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客观的钠+/牛磺胆酸盐协同转运多肽(NTCP)是一个膜转运体影响胆汁酸肝肠循环的(BAs)。我们旨在评估NTCP的角色在人类和动物模型的肝纤维化(低频)。
设计主肝星状细胞(pHSCs)隔绝肝脏活检的患者如果不同纤维化分级是NTCP染色。NTCP基因沉默,牛磺胆酸(柠檬酸),obeticholic酸(亚奥理事会),儿茶素(EGCG)和ha - 100盐酸盐(ha - 100)被用作工具来调节NTCP表达人类HSC线(LX2)。英航贩卖/吸收评估细胞外地(LX2培养基)和细胞治疗后/没有NTCP中和抗体。低频模型C57 / CCl BL6小鼠四氯化碳(4)和leptin-deficient (Ob / Ob)喂高脂肪饮食(Ob / ObHFD)评估pHSCs-NTCP表情,代谢和低频配置文件后腹腔内注射NTCP中和抗体。
结果pHSCs F3 / F4-scored患者的低频表现出三倍增加NTCP表达式与F0-scored患者相比(p < 0.0001)。Sorted-activated肝星状细胞(LX2αSMA +)显示高NTCP表达式和柠檬酸吸收体外激活并引发了进一步增加。这一现象被抑制NTCP小干扰RNA和NTCP中和抗体。排序LX2NTCP +(高α平滑肌肌动蛋白(αSMA) /高NTCP)细胞表现出较高的一种蛋白激酶磷酸化途径/ mTOR和蛋白激酶C (PKC)伴随着farnesoid减少X受体表达。此外,LX2NTCP +细胞治疗EGCG、亚奥理事会和PKC抑制剂显著降低NTCP和αSMA ha - 100。NTCP中和抗体抑制NTCP(柠檬酸吸收少);它在CCl两种衰减低频4和Ob / ObHFD动物模型与改善代谢轮廓。
结论NTCP表达式与纤维化严重程度是线性相关。调制英航贩卖低频发病机制的重要一步。与英航吸收可能会建议对预防疾病进展治疗策略。
- 胆汁酸
- 淤胆型肝炎
- 脂肪肝
- 分子机制
- 纤维化
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本研究的意义
已知在这个问题上是什么?
肝纤维化(低频)是慢性肝脏疾病的长期结果的主要因素。
血浆的增加和肝脏胆汁酸浓度(BAs)如果患者与疾病进展和低频相关建议。
有什么新发现吗?
第一次,牛磺胆酸盐钠协同转运多肽(NTCP),英航运输机被发现在肝星状细胞(hsc)。
我们的数据表明,HSC激活可能通过NTCP英航吸收产生的第二个步骤。
NTCP阻塞阻止低频的发展,为其提供进一步的证据在低频的治疗使用。
它会如何影响临床实践在可预见的未来吗?
与英航吸收可能会建议治疗策略防止低频进展。
介绍
钠+/牛磺胆酸盐协同转运多肽(NTCP)是一个多通道的跨膜蛋白表达几乎完全集中在肝细胞的正弦膜。1NTCP占大约90%胆汁酸(BA)和吸收是第一个克隆英航运输车。2NTCP也是一个关键受体病毒性乙型肝炎病毒和它的卫星病毒D型肝炎病毒。3NTCP表达式由BAs控制,雌激素和泌乳素等激素药物、毒素和促炎细胞因子。4此外,NTCP经过翻译后调控包括磷酸化和去磷酸化,从而调节其本地化。5信号通路参与环腺苷酸、钙、一氧化氮,磷酸肌醇3-kinase,蛋白激酶C (PKC)和蛋白质磷酸酶调解这个翻译后的监管。6NTCP表达减少胆汁淤积的人们和动物模型胆汁淤积引起的胆道梗阻,雌激素或内毒素。7
关键NTCP压抑机制涉及到的激活farnesoid X受体(FXR)通过BAs的积累,从而诱导小异质二聚体合作伙伴(SHP),肝核转录因子的抑制因子1 (HNF 1)和HNF4α,也干扰类维生素A X receptor-retinoic酸受体在大鼠形成或糖皮质激素受体在人类中,所有这些都需要正常NTCP表达式。8
NTCP监管在生理和病理条件下在肝纤维化(低频)在文献中尚未解决。没有研究调查BAs吸收和转运蛋白在肝星状细胞(hsc)。肝星状细胞是常驻居民成纤维细胞的间充质细胞保留特征(嵌入正常基质矩阵)和(附加到毛细血管的内皮细胞)和周围的周组成大约三分之一的non-parenchymal细胞和细胞总数的15%居民正常的人类肝脏。9纤维化肝脏,在静止的肝星状细胞transdifferentiate增殖、迁移和收缩myofibroblasts,从而展现pro-fibrogenic转录和分泌特性(所谓的“细胞激活”),他们分泌细胞外基质分子积累并形成疤痕组织Disse的空间,从而导致正弦capillarisation特点是内皮开窗术的丧失。10鉴于患者非酒精性脂肪肝(NASH)的水平会升高BAs在肝组织和血浆,11我们建议病理水平的BAs和之间的关系通过低频由NTCP纳什的发展。
材料和方法
病人
七十四例与低频纳什病因学根据肝活检获得2019 - 2021年在肝脏,沙龙医疗中心,以色列。所有患者在18岁男性。如果是如下:0:没有;1:perisinusoidal或门静脉周的;2:perisinus和门静脉周的;3:桥接纤维化和4:肝硬化。患者被排除在外,如果他们收到了类固醇管理;最近使用华法林,二甲双胍,thiaglitazones或胰岛素超过1个月或历史的任何使用前2个月,每天饮酒> 10 g /天。我们也排除病例的病因学其他肝脏疾病包括病毒性肝炎,自身免疫性疾病,haemochromatosis,威尔逊氏病,alpha -抗胰蛋白酶疾病、酒精或任何毒性。提供伦理委员会批准,并从参与者得到书面知情同意。
