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客观的检查肝细胞骨髓分化的作用主要回应基因88 (MyD88)葡萄糖和脂质代谢。
设计研究先天免疫系统的影响在肝细胞和新陈代谢的水平,我们生成的老鼠窝藏hepatocyte-specific删除MyD88。我们研究了删除对新陈代谢的影响通过喂养小鼠与正常控制饮食或为8周高脂饮食。我们评估体重,脂肪量增加(使用时域核磁共振),葡萄糖代谢和能量稳态代谢室(使用)。我们进行了微阵列和定量pcr在肝脏。此外,我们研究了肠道微生物群组成,胆汁酸和肝脏和血浆代谢物。我们分析基因的表达模式在肝脏的肥胖人类发展非酒精性脂肪肝(NASH)。
结果Hepatocyte-specific删除MyD88易诱发葡萄糖耐受不良、炎症和肝胰岛素抵抗的独立体重和肥胖。这些表型差异部分归因于基因表达的差异,转录因子的活动(例如,过氧物酶体扩散国活化剂receptor-α,farnesoid X受体(FXR),肝X受体和STAT3)和胆汁酸参与葡萄糖,脂质代谢和炎症。除了这些改变,基因删除MyD88在肝细胞改变肠道微生物群组成及其代谢物,像那些在食源性肥胖观察。最后,人类肥胖与纳什显示减少表达不同的细胞色素P450参与生物活性脂质合成。
结论我们的研究确定了一个新的联系先天免疫和肝脏胆汁酸的合成和生物活性脂质。这个对话似乎参与了对变化与肥胖有关,如2型糖尿病和纳什,在小鼠和人类。
- 糖尿病
- 葡萄糖代谢
- 脂质代谢
- 肠道细菌
- 胆汁酸代谢
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来自Altmetric.com的统计
本研究的意义
已知在这个问题上是什么?
toll样受体和髓样分化的主要对策基因88 (MyD88)与多个代谢途径。
冲突的结果存在关于先天免疫的作用,更精确地MyD88主机新陈代谢。
肝脏是一个关键的器官的目标所涉及的微生物群和葡萄糖和脂类代谢的控制。
有什么新发现吗?
的肝细胞缺失MyD88易诱发葡萄糖耐受不良、炎症和肝胰岛素抵抗的独立体重和肥胖。
肝细胞Myd88控制参与葡萄糖的合成生物活性脂质,脂质代谢和炎症。
肝细胞Myd88调节多个基因的转录活动参与胆汁酸代谢。
的肝细胞缺失MyD88在正常饮食诱导特定的肠道微生物的变化,基因表达,血浆和肝脏代谢组中观察到相似的食源性肥胖及糖尿病小鼠。
类似于在肝细胞Myd88删除老鼠,人类肥胖的研究对象发展非酒精性脂肪肝(NASH)的特点是减少表达不同的细胞色素P450参与生物活性脂质合成。
它会如何影响临床实践在可预见的未来吗?
我们确认新的机制将肝先天免疫细胞信号通过MyD88及其含义在糖尿病的发病。
我们提出一个特定的模式表达不同的细胞色素和生物活性脂质在肝脏组织的肥胖病人可以作为开发纳什易感性的一个标志。
我们的研究需要一步识别生物活性脂质由肝脏和代谢物连接免疫和代谢。
介绍
先天免疫系统和代谢途径在功能上是相互交织在一起的,1,2使他们有吸引力的目标治疗肥胖和相关疾病(如糖尿病、非酒精脂肪肝疾病(副功拜)和代谢疾病疾病)。越来越多的证据表明,先天免疫系统作为传感器对营养代谢压力。通常多个先天免疫受体等的toll样受体),核苷酸oligomerisation域(点头)和NOD样受体家族成员参与代谢压力的识别在炎症反应的发生,从而导致代谢紊乱的发展。2,3我们和其他人表明低度炎症和胰岛素抵抗可能与肠道微生物群,并抑制了在缺乏特定的通常。4 - 6然而,存在大量相互矛盾的结果。7 - 10例如,数据显示,脂肪所需地受体信号没有直接段肝胰岛素抵抗,10而其他显示肝脏特异性删除地防止食源性肝胰岛素抵抗。11,12
骨髓分化主要回应基因88 (MyD88)是最通常的关键信号适配器(除了TLR-3)受体(IL-1R)及地震-受体。MyD88已被证明在肥胖和糖尿病中发挥作用。非肥胖糖尿病突变小鼠,倾向于1型糖尿病的发展,不受这种疾病如果MyD88熔化,这保护可以转让后肠道微生物群转移到无菌的接受者老鼠。7删除MyD88肠道上皮细胞在中枢神经系统或保护对高脂肪饮食(HFD)全身的体重增加,葡萄糖耐受不良。13,14在另一个上下文中,删除MyD88被证明能增加患2型糖尿病的风险和HFD喂养下肝脂肪变性。15 - 17日总之,证据强烈支持的角色MyD88在肝障碍与肥胖相关信号;然而,收敛的分子机制和目标组织仍有待澄清。
评估肝细胞的特定角色MyD88代谢,生成hepatocyte-specific删除的小鼠模型Myd88基因。我们接下来研究的影响下删除生理(控制饮食(CT))和病理(HFD-induced肥胖)条件。
材料和方法
老鼠
一代的Albumin-Myd88KO小鼠
Hepatocyte-specificMyd88删除老鼠(肝脏特异性基因敲除小鼠(LKO))是由老鼠轴承Cre重组酶表达的控制下白蛋白启动子(Albumin-Cre)(C57BL / 6背景,杰克逊实验室,巴尔港,缅因州,美国)窝藏老鼠loxP在Myd88等位基因(C57BL / 6背景,杰克逊实验室)。
LKO实验
群8-week-old LKO小鼠和野生型(WT)的同胞被安置在特定的无菌条件下两组老鼠/笼子里(filter-top笼子)免费食品和热压处理过的水。WT和老鼠LKO CT(10%的脂肪,AIN93Mi,研究饮食,新布伦瑞克,新泽西州,美国)(WT-CT或LKO-CT)或一个HFD(60%的脂肪,D12492i,研究饮食)(WT-HFD或LKO-HFD)。治疗持续了8周。这个实验是独立进行三次。控制老鼠WT同窝出生的庇护Myd88 loxP在等位基因而不是Cre重组酶。体重和食物摄入量每周记录一次。身体成分是评估每周使用7.5 MHz时域核磁共振(LF50 Minispec,力量,Rheinstetten,德国)。
