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客观的p63是p53蛋白家族中的一个转录因子在发展关键角色,分化和预防衰老,但其代谢行为在很大程度上仍未知。在此,我们研究了p63在葡萄糖代谢的生理作用。
设计我们用细胞系和小鼠模型基因操纵p63在肝细胞。我们还测量了p63在肝脏有或没有肥胖2型糖尿病患者(T2D)。
结果我们表明,肝p63表达减少禁食。老鼠缺乏具体的同种型TAp63在肝脏(p63LKO)显示更高的餐后和pyruvate-induced葡萄糖远足。这些老鼠SIRT1水平升高,而SIRT1击倒p63LKO老鼠正常化glycaemia。过度的TAp63野生型老鼠降低餐后,pyruvate-induced血糖和SIRT1的水平。在肝细胞细胞株进行研究表明:TAp63调节SIRT1发起人通过抑制其转录激活。TAp63也介导胰岛素的抑制作用对肝葡萄糖生产,压制TAp63损害胰岛素敏感性。最后,蛋白质含量的TAp63减少肥胖人T2D和空腹血糖呈低度负相关,和内稳态模型评价指标。
结论。这些结果说明p63生理调节葡萄糖体内平衡。
- 肝
- 葡萄糖代谢
- 糖尿病
- 饮食
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已知关于这个主题是什么呢
p63在葡萄糖代谢的作用已被评估使用全局淘汰赛(KO)同种型TAp63(苏等,细胞金属底座16岁;(4):511 - 25)。这些老鼠肥胖,显示过早老化和减少寿命和低水平的SIRT1的显示。
这个研究增加了
TAp63肝p63表达,更精确地对碘氧基苯甲醚,减少后禁食和重新喂料正常化TAp63表达式。
老鼠缺乏TAp63在肝细胞中,不显示体重变化、增殖或凋亡,有较高的血糖远足在fasting-induced喂养或丙酮酸。
p63结合SIRT1的启动子,这是至关重要的维持正常糖质新生,并抑制其活性。
沉默SIRT1在肝脏TAp63 KO小鼠正常血糖水平。
胰岛素刺激p63和老鼠和人类肝细胞没有p63不响应insulin-induced抑制糖质新生。
在2型糖尿病患者,肝TAp63水平下降,与空腹血糖和胰岛素抵抗负相关。
这项研究可能会如何影响研究、实践和/或政策
p63是一个转录因子调节大量基因的表达。理解它的功能在葡萄糖代谢可能有助于确定小说的控制葡萄糖代谢相关的基因。
我们的数据表明TAp63水平在2型糖尿病患者建议改变它们的临床相关性。
介绍
p53蛋白的转录因子家族成员(包括p63和p73)通常显示高结构相似,1 2但可以表现出不同的功能和表达谱,通过不同的机制以及不同的生物效应。p63表示为两个主要的亚型:TAp63形式包含一个氨基端transactivation (TA)域和n端截断(ΔNp63)同种型,缺乏这一领域。3 4p63充当主转录因子基底上皮干细胞多能性和至关重要的发展、分化和预防衰老。然而,最近的证据表明,p63还参与代谢的不同方面。例如,杂合的p63老鼠显示减肥,5和老鼠缺乏TAp63发展晚发性肥胖。6
肝脏在代谢中发挥着关键作用灵活适应燃料氧化营养的可用性。7在小鼠肝脏,TAp63诱导食用高脂肪饮食后,其hepatic-specific击倒,改善了高脂肪食源性脂肪变性,减少炎症,内质网压力和新创脂肪生成。8在人类鳞状细胞癌样本,p63目标脂肪酸合酶,促进prosurvival效果。9增殖细胞不仅脂肪酸,还需要大量的葡萄糖来应对高活力的需要。10值得注意的是,p63已被确定为一个基因,表明葡萄糖依赖的鳞状细胞癌。11然而,p63在葡萄糖体内平衡的生理作用在很大程度上仍是个未知数。老鼠缺乏TAp63在整个身体过早衰老和降低寿命,12日13和肥胖,葡萄糖不能容忍和胰岛素抵抗。6考虑:(1)p63是广泛表达,(2)p63扮演组织角色和(3)葡萄糖稳态在多个器官不同监管,总零模型的结论关于葡萄糖代谢必须得到更多的组织模型和证据的支持。
在目前的工作中,我们调查的具体作用肝p63在(1)维持血糖水平在生理条件下,基于能力的肝脏葡萄糖为糖原存储在美联储的状态,(2)释放葡萄糖在禁食期间,这一过程必须严格监管保护身体不受资源的不可逆损失。感兴趣揭示代谢适应,使这种平衡可能被发现间歇性禁食提高起着有益的作用在防止老化和一些疾病的发展和发展状态。14日15我们的研究结果表明,p63在禁食肝脏迅速减少和增加当食物。老鼠缺乏TAp63肝脏显示gluconeogenic增加产能,而老鼠overexpressing转录因子显示相反的表型;这符合TAp63 SIRT1基因启动子结合抑制其转录表达,肝葡萄糖生产的一个著名的电感。16最后,TAp63降低2型糖尿病患者的肝脏(T2D)和空腹血糖呈负相关,稳态模型评估(HOMA)指数和SIRT1的水平。
方法
动物
动物实验进行了符合批准的标准教员动物委员会圣地亚哥德孔波斯特拉大学,和协议的实验与实验动物保健和国际法的规则在动物实验。
结果
可用营养调节p63在肝脏
老鼠接受24小时禁食显示减少肝脏中p63 mRNA表达;值得注意的是,不仅重新喂料逆转,甚至增加了表达与广告相比libitum-fed老鼠(图1一个)。fasting-induced减少表达观察早6小时禁食(图1 b)。一整夜禁食后,小鼠获得食物,和肝p63迅速诱导表达,倾向于upregulation在30分钟(p = 0.06)和upregulation 1小时后(图1 b)。获得的结果在小鼠体外复制在人类肝细胞THLE-2: p63表达水平下降30分钟后在饥饿的细胞,保持低4小时(图1 c)。然后我们测试老鼠受到60%的热量限制为4天,生理条件(类似于禁食)促进肝醣类。17p63 mRNA表达同样显著降低与老鼠随意(图1 d)。
