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结肠
原始研究
结直肠癌的高维细胞分析揭示了抗肿瘤免疫的新介质
  1. 娜塔莎·德·弗里斯1，2，
  2. 文森特·范尤宁1，
  3. 玛丽克·艾瑟斯泰因3.，
  4. 塔Abdelaal4，5，
  5. 范德布雷根3.，
  6. Arantza Farina Sarasqueta3.，
  7. 艾哈迈德•马哈福兹4，5，
  8. 柯恩·C·M·J·彼得斯6，
  9. 托马斯Hollt5，7，
  10. Boudewijn P F Lelieveldt4，8，
  11. 熔化通力1，
  12. 诺埃尔·F·C·德·米兰达3.
  1. 1免疫血液学与输血，莱顿大学医学中心，莱顿、荷兰
  2. 2TECObiosciences GmbH是一家，正如、德国
  3. 3.病理，莱顿大学医学中心，莱顿，荷兰
  4. 4模式识别与生物信息学，代尔夫特理工大学，代尔夫特，荷兰
  5. 5莱顿计算生物学中心，莱顿大学医学中心，莱顿，荷兰
  6. 6手术，莱顿大学医学中心，莱顿，荷兰
  7. 7计算机图形学与可视化，代尔夫特理工大学，代尔夫特，荷兰
  8. 8LKEB放射学，莱顿大学医学中心，莱顿，荷兰
  1. 对应到Noel F C C de Miranda博士，莱顿大学医学中心病理学，荷兰莱顿;N.F.de_Miranda在{}lumc.nl

摘要

客观的全面了解抗癌免疫反应对于癌症免疫疗法的最佳应用和发展至关重要。我们通过高维分析揭示了结直肠癌(CRC)患者的局部和全身免疫谱，以提供CRC免疫结构的无偏倚特征。

设计在单细胞水平上，通过细胞质量术同时评估了31例CRC患者35个CRC组织、26个肿瘤相关淋巴结、17个结直肠健康黏膜和19个外周血样本中的36种免疫细胞标志物。此外，通过流式细胞术、单细胞rna测序和多光谱免疫荧光对肿瘤浸润淋巴细胞进行功能、转录和空间分析。

结果我们发现以前不被重视的先天淋巴细胞群(Lin- - - - - -CD7+CD127- - - - - -CD56+CD45RO+)在CRC组织中富集，并表现出细胞毒活性。这个子集显示出组织常驻(CD103+CD69+)表型，在免疫原错配修复(MMR -deficient CRCs)中最为丰富。它们在肿瘤中的存在与高度相似活化的肿瘤细胞毒性、辅助细胞和γδ T细胞的浸润相关(HLA-DR+CD38+PD-1+)表型。值得注意的是，激活的γδ T细胞几乎只在mmr缺陷的癌症中发现。在CRC和健康黏膜组织中存在未激活的肿瘤细胞毒性和γδ T细胞，但在淋巴结中没有，除了肿瘤阳性淋巴结。

结论这项工作为理解CRC的异质性和复杂的免疫景观提供了蓝图，包括以前未被重视的免疫细胞亚群的鉴定。肿瘤固有和适应性免疫细胞群的同时存在表明在治疗环境中多靶向利用其抗肿瘤特性。

  • 结肠直肠癌
  • 单细胞immunophenotyping
  • 质量血细胞计数
  • 先天淋巴细胞
  • 组织常驻记忆T细胞
  • 免疫景观
http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/

这是一篇开放获取的文章，根据创作共用署名非商业(CC BY-NC 4.0)许可证发布，该许可证允许其他人以非商业方式分发、混音、改编、在此基础上进行构建，并以不同的条款许可其衍生作品，前提是正确引用原始作品，给予适当的荣誉，任何更改都已注明，并且使用是非商业性的。看到的:http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/．

http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl-2019-318672

数据来自Altmetric.com

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    本研究的意义

    关于这个问题我们已经知道了什么?

    • 结直肠癌(CRC)免疫微环境是患者临床预后的重要决定因素，无论是在自然疾病进展的背景下，还是对免疫治疗的反应。

    • 迄今为止，大多数研究都集中在研究细胞毒性T细胞在CRC中的作用，而在很大程度上缺乏描述CRC免疫先天和适应性成分的无偏倚、全面的分析。

    • 大规模细胞术允许对多个谱系的免疫景观进行详细的单细胞表征，以表征抗肿瘤免疫细胞反应并开发新的免疫治疗策略。

    新的发现是什么?

    • 以前不被重视的先天淋巴细胞群(林- - -CD7+CD127- - - - - -CD56+CD45RO+)在CRC组织中富集，显示细胞毒活性，在错配修复(MMR)缺陷的癌症中尤其常见。

    • 肿瘤驻留免疫细胞群跨越适应性(细胞毒和辅助)和先天(γδ) T细胞区室，具有高度相似的激活(HLA-DR)+、CD38+, PD-1+)组织常驻(CD103 .;+、CD69+)内存(CD45RO+)表型在结直肠健康黏膜、肿瘤引流淋巴结和外周血中并不常见。

    • PD-1+γδ T细胞在mmr缺陷的癌症中富集，并可能在CRC患者中被PD-1检查点阻断靶向。

    • 肿瘤常驻细胞毒性和γδ T细胞的非激活对应物存在于癌症和健康的结直肠组织中，但在传统上被视为抗肿瘤免疫反应起源的关键参与者的肿瘤相关淋巴结中未被检测到。

    本研究的意义

    在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?

