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摘要
客观的有牙周病史和存在针对特定口腔病原体的循环抗体与胰腺癌风险增加有关;然而，口腔微生物与胰腺癌的直接关系尚未在前瞻性研究中得到评估。我们在一项大型嵌套病例对照研究中检查了口腔菌群与胰腺癌后续风险的关系。
设计我们从美国癌症协会癌症预防研究II和国家癌症研究所前列腺、肺癌、结直肠癌和卵巢癌筛查试验两项前瞻性队列研究中选择了361例胰腺腺癌和371例匹配对照。从诊断前的口腔洗液样本中，我们使用细菌16S核糖体RNA (16S rRNA)基因测序对口腔菌群的组成进行了表征。在控制了队列和其他协变量的随机效应后，使用传统的和l1惩罚的最小绝对收缩和选择算子逻辑回归检验口腔菌群和胰腺癌风险之间的关系。
结果口腔病原体的携带，Porphyromonas gingivalis而且Aggregatibacter actinomycetemcomitans的胰腺癌风险较高(存在vs不存在的校正OR =1.60, 95% CI 1.15 ~ 2.22;OR=2.20, 95% CI 1.16 ~ 4.18)。门Fusobacteria和它的属纤毛菌属与胰腺癌风险降低相关(相对丰度增加的OR =0.94, 95% CI 0.89 ~ 0.99;OR=0.87, 95% CI 0.79 ~ 0.95)。在排除了样本收集2年内发生的病例后，与这些系统型相关的风险仍然存在，减少了本前瞻性研究中反向因果关系的可能性。
结论本研究为口腔菌群可能在胰腺癌病因学中发挥作用提供了有力的证据。
- 胰腺
来自Altmetric.com的统计
本研究的意义
关于这个问题，我们已经知道了什么?
胰腺癌是高度致命的;93%的患者在确诊后5年内死亡。
口腔健康不良和牙周病病史与胰腺癌的高风险相关。
选定牙周病原体的血清抗体水平与胰腺癌风险增加相关。
新的发现是什么?
在口腔样本中基于基因组的微生物组的直接评估中，口腔病原体的携带Porphyromonas gingivalis而且Aggregatibacter actinomycetemcomitans会增加患胰腺癌的风险
Fusobacteria和它的属纤毛菌属都能降低胰腺癌的风险
在排除了样本收集2年内发生的病例后，与这些系统型相关的风险仍然存在，减少了本前瞻性研究中反向因果关系的可能性。
在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?
与胰腺癌相关的特定口腔细菌的鉴定促进了胰腺癌病因学的科学认识。
此外，这些口腔细菌还可作为容易获得的、非侵入性的胰腺癌风险生物标志物，这有助于识别患胰腺癌的高危人群。
有针对性的预防治疗可能被开发来对抗牙周病原体和降低胰腺癌的风险。
简介
胰腺癌是高度致命的;93%的患者在确诊后5年内死亡，是美国癌症死亡的第四大原因。1人们对预防这种癌症的机会知之甚少。除了遗传因素外，胰腺炎、吸烟和超重也是危险因素，但这些只是部分解释了该疾病的风险。2 - 5为了减轻公共卫生负担，迫切需要提高关于胰腺癌病因的科学知识，并为预防措施提供指导。
人类口腔中有700多种不同的细菌，统称为口腔微生物群。6新的证据表明，口腔菌群在人体健康中发挥着重要作用，包括免疫反应、致癌物代谢和营养物质消化。7号到9号最近一系列流行病学研究表明，口腔健康状况不佳10 - 14以及针对特定口腔病原体的血液抗体15会增加患胰腺癌的风险因为口腔健康与口腔微生物状况密切相关，16我们假设口腔健康与胰腺癌之间的联系可能有潜在的微生物基础，但没有研究直接评估口腔微生物组与胰腺癌后续风险之间的关系。