病人和公众参与
患者或公众没有参与设计,或行为,或报告,或传播我们的研究计划。
原发性肝星状细胞隔离从人类肝脏活检
肝活检是超声指导下使用一个可支配Tru-Cut 18 G针(15毫米)如果患者不同纤维化评分(n = 30)。标本固定在4%福尔马林和permeablised triton X10(0.01%)组织学染色或用于隔离主要肝星状细胞(pHSCs)通过消化40分钟的肝脏在37°C 20毫升相当的平衡盐溶液的解决方案包含0.1% (wt /卷)链霉蛋白酶,0.1%胶原酶(wt /卷)和0.01% (wt /卷)脱氧核糖核酸酶(DNase I)(所有酶都从罗氏诊断GmbH是一家购买,曼海姆,德国)。由此产生的悬浮是150毫米钢丝网和离心机过滤17.5% Nycodenz缓冲(美国圣路易斯σ)1400克为20分钟25°C,这产生一个HSC-enriched分数上白色层。细胞被离心洗(400 g, 25°C, 10分钟),在杜尔贝科的修改鹰培养基培养(DMEM)补充(卷/卷)为10%胎牛血清(FCS), 100µg /毫升青霉素和链霉素100µg /毫升、融合。纯化pHSCs进行通过α-平滑肌肌动蛋白(αSMA)染色流式细胞术一起用台盼蓝的可行性评估。的意思是可行性pHSCs以碘化propidium排除92.7%±2.1%,意味着pHSCs孤立的数量从1毫克的肝组织范围之间的3000和500细胞/毫克。pHSCs然后培养48小时,直到达到融合。
细胞培养
LX2 (105细胞),人类HSC线,在DMEM培养补充1%(天真状态)或10%(激活状态)FCS, 100单位/毫升青霉素和链霉素100毫克/毫升。细胞增长低于5%股份有限公司2在37°C和确认为支原体污染负EZ-PCR支原体检测组件(生物产业,20-700-20)。的操作实验,LX2细胞治疗:牛磺胆酸(柠檬酸;σ,86 339 - 5 - 100µM g)的浓度;obeticholic酸(亚奥理事会;拦截)的浓度0、0.05和1µM;ha - 100盐酸盐(ha - 100;Abcam ab145567) 7µM的浓度;二甲亚砜(DMSO)的浓度1%,儿茶素(EGCG;σ,猫# 50 299 - 1 MG-F)浓度(0,1,50µM。所有治疗都与细胞48小时孵化。
Fluorescence-activated细胞分类
LX2 (106细胞/毫升)沾有以下主要抗体:鼠标反αSMA(研发;IC1420P)和兔反SLC10A1(罗福斯;nbp1 - 60109)。细胞被沾染了以下二次抗体:山羊anti-rabbit-AF647 (Abcam;ab150079)和兔anti-mouse-FITC (Abcam;ab6724)。Fluorescence-activated细胞排序(流式细胞仪)是用来排序根据αSMA表达式(LX2 LX2细胞αSMA−vs LX2αSMA +)和(LX2 NTCP表达式NTCP−vs LX2NTCP +)与一个咏叹调三世分选机(BD FACSAria)。
NTCP基因沉默(siRNA)
积极的NTCP人口(LX2排序NTCP +)是沉默NTCP小核RNA)工具包(圣克鲁斯,sc - 92260)根据制造商的指示。
柠檬酸吸收试验
LX2NTCP +亚种群被播种到24-well盘子和培养在标准条件下,直到他们达到80%融合。这些细胞被孵化在37°C与吸收缓冲区包含100µM柠檬酸补充与放射性标记的0.25μC [3 h]柠檬酸45分钟。随后,这些细胞被洗4×冰冷的磷酸缓冲盐(PBS)和细胞溶解在0.05% SDS。积累放射性标记的基质是由闪烁计数。NTCP中和抗体(10µM;罗福斯;nbp1 - 60109)与LX2孵化NTCP +细胞柠檬酸侮辱前2小时。
免疫印迹分析
收获LX2蛋白质提取准备在均化缓冲(50更易与L Tris-HCl, pH值7.6,0.25% Triton-X 100 0.15 M氯化钠,CaCl 10毫米2并完成迷你EDTA-free蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏诊断))。接下来,蛋白质(30µg / lane)解决10% (w / v) SDS-polyacrylamide凝胶(Novex、荷兰)。蛋白质免疫印迹,被转移到一个聚乙二烯二氟化物膜。印迹孵化了1小时在室温下在阻断缓冲区包含5%脱脂牛奶;孵化一夜之间在4°C鼠标反αSMA,兔子反NTCP,兔子反MMP-9,鼠标反FXR,鼠标反p-AKT,鼠标反AKT,老鼠反pmTOR,山羊反mTOR,鼠标反坳我,兔子反坳三世,兔子反PKC和鼠标反pPKC(研发系统、稀释1:1000);随后与peroxidase-conjugated山羊anti-mouse孵化,山羊anti-rabbit,山羊anti-rat或rat-anti-goat免疫球蛋白(法国贡比涅,稀释1:5000)在室温为1.5小时。免疫反应性检测与ECL工具包(Amersham法玛西亚生物技术,莱斯乌里,法国)。
动物模型