    • 我们的工作为CRC中适应性和先天免疫区室的抗肿瘤免疫反应提供了一个全面的蓝图。这将促进新型免疫疗法的发展，充分利用肿瘤免疫细胞群的潜力。

    简介

    随着针对CTLA-4和PD-1/PD-L1轴的治疗性抗体在癌症患者中取得临床成功，T细胞检查点封锁免疫疗法已经彻底改变了癌症治疗。这些策略重新激活抗肿瘤T细胞反应，对具有高突变负担的癌症特别有效，如黑色素瘤、非小细胞肺癌和DNA错配修复(MMR)缺陷癌症。1 - 5大约15%-20%的结直肠癌(CRCs)存在MMR缺陷，并导致肿瘤中广泛积累体细胞突变，包括DNA微卫星序列的插入和缺失。6 7与mmr精通的癌症相比，这些癌症中大量上皮内淋巴细胞的存在证实了这种理论上的免疫原性特征。8 9然而，并不是所有mmr缺陷的CRCs都对免疫检查点封锁有反应，而mmr熟练的CRCs对这种治疗不敏感。

    为了理解决定当前免疫疗法反应的机制和设计替代方法，用多维方法描述癌症微环境是至关重要的，这种方法允许同时识别和描述多个谱系的免疫细胞群。10 11大规模细胞术允许详细的单细胞特征的适应性和先天免疫景观，从而提供了一个独特的平台来区分免疫细胞亚群，可以在免疫治疗环境中利用。

    我们对31例结直肠癌患者的结直肠癌组织、肿瘤相关淋巴结、结直肠癌健康黏膜和外周血样本的免疫景观进行了深入的描述，采用高维单细胞大规模细胞术。我们揭示了在适应性和先天区室中肿瘤组织特异性免疫特征，并发现了以前未被重视的与抗肿瘤免疫有关的先天免疫细胞群，该细胞群强烈区分了免疫原性(mmr缺陷)和非免疫原性(mmr精通)CRCs。

    材料与方法

    人类的样本

    本研究处理了31例CRC患者的原发性CRC组织(n=35，其中22例mmr正常，13例mmr缺乏)与匹配的肿瘤相关淋巴结(n=26)、结肠直肠健康黏膜(n=17)和术前外周血样本(n=19)补充表S1)．除5例接受新辅助治疗的直肠癌患者外，所有患者均为treatment-naïve补充表S1)．一名患者在不同的位置被诊断为多发性原发性结直肠肿瘤(n=5)，所有这些都被纳入了这项研究(在线)补充表S1)．没有既往有炎症性肠病病史的患者被研究。为了解释肿瘤的异质性，我们进行了从管腔到肿瘤最具侵袭性区域的宏观切片，以便进一步处理。本研究由莱顿大学医学中心医学伦理委员会批准(方案P15.282)，患者提供书面知情同意书。所有标本都经过匿名处理，并按照荷兰医学科学学会联合会《荷兰人体组织适当二次使用守则》中所述的道德准则进行处理。

    组织处理和海量细胞仪抗体染色

    详细的组织处理和大规模细胞仪抗体染色可在网上补充的方法和在线补充表S2．

    海量细胞术数据分析

    在发现和验证CRC患者队列的情况下进行了大规模细胞术实验。发现队列包括19个CRC组织、17个肿瘤相关淋巴结、4个结直肠健康黏膜和9个外周血样本。单，活CD45+细胞库中的细胞被门控12(在线补充图S1)．CD45+细胞样本标记，双曲ArcSinh转化，辅因子为5，并在Cytosplore中进行降维分析。13在该小组纳入的39种抗体中，有36种在阳性和阴性细胞之间显示出明显的区别补充图S1)．主要免疫谱系(图1 a, B)在5级分层随机邻居嵌入(HSNE)分析的总体水平上进行识别14日15在CD45+所有样本数据(8.9×106使用默认的复杂度和迭代(分别为30和1000)。幼稚和记忆CD4+和CD8+/γδ T细胞，B细胞，Lin- - - - - -CD7+以数据驱动的方式分析先天淋巴样细胞(ILC)和髓系细胞，最大数量为0.5×106地标性建筑。15数据在Cytosplore中采用高斯均值漂移(GMS)聚类，所有标记的arcsinh5转换中值表达高度相似(<1)的聚类算法进行聚类。在Matlab中使用Spearman秩相关对单元频率进行分层聚类。

    Tumour-resident immune cell populations derive from multiple lineages. (A,B) HSNE embedding showing 7.5×104 landmarks representing immune cells (8.9×106 cells) isolated from CRC tissues (n=19), tumour-associated lymph nodes (n=17), colorectal healthy mucosa (n=4) and peripheral blood (n=9) samples from the discovery cohort. Colours represent the different tissue types (A) and the relative expression of indicated immune lineage markers (B). Arrows indicate the HSNE location of phenotypically distinct tumour-resident immune cell populations. (C) Example of an HSNE analysis of 7.4×102 landmarks representing 1.1×106 cells from the memory CD8+/γδ T cell compartment as identified in (A). All landmarks are selected and embedded at the next, more detailed levels showing a finer granularity of structures with 5.0×103 landmarks at level 2, to 3.0×104 landmarks at level 3 and 1.6×105 landmarks at level 4. Phenotypically distinct immune cell clusters were identified by unsupervised GMS clustering based on the density features. Black dots indicate the centroids of the identified clusters. (D,E) t-SNE embedding showing 1079 cells from CRC tissues (n=7) analysed by single-cell RNA-sequencing. Colours represent the different clusters (D) and the log-transformed expression levels of indicated immune lineage markers (E). Each dot represents a single cell. CRC, colorectal cancer; GMS, Gaussian mean shift; HSNE, hierarchical stochastic neighbour embedding; LN, lymph node; PBMC, peripheral blood mononuclear cell; t-SNE, t-distributed stochastic neighbour embedding.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    肿瘤免疫细胞群来自多个谱系。(A,B) HSNE嵌入显示7.5×104代表免疫细胞的地标(8.9×106从CRC组织(n=19)、肿瘤相关淋巴结(n=17)、结直肠健康黏膜(n=4)和外周血(n=9)样本中分离出来的细胞。颜色代表不同的组织类型(A)和免疫谱系标记的相对表达(B)。箭头表示表型上不同的肿瘤免疫细胞群的HSNE位置。(C) 7.4×10的HSNE分析示例2代表1.1×10的地标6来自记忆CD8的细胞+/γδ T细胞室，如(A)所示。所有的标志都被选择并嵌入在下一个，更详细的层次显示更细的结构粒度5.0×103.第2级的地标，到3.0×1043级和1.6×10的地标5第4级的地标。基于密度特征，采用无监督GMS聚类方法鉴定表型明显的免疫细胞簇。黑点表示已识别的星团的质心。(D,E) t-SNE包埋显示来自CRC组织(n=7)的1079个细胞，通过单细胞rna测序分析。颜色代表不同的簇(D)和指示免疫谱系标记的对数转换表达水平(E)。每个点代表一个单个细胞。结直肠癌;GMS，高斯平均位移;HSNE，层次随机近邻嵌入;LN，淋巴结;PBMC，外周血单个核细胞; t-SNE, t-distributed stochastic neighbour embedding.