可用营养调节肝p63。(一)p63 mRNA水平在肝脏的野生型小鼠(WT)美联储的随意,禁食24小时或裁判(RF) 24小时禁食后24小时。(B) p63 mRNA水平WT老鼠的肝脏随意(基线)或6或12小时禁食和ref 30分钟、1小时或2小时后一夜之间(12小时)禁食。(C) p63 THLE-2 mRNA水平细胞保持在完全培养基(CM)(基线)或饿死在Krebs-Henseleit-HEPES缓冲区(KHH)表示。(D) p63 mRNA水平在小鼠肝脏受到60%的热量限制为4天(CR)。(E) p63 mRNA水平在肝脏WT随意的老鼠,禁食24小时或24小时禁食,美联储与糖。(F) p63 THLE-2 mRNA水平细胞保持在CM或饥饿KHH有或没有葡萄糖(10毫米)。THLE-2细胞(G) p63 mRNA水平保持在CM或饥饿KHH有或没有葡萄糖(10毫米)和2-deoxy-d-glucose(10毫米)。表达hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa(产生HPRT)担任加载控制,和控制值正常化为100%。数据提出了均值±SE的意思。 *P<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, using a Student’s t-test (B–D), or one way analysis of variancfollowed by a Bonferroni multiple comparison test (A,E–G).
p63 mRNA水平很低在那些条件下(例如,禁食或热量限制)和高后重新喂料(当血糖升高),我们旨在找出哪些信号背后的营养状况是其监管。我们第一次评估如果胰高糖素和FGF21,基本禁食激素,可以调节肝p63水平。无论是在野生型小鼠(WT)胰高血糖素政府或胰高血糖素受体敲除小鼠(KO),影响肝p63表达式(在线补充图S1A)。符合这些发现,没有肝p63水平差异WT和胰高血糖素受体(GCNR) KO受到禁食(在线补充图印地)。此外,FGF21击倒不修改肝p63表达式(图就是S1C在线补充,D)。考虑到这些负面结果,我们接下来研究了循环葡萄糖本身是否能调节肝p63表达式。为此,我们把小鼠在24小时快速和无糖补充。正如之前报道的,8日18禁食小鼠接受糖一样失去了重量non-sugar补充禁食老鼠,但是他们的血糖水平保持稳定,类似于老鼠随意。进一步,禁食减少肝p63表达式,但老鼠接受糖在禁食期间显示,p63表达显著增加,明显高于在老鼠随意(图1 e)。值得注意的是,在孵化后人类THLE-2细胞饥饿中等(Krebs-Henseleit-HEPES缓冲区(KHH))有或没有葡萄糖2小时,我们观察到更高级别的比non-supplemented p63 glucose-supplemented细胞的细胞(图1 f)。此外,glucose-induced p63 upregulation完全封锁的共同2-deoxy-d-glucose (图1 g),不能接受进一步糖酵解,表明葡萄糖本身是能够调节p63表达式。
此外,在24小时禁食小鼠肝脏,TAp63蛋白质的水平显著降低(在线补充图S1E),但是ΔNp63蛋白质含量和ΔNp63 mRNA没有变化在线补充图S1F, G)。因此,p63亚型被营养不足,监管明显只有TAp63受到影响。我们还测量了p63,养分有效性的规定在不同的组织如窟、蝙蝠、肌肉、肾脏和肠道。我们发现p63在这些器官的表达在禁食保持不变(在线补充图S1H)。进一步控制我们的动物模型在禁食的效率,不仅在肝脏,而且在肝外组织相关的肠道和肾脏等糖质新生,我们也测量gluconeogenic基因的表达在这些器官。我们发现G6Pase和PCK1确实升高后24小时禁食和减少重新喂料在肾脏和肠道(在线补充图S1I, J)。
老鼠缺乏TAP63肝脏显示gluconeogenic容量增加
肝TAp63表达式是由营养的可用性,我们生成的两个TAp63条件KO小鼠模型详细研究内源性肝TAp63葡萄糖代谢的作用。一个模型生成的尾静脉注入AAV8-Cre成人TAp63液氧老鼠,给肝脏KO在成人阶段(图2一个);其他模型,TAp63液氧老鼠交叉与小鼠表达Cre重组酶蛋白基因启动子的控制下与α-fetoprotein增强器(Alfp-Cre),导致缺乏TAp63特别是肝细胞(TAp63LKO)从胚胎开始阶段(图2 f)。p63未在其他组织的表达包括白色脂肪组织(窟),褐色脂肪组织(蝙蝠)、肌肉、肾脏和肠道(在线补充图S2A)。
