. HandsakerB，
      4. Wysoker一个，等
      ．序列对齐/映射格式和SAMtools．生物信息学2009；25：2078- - - - - -9．doi: 10.1093 /生物信息学/ btp352pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19505943
      OpenUrl CrossRef PubMed 科学网
    45. ↵
      2. Koboldt直流，
      3. 张问，
      4. 拉森德，等
      ．VarScan 2:通过外显子组测序发现癌症中的体细胞突变和拷贝数改变．基因组Res2012；22：568- - - - - -76．doi: 10.1101 / gr.129684.111pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22300766
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    46. ↵
      2. 释放D，
      3. 锅R，
      4. 阿尔达纳R
      ．TNscope:通过基于单倍型的变异候选检测和机器学习过滤，准确检测体细胞突变．bioRxiv2018；250647．
    47. ↵
      2. CibulskisK，
      3. 劳伦斯女士，
      4. 卡特SL，等
      ．不纯和异质癌症样本中体细胞点突变的敏感检测．生物科技Nat》2013；31：213- - - - - -9．doi: 10.1038 / nbt.2514pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23396013
      OpenUrl CrossRef PubMed
    48. ↵
      2. 王K，
      3. 李米，
      4. HakonarsonH
      ．ANNOVAR:高通量测序数据中遗传变异的功能注释．核酸测定2010；38：e164．doi: 10.1093 / nar / gkq603pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20601685
      OpenUrl CrossRef PubMed
    49. ↵
      2. TalevichE，
      3. 沙恩啊，
      4. 波顿T，等
      ．CNVkit:来自靶向DNA测序的全基因组拷贝数检测和可视化．PLoS计算生物学2016；12：e1004873．doi: 10.1371 / journal.pcbi.1004873pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27100738
      OpenUrl CrossRef PubMed
    50. ↵
      2. D 'AurizioR，
      3. PippucciT，
      4. Tattinil，等
      ．利用发掘2增强了全外显子组测序数据的拷贝数变异检测．核酸测定2016；44：e154．doi: 10.1093 / nar / gkw695pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27507884
      OpenUrl CrossRef PubMed
    51. ↵
      2. 陈年代，
      3. 刘米，
      4. 黄T，等
      ．GeneFuse:从DNA测序数据中检测和可视化目标基因融合．国际生物科学2018；14：843- - - - - -8．doi: 10.7150 / ijbs.24626pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29989075
      OpenUrl PubMed
    52. ↵
      2. 的查克推瓦蒂D，
      3. 高J，
      4. 菲利普斯SM
      ．OncoKB:精准肿瘤学知识库．JCO Precis Oncol2017；2017．doi:doi: 10.1200 / PO.17.00011．[Epub印前:16 05 2017]。pmid:28890946
      OpenUrl CrossRef PubMed
    53. ↵
      2. 周C，
      3. 元Z，
      4. 妈W，等
      ．肿瘤基因组谱在高血浆循环肿瘤DNA负担或代谢活性肿瘤患者中的临床应用．J Hematol Oncol2018；11：129．doi: 10.1186 / s13045 - 018 - 0671 - 8pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30400986
      OpenUrl PubMed

    补充材料

    • 补充数据

      此网页文件由BMJ出版集团从作者提供的电子文件制作而成，并没有对内容进行编辑。

    脚注

    • FW、Y-SH、H-XW、Z-XW和YJ为共同第一作者。

    • 贡献者构思与设计:FW, R-HX。方法开发:Y-SH, H-XW, Z-XW, YJ, Y-XC, M-MH, S-fC, M-yX, QZ。数据采集:Y-SH、H-XW、Z-XW、YJ、Y-XC、QZ、M-MH、H-YL、M-ZQ、D-sW、F-HW、Y-HL、FW、R-HX。数据分析与解释:Y-SH, H-XW, Y-XC, S-fC, M-yX, QZ, FW, R-HX。撰写、评审和/或修改稿件:Y-SH, H-XW, Z-XW, FW, R-HX。研究指导:FW, R-HX。

    • 资金国家重点研发计划项目(2018YFC1313300，转R-HX);国家自然科学基金(81930065，转R-HX);国际合作与交流国家自然科学基金(82061160373，转FW);国家自然科学基金(一般项目，81872011，授予FW);广东省科技计划项目(2019B020227002，转R-HX);广州市科技计划项目(201904020046,201803040019,201704020228，转R-HX);中山大学临床研究5010项目(2018014，转FW);中山大学肿瘤中心青年医师科学家计划项目(16zxqk03, to FW);中山大学肿瘤中心基本科研业务费(20ykzd166，至YJ);广东省精准肿瘤研究计划项目(至YJ)。

    • 相互竞争的利益没有宣布。

    • 出处和同行评审不是委托;外部同行评审。

    • 补充材料此内容由作者提供。它没有经过BMJ出版集团有限公司(BMJ)的审查，也可能没有经过同行评审。讨论的任何意见或建议仅是作者的意见或建议，不被BMJ认可。BMJ不承担因对内容的任何依赖而产生的所有责任和责任。如果内容包括任何翻译材料，BMJ不保证翻译的准确性和可靠性(包括但不限于当地法规、临床指南、术语、药品名称和药物剂量)，并且对因翻译和改编或其他原因引起的任何错误和/或遗漏不负责。