    验证队列包括16个CRC组织、9个肿瘤相关淋巴结、13个结直肠健康黏膜和10个外周血样本。单，活CD45+细胞被双曲ArcSinh转化，辅助因子为5，并根据标记物表达的相似性将细胞分类为发现队列中预先识别的免疫细胞簇。为了在两个队列中获得一致的细胞簇，使用发现队列的细胞簇训练线性判别分析分类器，并用于自动预测验证队列中每个细胞的聚类标签。16为了解释技术上的差异，在每次细胞计数实验中都包含一个外周血单个核细胞(PBMC)参考样本。ComBat用于对齐PBMC参考样本和相应的患者样本，以校正批次效应。17

    单细胞RNA-sequencing

    CD45+用抗cd45 - pe抗体(克隆2D1, Thermo Fisher Scientific)和抗pe微珠(Miltenyi Biotec)对来自7个肿瘤(4个mmr缺陷和3个mmr良好)的细胞进行macs分类。单细胞rna测序文库使用Chromium Single Cell 3’Reagent Kit, V.2 Chemistry (10× Genomics)根据制造商的协议制备。文库在NovaSeq6000上使用配对端2×150 bp测序(Illumina)进行测序。根据作者的说明，使用Seurat R包进行下游分析。18简单地说，表达基因少于200个的细胞和表达基因少于3个的细胞被排除在外。此外，线粒体基因差异表达的细胞(>0.20)和基因表达数量的细胞(>5000)被排除在外。这导致了一个1079个细胞的最终数据集，共表达1972个可变基因。使用主成分分析对细胞进行预处理，使用基于图的群落检测对细胞进行聚类19并通过t分布随机邻域嵌入(t-SNE)进行可视化。20.在每个细胞簇中鉴定出差异表达基因，并在小提琴图中可视化。此外，CD45+来自一个mmr缺陷肿瘤的细胞具有大量的Lin- - - - - -CD7+CD127- - - - - -CD56+CD45RO+ILCs在FACS Aria II分选器上进行排序(BD生物科学)(在线)补充表S3)．当测序在HiSeq4000 (Illumina)上进行时，进行了类似的单细胞rna测序分析管道。使用差异表达的线粒体基因(>0.05)和表达基因的细胞(>5500)的离群百分比的截断值。在这里，我们获得了795个细胞的最终数据集，共表达1814个可变基因。

    流式细胞术

    将CRC组织的单细胞悬液(n=8个，其中5个mmr缺乏，3个mmr精通)在IMDM/ l -谷氨酰胺培养基(Lonza)中刺激，培养基中补充10%的人血清，其中含有20 ng/mL PMA (Sigma-Aldrich)和1µg/mL离子霉素(Sigma-Aldrich)，在37℃下刺激6小时。最后4 h加入10 μg/mL brefeldin A (Sigma-Aldrich)。设计了流式细胞仪抗体面板来检测ILC、T细胞和γδ T细胞群中颗粒酶B/穿孔素、IFN-γ和TNF-α的产生补充表S3)．此外，FOXP3通过ico表达+在CRC组织的单细胞悬液中评估调节性T细胞(n=4，其中1个mmr缺乏，3个mmr精通)。流式细胞仪抗体染色的详细信息可在网上查阅补充的方法．

    免疫组织化学染色

    关于MMR蛋白的免疫组化检测和CRC组织中人类白细胞抗原(HLA) I类表达的详细信息可在网上获得补充的方法．

    多光谱免疫荧光

    如前所述，将六标记免疫荧光板应用于4个mmr缺陷和4个mmr良好的结直肠肿瘤的5µm冷冻组织切片。21免疫荧光抗体染色的详细信息可在网上查阅补充的方法和在线补充表S4．对于每个肿瘤，使用Vectra 3.0自动定量病理成像系统(Perkin Elmer)在20倍放大下对5个不同的组织切片进行成像。采用Perkin Elmer公司的InForm Cell Analysis软件对染料进行图像分析和光谱分离，采用单标记免疫荧光检测定义的光谱库。使用DAPI手动训练组织分割，将图像分割为组织和“无组织”区域。目视检查所有图像的CD3数量- - - - - -细胞受体αβ- - -CD127- - -CD7+CD45RO+ILCs和细胞计数以组织面积(每毫米细胞数)归一化2)．

    统计分析

    数据以中位数±IQR范围表示。分组比较采用Mann-Whitney U检验、Kruskal-Wallis检验与Dunn 's检验进行多重比较或Friedman检验与Dunn 's检验进行多重比较(GraphPad Prism V.7)。在相关性分析中，使用Benjamini-Hochberg程序对p值进行多次检验。P<0.05为差异有统计学意义。