肝TAp63调节餐后葡萄糖。(A) p63 mRNA水平FloxTAp63老鼠注射AAV8-GFP或AAV8-Cre。(B)血糖FloxTAp63老鼠注射AAV8-GFP AAV8-Cre和丙酮酸耐量试验(PTT)。食物摄入量(C)和餐后血糖水平(D) FloxTAp63小鼠注射AAV8表达GFP或者CRE,裁判(RF)与食物的饮食。(E) SIRT1 mRNA水平和肝脏蛋白质水平的SIRT1, PCK1 G6Pase。(F) p63 mRNA水平控制老鼠和Alfp-Cre FloxTAp63 (TAp63LKO)老鼠。(G)血糖TAp63LKO老鼠PTT。食物摄入量(H)和餐后血糖水平(我)TAp63LKO老鼠射频与食物的饮食。(J) SIRT1 mRNA水平和肝脏蛋白质水平的SIRT1, PCK1 G6Pase。曲线下面积(AUC)也显示。 (K) Glucose infusion rate in control mice and TAp63LKO. (L) Tissue glucose uptake from brown adipose tissue (BAT) white adipose tissue (WAT) and muscle in control mice and TAp63LKO. Subcutaneous adipose tissue (SAT), perigonadal visceral adipose tissue (pgVAT) and renal perivascular adipose tissue (rpVAT). (M) p63 mRNA levels in control and TAp63 LKO mice injected with AAV8-GPF and AAV8-TAp63. (N) Blood glucose in control and TAp63 LKO mice injected with AAV8-GPF and AAV8-TAp63 subjected to PTT. Food intake, postprandial blood glucose (O) and protein levels (P) of SIRT1, PCK1 and G6Pase in control and TAp63 LKO mice injected with AAV8-GPF and AAV8-TAp63. Expression of HPRT (qRT-PCR) and GAPDH (western blot) served as loading control, and control values were normalised to 100%. Data are presented as mean±SE mean. *P<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, using a Student’s t-test (A,B,D–G,I,J,L), or one-way analysis of variance followed by a Bonferroni multiple comparison test (M–P). *Indicates differences compared with control group. #Indicates differences between AAV8-GFP and AAV8-CRE mice.
与各自控制的老鼠相比,两组KO小鼠显示类似的食物摄入,体重和血糖水平在葡萄糖耐量试验(GTT),胰岛素耐量试验(ITT)和谷氨酰胺耐量试验(图开通在线补充,C);然而,他们显示pyruvate-induced hyperglycaemic (图2 b, G),表明gluconeogenic增加容量。我们下一个执行一个通宵禁食后的重新喂料实验小鼠模型;维持葡萄糖稳态在生理条件下,肝脏糖质新生必须作为一个需要抑制代谢从美联储禁食状态的转变。19我们发现,小鼠肝脏中缺乏TAp63显示小鼠血糖水平高于WT (图2 d,我),尽管吃同样数量的食物(图2 c, H)。要注意,当受到口服葡萄糖耐量试验(OGTT), TAp63肝脏KO小鼠显示更高水平的葡萄糖后15分钟但曲线下的面积没有变化在线补充图S2D)。在分子水平上,蛋白质与葡萄糖合成高在两种模型缺乏TAp63在肝脏后60分钟重新喂料;这些蛋白质包括SIRT1在mRNA水平(调制),PCK1和G6Pase (图2 e, J)。鉴于老鼠缺乏肝p63显示增加血糖水平在丙酮酸耐量试验(PTT)没有改变ITT和GTT,我们执行一个euglycaemic-hyperinsulinemic夹来查明这一发现可能是由于后者测试期间任何组织/器官补偿有助于维持正常的血糖水平。发现,在euglycaemic-hyperinsulinemic夹,葡萄糖输注率增加禁食TAp63 KO小鼠肝脏与控制小鼠禁食(图2 k)。此外,这些老鼠还显示更高的葡萄糖摄取不同的白色脂肪仓库而不是棕色脂肪或骨骼肌(图2 l)。
进一步探索TAp63的相关性肝葡萄糖生产、小鼠模型缺乏TAp63在肝脏和控制受到24小时禁食。他们显示出较高的血糖水平(在线补充图S3A, E)在循环FGF21没有差异,胰高糖素或氨基转移酶(在线补充图S3B-H)。重要的是,gluconeogenic酶水平也以小肠和肾脏的动物模型,但未发现差异(在线补充图S3I-L),强调肝醣类的特定角色的观察表型。最后,循环水平FGF21和胰高糖素在动物模型也重新喂料后测量,没有显著差异(在线补充图S4)。的影响缺乏肝TAp63葡萄糖稳态不改变所引起的细胞凋亡和细胞增殖,作为裂解疣状半胱天冬酶3和Ki67(分别标记的细胞凋亡和增殖)相似的老鼠缺乏肝TAp63控制老鼠(在线补充图S5)。然而,这些影响是清晰可见的肝脏鼠标与肝细胞癌(用作控制)。