雄性C57BL / 6 j小鼠模型的低频和leptin-deficient老鼠(Ob / Ob在第12周的时候收到根据希伯来大学护理伦理法规和国家卫生研究院的指导方针。动物保健机构伦理委员会批准了所有动物协议。老鼠被安置在一个屏障设施。四氯化碳(三地4;σ,c - 5331)纤维化模型被腹腔注射0.5 CClµL纯4体重/ g(1到9稀释矿物油)每两周,8周作为一个先进的慢性肝病。12日13Ob / Ob4周的高脂肪饮食的老鼠(HFD) (Ob / ObHFD)(猫# TD.06414(60%的脂肪);(18.3%千卡蛋白质,21.4%千卡千卡脂肪碳水化合物和60.3%)。CCl的6周4小鼠模型和HFD 2周,小鼠腹腔内处理多克隆anti-mouse NTCP中和抗体(猫# 350832;我们生物,美国)的浓度20µg /老鼠每周两次的额外的2周。所有的实验都是在白天进行。在每个动物组,n = 10。CCl最后牺牲了2天后4注射;小鼠体重和犀牛肌内0.1毫升的氯胺酮:甲苯噻嗪:乙酰丙嗪(4:1:1)每30 g颈椎脱位前体重。
血清生化
全血样品收集的老鼠在牺牲一天,离心机在3500 rpm 10分钟4°C。血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)和BAs浓度测定。空腹血糖、胆固醇、甘油三酯和葡萄糖耐量试验评估后小鼠禁食16小时。所有测试中心实验室进行,沙龙医疗中心耶路撒冷。
RNA分离、cDNA准备和实时PCR
从肝组织细胞总RNA分离2毫升三试剂(生物实验室;猫每厘米# 90102331)3的组织。样品在室温下看了5分钟。氯仿的体积0.2毫升(生物实验室;猫# 03080521)被添加到每个样本,孵化15分钟在室温和离心机(1400 rpm) 15分钟在4°C。RNA沉淀,上清液在每个样本被转移到一个新的微型离心机管,0.5毫升的异丙醇(生物实验室;猫# 16260521)添加和孵化10分钟25°C,和管离心机(12 000 rpm) 10分钟在4°C。上层清液被移除,1毫升的75%乙醇添加到颗粒和离心机(7500 rpm) 5分钟。颗粒被风干在室温下15分钟,50µL diethylpyrocarbonate补充道,样本加热10分钟55°C。制备c-DNA进行高容量cDNA隔离设备(研发;猫# 1406197)。 Real-time PCR was performed with TaqMan Fast Advanced Master Mix (Applied Biosystems; Cat# 4371130) for quantification of αSMA and SLC10A1 gene expression, which was normalised to the expression of the housekeeping gene GAPDH.
小鼠肝脏的组织学评估
后1/3的肝脏在4%福尔马林固定石蜡包埋在24小时自动组织处理器。部分(7毫米)染色)评估脂肪变性,necroinflammatory地区和凋亡的身体,饱和苦味酸天狼星红F3B 0.1% (Abcam ab150681)以及马森三色的染色的结缔组织(Abcam ab150686)。
免疫荧光染色
deparaffinisation,石蜡包埋部分被放置15分钟60°C,孵化的二甲苯在室温下15分钟,然后顺序转移到100% EtOH EtOH EtOH 95%, 70%和50% EtOH 4分钟每个在室温下。部分是在去离子水冲洗并存储在PBS。对于抗原检索,我们使用一个缓冲(10毫米柠檬酸,pH值6.2,2毫米EDTA和0.05%渐变20)anti-NTCP受体和anti-αSMA检测。肝星状细胞(LX2和pHSCs)以及动物肝脏组织样本中100µL KASBLOCK液体阻滞剂减少染色所需的抗体溶液的体积。样本孵化一夜之间在4°C兔子反NTCP,兔子anti-mouse NTCP(稀释1:30)和鼠标反/鼠标/ ratαSMA(稀释1:170)(智力产品,格罗宁根,荷兰)。样本用PBS、二次抗体共轭Cy-3或Cy-2申请1小时在室温下,和图像捕获。样品被认为和成像蔡司LSM 710共焦激光扫描系统(德国蔡司)附加到蔡司Axiovert 135显微镜,配有Plan-Apochromat蔡司63 x镜头。一个氩激光(488 nm励磁)是用于检测绿色荧光,和一个Alexa萤石激光(552海里)是用于检测红色荧光。
统计分析
统计差异分析和双尾未配对的学生的学习任务(用于比较两组)或单向方差分析(Newman-Keuls测试后在多个组)在GraphPad棱镜V.5.0(美国加州La Jolla GraphPad软件)。在体外研究中,每一个实验重复三次每四个复制。
结果
NTCP表情肝星状细胞与肝纤维化进展是线性相关患者的低频