    结果

    肿瘤免疫细胞群来自多个谱系

    对从CRC患者的癌症和健康组织中分离的单细胞悬液进行了36种免疫细胞标志物的大规模细胞分析。为了破译它们的免疫组成，我们对所有获得CD45的细胞脾脏进行了HSNE分析+发现队列的细胞(8.9×106细胞总数)(图1一个)．基于hsne嵌入标记物的密度特征，采用无监督GMS聚类方法鉴定出7个主要的免疫细胞簇，分别对应于naive和memory(基于CD45RO和CCR7表达)CD4+和CD8+/γδ T细胞，B细胞，Lin- - - - - -CD7+ilc和髓细胞(图1 a, B)．CD4记忆+和CD8+T细胞，以及髓系细胞，是肿瘤微环境中的主要免疫谱系，而B细胞，Lin- - - - - -CD7+ILCs和幼稚CD4+和CD8+T细胞出现在较低的程度(在线补充图S2)．HSNE分析还揭示了在记忆CD4中存在几个肿瘤组织特异性，表型明显的标志+T细胞，CD8+/γδ T细胞，Lin- - - - - -CD7+ILC和髓样细胞间室(图1一个)．

    所有7个主要的免疫谱系都通过HSNE数据的分级探索进行了详细分析。以嵌入CD8内存为例+/γδ T细胞间室显示在图1 c．总的来说，对这7个主要免疫谱系的分析产生了220个不同的免疫细胞簇，其中2个由少于100个细胞组成，被排除在进一步的分析之外。所有获得性CD45+验证队列的细胞(6.6×106细胞总数)随后根据其表型将这些预先识别的免疫细胞簇分类(见方法部分)。

    同时进行了CD45单细胞rna测序+细胞来自7个CRC组织。根据转录组谱可检测到7个免疫细胞簇(图1 d)，对应B细胞，CD8+和CD4+T细胞、ilc、髓样细胞、增殖细胞和浆B细胞(图1 d, E)．

    激活CD8+和γδ T细胞是肿瘤组织特异性的，在错配修复缺陷的结直肠癌中富集

    分层聚类分析显示记忆CD8+/γδ T细胞表型以组织特异性方式聚集(图2一个)．两个CD8+CD103+PD-1+以CD161表达区分的人群(#60和# 96)存在于肿瘤组织中(占CD45的28.2%)+细胞)，在所有其他样本中并不常见(图2 b, C)，只有一个淋巴结样本在组织学检查中发现肿瘤细胞浸润(数据未显示)。这些CD8+CD103+PD-1+细胞进一步以CD69、FAS、HLA-DR和CD38共表达为特征(图2 b)．有趣的是，CD161- - - - - -CD8的对应物+CD103+PD-1+与mmr精通的肿瘤相比，T细胞在mmr缺乏的肿瘤中特别丰富(在线)补充图S3)．在CD8内+CD103+PD-1+CD38+我们观察到CD39的共表达(在线)补充图S3)，一种最近被发现可以识别肿瘤反应性CD8的标记物+T细胞。22日23日在这些肿瘤常驻细胞旁边，在肿瘤和健康的结直肠样本中都存在一个表型相似但缺乏HLA-DR、PD-1、FAS且CD38表达较低的簇(#61)(图2 b, C)，并且可以代表非激活的对应物。单细胞rna测序显示CD8+结直肠肿瘤中的T细胞表达溶细胞分子(例如，GZMA，GZMB，GZMH, PRF1） (图2 d)．此外，他们显示了免疫检查点分子的表达LAG3（图2 d)．

    Activated CD8+ and γδ T cells are tumour tissue-specific and enriched in mismatch repair-deficient colorectal cancers. (A) HSNE embedding of 1.6×105 landmarks representing the memory CD8+/γδ T cell compartment (1.1×106 cells) from the discovery cohort of patients with CRC coloured by tissue type (first plot) and relative expression of indicated markers. (B) A heatmap showing median marker expression values (left) and frequencies of selected memory CD8+/γδ T cell clusters (right). Hierarchical clustering was performed on cluster frequencies using Spearman’s rank correlation. Colour bars indicate tissue type. (C) Frequencies of selected memory CD8+/γδ T cell clusters among CRC tissues (n=35, MMR-deficient (n=13) and MMR-proficient (n=22)), colorectal healthy mucosa (n=17), tumour-associated lymph nodes (n=26) and peripheral blood (n=19) as percentage of total CD45+ cells (upper panel) and memory CD8+ or γδ T cells (lower panel). Cluster IDs correspond to the ones in (B). Bars indicate median±IQR. Each dot represents an individual sample. Data from 22 independent experiments with mass cytometry. *P<0.05, ***p<0.001, ****p<0.0001 by Kruskal-Wallis test with Dunn’s test for multiple comparisons. (D) Violin plot showing log-transformed expression levels of the top 20 differentially expressed genes within CD8+ T cells (n=217) analysed by single-cell RNA-sequencing on CD45+ cells from CRC tissues (n=7) (figure 1D). Each dot represents a single cell. CRC, colorectal cancer; HSNE, hierarchical stochastic neighbour embedding; LN, lymph node; MMR-d, mismatch repair-deficient; MMR-p, mismatch repair-proficient; PBMC, peripheral blood mononuclear cell.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    激活CD8+和γδ T细胞是肿瘤组织特异性的，在错配修复缺陷的结直肠癌中富集。(A) 1.6×10的HSNE嵌入5代表记忆CD8的地标+/γδ T细胞室(1.1×106细胞)来自CRC患者的发现队列，按组织类型着色(第一个图)和指示标记物的相对表达。(B)显示中位标记表达值(左)和所选记忆CD8频率的热图+/γδ T细胞簇(右)。采用斯皮尔曼秩相关对聚类频率进行分层聚类。色条表示组织类型。(C)所选内存CD8的频率+/γδ T细胞簇在CRC组织(n=35, mmr缺乏(n=13)和mmr精通(n=22))，结直肠健康黏膜(n=17)，肿瘤相关淋巴结(n=26)和外周血(n=19)中占总CD45的百分比+细胞(上面板)和记忆CD8+或γδ T细胞(下面板)。簇id与(B)中的簇id对应，柱状表示中位数±IQR。每个点代表一个单独的样本。数据来自22个独立的大规模细胞术实验。* P<0.05 * * * p<0.001 * * * * p<0.0001采用Kruskal-Wallis检验和Dunn 's检验进行多重比较。(D)小提琴图显示CD8中前20个差异表达基因的对数转换表达水平+用单细胞rna测序CD45分析T细胞(n=217)+结直肠癌组织细胞(n=7) (图1 d)．每个点代表一个单元格。结直肠癌;HSNE，层次随机近邻嵌入;LN，淋巴结;MMR-d，错配修复缺陷;MMR-p，错配修复熟练;PBMC，外周血单个核细胞。