p63 SIRT1的结合。(一)两个假定的图案TP63 SIRT1启动子中发现使用JASPAR数据库。真核生物启动子数据库标识TP63结合位点(黑点)SIRT1的启动子。(B)测定荧光素酶记者AML12细胞转染与si (si0)或sip63控制,以及控制pTa-luciferase或pta - 202 - sirt1 -荧光素酶48小时,和荧光素酶活性测定。(C) p63和AML12 SIRT1 mRNA水平细胞转染si0或sip63。(D) SIRT1活动与si0 AML12细胞转染或sip63。细胞被保存在完全培养基(CM)。(E)测定荧光素酶记者AML12饥饿细胞(保存在Krebs-Henseleit-HEPES缓冲区(KHH))与控制质粒转染(p0)或质粒overexpressing Tap63 (pp63)和控制pTa-luciferase或pta - 202 - sirt1 -荧光素酶为24小时。(F) p63和SIRT1 mRNA水平AML12饥饿细胞转染p0或pp63。(G) SIRT1活动AML12饥饿细胞转染p0或质粒overexpressing TAp63。 (H) Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay. Soluble chromatin prepared from AML 12 cells transfected with the pCDNA3 (empty vector) or the TAp63-FLAG vector for 48 hours was immunoprecipitated with an anti-FLAG antibody or control IgG. The immunoprecipitated DNA was amplified by PCR using primers amplifying the proximal binding site of p63 in the SIRT1 gene promoter. Intensity of the PCR product from three experiments was quantified. Expression of HPRT served as loading control, and control values were normalised to 100%. Data are presented as mean±SE mean. *P<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, using a Student’s t-test (C,D,F–H), or one-way analysis of variance followed by a Bonferroni multiple comparison test (B,E).
肝通过SIRT1 TAp63调节糖质新生。(一)丙酮酸耐量试验(PTT),葡萄糖耐量试验(GTT)和胰岛素耐量试验(ITT)控制或TAp63LKO老鼠注射后sh-luciferase或sh-SIRT1。(B)餐后血糖水平的控制和TAp63LKO小鼠注射后sh-luciferase或sh-SIRT1。(C) SIRT1, PCK1 G6Pase蛋白质含量在控制或p63 LKO老鼠注射后sh-luciferase或sh-SIRT1重新喂料(RF)。曲线下面积(AUC)也显示。(D)控制或ALT和AST水平TAp63LKO小鼠注射后sh-luciferase或sh-SIRT1。(E) SIRT1 mRNA水平在老鼠身上注射后sh-luciferase或sh-SIRT1。表达产生HPRT(存在)的GAPDH(免疫印迹)担任加载控制,和控制价值观正常到100%。数据提出了均值±SE的意思。* * * P < 0.05, P < 0.01, * * * P < 0.001,使用单向方差分析后跟Bonferroni多重比较检验。 *Indicates differences compared with control group. #Indicates differences between sh-luciferase and sh-SIRT1 mice.
肝TAp63过度恶化糖质新生。(一)p63 mRNA水平在野生型小鼠(WT)注射AAV8-GFP或AAV8-TAp63。食物摄入量(B)和累积的身体体重增加(C)在WT小鼠注射AAV8-GFP或AAV8-TAp63。(D)丙酮酸耐量试验(PTT),葡萄糖耐量试验(GTT)和胰岛素耐量试验(ITT) WT小鼠注射AAV8-GFP或AAV8-TAp63。(E)体重和血糖在老鼠随意或受到60%的热量限制(CR)。蛋白质含量(F) SIRT1的上述团体。(G) SIRT1蛋白质含量在WT老鼠随意或禁食24小时。血糖(H)和SIRT1的蛋白质含量(I)在WT小鼠注射AAV8-GFP或AAV8-TAp63。的表达产生HPRT(存在)或GAPDH(免疫印迹)担任加载控件;控制值正常化为100%。 Data are presented as mean±SE mean. *P<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, using a Student’s t-test (A,D,E,G–I), or one-way analysis of variance followed by a Bonferroni multiple comparison test (F). AUC, area under curve.