我们在美国两个大型队列中进行了一项前瞻性研究，即美国癌症协会癌症预防研究(CPS) II和国家癌症研究所前列腺、肺癌、结肠直肠癌和卵巢癌(PLCO)筛查试验，以确定口腔微生物组是否与后续胰腺癌风险相关。我们通过对361例胰腺癌患者和371例对照组的诊断前口腔样本的16S核糖体RNA (16S rRNA)基因的高通量测序直接评估了口腔菌群，并比较了这些组的基线总体菌群组成、已知口腔病原体的携带和其他特定细菌类群的相对丰度。
方法
研究人群
父母军团
CPS II和PLCO队列包括大量的美国研究人群，包括储存的口腔漱口水样本、全面的人口统计信息和癌症发病率的前瞻性随访。两个队列的特征具有可比性，并且在两个队列中以类似的方式收集口腔洗液样本。对偶发癌症的研究设计和鉴定进行了详细的描述补充方法(参见在线补充方法))．
简言之，CPS II队列17包括来自美国21个州的18.4万多名参与者，年龄在50-74岁之间，他们在1992年完成了邮寄的基线饮食和生活方式问卷。每隔一年向队列成员发送随访问卷，以更新接触信息并确定癌症病例;每个随访问卷的回复率都达到了87%。癌症事件是通过医疗记录、州癌症登记或死亡证明来核实的。在2000-2002年期间，通过邮件从70004名队列成员中收集了口腔漱口液样本。18本分析包括在口腔洗液收集至2008年12月期间诊断的胰腺癌病例。
全方位的队列19是一项以人群为基础的大型随机试验，研究筛查对55-74岁男性和女性癌症相关死亡率和次要终点的影响，招募于1993年至2001年，并跟踪癌症发病率。参与者被随机分配到筛选组或控制组。在对照组(n=52 000)中收集口腔洗液样本。在随访期间，通过每年邮寄的问卷确定癌症事件(>95%随访率)，并通过医疗记录或死亡证明进行核实。该分析包括在口腔洗液收集到2010年12月期间诊断的胰腺癌病例。
嵌套病例对照研究选择
病例来自两个队列，均发生原发性胰腺腺癌(ICD-O-2编码为C25.0-C25.3, C25.7-25.9)，既往无癌症病史(非黑素瘤皮肤癌除外)，有有效的同意和诊断前的口腔漱口样本。在选择前没有癌症的队列成员中，提供有效的同意和口腔冲洗样本，通过发病率密度抽样选择队列嵌套对照。对照按队列、年龄(5岁)、性别、种族(白人、其他人种)和收集口腔漱口液的历年与病例匹配。截至2012年12月，来自CPS II的170例病例和170个对照，来自PLCO的191例病例和201个对照符合该项目的条件(见在线)补充图S1)．
测量
基于问卷的协变量评估
在登记和随访期间，两组参与者都完成了一份结构化问卷，其中包括年龄、性别、种族、体重指数(BMI)、吸烟状况、饮酒和糖尿病史等问题。我们使用从时间最接近的问卷到每个参与者的口腔漱口液样本收集的协变量。相关的队列数据被协调并转移到纽约大学医学院。
口腔冲洗样品
口腔漱口水样本最初在两个队列中收集，以代替血液样本，目的是为了获取口腔细胞DNA，用于人类基因组研究。17，19两组的参与者都被要求用10ml Scope漱口水(P&G)用力漱口，然后将痰呼入样本管。这些样本被运送到每个队列的生物仓库，制成颗粒，并在-80°C保存直到使用。18，19我们的实验使用DNA进行口腔微生物组测序;DNA在冷冻状态下高度稳定，因此我们可以使用CPS II和PLCO队列中存档的冷冻口腔漱口球。我们之前已经证明了这种样本类型对口腔微生物组测量的适用性，20.和优秀的质量控制(QC)协议。21因为我们的假设是，口腔细菌通过口腔细菌间歇性而持续地迁移到胰腺来影响胰腺癌的风险，所以含有广谱口腔细菌的漱口水样品适合检验这一假设。22
用16S rRNA基因扩增和测序测定口腔菌群