    引人注目的是，TCRγδ+CD103+PD-1+人群(#99)几乎只在mmr缺陷肿瘤中发现，CD45的比例高达8.4%+细胞(图2 b, C)．这些γδ T细胞具有与CD8相似的表型+CD103+PD-1+细胞，由CD69, FAS, CD38和HLA-DR共表达定义(图2 b)．一个HLA-DR- - - - - -PD-1- - - - - -这些细胞的对应物(#97和101)也在结直肠健康粘膜和mmr成熟肿瘤中观察到，可能代表CD103的非激活形式+PD-1+肿瘤微环境中的γδ T细胞(图2 b, C)．我们通过流式细胞术分析了肿瘤驻留的γδ T细胞的细胞毒性潜能，并确定这些细胞在PMA/离子霉素刺激下能够产生IFN-γ和颗粒酶B/穿孔素(在线)补充图S4)．

    国际安全和发展理事会+活化的CD4+T细胞是主要的，肿瘤组织特异性T细胞群错配修复缺陷和修复精通结直肠癌

    接下来，我们测定了记忆CD4的细胞表面表型+T细胞在结直肠癌患者中的作用。CD4记忆+T细胞也以组织特异性的方式分布(图3一)．这里有大量的CD4细胞+国际安全和发展理事会+CD27- - - - - -细胞(#20和58)的CD45含量高达21.1%+而除肿瘤阳性淋巴结样本外，所有其他组织中均无细胞(图3 b, C)．这些人群中的一部分共表达CD161和PD-1(#58)，而另一部分这些标记为阴性，但表达高水平的CD25(#20)，表明了一种调控样表型(图3 b)．流式细胞仪分析证实FOXP3在91% ~ 98%的ICOS中表达+CD4+CD45RO+CD25+CD127低结直肠肿瘤中的T细胞(在线补充图S5)．有趣的是，ico+CD4+T细胞在mmr缺乏和mmr精通的肿瘤中均有相似程度的存在(图3 b, C)．

    ICOS+ and activated CD4+ T cells are dominant, tumour tissue-specific T cell populations in both mismatch repair-deficient and repair-proficient colorectal cancers. (A) HSNE embedding of 3.1×105 landmarks representing the memory CD4+ T cell compartment (2.0×106 cells) from the discovery cohort of patients with CRC coloured by tissue type (first plot) and relative expression of indicated markers. (B) A heatmap showing median marker expression values (left) and frequencies of selected memory CD4+ T cell clusters (right). Hierarchical clustering was performed on cluster frequencies using Spearman’s rank correlation. Colour bars indicate tissue type. (C) Frequencies of selected memory CD4+ T cell clusters among CRC tissues (n=35, MMR-deficient (n=13) and MMR-proficient (n=22)), colorectal healthy mucosa (n=17), tumour-associated lymph nodes (n=26) and peripheral blood (n=19) as percentage of total CD45+ cells (upper panel) and memory CD4+ T cells (lower panel). Cluster IDs correspond to the ones in (B). Bars indicate median±IQR. Each dot represents an individual sample. Data from 22 independent experiments with mass cytometry. *P<0.05, ***p<0.001, ****p<0.0001 by Kruskal-Wallis test with Dunn’s test for multiple comparisons. (D) Violin plot showing log-transformed expression levels of the top 20 differentially expressed genes within CD4+ T cells (n=245) analysed by single-cell RNA-sequencing on CD45+ cells from CRC tissues (n=7) (figure 1D). Each dot represents a single cell. CRC, colorectal cancer; HSNE, hierarchical stochastic neighbour embedding; LN, lymph node; MMR-d, mismatch repair-deficient; MMR-p, mismatch repair-proficient; PBMC, peripheral blood mononuclear cell .
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
    图3

    国际安全和发展理事会+活化的CD4+T细胞是主要的，肿瘤组织特异性T细胞群错配修复缺陷和修复精通结直肠癌。(A) 3.1×10的HSNE嵌入5代表记忆CD4的标志+T细胞室(2.0×106细胞)来自CRC患者的发现队列，按组织类型着色(第一个图)和指示标记物的相对表达。(B)显示中位标记物表达值(左)和所选记忆CD4频率的热图+T细胞簇(右)。采用斯皮尔曼秩相关对聚类频率进行分层聚类。色条表示组织类型。(C)选择记忆CD4的频率+T细胞簇在CRC组织(n=35, mmr缺乏(n=13)和mmr精通(n=22))，结直肠健康黏膜(n=17)，肿瘤相关淋巴结(n=26)和外周血(n=19)中占总CD45的百分比+细胞(上面板)和记忆CD4+T细胞(下图)。簇id与(B)中的簇id对应，柱状表示中位数±IQR。每个点代表一个单独的样本。数据来自22个独立的大规模细胞术实验。* P<0.05 * * * p<0.001 * * * * p<0.0001采用Kruskal-Wallis检验和Dunn 's检验进行多重比较。(D)小提琴图，显示CD4内前20个差异表达基因的对数转换表达水平+T细胞(n=245) CD45单细胞rna测序分析+结直肠癌组织细胞(n=7) (图1 d)．每个点代表一个单元格。结直肠癌;HSNE，层次随机近邻嵌入;LN，淋巴结;MMR-d，错配修复缺陷;MMR-p，错配修复熟练;PBMC，外周血单个核细胞。