人类肝细胞已被证明表达NTCP的表达式是胆汁淤积患者中表达下调。14NTCP介导肝和肠英航吸收。15我们确认(数据未显示)的存在NTCP肝细胞肝活检的患者获得低频;但是,没有以前的数据可用NTCP表达在这些患者肝星状细胞。纤维化肝脏,在静止的肝星状细胞transdifferentiate增殖、迁移和收缩myofibroblasts,从而展现pro-fibrogenic属性,比如αSMA积累。10图1 a - c显示NTCP表情孤立pHSCs从低频活检的患者获得F0、F1、F2、F3、F4的分数。这些pHSCs培养和评估NTCP表达式后48小时(细胞融合)。共焦显微镜显示代表图像的pHSCs沾NTCP F1的高强度/表情/ F2-scored (图1 b)和F3 / F4-scored (图1 c)患者与F0-scored患者相比(图1一个)支持F3 / F4-scored病人。我们量化NTCP pHSCs通过枚举每个字段表示为pHSCs pHSCs表达NTCPNTCP +/字段。图1 d显示数量的增加与NTCP pHSCs染色从F3 / F4-scored病人符合NTCP强度在增加图1 c(p < 0.0001)。免疫印迹分析量化NTCP pHSCs也证实了高表达在F3 / F4-scored患者相比F0和F1、F2 (图1 e)。排除媒介环境的影响和细胞融合NTCP调制表达式,孤立pHSCs染色在同一天培养前(时间0)。数据显示表达式的NTCP共焦显微镜(在线补充图1(24小时),线性相关在线补充图1 b)和48小时(在线补充图1 c孵化项目)的文化。结果被量化在线补充图1 d(pHSCs数量NTCP +/字段)和在线补充图1 h(pHSCsNTCP +强度)。NTCP表达式也表现直接通过染色肝活检肝星状细胞的部分。在线补充图1 f-h显示代表肝脏活组织检查(F) F0, (G) F1、F2和(H) F4分数显示合并染色NTCP(绿色)和αSMA(红色)反映了黄颜色表示线性色彩强度与纤维化严重程度评分。更好地确认上述现象,我们使用了一个人类HSC细胞系(LX2)作为评价的体外模型NTCP表达式的天真(培养1% FCS)和激活(培养10% FCS)状态。图1 f, G共焦显微镜显示LX2沾绿色(αSMA)和红色(NTCP)。图1 g表明高αSMA染色强度与高强度相关的激活LX2 NTCP染色比较天真的同行有低NTCP表达式(图1 f)。定量彩色NTCP荧光强度并显示执行双重的增加激活LX2而天真的(p < 0.001,图1 h)。此外,流式细胞仪是用来评估NTCP表情LX2材料和方法部分中描述。图1我流式细胞仪分析显示高表达NTCP(375±16平均荧光强度(MFI))在激活LX2相比与幼稚细胞(268.5±15 MFI)。进一步相关NTCP LX2激活,我们分类积极LX2细胞(αSMA阳性细胞),试图量化NTCP表情和与消极的排序细胞进行比较。这是通过一个门(G1: LX2αSMA +;αSMA 58%)包括排序从高αSMA LX2人口和门(G2: LX2αSMA−;αSMA 42%)包括低αSMA人口,如图所示图1 j。这两个种群评估αSMA强度LX2确认激活状态。图1 k直方图显示代表αSMA MFI从封闭的G1 (MFI = 429.1)和G2 (MFI = 21.7)的人口。排序G1人口(高αSMA)表现出增加NTCP和减少MMP-9比G2人口(低αSMA)代表表明免疫印迹分析(图1 l)和蛋白质的平均量化分析(图1米)。我们的研究结果首次揭示NTCP表达之间的相关性和HSC激活,从而表明NTCP在纤维发生的潜在作用。
主要激活肝星状细胞(pHSCs)和LX2展览NTCP的高表达。共焦显微镜NTCP表达式pHSCs从肝活检获得的肝纤维化患者(A) F0得分,得分(B) F1、F2和F3 (C) / F4得分。pHSCs如下所示:DAPI细胞核染色(蓝色),Cy-3共轭NTCP(红色)。(D) pHSCs表达NTCP枚举和pHSCsNTCP +/字段。(E)量化免疫印迹分析NTCP pHSCs从F0、F1、F2、F3、F4肝纤维化患者。(F)共焦显微镜NTCP表达式与1% FCS LX2细胞孵化;天真的状态和FCS (G) 10%;激活状态。LX2细胞显示如下:DAPI细胞核染色(蓝色),Cy-2共轭αSMA(绿色),Cy-3共轭NTCP(红色)。(H)共焦显微镜定量NTCP表示为颜色强度的1%和10% FCS的治疗方法。流式细胞术分析(I)平均NTCP和αSMA平均荧光强度(MFI)与1%或10% FCS LX2细胞孵化。流式细胞术(J)代表图显示排序根据αSMA表达式(LX2 LX2族群αSMA−:1 (G1)和LX2门αSMA +:门2 (G2))。上小图代表LX2细胞可以按大小分类(forward-scattered;FSC)和粒度(侧面散射;SSC)。流式细胞术直方图(K)代表αSMA-MFI LX2后分组人口由αSMA表达式(LX2排序显示αSMA−:1 (G1)和LX2门αSMA +:门2 (G2))。(左)乐队的西方滴NTCP和纤维化标志物在排序LX2 (MMP-9和αSMA)αSMA程序。(M)的蛋白质平均量化NTCP和纤维化标志物在排序LX2 (MMP-9和αSMA)αSMA程序。αSMAα平滑肌肌动蛋白;FCS,胎牛血清;NTCP,牛磺胆酸盐钠协同转运多肽。
NTCP BAs贩卖LX2提供中介