然后我们获救TAp63 TAp63LKO老鼠的肝脏(图2米)通过注入AAV8窝藏WT TAp63 cDNA;表达TAp63逆转pyruvate-induced和refeeding-induced hyperglycaemic (图2 n, O在GTT),没有差异或ITT公司(在线补充图S6)。此外,恢复肝TAp63 TAp63LKO老鼠之后,我们发现没有增加SIRT1酶或gluconeogenic PCK1,或重新喂料后G6Pase (图2 p)。总之,这些数据表明,缺乏肝TAp63青睐肝葡萄糖生产增加的水平gluconeogenic基因,而拯救TAp63逆转这些影响。p63 SIRT1启动子结合并调节其活动
肝TAp63介导胰岛素的行动。(一)p63 mRNA水平在老鼠身上注射了生理盐水或静脉静脉胰岛素5 U /公斤。(B) THLE-2 p63 mRNA水平细胞保存在完全培养基(CM), KHH或KHH胰岛素(10海里)。(C) p63 THLE-2 mRNA水平细胞在厘米,KHH, KHH胰岛素(10 nM)或与胰岛素(10 nM)和KHH LY294002(10海里)。(D)蛋白质含量pAKT和SIRT1 FloxTAp63小鼠注射AAV8表达GFP或CRE用生理盐水或静脉静脉胰岛素治疗。(E)蛋白质含量pAKT和SIRT1 THLE-2细胞生理盐水治疗或胰岛素(10海里)。(F)葡萄糖生产THLE-2细胞转染的存在与否与si0或sip63胰岛素(10海里)。(G) SIRT1蛋白质含量在野生型小鼠注射病毒编码绿色荧光蛋白或overexpressing TAp63。表达产生HPRT(存在)或GAPDH(免疫印迹)担任加载控制,和控制值正常化为100%。数据提出了均值±SE的意思。 *P<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, using a Student’s t-test (A,D,E), or one-way analysis of variance followed by a Bonferroni multiple comparison test (B,C,F,G).
SIRT1 nutrient-sensing脱乙酰酶的水平和活动增加与热量限制,从而保护euglycaemia通过激活肝醣类。例如,SIRT1在禁食适应性反应中发挥着关键作用刺激基本gluconeogenic酶的表达,包括G6Pase和PCK1。16日20当我们观察到,SIRT1水平升高小鼠缺乏肝TAp63救援后,SIRT1水平恢复TAp63表达TAp63LKO老鼠,我们评估了p63和SIRT1调节肝醣类之间的关系。通过搜索潜在的结合位点p63在使用JASPAR SIRT1启动子数据库(http://jaspar.genereg.net/),我们发现总共有19个假定的结合位点p63 (在线补充图S7A)亩骶和智人SIRT1基因启动子。然而,当应用限制条件,使用p值< 0.001,我们只发现一个结合位点100年第−碱基对(bp)上游网站从一开始转录SIRT1的启动子区域(https://epd.epfl.ch//index.php)(图3一)。值得注意的是,这个片段是守恒的老鼠和人类之间(在线补充图S7B)。
肝TAp63与人类2型糖尿病有关。(一)肝TAp63和SIRT1 normoglycaemia患者的蛋白质含量(NG)或2型糖尿病(T2D)。(B) p63和空腹血糖之间的相关性,口服葡萄糖耐量试验(OGTT)和内稳态模型评估(HOMA)指数。(C)之间的相关性TAp63蛋白质水平和SIRT1的水平。表达GAPDH担任加载控制和控制值正常化为100%。数据提出了均值±SE的意思。* * * p < 0.001,使用学生的学习任务(a)。
评估可能的转录调节TAp63 SIRT1的荧光素酶记者化验没有或使用控制存在p63进行了质粒(pTa luc)或质粒包含202个基点−SIRT1的启动子区域,pTa - 202 - SIRT1 -荧光素酶。首先,沉默p63 AML12细胞后,在荧光素酶活性显著增加SIRT1启动子被发现(图3 b)。同意这一点,沉默p63增加SIRT1表达式和活动(图3 c, D)。相比之下,在饥饿的细胞转染质粒overexpressing TAp63, SIRT1的启动子的荧光素酶活性显著降低(图3 e,在线补充图S7C),SIRT1 mRNA表达和活动减少(图3 f, G)。最终证明转录因子的结合p63 SIRT1的启动子,我们进行了一个芯片分析确凿的这两个因素之间的相互作用(图3 h)。这些结果表明,TAp63直接调节SIRT1,抑制其表达和活动。