    此外，CD4+CD103+PD-1+细胞(#85和86)，其构成高达23.8%的CD45+细胞也在肿瘤组织中富集(图3 b, C)．引人注目的是，这些细胞的一些特征反映了我们在CD8中的观察结果+/γδ区，包括由CD69、FAS、CD38和HLA-DR共表达定义的活化组织驻留表型(图3 b)．此外，CD161的表达也将CD4细胞细分+CD103+PD-1+T细胞分为阳性(#85)和阴性(#86)种群，其中CD161 .- - - - - -与mmr精通的肿瘤相比，mmr缺乏的肿瘤中细胞更丰富补充图S3)．与肿瘤细胞CD8相反+和γδ T细胞，在这些细胞中无法检测到未激活的对应物。

    国际安全和发展理事会时+调节性T细胞(Tregs)是肿瘤组织特异性的，ICOS- - - - - -CD25+CD127- - - - - -treg(# 13-73)在肿瘤相关淋巴结和CRC组织中均被发现(图3 b, C)．最后，免疫细胞群，如CD4+CD27+CD127+中央存储器(CCR7+CD45RO+)细胞(# 1-37)在外周血和淋巴结(图3 b, C)．的表达式国际安全和发展理事会在CD4+T细胞经单细胞rna测序证实，也显示表达TNFRSF4（OX40R),TNFRSF18（GITR） (图3 d)．t-SNE分析显示CD4共表达三种免疫治疗靶点+T细胞(在线)补充图S6)．

    CD127- - - - - -CD56+CD45RO+ILC是错配修复缺陷结直肠肿瘤中普遍存在的ILC群体

    先天淋巴间室的大量细胞分析显示存在三种不同的Lin- - - - - -CD7+细胞簇:CD127- - - - - -CD56+CD45RO- - - - - -自然杀伤(NK)细胞(90.4%)，CD127+ILCs(3.4%)和一簇CD127- - - - - -CD56+CD45RO+细胞(6.2%)(图4一)．聚类频率分析表明CD56 .昏暗的CD16明亮的NK细胞(# 33-4)在外周血中呈高频率存在，而CD56明亮的CD16昏暗的NK细胞(# 10-82)是淋巴结样本中主要的NK类型(图4 b, C)．CD127+ILCs(# 6-9)在健康黏膜、淋巴结和mmr精通的肿瘤中更丰富，并显示KLRG1- - - - - -表型，ILC3细胞的特征(图4 b, C)．引人注目的是CD127- - - - - -CD56+CD45RO+ILCs(# 87,95,92,97)在肿瘤组织中富集，占先天淋巴间室的80% (图4 b, C)．此外，它们在mmr缺陷肿瘤中尤其丰富，尤其是CD161- - - - - -人口(# 95,92和97)(图4 b, C)．CD127的- - - - - -CD56+CD45RO+最近在人胎肠中发现ILC群体为中间ILC。24与此工作一致，层次聚类定位CD127- - - - - -CD56+CD45RO+NK细胞和CD127之间的ILCs+ilc (图4 b)．我们观察到CD69和CD103在所有CD127上的共表达-CD56+CD45RO+ILCs，但CD16、ICAM-1、FAS、CD11c、CD161、CD44和HLA-DR的差异表达，表明该细胞簇内存在进一步的异质性(图4 b)．

    CD127–CD56+CD45RO+ ILCs are the prevalent ILC population in mismatch repair-deficient colorectal tumours. (A) HSNE embedding of 5.5×104 landmarks representing the innate lymphoid compartment (0.4×106 cells) from the discovery cohort of patients with CRC coloured by tissue type (first plot) and relative expression of indicated markers. (B) A heatmap showing median marker expression values (left) and frequencies of selected ILC clusters (right). Hierarchical clustering was performed on cluster frequencies using Spearman’s rank correlation. Colour bars indicate tissue type. (C) Frequencies of selected innate lymphoid clusters among CRC tissues (n=35, MMR-deficient (n=13) and MMR-proficient (n=22)), colorectal healthy mucosa (n=17), tumour-associated lymph nodes (n=26) and peripheral blood (n=19) as percentage of total CD45+ cells (upper panel) and ILCs (lower panel). Cluster IDs correspond to the ones in (B). Bars indicate median±IQR. Each dot represents an individual sample. Data from 22 independent experiments with mass cytometry. NS, not significant, *P<0.05, ****p<0.0001 by Kruskal-Wallis test with Dunn’s test for multiple comparisons. CRC, colorectal cancer; HSNE, hierarchical stochastic neighbour embedding; ILC, innate lymphoid cell; LN, lymph node; MMR-d, mismatch repair-deficient; MMR-p, mismatch repair-proficient; PBMC, peripheral blood mononuclear cell.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
    图4

    CD127- - - - - -CD56+CD45RO+ILC是错配修复缺陷结直肠肿瘤中普遍存在的ILC群体。(A) 5.5×10的HSNE嵌入4代表先天淋巴室的标志(0.4×106细胞)来自CRC患者的发现队列，按组织类型着色(第一个图)和指示标记物的相对表达。(B)显示中位标记表达值(左)和所选ILC簇频率(右)的热图。采用斯皮尔曼秩相关对聚类频率进行分层聚类。色条表示组织类型。(C) CRC组织(n=35, mmr缺乏(n=13)和mmr正常(n=22))、结直肠健康黏膜(n=17)、肿瘤相关淋巴结(n=26)和外周血(n=19)中选定的先天性淋巴簇的频率占总CD45的百分比+细胞(上图)和ilc(下图)。簇id与(B)中的簇id对应，柱状表示中位数±IQR。每个点代表一个单独的样本。数据来自22个独立的大规模细胞术实验。NS，不显著，*P<0.05 * * * * p<0.0001采用Kruskal-Wallis检验和Dunn 's检验进行多重比较。结直肠癌;HSNE，层次随机近邻嵌入;ILC，先天淋巴样细胞;LN，淋巴结;MMR-d，错配修复缺陷;MMR-p，错配修复熟练;PBMC，外周血单个核细胞。