评估是否NTCP肝星状细胞在肝细胞可能具有相同的作用在调停BAs吸收,我们LX2治疗NTCP +与放射性标记的细胞与缓冲区包含100µM柠檬酸补充0.25μC [3 h]柠檬酸(NTCP生理基质;受体激动剂)45分钟。调节柠檬酸吸收,我们使用NTCP中和抗体,试图阻止NTCP之前柠檬酸侮辱。柠檬酸含量后来在媒介和LX2决定NTCP +每隔45分钟溶解产物。图2一个表明,柠檬酸浓度在中被减少到100µM 43±1.2, 11.3±0.1, 2.4±0.2µM 15岁,30 - 45分钟,分别与LX2孵化NTCP +(p值< 0.01)。同时,柠檬酸细胞内浓度在细胞溶解产物表现出显著的研究生海拔103±1.3µM 205±1.3µM柠檬酸45分钟后孵化项目(p值< 0.03;图2 b)。LX2NTCP +使用NTCP中和抗体保持柠檬酸浓度介质以及细胞无显著变化观察表明抑制柠檬酸吸收。人类原发性肝细胞(THLE-2细胞株)表达NTCP16作为一个积极的控制和NTCP Hep3B细胞不表达17被用作一个消极的控制。没有改变的柠檬酸浓度在中或在Hep3B细胞观察后45分钟(数据未显示),因此建议NTCP柠檬酸消费/吸收的重要性。进一步的关联影响LX2 BAs吸收NTCP +激活状态,αSMA强度随访期间动力学45分钟。图2 c显示了一个毕业于LX2高程NTCP +激活αSMA反映在增加(p < 0.05)以及柠檬酸吸收里面的细胞,而阻塞NTCP保持相同αSMA强度类似柠檬酸未经处理的细胞。上述设置实验是重复的和额外的纤维化标志物坳我坳三世使用免疫印迹(胶原蛋白)。图2 d显示西方滴坳带表情的提升我和坳三世后30 - 45分钟的柠檬酸(100µM)侮辱。生成的乐队是估计的数量显示在图2 e。通过柠檬酸侮辱BAs激活肝星状细胞,然而,鹅去氧胆酸(CDCA)和tauroursodeoxycholic酸(TUDCA)也显示导致肝星状细胞激活虽然一定程度上与柠檬酸(在线补充图2 a, B)。CDCA和TUDCA没有调节NTCP表达式(数据没有显示)和一些其他机制可能干扰对HSC活化的影响在不同的实验设计可以解决的。我们的数据表明,HSC激活可能通过NTCP BAs吸收产生的第二个步骤。
柠檬酸在肝星状细胞贩运。排序LX2NTCP +细胞孵化缓冲区包含100µM柠檬酸补充与放射性标记的0.25μC [3 h]柠檬酸有或没有NTCP拦截器(中和抗体)15、30、45分钟。柠檬酸浓度动力学(A)和(B)细胞溶解产物媒介由闪烁计数。动力学LX2的小额信贷机构NTCP +αSMA柠檬酸侮辱后的15分钟的时间间隔有或没有NTCP中和抗体由(C)流式细胞术,(D)西方滴纤维化标志物(αSMA,坳坳III(30到45分钟后))和(E)量化通过蛋白质:β-actin比率。组间结果具有统计学意义(p < 0.05)。αSMAα平滑肌肌动蛋白;小额信贷机构,平均荧光强度;NTCP、钠+/牛磺胆酸盐协同转运多肽;柠檬酸,牛磺胆酸。
阻塞LX2 NTCP表达式NTCP +抑制其活化后柠檬酸侮辱
功能性质的NTCP诱导LX2激活研究通过使用选择siRNAs-NTCP击倒后侮辱与柠檬酸和DMSO (NTCP non-physiological受体激动剂)。排序LX2NTCP +在1% FCS表达低NTCP孵化与上述受体激动剂在材料和方法部分。图3一显示了高架NTCP与受体激动剂治疗后观察,因此引发了HSC激活(αSMA MFI从未经处理的细胞中313±25增加到700±81年和900年52±侮辱与柠檬酸和DMSO溶液后,分别;p < 0.05)。siRNA-transfected LX2NTCP +阻止受体激动剂诱导的侮辱海拔αSMA和强调NTCP调节的作用在调节HSC激活潜在影响离体培养试验。不同的实验进行了澄清NTCP表达式在HSC激活;排序LX2NTCP +第一次激活通过培养有10% FCS(进一步刺激NTCP表达式),然后被处理EGCG试图诱导NTCP内吞作用。18在线补充图3显示了一个减少NTCP跨膜表情和与儿茶素浓度升高有关(1µM和50µM)流式细胞术分析。确认调节作用EGCG在LX2 NTCP表达式NTCP +也评估免疫印迹分析(图3 b与纤维化标志物的变化)和相关的总结图3罪犯。图3 b显示代表乐队LX2免疫印迹NTCP +与浓度的EGCG治疗后1µM 50µM。减少NTCP表达式与高EGCG含量呈负相关。此外,pro-fibrogenicαSMA和MMP-9的标志19改善(αSMA降低,增加MMP-9)剂量依赖性的方式EGCG治疗后的验证吗图3 c免疫印迹定量。进一步验证LX2 EGCG的影响上NTCP +αSMA强度也执行。图3 d显示直方图的LX2NTCP +人口未经处理或处理EGCG。数据表明,EGCG含量1µM 50µM LX2减少NTCP +分别激活4.5倍、20倍比未经处理的细胞(p < 0.02)。此外,我们相关的影响EGCG信号通路的一种蛋白激酶和mTOR肝星状细胞激活的索引。20.通过免疫印迹分析评估这些途径进行选择ECGC 50µM的浓度。在线补充图3 b, C显示更少的磷酸化AKT和mTOR LX2NTCP +细胞后与EGCG孵化项目。我们的总体结果强调LX2失活与减少NTCP表达式。
体外抑制NTCP LX2αSMA的降低NTCP +。(A)抑制NTCP表情LX2是由小干扰RNA (siRNA)。柠檬酸和DMSO作为NTCP与炒和特定的核受体激动剂治疗。EGCG的浓度0,1和50µM与排序LX2孵化NTCP +。乐队的代表西方滴NTCP,αSMA MMP-9介绍(B)和(C)的量化和(D)代表的流式细胞术分析αSMA强度进行分析。统计上的显著差异,配对和未配对学生的t检验和方差分析。αSMAα平滑肌肌动蛋白;DMSO(二甲亚砜;EGCG,儿茶素;小额信贷机构,平均荧光强度;MMP-9;矩阵metallopeptidase 9;NTCP、钠+/牛磺胆酸盐协同转运多肽;柠檬酸,牛磺胆酸。