击倒SIRT1的肝脏恢复小鼠的血糖水平缺乏TAp63
我们接下来研究了SIRT1是否有功能相关性的中介TAp63在体内葡萄糖代谢的影响。为此,我们抑制SIRT1 TAp63LKO小鼠的肝脏通过注射慢病毒shRNA-luciferase(控制)或shRNA-SIRT1。如上所述,肝脏中缺少TAp63加剧pyruvate-induced hyperglycaemic,由于gluconeogenic增加容量。然而,当SIRT1也撞倒了,血糖水平在PTT的完全相同在控制老鼠;这不是在GTT相关变化或ITT公司(图4一)。
我们还进行了一次通宵禁食后重新喂料实验,发现删除SIRT1正常血糖水平与控制老鼠(图4 b)。当我们测量蛋白与葡萄糖合成、增强SIRT1的水平,PCK1和G6Pase TAp63LKO老鼠改善SIRT1击倒后(图4 c)。注意,血清天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)没有改变(图4 d)和肝SIRT1的可拆卸的具体表达式仍未修改的其他器官(以来图4 e)。这些结果指出,一个关键的角色SIRT1的调停TAp63在葡萄糖代谢的作用。
我们也调查了这些老鼠喂食物的饮食是否改变脂质代谢和/或炎症。油红O染色并没有显示出老鼠的三组之间的差异(在线补充图S8A)。蛋白质含量的酶参与脂肪从头合成(FAS,扣带皮层部位/ ACC),脂质氧化(CPT1)和脂质吸收(LPL)也评估,没有发现显著差异(在线补充图S8B)。基因的mRNA表达涉及炎症(TnfαIl1β,白细胞介素6、Tgfβ,F4/80)和脂质运输/胆固醇代谢(Cyp7a1、Apoc2 Apoa1、Hmgcr)未能显示差异(在线补充图S8C, D)。最后,总蛋白质含量和磷酸化分子也保持稳定(在线补充图S8E)。
总之,我们的数据表明,缺乏p63在肝脏的老鼠的食物热量饮食8 - 10周不会引起显著改变脂质存储、炎症或胆固醇代谢。
过度的TAp63肝脏减少gluconeogenic能力和增加胰岛素敏感性
测试是否TAp63充当一个阻遏的肝醣类,我们接下来进行功能实验通过管理AAV8编码TAp63 WT老鼠(图5一个)。过度的TAp63肝脏没有影响体重和食物摄入量(图5 b, C)。当老鼠挑战与丙酮酸,水平调节的TAp63显示血糖水平低于控制老鼠(图5 d)。值得注意的是,在KO TAp63模型相比,这些老鼠还显示更高的胰岛素敏感性(图5 d),这表明TAp63减少糖质新生是很重要的。事实上,当老鼠受到卡路里限制或fasting-two条件有利于葡萄糖production-mice表达异位TAp63显示在肝脏葡萄糖水平降低,Sirt1的表情,这是典型的升高控制WT老鼠(图5练习)。这些数据表明,TAp63水平的增加减少了gluconeogenic肝脏的能力。要注意,这些影响并不相关的细胞凋亡的变化和/或细胞增殖(在线补充图S9A)、胰高糖素信号通路或缺陷(在线补充图S9B)。
为了更好地解决禁食如何影响p63和SIRT1的监管,空腹时间进程WT老鼠实验(6-12-24小时)。我们发现,正如所料,在空腹血糖水平逐渐下降,而SIRT1表达增加(在线补充图S10A)。在禁食肝p63表达增加(在线补充图S10A)。一致,我们发现之间显著负相关性SIRT1 TAp63 SIRT1之间和血糖,血糖之间显著正相关,TAp63 (在线补充图S10B)。SIRT1的fasting-induced表达式是逆转后重新喂料或葡萄糖补充不肥沃的细胞(在线补充图S10C, D)。此外,我们还测量了SIRT1水平在不同组织(窟、蝙蝠、肌肉、肾脏和肠道)禁食24小时以后再重新喂料。我们的数据表明,SIRT1是调节后禁食和蝙蝠回到基线水平,但在其他研究器官保持不变(在线补充图S10E)。我们还测量了SIRT1在肝脏、窟、蝙蝠、肌肉、肾脏和肠道控制老鼠和老鼠缺乏TAp63在肝脏和未能发现的差异(在线补充图S10F)。
缺乏TAp63块胰岛素信号
除了刺激葡萄糖摄取脂肪组织和肌肉,另一个关键机制,降低餐后血糖浓度是insulin-mediated抑制肝葡萄糖生产。21当我们发现TAp63发挥着重要作用的抑制肝醣类通过调节SIRT1的活动,我们进一步评估的潜在含义TAp63降糖作用2。小鼠胰岛素治疗增加了p63 mRNA表达(图6)。此外,低水平的p63在THLE-2饥饿细胞细胞胰岛素治疗时增加(图6 b),效果是完全被共同的PI3K / AKT抑制剂(图6 c)。小鼠肝脏对胰岛素显示高浓度的pAKT独立于肝TAp63击倒(图6 d)。尽管来WT老鼠显示预期的减少SIRT1的蛋白质含量,SIRT1在小鼠缺乏TAp63保持不变(图6 d)。一致,pAKT增加THLE-2细胞孵化与胰岛素,但较低的表达时没有发现Sirt1 p63沉默(图6 e),因此,胰岛素不能降低血糖水平在中(图6 f)。最后,我们测量了SIRT1在WT overexpressing GFP小鼠或TAp63用胰岛素,治疗和检测胰岛素后更有效的减少SIRT1 TAp63异位超表达(图6克)。