    肿瘤内的ILCs参与抗肿瘤免疫反应

    单细胞rna测序揭示了细胞毒性分子的高表达水平(例如，gn，PRF1，GZMA，GZMB)在ILC集群(图5一个)．此外，我们观察到杀手细胞免疫球蛋白样受体(KIR)家族成员的转录本的存在，KIR2DL4（图5一个)．我们对CD45进行了额外的单细胞rna测序+来自一个mmr缺陷肿瘤的细胞具有大量的Lin- - - - - -CD7+CD127- - - - - -CD56+CD45RO+ILC(70%的ILC簇)，如大规模细胞术数据所示。在这里，我们还观察到细胞毒分子(如，gn，PRF1，GZMA)以及的表达KIR2DL4而且KIR3DL2在ILC集群中(online补充图S7)．流式细胞术证实Lin细胞表面表达KIRs- - - - - -CD7+CD127- - - - - -CD56+CD45RO+来自该肿瘤的ilc(在线补充图S7)．

    Tumour-resident ILCs are involved in the antitumour immune response. (A) Violin plot showing log-transformed expression levels of the top 20 differentially expressed genes within ILCs (n=74) analysed by single-cell RNA-sequencing on CD45+ cells from CRC tissues (n=7) (figure 1D). Each dot represents a single cell. (B) Representative plots of a MMR-deficient tumour analysed by flow cytometry without stimulation showing the distinction between CD45RO+ ILCs and CD45RA+ NK cells within Lin–CD7+CD127–CD56+ cells (first plot) and their expression of cytotoxic molecules. (C) Granzyme B/perforin expression in different immune cell populations of CRC tissues (n=6, of which 4 MMR-deficient and 2 MMR-proficient). Dot shape indicates similar tumour samples. Data from three independent experiments with flow cytometry. CRC, colorectal cancer; ILC, innate lymphoid cell; MMR-d, mismatch repair-deficient; MMR-p, mismatch repair-proficient; NK, natural killer.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5
    图5

    肿瘤内的ILCs参与抗肿瘤免疫反应。(A)小提琴图显示通过CD45上的单细胞rna测序分析的ILCs (n=74)中前20个差异表达基因的对数转换表达水平+结直肠癌组织细胞(n=7) (图1 d)．每个点代表一个单元格。(B)在没有刺激的情况下，流式细胞术分析mmr缺陷肿瘤的代表性图，显示CD45RO之间的区别+ILCs和CD45RA+Lin内的NK细胞- - - - - -CD7+CD127- - - - - -CD56+细胞(第一张图)及其细胞毒分子的表达。(C)颗粒酶B/穿孔素在CRC组织不同免疫细胞群中的表达(n=6，其中4个mmr缺乏，2个mmr精通)。圆点形状表明肿瘤样本相似。3个独立的流式细胞术实验数据。结直肠癌;ILC，先天淋巴样细胞;MMR-d，错配修复缺陷;MMR-p，错配修复熟练;朝鲜，天生的杀手。

    为了进一步研究肿瘤驻留淋巴细胞的功能特性，我们设计了流式细胞仪抗体板来分析Lin的细胞毒潜能- - - - - -CD7+CD127- - - - - -CD56+CD45RO+ilc,林- - - - - -CD7+CD127- - - - - -CD56+CD45RA+NK细胞和记忆CD8+CRC组织中的T细胞。引人注目的是，高达82.3%的未刺激CD127- - - - - -CD56+CD45RO+ILCs在肿瘤组织中显示颗粒酶B/穿孔素表达(图5 b)．与mmr精通的癌症相比，ilc中颗粒酶B/穿孔素的表达在mmr缺乏的癌症中最多(图5 c)．有趣的是，CD127的细胞毒能力- - - - - -CD56+CD45RO+ILCs在CD127中也有相似的表达- - - - - -CD56+CD45RA+NK细胞和记忆CD8+样本中的T细胞(图5 c)，表明CRC组织中存在协调的细胞毒性先天和适应性免疫反应。

    为了研究ILCs在CRCs中的空间定位，我们对4个mmr缺乏和4个mmr熟练的CRCs的冷冻组织切片应用了6色多光谱免疫荧光。同时检测CD3、TCRαβ、CD127、CD7、CD45RO和DAPI。我们鉴定出CD3- - - - - -细胞受体αβ- - - - - -CD127- - - - - -CD7+CD45RO+肿瘤中的ilc (图6 a, B)，并观察到与mmr正常的CRCs相比，mmr缺乏的CRCs中这些细胞的存在增加(图6 c)．有趣的是，CD3- - - - - -细胞受体αβ- - - - - -CD127- - - - - -CD7+CD45RO+ilc经常表现出与其CD103一致的上皮内定位+CD69+组织常驻表型(图6)．

    Higher cell density of CD127–CD45RO+ ILCs in mismatch repair-deficient colorectal cancers. (A,B) Representative image of the immunofluorescence microscopic detection of CD3–TCRαβ–CD127–CD7+CD45RO+ ILCs in a MMR-deficient tumour, showing CD3 (coloured in blue), TCRαβ (coloured in blue), CD127 (coloured in blue), CD7 (coloured in red), CD45RO (coloured in green) and DAPI (coloured in grey) as nuclear counterstain. (C) Frequencies of CD3–TCRαβ–CD127–CD7+CD45RO+ ILCs in four MMR-deficient and four MMR-proficient CRCs. *P<0.05 by Mann-Whitney U test. ILC, innate lymphoid cell; MMR-d, mismatch repair-deficient; MMR-p, mismatch repair-proficient.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图6
    图6