额外的协议和网上所描述的程序补充方法部分。
统计分析
数据表示为均值±SEM。组之间的差异评估使用单向方差分析(方差分析),其次是Newman-Keuls正常化后的事后测试日志转换。双向方差分析分析Bonferroni测试后的演变进行了重复测量体重,脂肪量和glycaemia口服葡萄糖耐量试验。数据分析使用GraphPad棱镜V.5.00 Windows (GraphPad软件,圣地亚哥,加利福尼亚,美国)。数据与不同的上标字母或符号是明显不同的p < 0.05根据事后方差分析统计分析。
加入数据
微阵列数据的地理加入数字摘要报道GSE73489。加入地理的人类GSE59045微阵列数据集。
结果
肝细胞Myd88删除不影响体重和脂肪量增加
评估肝细胞MyD88在新陈代谢的作用,我们用一个条件hepatocyte-specific删除生成的老鼠Myd88基因(LKO老鼠)。我们验证的删除Myd88LKO小鼠肝细胞的基因通过量化mRNA(下降了50%)和蛋白质含量在肝脏WT和LKO老鼠(见在线补充图S1A, B)。
我们下一个评估是否肝细胞Myd88删除改变宿主代谢表型在CT (WT-CT和LKO-CT组)或一个HFD (WT-HFD和LKO-HFD组)。我们发现肝细胞Myd88删除不影响体重在8周的治疗与WT老鼠。WT和LKO老鼠在治疗慢性和HFD(体重增长的类似图1A、C)。使用核磁共振表明,身体成分分析LKO小鼠获得类似脂肪量在整个实验WT老鼠CT或HFD挑战(下图1B, D)。肝体重和脂肪垫没有肝脏的影响Myd88删除(图1情况)。意味着食物摄入量之间的相似组(图1我)。
肝细胞基因88(骨髓分化的主要对策Myd88)删除不影响体重和脂肪量发展。(A)体重(g)进化。(B)脂肪量进化(g)衡量时域核磁共振(TD-NMR)。(C)全身体重增加(g)。(D)总脂肪量增加(g)衡量TD-NMR。(E)肝脏重量(毫克)。(F)皮下脂肪组织(坐)重量(毫克)。(G)附睾的脂肪组织(吃)重量(毫克)。(H)内脏脂肪组织(增值税)的重量。(我)食物的摄入量(g /天/鼠标)。(J)总体力活动测量代谢室(梁总减免计数)。(K)呼吸道交换比率(VCO2/签证官2)。这些数据(a)对应于至少三个独立实验的结果(n =技能),(我)(n = 10 /组),(J和K)每组(n = 4 - 6)。数据意味着±SEM。*显著差异(p < 0.05)之间的高脂肪饮食(HFD)治疗组和控制饮食(CT)治疗的老鼠。数据用不同的上标字母或符号明显不同(p < 0.05)根据事后单向方差分析。LKO肝脏特异性基因敲除小鼠;WT,野生型。
通过使用代谢室,我们分析了总体力活动水平和呼吸交换比率。我们没有发现任何差异组相比总体力活动(图1J)。然而,LKO老鼠在CT的特点是下呼吸道交换比率类似于老鼠HFD,显示脂肪酸一样优惠能量底物的使用中发现HFD喂养,从而提出降低葡萄糖的氧化底物(图1K)。
葡萄糖代谢的改变LKO老鼠
我们下一个评估全身葡萄糖代谢,发现肝细胞Myd88删除并不影响CT下口服葡萄糖耐量,而LKO-HFD老鼠表现出葡萄糖耐量较WT-HFD老鼠(图2A、B)。正如所料,HFD喂养显著增加血浆胰岛素水平口服葡萄糖负荷后的曲线下面积(图2C)。虽然在LKO-CT葡萄糖概要文件没有影响,这些老鼠产生更多的胰岛素口服葡萄糖响应政府维持正常glycaemia,表明胰岛素抵抗状态(图2C)。在HFD治疗,LKO-HFD小鼠胰岛素分泌增加了约60%相比WT-HFD老鼠。这些结果支持一个受损的胰岛素抵抗指数,与LKO-HFD老鼠显示与WT-HFD老鼠相比增加70% (图2D)。我们接下来使用胰岛素耐量试验评估胰岛素耐受性。这个参数是适度但非重大的影响在LKO-HFD (图2E)。胰岛素抵抗指数被认为是肝胰岛素抵抗的代理。18按照这种假设,我们发现肝脏糖原含量较低(其合成和降解由胰岛素控制19)在LKO-CT WT-HFD和LKO-HFD老鼠相比WT-CT老鼠(图2F)。
肝细胞基因88(骨髓分化的主要对策Myd88)删除改变葡萄糖耐量,全身脂类代谢,促进胰岛素抵抗。(A)后血浆葡萄糖(mg / dL)剖面2 g / kg葡萄糖口头挑战自由移动的老鼠和(B)均值曲线下面积(AUC)测量葡萄糖负荷后0到120分钟之间。(C) AUC血浆胰岛素的葡萄糖负荷后测量-30至15分钟。(D)胰岛素抵抗指数由相乘的AUC AUC血糖的胰岛素。(E)腹腔内注射胰岛素后血糖概要(0.75 U /公斤)自由移动的老鼠(n = 9)。(F)肝糖原(µg葡萄糖的糖原/毫克的肝脏)内容以禁食老鼠。(G)和磷酸化Akt水平总intraportal后小鼠的肝脏胰岛素注射和(H) %的一种蛋白激酶的磷酸化蛋白(n = 3)。(我)内脏脂肪组织CD11c mRNA的表达。这些数据(模拟,我和F)对应于至少三个独立实验的结果(n =技能)。数据意味着±SEM。 Data with different superscript letters or symbols are significantly different (p<0.05) according to post hoc one-way analysis of variance. CT, control diet; HFD, high-fat diet; LKO, liver-specific knockout mice; WT, wild type.