因为它是良好的,如Foxo1和Pgc1αSIRT1调节gluconeogenic信号,我们也评估是否p63可以调节这些因素。首先,我们测量PGC1a乙酰化水平,发现这是减少小鼠的肝脏中缺乏TAp63-which增加了SIRT1的水平(在线补充图S11A)。最后,我们处理的细胞位置Foxo1在细胞培养中没有营养,胰岛素治疗和细胞治疗胰岛素p63以前沉默的地方。我们的研究结果表明,与胰岛素治疗后,Foxo1被排除在核如前所报道。22然而,当p63沉默,胰岛素的效应Foxo1部分改善(在线补充图S11B)。总的来说,这些结果表明,胰岛素刺激p63,转录因子的缺乏削弱胰岛素信号。
TAp63减少肥胖人群和T2D与葡萄糖和HOMA指数呈负相关
最后,了解潜在的临床前研究的临床意义,我们评估了肝脏的TAp63水平的肥胖人员normoglycaemia和肥胖的人T2D(见在线补充表S1我们组)的临床特点。TAp63蛋白质含量都显著降低与T2D肝的人,相反SIRT1的表达增加(图7)。此外,TAp63蛋白质与空腹血糖水平负相关,glycaemia OGTT和胰岛素抵抗在2小时后由HOMA指数(如图所示)(图7 b)、糖化血红蛋白糖化血红蛋白(HbA1C) (在线补充表S2),SIRT1表达式(图7 c)。多元线性回归分析还显示,胰岛素抵抗,加上年龄和身体质量指数,代表肝p63蛋白水平的主要决定因素(在线补充表S3)。总的来说,这些证据表明,在人类肝TAp63葡萄糖稳态有关。
讨论p53家庭成员被公认为他们的角色在癌症,主要是肿瘤抑制。用于抑制肿瘤发展的机制,这些成员改变细胞在增殖细胞的新陈代谢。23然而,p53家庭成员之间的相互作用等因素mTOR, AMPK或一种蛋白激酶,参与各种各样的生物过程,也让他们发挥相关作用与肿瘤细胞代谢方面。23日24的家庭成员,p53是最广泛的研究,积累数据表明,它可以在不同的器官的能量和葡萄糖体内平衡调节几个方面。例如,老鼠缺乏p53在特定下丘脑神经元更倾向于食源性肥胖,25而白色脂肪组织中p53的抑制提高小鼠的胰岛素抵抗与T2D-like疾病。26在肝脏,p53缺陷导致肝脂肪含量增加8 27 28和减少gluconeogenic能力。29 30我们了解p63非常稀缺的代谢行为,考虑到有大量的基因下游p63,可能表现出许多不同的生物效应。
我们的研究结果,在此,表明p63是由营养的可用性,和更准确地说,血糖水平但不是FGF21或胰高血糖素。禁食产生快速减少p63表达肝脏,这是迅速逆转当食物。值得注意的是,这一规定是完全相反作为p53的确认,这是稳定在小鼠禁食和热量限制和重新喂料后回到基线水平。29 30这些数据代表的另一个例子p53、p63之间的复杂的相互作用,在细胞水平上可以互相补充或抵销(Allocati审查等31日)。
我们还透露,肝TAp63参与肝葡萄糖生产的规定,作为老鼠的这种同种型肝显示血糖较高游览丙酮酸管理后,禁食后,然后重新喂料;虽然老鼠overexpressing TAp63表现出胰岛素敏感性的变化。这些影响是独立相关的葡萄糖耐量的变化。然而,老鼠缺乏肝TAp63胰岛素敏感,似乎和白色脂肪组织负责增加葡萄糖的吸收。这些结果在小鼠不同的报告缺乏TAp63,全球肥胖、血糖不能容忍,胰岛素抵抗和发展肝脂肪变性由于其脂肪利用缺陷,脂肪酸氧化和葡萄糖利用率。6可能使用的不同动物模型解释这些不同的结果。使用鼠标模型缺乏TAp63在所有涉及器官相声面临组织解决问题的限制,不占组织负责这些代谢变化。例如,相比之下TAp63-deficient老鼠,老鼠缺乏TAp63尤其是肝脏是防止食源性脂肪变性。8此外,抑制TAp63 POMC在雄性老鼠不影响体重和肥胖。32总体而言,显然,肝TAp63扮演瀑特异性在葡萄糖和脂质代谢的调节作用。