PKC激活肝星状细胞磷酸化和调节NTCP FXR表达
根据上述结果,并探讨是否NTCP超表达可能与细胞内信号通路改变有关,我们评估FXR (NTCP表达式)的监管机构和PKC (NTCP本地化调节器)LX2排序亚种群有或没有NTCP表达式。一些配体依赖性转录因子核受体超家族的成员,包括FXR (NR1H4),调节NTCP表达式。通过诱导轴马力FXR抑制NTCP表达式。21日22排序LX2NTCP +显示FXR的基因数与NTCP -细胞(LX2相比NTCP−;图4一)。此外,这些排序的亚种群显示显著增加磷酸化AKT(参与细胞生存和新陈代谢)、mTOR(参与胰岛素代谢和生理)和PKC(参与易位NTCP膜)。免疫印迹分析细胞信号通路被量化,提出了图4 b。在协议与肝细胞生成的数据,我们显示FXR和NTCP负相关。此外,PKC LX2磷酸化NTCP +人口与放大AKT-mTOR信号以及αSMA,这或许可以解释部分肝星状细胞的跨膜NTCP表达升高。我们通过获得LX2进一步支持我们的数据NTCP +细胞抑制FXR表达和对待他们与亚奥理事会,一个FXR受体激动剂,在浓度为0.05和1µM,在材料和方法部分描述。图4 c, D显示免疫印迹分析表明FXR表达的增加与减少αSMA水平与亚奥理事会治疗后。这些发现是伴随着减少细胞内和跨膜染色αSMA NTCP表示为百分数+/ NTCP+(图4 e)以及演示了通过共焦显微镜(在线补充图4 a - c)。我们的研究结果表明,减少跨膜的表达NTCP可能归因于pPKC减少,并可能导致少NTCP易位到细胞表面。因此,我们对待LX2NTCP +分组人口表达高与PKC抑制剂pPKC ha - 100(抑制NTCP易位到等离子体基底膜)和评估跨膜NTCP的表情。图4 f表明,抑制PKC(数据未显示)导致NTCP下降,因此与αSMA显著下降,因此强烈建议监管NTCP易位的PKC信号通路可能是一个方法来理解在未来的研究。
通过FXR和pPKC NTCP监管。(A)蛋白印迹和西部(B)量化NTCP乐队,FXR, pAKT, pmTOR, pPKCαSMA LX2NTCP +细胞分类。亚奥理事会,一个FXR受体激动剂,与LX2孵化NTCP +在0.05和1µM浓度,在材料和方法部分描述。(C)的免疫印迹FXRαSMA和(D)进行了定量。(E)流式细胞术分析跨膜和胞内表达的NTCPαSMA积极LX2(αSMA+/ NTCP+)(计算细胞内NTCP =总NTCP表达式-跨膜NTCP)。(F) ha - 100, pPKC抑制剂,与LX2孵化NTCP +细胞的浓度7µM排序。流式细胞术分析是用来评估强度NTCPαSMA。αSMAα平滑肌肌动蛋白;FXR farnesoid X受体;小额信贷机构,平均荧光强度;NTCP,牛磺胆酸盐钠协同转运多肽;亚奥理事会,obeticholic酸;PKC蛋白激酶C;柠檬酸,牛磺胆酸。
在三地NTCP中和抗体抑制低频形象4小鼠模型
他人,我们曾表明,肝肝星状细胞表达pro-fibrogenic标记和导致低频三地4纤维化小鼠模型。10然而,NTCP在纤维发生的作用并不是先前研究。的影响NTCP中和抗体在CCl修改的影响4全身的纤维发生研究材料和方法部分中描述。代表他走时,小天狼星红和马森的三色的染色肝部分给出图5一个。他走时CCl染色的4肝小叶中心的肝细胞肿胀和大的坏死区域的高浸润炎症细胞脂肪变性。NTCP中和抗体治疗逆转这些组织学发现显著减少微血管和macrovascular脂肪变性。小天狼星红染色显示在CCl perisinusoidal地区后胶原沉积增加4治疗;虽然NTCP中和抗体导致显著降低染色的纤维致密组织区域。此外,使用矿渣MTC染色,NTCP中和抗体显示最小CCl积累的厚纤维组织4老鼠CCl相比4未经治疗的老鼠。使用共焦显微镜,我们发现NTCP CCl后肝段肝星状细胞中高度表达4注射(图5 b)。肝活检后NTCP中和抗体显示肝星状细胞表达NTCP却越来越少;结果量化的肝星状细胞的数量表达NTCP /字段给出图5 c。这些数据都与降低纤维化αSMA概要文件(图5 d)和我上校(图5 e)分析了从孤立pHSCs rt - pcr检测。肝脏炎症的血清ALT (图5 f)和AST水平(图5克显示改进后NTCP中和抗体。
CCl NTCP中和抗体抑制低频的小鼠模型4。如果在C57 /提单小鼠诱导8周,相比之下,天真的同行(n = 10每组;实验重复三次)。NTCP中和抗体是腹腔内注射CCl的第六周4一个额外的2周在材料和方法部分描述。代表的部分肝脏免疫组织化学染色(A)他走时,马森的三色的和小天狼星红(原始放大10×)。肝脏的肝星状细胞(B) Immunofluorescent可视化部分获得治疗和治疗老鼠。肝星状细胞是显示如下:DAPI共轭细胞核(蓝色),Cy-2共轭αSMA(绿色),Cy-3共轭NTCP(红色)(C)量化。肝损伤的标记(D)αSMA mRNA, (E)胶原蛋白mRNA,血清ALT (F), (G)血清AST、(H)血清柠檬酸和(I) pHSC柠檬酸进行评估。ALT,丙氨酸氨基转移酶;αSMAα平滑肌肌动蛋白;AST、天冬氨酸氨基转移酶;低频,肝纤维化;NTCP,牛磺胆酸盐钠协同转运多肽;pHSCs,主肝星状细胞; TCA, taurocholic acid.