使用MoBio PowerSoil DNA分离试剂盒(Carlsbad, California, USA)从漱口水样品中提取细菌基因组DNA，并在Ahn博士实验室的MoBio Powerlyzer仪器中使用打珠法。从提取的DNA中，我们使用通用引物(347F 5 ' - ggaggcagtrrggaat ' -3 '和803R 5 ' -CTACCRGGGTATCTAATCC-3 ')扩增16S rRNA基因V3-V4区域，同时结合适配器和样本特异性条形码序列。23使用Roche 454 FLX钛焦磷酸测序系统对扩增产物进行测序。测序数据将提交到dbGaP。
微生物组数据的推导
多路复用和条形码序列进行了反卷积。使用QIIME脚本的默认参数排除了劣质序列split_libraries.py(最低平均质量分数=25，最小/最大序列长度=200/1000碱基对，无歧义碱基调用，引物序列不允许错配)。24最后用ChimeraSlayer去除嵌合序列。25从732个诊断前口腔漱口样本中，我们获得了9 354 571个高质量的16S rRNA基因序列reads(每个样本的平均序列为11 782 (SD 2799))，两组的reads数量相似(见在线)补充表S1)．过滤后的序列聚类为操作分类单元(OTUs)，识别率为97%，并使用人类口腔微生物组数据库(HOMD)进行分类。26
质量控制
实验室人员对病例/对照状态进行盲测，配对配对并排处理。所有测序批次均使用盲法阳性QC标本。CPS II样本插入22个重复序列，PLCO样本插入9个重复序列。我们之前报道过QC样品在以下QC科目中有很好的一致性:21Shannon-Wiener指数的变异系数为8.90% ~ 11.10%，Simpson指数的变异系数为0.92% ~ 4.68%，这两个指标都是研究对象内细菌群落多样性的衡量指标。阴性对照样品(无DNA模板)用于检测所有测序批次中可能的试剂和环境污染。
统计分析
通过加权和非加权UniFrac距离分析，评估口腔整体菌群组成与胰腺癌之间的关系27；这些指标评估了细菌群落对的系统发育相似性，分别考虑了OTU的相对丰度或存在/缺失。为了根据成对距离可视化分离受试者，使用前两个主坐标生成主坐标分析(PCoA)图，并根据胰腺癌状态进行标记。使用距离矩阵(PERMANOVA)的排列多变量方差分析(“Adonis”函数，纯素包，R)28的UniFrac距离用于检测总体口腔微生物组组成的差异，根据胰腺癌状况，控制潜在的混杂因素(年龄、性别、种族、BMI、吸烟状况、饮酒状况和糖尿病史)。
我们首先评估了胰腺癌风险与四种预先定义的牙周病原体(牙龈卟啉单胞菌，放线菌聚集菌，连翘单宁菌而且普氏菌媒介物)．29由于这些病原体的相对丰度较低，我们将个体分为病原体的携带者和非携带者，非携带者具有特定病原体的零序列读数。对于这些病原体携带的病例对照比较，我们使用逻辑回归模型控制队列的随机效应，30.并包括其他协变量(年龄、性别、种族、BMI、吸烟状况、饮酒状况和糖尿病史)。当我们使用条件逻辑回归模型时，结果是相似的补充结果)．
我们还广泛比较了病例和对照组之间的细菌类群(门到属)。我们将细菌门的分析限定在平均相对丰度≥0.01%的细菌门。对于较低层类群(从纲到属)，我们将分析范围限定在平均相对丰度≥0.0001%的类群。我们的分析包括5门15纲22目36科62属。为了探索每个水平(门到属)的分类单元相对丰度与胰腺癌风险的关系，我们进行了L1惩罚最小绝对收缩和选择算子(LASSO)逻辑回归31在R ' glmnet '包中实现，32遵循以前的方法来解开二甲双胍治疗对人类肠道菌群的影响。33这种方法惩罚了回归系数绝对值的和，导致了一个简约的模型，只有与结果有最强关联的类群将被选择。协变量(队列、年龄、性别、种族、BMI、吸烟状态、饮酒状态、糖尿病史)在LASSO分类选择过程中进行控制。为了评估所选分类的风险相关性，我们拟合传统逻辑回归模型，使用每个所选分类单元作为胰腺癌风险的单独预测因子，如病原体分析中所述。进一步，我们根据吸烟状况、饮酒状况和癌症诊断时间进行分层分析。采用R V.3.2.0进行分析。每个方法的进一步描述可以在网上看到补充材料的方法．