探索是否LKO小鼠肝脏中产生胰岛素抵抗,我们分析了insulin-induced一种蛋白激酶的磷酸化(p-Akt)。我们发现一种蛋白激酶的磷酸化胰岛素刺激后减少LKO-CT小鼠的肝脏;这种效应更明显在LKO-HFD老鼠(图2G H)。内脏脂肪炎症与较低的葡萄糖耐量,增加肝胰岛素抵抗。20.在这里,我们发现LKO老鼠表现出显著增加(大约65%)的mRNA表达集群分化11 c (CD11c)分组人口内脏脂肪组织巨噬细胞的脂肪组织巨噬细胞的主要人口的肥胖和胰岛素抵抗(图2我)。21,22这个参数在WT-HFD增加了2.3倍,更因此LKO-HFD老鼠的3.5倍(图2我)。
肝脏功能和脂质含量LKO老鼠
我们下一个评估是否肝Myd88删除了对转氨酶水平反映肝脏炎症的影响。我们发现血浆丙氨酸转氨酶(ALT)水平主要是增加HFD-treated老鼠,而天冬氨酸转氨酶(AST)水平增加了约30% LKO-CT老鼠和老鼠HFD-fed但没有达到意义(图3A、B)。我们发现肝脏脂质含量显著改变在HFD喂养增加WT-HFD增加50%和65% LKO-HFD肝甘油三酯内容(图3C)。这些结果进一步证实了利用组织学分析和脂肪变性评分(图3D, E)。炎症评分HFD喂养后显著增加,但不影响Myd88删除(图3F)。纤维化评分之间的相似组(图3G)。
肝细胞基因88(骨髓分化的主要对策Myd88)删除和肝参数。(一)血浆ALT活性。(B)等离子体AST活性。(C)肝甘油三酯(nmol /毫克的蛋白质)(n = 20-27)。(D)代表组织肝油红O染色,酒吧= 100µm规模。(E)肝脂肪变性的分数(任意单位)。(F)炎症评分(任意单位)。(G)纤维化评分面积(%)。数据意味着±SEM。这些数据(a - c)对应于至少三个独立实验的结果(n =政府),获得的分数(E)和(F)分析后取得了至少五个字段/动物每组(n = 8)和由三个独立的被调查人员。 Data with different superscript letters or symbols are significantly different (p<0.05) according to post hoc one-way analysis of variance. CT, control diet; HFD, high-fat diet; LKO, liver-specific knockout mice; WT, wild type.
肝脏的基因表达谱LKO老鼠
理解的机制参与肝脂肪变性和胰岛素抵抗的发展,我们执行一个全球使用微阵列基因表达分析。这些微阵列显示大量的基因表达的增加参与急性期反应和炎症通路,脂质代谢和降低许多基因的表达与细胞色素P450-mediated氧化和还原(图4A)。这些途径的意义是通过分析基因本体使用生物信息学工具大卫和TFactS第23 - 25(文档S1大卫和在线补充图S2)。图4一个代表基因表达下调或调节LKO-CT 1.5倍,LKO-HFD WT-HFD老鼠和WT-CT老鼠。热图选择基因同样被用来比较不同条件影响三个条件的相同的基因的表达与WT-CT组。我们发现许多重要的途径是肝后修改Myd88删除在CT和HFD治疗(图4)。我们发现425基因显著影响LKO-CT老鼠,而HFD喂养诱导显著1168 890个基因和基因的修改修改LKO-HFD相比WT-CT老鼠(图4A)。在这些变化中,167个基因明显LKO-CT同样影响的三个条件,WT-HFD和LKO-HFD(见图4一个和在线补充表S1)。多个基因参与炎症和急性期反应,如Saa1 Saa2, Saa3, Orm1 Orm2明显和强烈诱导LKO-CT与WT-CT老鼠相比,在更高的级别上,甚至比HFD-fed老鼠(图4B-F)。Lcn2,一个基因参与先天免疫,在肝细胞显著增加MyD88删除老鼠CT和HFD条件下(图4G)。基因免疫和防御如Cd43、C4A, Cd8b1 LKO-CT和处于显著增加,WT-HFD和LKO-HFD老鼠相比WT-CT (图4H-K)。
肝细胞基因88(骨髓分化的主要对策Myd88)删除更改基因档案和肝脏转录活动。(A)热图代表选定的微阵列分析和转录因子基因参与炎症,先天免疫,主机防御、氧化和还原途径。这个列表包含的基因列表显著表达下调或调节肝脏特异性敲除的1.5倍(LKO)阀门的饮食(CT),野生型(WT)高脂肪饮食(HFD) LKO-HFD老鼠和WT-CT小鼠(p < 0.05)。表达的标记(B) Saa1参与急性期反应,(C) Saa2, (D) Saa3, (E) Orm1 Orm2 (F);基因参与先天免疫和防御(G) Lcn2 C4A (H),(我)Cd8b1 (J) Cd43、(K)处于由微阵列测量。