我们发现调节机制涉及TAp63 SIRT1的影响,这是一个肝葡萄糖代谢的重要调节器。16 33例如,肝SIRT1是一个关键的调制器的糖质新生禁食,34 35效果取决于多种因素之间复杂的相互作用在不同阶段的禁食和/或喂养。我们的研究结果表明,p63直接绑定到SIRT1在肝细胞启动子并抑制其活动,而沉默p63诱导SIRT1的活动。一致,SIRT1击倒只有在肝脏减弱小鼠的特点缺乏肝TAp63与葡萄糖代谢有关,减少增加偏移后的血糖PTT和fasting-induced喂养TAp63肝脏KO小鼠中发现。这是不同于先前的报道在TAp63全球KO小鼠模型,较低水平的SIRT1当老鼠是热量限制或禁食。6报告还显示,在老鼠胚胎成纤维细胞从TAp63全球KO小鼠,获得TAp63转录激活SIRT1。6再一次,我们的研究结果之间的明显差异,以往可能被使用的不同类型的细胞和动物模型,即我们认为研究这个转录因子在特定细胞类型(如肝脏,我们在这里做的),动物模型可以更精确地揭示其生物作用。
最后,我们阐明当前数据的潜在临床应用价值,发现TAp63在肝脏的肥胖人表达下调与T2D normoglycemic相比,肥胖的人。TAp63也呈负相关与空腹血糖,血糖水平后OGTT、HOMA指数,糖化血红蛋白和SIRT1的水平。水平降低TAp63 T2D患者肝脏,因为尽管这些患者显示高水平的血糖和胰岛素,这些患者的肝细胞胰岛素抵抗。因为这些肝细胞并非‘感觉’胰岛素,因此不包含葡萄糖,低水平的p63预期结果是根据我们的临床前数据。所有这些临床结果表明TAp63之间的交互和SIRT1调节血糖水平的方式对人类很重要,这可以与T2D等病理生理情况。值得注意的是,这个概要文件和相关性的TAp63 T2D患者不同于发现p53,稳定在这个病人组。30.这支持了假设p53家庭成员可以有不同的行为对葡萄糖代谢。
总之,我们的数据表明,TAp63调制了肝脏葡萄糖的可用性,这缺乏转录因子提高了空腹血糖水平的适应性反应通过刺激SIRT1的活动。相反,过度的TAp63增加胰岛素敏感性。值得注意的是,这些临床前研究结果由临床数据支持。众所周知,代谢灵活性是实现在许多情况下通过调节葡萄糖的吸收。我们的数据发现一个新的对葡萄糖稳态机制提供一个新的见解,可能与糖尿病的生理病理学相关,其他障碍。总之,这项工作确定了新的TAp63生理作用在non-tumoral细胞葡萄糖代谢。
数据可用性声明
合理的请求数据。
伦理语句
病人同意出版
伦理批准
本研究涉及人类参与者和我们共同批准西班牙纳瓦拉大学伦理委员会(协议2017.104)。参与者给知情同意参与这项研究之前的部分。
引用
补充材料
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补充数据
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脚注
推特@ChusaGzlzRellan、@MFdezFondevila @RubenNogueiras
MJG-R和EN同样起到了推波助澜的作用。
贡献者NdSL MJG-R, EN, AR CV-D党卫军,英国石油(BP) MFF,超滤,MV-R,, CI和AE:研究概念和设计,数据采集,数据分析和解释。MJG-R、EN、MF、DG RP-F,副总裁,MS, ML, CD, RC和RN:稿件写作和最终审核。RN充当担保人。
资金这项工作已经由支持菲德尔/ Ministerio de Ciencia Innovacion y Universidades-Agencia Estatal Investigacion (CD: bfu2017 - 87721;ML: rti2018 - 101840 b - i00;RN: rti2018 - 099413 b - i00 red2018 - 102379 t), Xunta加利西亚(ML: 2016 - pg068;RN: 2021 - cp085和2020 - pg015), Fundacion BBVA (RN: BBM_BAS_0062), Fundacion Atresmedia (ML和RN: 2018 - po055), Fundacion耶稣塞拉(RN: 2021 - 003),欧洲糖尿病研究基金会(RN: 2018 - po069)和FIS-FEDER (GF: PI19/00785;基于“增大化现实”技术:PI19/00990)。本研究亦收到资金从欧洲共同体的H2020框架计划(ERC协同格兰特- 2019 -看- 810331,RN, VP和MS)。基于Centro de Investigacion en红色(cib) de Fisiopatologia de la肥胖症患者y Nutricion (CIBERobn), cib de心血管植物y助消化药(CIBERehd)。CIBERobn和CIBERehd倡议的de Salud卡洛斯三世(ISCIII)西班牙支持菲德尔基金。
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