结果
病例和对照的人口学特征见表1．两个队列的大多数参与者都是白人，而CPS II队列的受试者往往比PLCO队列的受试者年龄大。两组病例和对照组在年龄、性别和种族匹配因素方面相似。在PLCO队列中，病例更可能是当前吸烟者，而在CPS II队列中，病例更可能是饮用更多酒精饮料。
我们首先检查了口腔整体菌群组成与胰腺癌后续风险的关系。根据加权UniFrac距离绘制了PCoA的第一和第二分量(见在线)补充图S2)．控制协变量的PERMANOVA分析显示，在两个队列中，关于口腔微生物组组成的总体系统发育距离，发展为胰腺癌的受试者(病例)和未发展为胰腺癌的受试者(对照组)之间(CPS II, p=0.85和PLCO, p=0.49)没有差异(见在线)补充图S2)．使用未加权UniFrac距离也得到了类似的结果(CPS II, p=0.43, PLCO, p=0.87)。
我们接下来检查了预先选择的口腔牙周病原体与随后胰腺癌风险的关系(表2)．运输p . gingivalis与较高的胰腺癌风险相关(存在vs不存在的校正OR =1.60, 95% CI 1.15 ~ 2.22)。在低携带者(低于中位数相对丰度，OR 1.47(0.96 - 2.26))和高携带者(高于中位数相对丰度，OR 1.73(1.14 - 2.63))中观察到这种关联，显示出显著的剂量-反应关系(p趋势=0.0047)。此外，这些关联在CPS II中是一致的(p趋势=0.032;在网上看到的补充表S2a)和PLCO (p趋势=0.070;在网上看到的补充表开通)．运输答:actinomycetemcomitans也与胰腺癌风险增加相关(OR 2.20(1.16 - 4.18))，但总体携带患病率较低，这种关系无法评估剂量反应。运输t .连翘而且p .媒介物与患胰腺癌的风险无关
我们对口腔细菌分类群在所有分类水平上的相对丰度进行了病例和对照的比较(表3看看网上补充图S3)．我们发现大量的Fusobacteria与胰腺癌风险降低相关(调整后的OR相对丰度增加的百分比=0.94和95% CI(0.89至0.99))，以及其属纤毛菌属(OR 0.87(0.79至0.95))。属Alloprevotella也可能与胰腺癌风险相关(OR 1.20(1.01 - 1.43))。经过进一步的调整，结果是相似的p . gingivalis而且答:actinomycetemcomitans．进一步分析发现，这两个属的风险无法与特定物种相关联。逆关联Fusobacteria而且纤毛菌属与胰腺癌风险的相关性在CPS II队列中是一致的(见在线)补充表S3a)和PLCO队列(见在线)补充表S3b)，虽然影响Alloprevotella仅限于CPS II组。
由于吸烟和饮酒与胰腺癌风险有关，而且这些因素会影响口腔微生物群落结构，我们在从不吸烟和从不吸烟以及从不饮酒的人群中检测了所选微生物与胰腺癌风险的关系(表4)．协会答:actinomycetemcomitans经常喝酒的人患胰腺癌的风险(OR 3.03(1.31 - 7.03))高于从不喝酒的人(OR 0.47(0.13 - 1.72))，尽管这些差异没有统计学意义(相互作用p =0.086)。此外，没有证据表明其他选择的系统型与胰腺癌风险的关联因吸烟或饮酒状态而不同(相互作用的p值均为>0.05)。