令人惊讶的是,许多基因参与氧化和还原(即细胞色素P450)途径是减少LKO-CT老鼠和HFD-treated组(图4A)。在这些基因,既降低了肝细胞MyD88删除和HFD,我们发现了几个细胞色素参与长链脂肪酸代谢,更具体地说,在epoxyeicosatrienoic酸的合成(缺钱)、hydroxyepoxyeicosatrienoic (het)和dihydroxyepoxyeicosatrienoic (DHETs)酸的家庭。26这些脂质调节血糖,血脂和炎症过程。例如,邂逅了,het, DHETs降低肝脏脂质和炎症,27他们作为胰岛素感光剂,29日抗炎分子30.并降低代谢综合征标记。31日引人注目的是,缺钱也报道过氧物酶体扩散国活化剂receptor-α(PPAR-α)受体激动剂。32,33肝脏转录因子PPAR-α激活等多个途径可以调节脂质代谢(如脂肪酸合成、脂肪酸氧化、胆汁酸合成)。通过使用TFactS分析,我们发现LKO老鼠表现出一个强大的和重要的抑制PPAR-α,NR1H3和NR1H2(肝X受体(LXR)α和LXRβ,分别)(p < 0.0005),而STAT3显著激活(p = 0.01)(见在线补充图S2)。PPAR-α符合的抑制表型观察,这是一个增加炎症、肝脂肪变性和改变胰岛素敏感性。的差别有趣的是,对这些基因的成纤维细胞生长因子21 (Fgf21)与STAT3的激活,导致更高的肝葡萄糖生产和肝糖分解。34在这里,我们发现,Fgf21 LKO小鼠表达下降了50%和80% WT-HFD和LKO-HFD老鼠,从而导致STAT3激活和糖原含量低这三个组(图5LXR的差别),对这些变化也可能导致免疫力,胆汁酸,葡萄糖和脂质代谢。35
肝细胞基因88(骨髓分化的主要对策Myd88)删除增加基因的mRNA表达参与胆汁酸合成和信号,影响等离子体胆汁酸概要文件。(A) Fgf21表达发布的微阵列分析,(B) Cyp7a1 mRNA, (C) Cyp8b1 mRNA, (D) Cyp7b1 mRNA和(E) Cyp27a1 mRNA水平衡量qPCR肝脏的野生型(WT)阀门的饮食(CT),肝脏特异性敲除(LKO) - CT, WT-high-fat饮食(HFD)和LKO-HFD老鼠。这些数据对应于至少两个独立实验的结果(n = 12-20)。数据意味着±SEM。数据与不同的上标字母明显不同(p < 0.05)根据事后单向方差分析(方差分析)。(F)等离子体胆汁酸含量总胆汁酸(%),柠檬酸,TUDCA, THDCA, TCDCA, TDCA, CA, UDCA, HDCA, CDCA, DCA, TbMCA, TaMCA, ToMCA, oMCA, aMCA bMCA。数据提出了均值±SEM (n = 9)。(G) Fgf15 mRNA在回肠(n = 12)和(H) Fgfr4 mRNA (n = 10 - 20)在肝脏WT-CT, LKO-CT, WT-HFD LKO-HFD。(我)盲肠胆汁酸含量总胆汁酸(%)。数据提出了均值±SEM (n = 9)。 (J) Graphical summary: impact of a decreased abundance of FXR agonist and an increased abundance of FXR antagonist, leading to a decreased FXR activity and altered glucose, lipid metabolism. Data with different superscript letters are significantly different (p<0.05) according to post hoc one-way ANOVA. CA, cholic acid; CDCA, chenodeoxycholic acid; DCA, deoxycholic acid; HDCA, hyodeoxycholic acid; LCA, lithocholic acid; MCA, muricholic acid; T, taurine; UDCA, ursodeoxycholic acid. a, alpha; b, beta; o, omega conjugated species.