孟等23CCl观察:4全身的肝损伤破坏了BAs肝肠循环,导致肝脏BAs的积累。因此,我们评估的影响NTCP中和抗体浓度调节血清和肝脏HSC的BAs和柠檬酸。在人类中,柠檬酸和glycocholic酸(胆酸的衍生物)和taurochenodeoxycholic酸和glycochenodeoxycholic酸(鹅去氧胆酸的衍生物)是主要的胆汁盐。他们在浓度大致相当。24图5 h显示了预期CCl血清柠檬酸浓度的增加4老鼠与天真的同行相比。CCl的NTCP中和抗体4小鼠血清中柠檬酸浓度进一步增加两倍(p < 0.001),表明血清中柠檬酸积累。CCl pHSCs获得4肝脏显示高细胞内浓度的柠檬酸(124点)与53点天真的(图5我;p = 0.009)。这些结果符合高架跨膜NTCP表达式(图5 b),在一定程度上解释恶化肝脏组织学所示图5一个。NTCP中和抗体抑制细胞内浓度的柠檬酸pHSCs (图5我)水平与天真的老鼠,因此血清中解释他们的积累结果,衰减的肝损伤的概要文件。相似的结果总BAs评估我们的小鼠组和数据总结在线补充图5 a, B。
Ob / Ob老鼠和HFD (Ob / ObHFD)减少肝损伤和代谢后NTCP中和抗体
Ob / ObHFD展览的几个关键纳什特性包括脂肪变性,肝细胞膨胀和发展重要的纤维化。21我们采用这个模型以获得确认数据的影响NTCP中和抗体在低频上额外的小鼠模型。NTCP中和抗体是腹腔内治疗2周如前所述在材料和方法部分。肝活检获得Ob / ObHFD显示肝星状细胞表达高NTCP的共焦显微镜与野生型相比(WT)同窝出生的(图6)。NTCP中和抗体显示没有NTCP-expressing肝星状细胞和数据中总结图6 b肝星状细胞的数量表达NTCP /字段。关联NTCP表达的抑制作用是否与组织病理学结果,老鼠肝脏彩色)和小天狼星红染色。而Ob / ObHFD展览使用)染色脂肪变性,NTCP中和antibody-treated小鼠没有表现出微观可视化脂肪变性和肝细胞膨胀类似WT小鼠的肝脏(图6 c)。此外,小天狼星红染色显示改进后低频NTCP中和抗体,显示没有隔膜,相比之下Ob / ObHFD处理车辆(图6 d)。血清肝损伤概要;ALT (图6 e)、AST (图6 f)以及肝αSMA表达式(图6克),所有在衰减组织学结果确诊肝损伤参数后NTCP中和抗体治疗。进一步描述我们的小鼠模型中,我们评估了脂质和葡萄糖代谢标记的资料。Ob / ObHFD显示高血清胆固醇(图6 h)和甘油三酯(图6我)。NTCP中和抗体保持可比血清胆固醇和甘油三酯水平WT未经处理的老鼠Ob / ObHFD。这些结果与降低空腹血糖(图6 j),改善葡萄糖耐量试验(图6 k)。一起,上述数据表明NTCP中和抗体显示一个antifibrotic效果和可能是一个有前途的和潜在的目标在延缓和抑制纤维发生阻塞BAs走私进入肝脏。
![TCA trafficking in HSCs. Sorted LX2NTCP+ cells were incubated with buffer containing 100 µM TCA supplemented with radiolabeled 0.25 μC [3H] TCA with or without NTCP blocker (neutralizing antibody) for 15, 30 or 45 min. Kinetics of TCA concentrations in (A) medium and (B) cell lysate made by scintillation counting. Kinetics of MFI of LX2NTCP+αSMA of 15 min time intervals following TCA insults with or without NTCP neutralizing antibody performed by (C) flow cytometry, (D) western blots of fibrosis markers (αSMA, Col I and Col III (following 30 and 45 min)) and (E) quantitated through protein:β-actin ratio. Results between groups were statistically significant (p<0.05). αSMA, alpha smooth muscle actin; MFI, mean fluorescence intensity; NTCP, sodium+/taurocholate cotransporting polypeptide; TCA, taurocholic acid.](http://www.marcconsult.com/content/gutjnl/71/7/1373/F2.large.jpg?width=800&height=600&carousel=1){kind=link}
NTCP中和抗体改善炎症、纤维化和代谢在leptin-deficient (Ob / Ob)老鼠HFD (Ob / ObHFD)。如果生成的Ob / Ob老鼠通过HFD (n = 10)。NTCP中和抗体是腹腔内注射每周两次在材料和方法部分描述。(一)Immunofluorescent可视化肝星状细胞在肝部分获得治疗和治疗老鼠。HSC细胞显示如下:DAPI共轭细胞核(蓝色),Cy-3共轭αSMA(红色),Cy-2共轭NTCP(绿色)。(B) NTCP-expressing肝星状细胞被枚举量化的肝星状细胞表达NTCP /字段(肝星状细胞NTCP +)。肝脏免疫组织化学染色(C))和(D)天狼星红(原始放大10×)。肝损伤的标记(E)血清ALT, (F)血清AST和(G)肝脏αSMA进行了评估。代谢标记(H)的血清胆固醇、血清甘油三酸酯(我),(J)空腹血糖(K)葡萄糖耐量试验和评估。ALT,丙氨酸氨基转移酶;αSMAα平滑肌肌动蛋白;AST、天冬氨酸氨基转移酶;胆固醇,胆固醇;的边后卫,禁食血糖;HFD,高脂肪饮食; HSCs, hepatic stellate cells; LF, liver fibrosis; NTCP, sodium taurocholate cotransporting polypeptide; TRG, triglycerides; WT, wild type.