因为胰腺癌可能会影响口腔微生物的组成，我们还探索了按样本收集和胰腺癌诊断之间的时间分层的选定微生物的风险关联(表4)．相关风险p . gingivalis而且纤毛菌属在排除样本收集后2年内发生的病例后，仍然存在，减少了本前瞻性研究中反向因果关系的可能性。
讨论
在这第一次对口腔微生物群和胰腺癌风险的前瞻性评估中，我们证明了牙周病原体的携带p . gingivalis而且a . actinomycetemcomitans和相对丰度的减少Fusobacteria和它的属纤毛菌属与胰腺癌的后续风险有关。我们提供的证据表明，由于吸烟或其他潜在的混杂因素，这些关联不太可能存在。由于前瞻性设计，这些关联可能是由于反向因果关系的可能性被降到最低。34考虑到这些因素，我们的研究结果指出了口腔细菌在胰腺癌中的潜在病因作用。
虽然这是第一个前瞻性地通过直接测量口腔细菌来检验口腔细菌病原体和胰腺癌风险之间的联系的研究，但有广泛的流行病学证据支持这一发现。p . gingivalis而且答:actinomycetemcomitans是引起牙周病和牙齿脱落的口腔细菌中的关键病原体。35以前的研究报告，牙周病和牙齿脱落的历史与胰腺癌风险的增加有前瞻性的关联。10 - 14提供了进一步的，虽然间接的证据，证明胰腺癌风险与p . gingivalis在美国，一项大型欧洲队列研究发现，血清中抗p . gingivalis患胰腺癌的风险增加了两倍15
人们一致认为，胰腺癌与口腔健康状况不佳有关，特别是与口腔疾病的细菌驱动因素有关p . gingivalis在美国，关于胰腺癌潜在的生物学途径的几个问题仍未得到解答。首先，口腔细菌会在遥远的疾病部位繁殖吗?Swidsinski等36据报道，利用荧光原位杂交技术，在钙化性胰腺炎患者的胰管中存在密集的多物种细菌生物膜，包括口腔细菌类型;然而，是否在胰腺和口腔中发现相同克隆起源的细菌是未知的。从人类口腔传播的进一步证据是，观察到这些细菌类型存在于动脉粥样硬化斑块中，37，38远端食管组织,39阿尔茨海默症患者的大脑40在胎儿-胎盘单位。41第二，口腔细菌是如何在这些部位生长的?虽然口腔细菌传播到胰腺的途径还不确定，但通过吞咽或咀嚼后的循环系统和个人口腔卫生(刷牙和使用牙线)，口腔细菌间歇性而持续的迁移。42，43-可能到达胰腺和其他部位，正如我们之前提到的。22第三，口腔致病菌是否参与胰腺癌的发生?p . gingivalis已被证明有可能通过侵入宿主细胞和细胞因子和受体降解破坏信号通路来逃避宿主免疫系统。44，45此外,p . gingivalis而且答:actinomycetemcomitans可以启动toll样受体(TLR)信号通路，而TLR激活是动物模型胰腺癌发生的关键驱动因素，正如我们(Miller博士)最近证明的那样。46
认识到直接关系的证据p . gingivalis，相关口腔病原体和胰腺癌是初步的，也有另一种假设，胰腺和口腔疾病可能是由于平行的，独立的全身炎症过程。47免疫反应与胰腺癌的发生密切相关，一些已知的胰腺癌风险因素，包括慢性胰腺炎、吸烟和2型糖尿病，可能具有炎症成分。48良好的口腔卫生和正常的宿主免疫反应足以最大限度地减少牙周病原体，而免疫防御失败可能导致细菌载量增加和牙龈炎症的发展。49而我们的研究指出p . gingivalis而相关口腔致病菌作为胰腺癌的新危险因素，需要进一步的实验研究来建立这些关系的机制基础。