胆汁酸代谢的变化和概要文件LKO老鼠
细胞色素中肝细胞的影响Myd88删除,我们发现mRNA水平的Cyp7a1, Cyp8b1 Cyp7b1,关键细胞色素参与胆汁酸合成,增加在LKO-CT WT-HFD和LKO-HFD老鼠(图5罪犯)。Cyp27a1的表达,主要是参与胆汁酸合成的替代途径,并不影响(图5E)。Fgf15在回肠和信号通过Fgfr4肝细胞抑制表达的主要细胞色素参与胆汁酸合成。36引人注目的是,我们发现的表达在回肠Fgf15翻了一番LKO-CT小鼠相比WT-CT和增加了10倍的12 HFD喂养(图5G),而WT-HFD和LKO-HFD老鼠表现出显著降低mRNA表达Fgfr4 (图5H),从而提出一个改变负面反馈循环的存在肠道胆汁酸合成的肝细胞。
胆汁酸代谢的几个标记指向一个假定的胆汁酸概要的调制。因此,我们量化超过20个不同的胆汁酸在门静脉和盲肠(见图5F,我和在线补充图S3)。我们发现HFD喂养影响初级和次级胆汁酸如CA, TbMCA,柠檬酸,THDCA, TCDCA TDCA,而其他人则不受影响(见图5F,我和在线补充图S3)。有趣的是,肝Myd88删除模仿HFD喂养与主要的胆汁酸CA显著降低血浆及盲肠LKO-CT和WT-HFD老鼠相比WT-CT老鼠(图5F I)。相反,在等离子体,TbMCA LKO-CT达到同一水平水平显著增加HFD-fed老鼠(中图5F)。我们下一个测量标记胆汁酸代谢在肝脏和肠道。更准确地说,我们量化因素参与胆汁酸结合(落下帷幕,蝙蝠,Hnf4a1) (图6),胆汁酸的出口从肝脏(Abcb11, Abcb4 Ostb) (图6B)和胆汁酸的重吸收(Ntcp Otap1b2) (图6C)。此外,我们测量标记的胆汁酸的重吸收回肠(Osta, Ostb, Ibabp Asbt) (图6D)。这些标记并不缺乏MyD88和影响往往是受饮食治疗(即落下帷幕,Osta和Ibabp)。
标记在肝脏胆汁酸代谢和回肠。(一)胆汁酸结合(落下帷幕,蝙蝠和Hnf4a1 mRNA)。(B)胆汁酸出口(Abcb11、Abcb4 Ostb) mRNA。(C)胆汁酸再吸收(Ntcp和Otap1b2) mRNA在肝脏的野生型(WT)阀门的饮食(CT),肝脏特异性敲除(LKO) - CT, WT-high-fat饮食(HFD)和LKO-HFD老鼠。(D)胆汁酸再吸收(Osta、Ostb Ibabp, Asbt) mRNA在WT-CT回肠,LKO-CT, WT-HFD LKO-HFD老鼠(n = 10 - 12)。数据意味着±SEM。数据与不同的上标字母明显不同(p < 0.05)根据事后单向方差分析。
重要的是,CA和TbMCA已知FXR活动进行监管。37,38因此,这些结果强烈表明,减少主受体激动剂CA和增加拮抗剂TbMCA LKO小鼠减少FXR的活动(图5J),从而导致观察到的变化对葡萄糖和脂质代谢。根据这一假设,我们发现表达黄素单加氧酶3,FXR的基因调控,39是最减少LKO-CT, WT-HFD LKO-HFD老鼠(图4),进一步支持基因概要文件之间的联系,FXR和胆汁酸代谢。
删除的肝细胞Myd88影响特定的肠道细菌
胆汁酸,HFD喂养和FXR与肠道屏障功能的变化,胰岛素抵抗和肠道微生物。40-43在目前的研究中,我们调查了不同标记的肠粘膜屏障功能,在空肠和回肠。我们发现抗菌肽的表达RegIIIγ(由Reg3g再生islet-derived 3γ,编码)在WT-HFD甚至更强烈降低LKO-HFD空肠和回肠的在一个较低的程度上(见在线补充图S4A C)。紧密连接蛋白的其他标记(claudin 1和3,zonula occludens 1和occludin)影响弱(见在线补充图S4B, D)。
由不同的微生物胆汁酸代谢。因为我们发现了一个清晰的变化胆汁酸概要文件在两个基因删除Myd88和HFD喂养,我们调查这个观察是否可能与肠道微生物群组成的变化。与之前的研究一致,5,14,44,45HFD喂养显著改变肠道微生物群组成与WT-CT老鼠相比图7A、B和在线补充表S2)。的删除Myd88没有明显影响的主要类群(图7B)和操作的数量(辣子鸡)(见在线分类单位补充图S5A)。共有43 881辣子鸡QIIME确定的管道,由至少一个序列在一个样本。样本然后按治疗分组,每组中值序列的数量为每个OTU计算。总共1852个辣子鸡平均丰度优于0至少在一个治疗组,191辣子鸡占90%的序列。总共1113个辣子鸡平均丰度优于0 LKO-CT或WT-CT组,和751年的两组。同时,172辣子鸡累积丰富的中位数LKO-CT和WT-CT组优于10,占总数的89.26%序列。这些辣子鸡是代表在网上补充图S5B为核心的微生物控制治疗组。辣子鸡分为五门:厚壁菌门,拟杆菌,变形菌门,Tenericutes Deferribacteres。核心微生物的老鼠实验实际上是由一个相对有限的辣子鸡:< 10%的辣子鸡平均丰度优于0占总数近90%的序列。phylotype丰富性估计根据bias-corrected Chao1组间相似(见在线补充图S5BC),而香农多样性指数增加治疗组(见在线补充图S5D)。
肝细胞基因88(骨髓分化的主要对策Myd88)删除改变肠道微生物群组成。(一)PCoA基于未加权的UniFrac分析操作分类单位(辣子鸡)(n = 12)。每个符号代表一个样本是彩色根据集团。(B)构成丰富的细菌类群中确定肠道微生物群(n = 12)。(C-J)的相对含量(16 s rRNA序列的百分比)的各种细菌属在每个样本中每组的老鼠。数据提出了均值±SEM (n = 9)。数据与不同的上标字母明显不同(p < 0.05)根据事后单向方差分析。在网上看到也补充表S2和S3。CT,控制饮食;HFD,高脂肪饮食; LKO, liver-specific knockout mice; WT, wild type.