讨论
我们的研究是第一个描述NTCP的存在对人类肝脏肝星状细胞来自患者低频。NTCP表达式与纤维化严重程度是线性相关。我们还透露,NTCP介导BAs吸收在肝星状细胞,引发他们的激活。失调的NTCP通过抑制HSC发起失活在体外和体内小鼠模型。针对NTCP至关重要在肝脏,从而最小化BAs积累衰减低频三地4全身的小鼠模型。此外,我们还显示改善脂质代谢轮廓Ob / ObHFD使用后NTCP中和抗体。在与其他的研究一致,积累BAs血清中没有显示出对我们的低频模型病理的影响。Loglio等25显示使用myrcudex-B (MyrB;NTCP-selective抑制剂)患者血清中提升BAsδ型肝炎病毒(HDV为)-相关补偿肝硬化48周后无临床症状通常归因于胆汁淤积瘙痒或脂肪痢等。此外,MyrB耐受性良好;病人仍完全无症状尽管BAs的显著增加。空白等26表明MyrB低频等离子BAs增加患者暴露于19.2倍没有胆汁郁积的迹象。共轭BAs的上升到124倍(柠檬酸)。在瓦斯的研究等27,他们现在第一NTCP缺乏症患者被轻微的张力减退临床特征与高架BAs 1500µM没有胆汁阻塞黄疸的临床体征,瘙痒或肝脏功能障碍。
在小鼠模型中,NTCP缺乏预防肥胖和hepatosteatosis HFD老鼠和老鼠王亚南影响胆汁淤积。28Donkers等29日表明NTCP缺乏小鼠餐后血浆BAs增加,导致TGR5-independent减少体重,减少肝脂肪变性,降低血清胆固醇。因此,部分抑制肝间隙BAs的门户和系统性的血液可以用作治疗肥胖以及肥胖相关的hepatosteatosis新策略。然而,研究关注NTCP和BAs监管在低频在肝星状细胞在生理和病理条件下尚未解决之前。在目前的研究中,我们表明,在吸收BAs NTCP肝星状细胞是重要的。事实上,BAs的调制传输通过干扰:
1。排序-肝星状细胞的数量没有NTCP表达式,研究表型和分子变化与肝星状细胞表达NTCP同行相比。
2。NTCP基因沉默(siRNA)和基因数(使用EGCG)。
3所示。抑制NTCP表达式通过使用亚奥理事会FXR受体激动剂。FXR作为细胞内的传感器BAs水平和参与的协同调节BAs吸收,合成和表达式。30.FXR一直建议影响NTCP表达式通过一个复杂的机制涉及轴马力。31日
4所示。从细胞内抑制NTCP易位跨膜通过PKC介导使用ha - 100。NCTP经过翻译后调控包括磷酸化和去磷酸化,从而调节其本地化。这翻译后调节是通过信号通路介导涉及环腺苷酸、钙、一氧化氮,磷酸肌醇3-kinase, PKC和蛋白质磷酸酶。6
5。NTCP中和抗体。
LX2NTCP−有序的细胞显示低αSMA、高FXR(倾销NTCP表达式)和低磷酸化PKC抑制NTCP易位,量化的免疫印迹。此外,这些细胞表现出低磷酸化AKT / mTOR,结果表明更少的激活和扩散的细胞。相比之下,LX2NTCP +排序细胞表现出高度激活的人口通过αSMA表示,因此强烈建议NTCP在肝星状细胞激活,因此在纤维发生中的作用。我们antifibrotic EGCG的影响数据与其他研究是一致的。EGCG反血管增生,抗氧化剂和antifibrotic属性可能引起的潜在治疗肝硬化的治疗丙型肝炎病毒。32余等33表明,EGCG对antifibrotic影响胆管结扎大鼠和TGF-β1-stimulated LX-2细胞在体外通过抑制PI3K / Akt / Smad途径。
我们有充足的证据显示衰减低频LX2文化(图3CCl)和动物模型4和Ob / ObHFD结果NTCP通过捕获BAs的抑制外周血。Donkers等送给NTCP作为小说药理目标延长BAs在血液和外围组织,从而抵消肥胖和食源性脂肪肝。28通过我们的实验室团队也获得了类似的成就衰减的肝脏脂肪变性Ob / ObHFD在调制NTCP的表情。几种机制来解释这一现象,激活FXR诱发Tgr5基因表达并增加(Ca2 +)和夏令营活动来刺激glucagon-like peptide-1分泌和改善肝葡萄糖和脂质代谢。34与BAs对肝细胞的影响的知识,缺乏数据的BAs对肝星状细胞的影响是惊人的。在这里,我们发现新途径与NTCP和BAs在肝星状细胞吸收。血清柠檬酸浓度可能是一个额外的标记(如果不是更敏感比肝损伤的血清AST / ALT活动。激怒NTCP通过抑制肝星状细胞的表达和易位可能作为一个重要的治疗策略,防止疾病进展。
数据可用性声明
合理的请求数据。所有数据都包含在相关研究文章或上传作为补充信息和协议。
伦理语句
病人同意出版
伦理批准
所有人类的实验进行沙龙医学中心根据赫尔辛基宣言:hmo - 0605 - 16所示。伦理批准从耶路撒冷希伯来大学的老鼠实验:CCl的md - 18 - 15494 - 34小鼠模型和md - leptin-deficient老鼠16 - 14574 - 3 (Ob / Ob)。
引用
脚注
作为第一作者和JA联合。
,JA同样起到了推波助澜的作用。
贡献者进行实验,数据和统计分析;JA设计实验方法,指导研究和写的手稿;我们修订后的手稿;RS起草了手稿,修订后的实验分析和提供资源。
资金作者并没有宣布具体资助这项研究从任何公共资助机构,商业或非营利部门。
相互竞争的利益没有宣布。
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