我们还发现门的相对丰度较高Fusobacteria和它的属纤毛菌属可以降低患胰腺癌的风险这一发现与一项来自欧洲队列的嵌套病例对照研究的结果一致，在该研究中，较高的口腔共生细菌的整体血液抗体水平与降低胰腺癌风险相关(包括来自Fusobacteria物种,虽然不是纤毛菌属具体来说),15但与最近对8名患者的横断面研究不一致的是，该研究发现纤毛菌属在胰腺癌患者唾液中。50Fusobacteria是厌氧的，非孢子形成的革兰氏阴性杆菌和两个主要家族，Leptotrichiaceae而且Fusobacteriaceae(见在线补充图S3；系统发育树)，经常在人类口腔中发现。6在纤毛菌属有广泛的遗传多样性，目前已确定有6种属于该属;51但是，其特点和作用纤毛菌属对人类健康的影响尚不清楚纤毛菌属被认为是一种机会性病原体，往往在存在局部或普遍的诱发因素时引起疾病，据报告与各种人类感染有关，51-53包括牙周炎、肺脓肿、肺炎、骨髓炎、心内膜炎和菌血症，后者主要发生在免疫功能低下的患者。此外,纤毛菌属引起人体免疫反应，血清抗体很常见。51有可能是免疫反应引起的纤毛菌属,而不是纤毛菌属它本身，可以防止胰腺癌的发生。54需要进一步的人类和实验研究来证实这一关系，并理清免疫反应在胰腺癌发生中的复杂作用。
我们研究的一个局限性是一次性收集漱口水样本，这降低了我们捕捉口腔微生物群和胰腺癌发展之间潜在动态关系的能力。此外，我们缺乏研究参与者牙周病状况的信息，这将使我们能够确定牙周病原体是否独立于牙周病与胰腺癌有关。研究的人群主要是白人，而且仅限于研究志愿者，这可能限制了这些研究结果对普通人群和其他高风险群体的普遍性。我们认识到，一些对照组可能患有未诊断或未报告的胰腺癌，然而，考虑到胰腺癌的低生存率和通过死亡登记确定的所有癌症死亡，这不太可能普遍。17，19最后，我们不知道研究参与者之间是否有亲属关系;这种现象，如果存在，可能已经引入了由于微生物组组成的聚集和癌症的家庭。
我们的研究有几个优势。首先，该研究是前瞻性的，使用在癌症诊断前10年收集的口腔样本，提供了确定口腔菌群与胰腺癌后续发展之间的时间关系的机会。此外，我们的嵌套病例对照研究的前瞻性设计与对照的发生率密度抽样避免了传统病例对照设计中可能出现的选择偏差。我们的研究对口腔微生物组进行了全面的16S rRNA筛选，极大地拓宽了我们对与胰腺癌相关的总体细菌结构和细菌类型丰度的了解。相对较大的样本量，包括361例胰腺癌病例和371例匹配对照，提供了足够的统计力量来检测假设的解释因素和胰腺癌风险之间的相关关联。此外，我们在整个分析过程中调整了胰腺癌的既定和可能的风险因素，包括年龄、种族、性别、吸烟状况、饮酒情况、BMI和糖尿病史。
总之，这一前瞻性嵌套病例对照研究表明p . gingivalis而且a . actinomycetemcomitans门的相对丰度降低Fusobacteria和它的属纤毛菌属，与随后胰腺癌风险的增加有关。这项研究提供了口腔菌群可能在胰腺癌病因学中起作用的证据。
参考文献
脚注
贡献者JA有权访问研究中的所有数据，并对数据的完整性和数据分析的准确性负责。研究概念和设计:XF, RBH和JA。数据采集:JW, EJJ, SMG, MPP, CCA, RS-S和RBH。分析和解释数据:XF, AVA, JW, BAP, EJJ, SMG, MPP, CCA, RS-S, GM, JR, RBH和JA。手稿起草:XF, BAP, RBH, JA。重要知识内容的关键修订手稿:XF, AVA, JW, BAP, EJJ, SMG, MPP, CCA, RS-S, GM, JR, RBH和JA。统计分析:XF、AVA、RBH、JA。获得资金:是的。
资金本杂志报道的研究部分由美国国家癌症研究所支持，奖项编号为R01CA159036, U01CA182370, R01CA164964, R03CA159414, P30CA016087, R21CA183887，并由AACR/胰腺癌行动网络支持J Ahn。美国癌症协会(ACS)资助癌症预防研究II队列的创建、维护和更新。
相互竞争的利益没有宣布。
伦理批准纽约大学。
来源和同行评审不是委托;外部同行评议。