分类较低层面,我们发现大量的Sutterella和Allobaculum在LKO-CT强烈和明显减少,类似的程度,观察到在HFD喂养(看到在线吗补充表S3和图7C, D)。我们还建立了瘤胃球菌属和Oscillospira在LKO-CT显著增强(大约60 - 100%的增长)与WT-CT老鼠相比,而HFD喂养进一步增加这两个属(图7E-F)。等属Dorea,Anaeroplasma,Odoribacter和Coprococcus主要是受HFD治疗(图7G-J)。16个属中有显著的修改HFD下,4人也同样影响LKO-CT老鼠(即Sutterella,Allobaculum,瘤胃球菌属和Oscillospira)。因此,这些观测结果符合不同的代谢标记和胆汁酸概要显示LKO-CT老鼠表现出表型,这是接近HFD-fed老鼠。
删除肝细胞Myd88影响血清和肝脏代谢组
除了肠道微生物的影响和胆汁酸代谢,有证据表明,许多微生物代谢物可能导致宿主代谢。46,471 h NMR光谱进行肝门静脉的血液。代谢物作业是基于先前公布的数据。48,49
总共45代谢物在肝脏和33在血清代谢物,来自蛋白质、氨基酸、脂类、碳水化合物及微生物代谢被确定(见在线补充表S4,S5)。HFD-fed老鼠表现出较高的脂肪酸在肝脏和血清、低白蛋白水平和高水平的血清中异亮氨酸和较低水平的糖原和磷酸肌酸在肝。的数量NgydF4y2Ba乙酰基组蛋白聚糖(NAC2)在肝也增加HFD治疗。有趣的是,删除Myd88产生更多的代谢组的差异比在血清和肝脏CT比HFD之下。LKO动物的肝脏中含有低水平的乙酰乙酸盐但更高水平的谷氨酸、精氨酸。LKO动物肝脏CT显示独特的代谢组学在LKO-HFD动物不存在的特性,包括胆固醇的变化,可见总脂肪酸,丙氨酸,柠檬酸,肌酐,胆碱,三甲胺NgydF4y2Ba氧化(TMAO)、牛磺酸、脯氨酸、甘氨酸、总谷胱甘肽和酪氨酸。同样,这些动物表现出显著的低水平的支链氨基酸(异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸)和主要。
我们对数据进行了最优化分析更好地理解代谢相似性组。正如所料,宿主代谢的主要调制器的饮食类型(图8A、B),类似于我们观察到的个体代谢水平,基因缺失有轻微的影响在肝脏代谢组血清代谢物和温和的影响。作为肠道微生物群组成发现,基因缺失导致肝脏CT饮食的代谢物类似HFD-fed老鼠。进一步探索代谢组基因缺失和饮食之间的关系,我们建立了分离PLS-DA模型LKO的歧视和WT在CT或HFD治疗。
肝细胞基因88(骨髓分化的主要对策Myd88)删除改变了代谢组的血清和肝脏。PCoA基于核磁共振(NMR)代谢组的血清(A)和(B)肝脏组织。每个符号代表单个样本颜色根据组。在网上看到也补充表S4和S5。积分核磁共振代谢地区最重要的相对于野生型(WT)阀门的饮食(CT)的平均水平。(C)在血清胆固醇。(D)胆固醇在肝脏。(E)花生四烯酸在肝。(F)在肝脏亚油酸。(G)患者血清中异亮氨酸。血清中三甲胺(H)。(我)氧化三甲胺(TMAO)在肝脏。(J)总谷胱甘肽在肝脏。 (K)NgydF4y2Ba乙酰基组蛋白聚糖在肝脏。(左)l精氨酸在肝脏。HFD,高脂肪饮食;LKO,肝脏特异性基因敲除小鼠。
PLS-DA得分情节表现出更强的分离LKO WT在肝脏CT和HFD治疗比血清(分数阴谋在网上补充图S6)。我们还发现,判别代谢物的数量是在肝脏高于血清(VIP分数在网上补充图S6)。我们验证了评价模型的质量与变异系数和排列测试模型(见质量参数在线的传奇补充图S6)。按照代谢参数和微阵列,几个标记如胆固醇、长链脂肪酸,支链氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸),标记之间的氧化和还原为歧视团体(见图8有氯,在线补充图S5 S6和表S4)。代谢物识别基因删除在CT的饮食不同,多比HFD (VIP分数在网上补充图S6)。HFD组重叠LKO样品当投射到CT治疗模型分数情节(见在线补充图S6A S6B)。相反,CT与WT组重叠投射到HFD肝脏模型时得分图(见在线补充图S6E)但重叠LKO当投射到HFD血清模型(见在线补充图S6G)。
改变肥胖和非酒精性脂肪肝患者之间的分子途径
进一步调查是否具体观察啮齿动物在人类可靠,我们比较基因的表达模式在肝脏的肥胖人类接受减肥手术,可比对的身体质量指数和年龄但分层基于肝脏疾病的严重程度为非酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪肝(NASH)。22我们发现一致的结果与我们的啮齿动物模型中观察到。了解肝脏中分子过程中的差异,我们介绍了差异表达基因,确定从芯片到字符串的程序。50这个项目权重和集成信息从许多来源,包括实验库,计算预测方法和公共文本集合,因此作为metadatabase映射所有交互证据到一组通用的基因组和蛋白质。除了预测交互的图形表示,最相关的程序生成一个列表gene-to-gene交互。交互的复杂性得以成像,蓝线代表一个报道这两个基因之间的关系和线的厚度代表了信心(更多文献结果表明厚线)。网上显示了生成的结果补充图S7。基因和基因组的10个最重要的《京都议定书》百科全书(KEGG)通路和10个最重要的生物过程作为计算这个项目网上所示补充表S7。需要注意的是,大多数的观察MyD88模型也见过的病人。最重要的途径和生物过程位于正确的前部分的图。
讨论
在目前的研究中,我们证明肝细胞Myd88删除引发深刻的葡萄糖和脂类代谢的变化。在机制中,我们发现肝细胞Myd88删除修改基因的转录组剖面在炎症和代谢途径。这些修改与胆汁酸概要和指向修改的改变一些生物活性脂质和转录因子参与葡萄糖和脂类代谢(即PPAR-α,FXR LXR和STAT3)。除了这些变化,老鼠显示一个改变肠道微生物群组成和代谢组学概要文件。我们发现这种表型已经发生在正常饮食,建议一个HFD-like代谢表型,因为只有少数其他参数HFD下恶化。引人注目的是,缺乏肝MyD88没有改变食源性身体体重和脂肪量发展。这个惊人的发现不是按照其他几个研究表明小鼠大脑中缺乏MyD88或肠道食源性肥胖和胰岛素抵抗的保护。11 - 14号因此,我们的数据表明,MyD88不同导致能源监管和葡萄糖稳态取决于目标器官。这也部分解释了冲突的数量数据现有的调查全身Myd88删除和肥胖和相关疾病的影响。15 - 17日
我们发现LKO小鼠糖耐量正常CT的饮食。然而,在这种饮食的情况下,LKO老鼠已经表现出显著降低肝糖原含量,口服葡萄糖刺激后更高的胰岛素分泌。他们有一个趋势较低insulin-induced一种蛋白激酶的磷酸化,和更高的肝脏脂质含量和更高的内脏脂肪组织炎症,这表明LKO老鼠开发早期肝胰岛素抵抗和代谢改变。根据这一假设,我们发现LKO老鼠发展标志着内脏脂肪组织炎症,葡萄糖耐受不良和胰岛素抵抗在HFD喂食。更好地解释表型观察到肝Myd88删除老鼠,我们进行了转录分析微阵列的肝脏。这些发现多个基因之间明显不同LKO-CT WT-CT老鼠,这些基因同样调节或下调HFD-CT HFD-LKO老鼠,肝细胞缺乏确凿的事实Myd88触发一个HFD-like在这组小鼠表型。尽管这些数据已经通过使用微阵列方法使用一组老鼠,我们已经证实大多数基因表达的变化在同一组小鼠使用定量PCR。更重要的是,我们发现了类似的数据通过使用另外两组独立的实验,从而加强与芯片结果观察。肝胰岛素抵抗被广泛与更高的炎症有关。2,5,51,52在这项研究中,我们发现多个基因参与急性期反应,先天免疫和国防在小鼠肝细胞MyD88缺乏显著增加,这是正常的饮食和HFD条件下观察到的。令人惊讶的是,许多细胞色素P450与长链脂肪酸的新陈代谢是表达下调,除了细胞色素参与胆汁酸的合成(见图4和在线补充数据)。这些基因参与的合成生物活性脂质属于花生四烯酸和亚油酸的新陈代谢,邂逅了,het DHETs。这些脂质与糖代谢和脂类代谢相关。他们也被证明能降低肝脂肪变性和炎症27,28,30.,53并提出了胰岛素感光剂。29日,31日因此,我们的数据表明一个假定的小说分子之间的联系的先天免疫系统和合成生物活性脂质,有助于调节炎症、葡萄糖和脂质代谢。
TFactS分析发现一个强大的和显著的抑制PPAR-αLXRs小鼠缺乏肝细胞MyD88基因。这个观察的角色符合PPAR-α在控制各种脂肪酸合成途径,氧化和胆汁酸的生产。有趣的是,缺钱,可能减少LKO老鼠,PPAR-α受体激动剂。30.,53增加炎症、肝脂肪变性和胰岛素敏感性改变观察到我们的模型是按照抑制PPAR-α和观察到的表型。的差别可能对这些LXR也可能导致免疫力的调制,胆汁酸,葡萄糖和脂质代谢。按照转录分析,我们发现肝细胞Myd88删除几个胆汁酸水平深刻变化。其中,两个很好的描述胆汁酸控制FXR活动被修改,也就是说,CA和TbMCA。FXR受体激动剂CA是降低了,而FXR拮抗剂TbMCA增加LKO和HFD-fed老鼠。这个重要的发现表明,FXR LKO老鼠活动减少,因此验证链接的表型观察葡萄糖,脂质代谢和炎症(图5F I, J)。38,54在不同胆汁酸,我们发现初级胆汁酸大多是受基因缺失(CA和TbMCA),而特定的次级胆汁酸如脱氧胆酸和石胆酸增加了膳食干预在门静脉血液和盲肠的内容,从而反映了假定的肠道微生物的影响。我们的数据指向一个FXR信号在肝脏受损(图5J)因为我们发现了一个明显的减少大量的主要FXR受体激动剂和显著增加FXR拮抗剂,CA和TbMCA分别。Haeusler等55指出,相对缺乏的老鼠CA有助于糖尿病患者脂质表型通过FXR信号受损。
重要的是,我们能够将我们的一些数据中观察到小鼠human-relevant观测。除了网上不同的路径中描述补充图S7和表S7A, B,我们发现更具体地说,标记之间的判别纳什和non-NASH病人。Cyp4z1、Cyp1b1 Cyp4a22和Cyp2c19明显降低患者纳什。所有这些CYP450参与的合成生物活性脂质,属于缺钱,het, DHETs家庭。56-58因此,我们人类的结果表明,增加炎症标记物(如Saa1 Saa2,处于受控)描述纳什是独立于肥胖患者地位,也与假定的缺陷生产抗炎脂质。引人注目的是,Saa1/2处于也标记在HFD-fed LKO中高度表达的老鼠和老鼠。
然而,特定MyD88-dependent机制是否参与了表型观察到人类需要进一步调查。然而,文献的数据表明,TLR5多态性保护从肥胖易诱发糖尿病。59此外,TLR4和IRF3表达式(MyD88通路)似乎是调节在肝脏与非酒精性脂肪肝的患者,这是增加脂多糖(LPS)和脂肪酸的水平。60
按照胆汁酸,我们发现特定细菌属不同LKO和WT老鼠之间在正常食物的饮食。Sutterella和Allobaculum减少在LKO-CT老鼠和HFD-fed老鼠。值得注意的是,Allobaculum是丰富,代表了大约20%的类群在CT发现老鼠。更重要的是,大多数以前的研究已经表明,HFD喂养降低这些类群的存在,而饮食干预措施,改善宿主代谢(即胰岛素敏感性、炎症)如益生元或黄连素,增加丰富的Sutterella和Allobaculum。14,45,61年,62年勒罗伊等也表明,Allobaculum在小鼠抵抗更高HFD-induced代谢紊乱。63年相反地,大量的其他两个属(瘤胃球菌属和Oscillospira)在肝细胞增加了一倍MyD88删除老鼠,更增加了HFD喂养。有趣的是,生命起源以前的治疗改善宿主代谢在HFD喂养降低瘤胃球菌属和Oscillospira在食源性肥胖老鼠。61年肠道微生物群的其他主要的修改主要是由于饮食干预。此外,符合我们之前的研究,61年,64年我们发现改变新陈代谢和肝功能HFD喂养期间观察到与减少相关的表达Reg3g在空肠和回肠。然而,其他肠道屏障功能只有轻微影响的标记(补充图3 b, D)。
代谢组学分析血液和肝脏间表明LKO WT-CT老鼠老鼠隔离,通过化学计量学和代谢物的数量。然而,LKO老鼠表现出主要的代谢组变化下CT治疗和非常小的差异在HFD治疗。大部分的变化引起LKO CT老鼠非常类似HFD诱导的治疗。代谢产物中,有趣的是,几个判别标志之前与糖尿病和肝脏脂肪变性。长链脂肪酸,支链氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸),标记的氧化和还原(牛磺酸、肌肽和总谷胱甘肽)组之间的判别。以往的数据表明支链氨基酸概要文件之间的关联,而且其他代谢物,胰岛素抵抗和2型糖尿病的发病。65年,66年我们的结果表明,CT引导下LKO变化在许多代谢产物与支链氨基酸的合成和代谢(oxovalerates和aminobutyrates)。其中,NAC2,最近被报道为标记的炎症和与2型糖尿病和心血管疾病有关,67年影响LKO和HFD治疗。胆碱,TMA TMAO,68年也被判别之间组,与糖尿病、肝脂肪变性和此外心血管疾病。尽管所有这些元素之间的连接是极其复杂的,我们的数据显示一个新的角色的MyD88葡萄糖耐受不良的发展和肝脏脂肪变性。
总之,我们的研究指出小说连接肝先天免疫和代谢机制。我们展示,在小鼠和人类的表达不同的细胞色素参与胆汁酸和生物活性脂质合成可以作为一个标记的易感性开发与肥胖相关代谢紊乱包括2型糖尿病和纳什。
确认
作者要感谢a . Barrois a .毕弗t Pringels和h Danthinne技术援助。他们也感谢.戈培尔组织学援助。他们也感谢m . Osto帮助生成Albumin-Myd88KO小鼠和MyD88蛋白的免疫印迹。
引用
脚注
调整通知本文已经被修正,因为它第一次在网上发布。乔斯的归属van Pelt已经纠正。
推特遵循帕特里斯Cani在@MicrObesity
贡献者VG和MVH同样起到了推波助澜的作用。PDC构思,监督项目和设计实验,解释所有的结果和写的手稿。TD、惠普、VGM AE, MS, SM, LG, MVH, MMP-T, CD,,希望他能SM, FB, DM, AE和PDC获得数据。NMD, JBD提供设施和参与讨论。TD、惠普、VGM AE, MS, SM, LG, MVH, MMP-T, CD, J-BD,,希望他能SM, FB, DM, AE和PDC分析和解释数据。PDC和AE写的手稿。所有作者回顾了手稿。
经费PDC是一个研究员FRS-FNRS(昏聩de la任职),比利时。TD财政支持(1年)的农场(pour la医学基金会、法国)。惠普是一个研究员FRS-FNRS,比利时。DM支持格兰特Ministerio de隐藏y Competitividad的西班牙政府(saf2014 - 52875 - r)。AE FRS-FNRS博士后研究员,比利时。ND是资助的接受者从FNRS (CDR J.0122.15公约)和瓦隆地区(卓越项目FOOD4GUT)。从FNRS PDC是资助的接受者(J.0084.15公约,公约3.4579.11),PDR(项目de矫揉造作的约定:T.0138.14),纳(医学基金会)和弧(行动de精选的法国比利时Concertee-Communaute公约:12/17 - 047)。PDC是一个伦理委员会授予2013年开始的收件人(欧洲研究委员会,开始授予336452 - enigmo)。这项工作是支持的昏聩de la矫揉造作的Scientifique-FNRS FRFS-WELBIO在格兰特:welbio - cr - 2012 - 02 r。这部分工作是支持基金InBev-Baillet拉图(批准用于医学研究2015)。
相互竞争的利益没有宣布。
病人的同意获得的。
伦理批准所有老鼠实验是批准和执行按照当地伦理委员会的指导方针为动物保健catholique de鲁汶大学的卫生部门的监督下f . Lemaigre教授和教授JP Dehoux和根据具体协议号码2010 /伦敦/ MD / 022和2013 /伦敦/ MD / 25。住房条件是5月29日的比利时法律规定,2013年对实验动物的保护(协议号LA1230314)。
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