    CD127细胞密度增高- - - - - -CD45RO+错配修复缺陷性结直肠癌中的ILCs。(A,B)免疫荧光显微检测CD3的代表性图像- - - - - -细胞受体αβ- - - - - -CD127- - - - - -CD7+CD45RO+mmr缺陷肿瘤中的ILCs显示CD3(蓝色)、TCRαβ(蓝色)、CD127(蓝色)、CD7(红色)、CD45RO(绿色)和DAPI(灰色)作为核反染色。(C) CD3的频率- - - - - -细胞受体αβ- - - - - -CD127- - - - - -CD7+CD45RO+4个mmr缺陷crc和4个mmr熟练crc中的ilc。* P<0.05经Mann-Whitney U检验。ILC，先天淋巴样细胞;MMR-d，错配修复缺陷;MMR-p，错配修复熟练。

    免疫系统范围的分析揭示了结直肠癌中先天和适应性免疫细胞亚群之间的相关性

    最后，我们在一个免疫系统范围的分析中整合了所有主要免疫谱系(n=218)中鉴定出的免疫细胞簇，根据组织类型、MMR状态和可用的临床病理参数来表征样本。综合t-SNE分析证实了不同组织类型中独特的免疫组成，并可视化了排名前10位的免疫细胞簇，有助于样本的独特聚类模式(在线补充图S8)．未观察到与临床分期相关，而与肿瘤位置和HLA I类表达相关的差异可归因于区分mmr缺乏和mmr熟练的CRCs的特征补充图S8)．

    对每种组织类型中排名前10的独特免疫细胞簇进行的Spearman等级相关分析显示，CD127的存在之间存在很强的相关性- - - - - -CD56+CD45RO+ilc (ILC97,92,95)和CD103的存在+PD-1+细胞毒(cd8memory60,96)，辅助(cd4memory85,86)和γδ (TCRγδ99) T细胞群在mmr缺陷的CRCs (图7,在线补充表S5)．相反，mmr精通的肿瘤的特征是存在几个髓系种群(图7,在线补充表S5)．

    Immune-system-wide analysis reveals correlations between innate and adaptive immune cell subsets in colorectal cancer. Matrix showing correlations (Spearman’s ρ, see online supplementary methods) between unique top 10 ranked immune cell clusters for each tissue type (shown in online supplementary figure S8) based on cell percentages (of total CD45+ cells) corresponding to 97 samples from 31 patients with CRC. Colour and shape of the ellipses indicate the strength of the correlation. Only significant correlation coefficients are shown. Colour bars indicate tissue type. Coefficient and p values of correlations for CRC tissues are shown in online supplementary table S5. P values were adjusted for multiple testing using the Benjamini-Hochberg procedure. Data from 22 independent experiments with mass cytometry. CRC, colorectal cancer; ILC, innate lymphoid cell; LN, lymph node; MMR-d, mismatch repair-deficient; MMR-p, mismatch repair-proficient; PBMC, peripheral blood mononuclear cell.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图7
    图7

    免疫系统范围的分析揭示了结直肠癌中先天和适应性免疫细胞亚群之间的相关性。显示相关性的矩阵(斯皮尔曼ρ，见在线补充的方法)在每种组织类型中排名前10的独特免疫细胞簇之间(在线显示)补充图S8)基于细胞百分比(总CD45+细胞)对应于31例CRC患者的97个样本。椭圆的颜色和形状表明了相关性的强度。仅显示显著相关系数。色条表示组织类型。CRC组织的相关系数和p值在线显示补充表S5．使用Benjamini-Hochberg程序对P值进行多次测试调整。数据来自22个独立的大规模细胞术实验。结直肠癌;ILC，先天淋巴样细胞;LN，淋巴结;MMR-d，错配修复缺陷;MMR-p，错配修复熟练;PBMC，外周血单个核细胞。

    讨论

    我们应用大规模细胞术在肿瘤和健康组织的单细胞水平上全面分析CRCs的免疫景观。我们的分析揭示了CRC的先天性和适应性免疫区室中的肿瘤组织特异性免疫特征。免疫组织化学，流式细胞术和最近的转录组学方法提供了对肿瘤免疫景观复杂性的深入了解。25 - 29然而，在免疫组化或流式细胞术中可以同时检测的标记物的数量是有限的，大量的转录组研究不允许在细胞水平上区分表型。30 31在大规模细胞术中，可以同时在单细胞水平上分析40多个标记物，这为获得肿瘤驻留淋巴细胞的全面概述提供了独特的机会。32 33在这里，我们结合了CRC中肿瘤免疫细胞群的功能、转录和空间分析的大规模细胞计数表型。

    在先天腔室中，我们观察到以前未被重视的先天淋巴细胞群，Lin- - - - - -CD7+CD127- - - - - -CD56+CD45RO+ILCs在mmr缺陷的肿瘤中富集，并表现出细胞毒活性。原位检测ILCs证实在mmr缺陷的CRCs中有更高的细胞密度，并显示出频繁的上皮内定位。这与他们的组织常驻表型(CD103+CD69+)，并支持这些细胞在抗肿瘤免疫反应中的积极作用。ilc类似于前面对TCR的描述- - - - - -CD103+这些细胞在小鼠中被发现表达颗粒酶B。34此外，在一些人体组织中发现了一个独特的NK细胞子集，被描述为NKp44+CD103+上皮内ILC1-like。35 36与NKp44相反+CD103+ILC1和CD127- - - - - -CD56+CD45RO+这里鉴定的ilc缺乏CD122和NKp46表达(图4 b)并显示低水平的NKp44(数据未显示)。这些可变标记表达模式最有可能代表ILC子集内的额外可塑性和异质性水平。单细胞rna测序显示存在转录本KIR2DL4而且KIR3DL2在ILC簇中，这暗示了潜在的激活机制。37常见的kir配体包括HLA I类分子，38 39HLA I类表达缺失已被描述发生在大多数mmr缺陷的CRCs中。40-42人们很容易猜测CD127- - - - - -CD56+CD45RO+ilc介导的对这种hla缺失变异的细胞毒性可能有助于mmr缺陷CRCs的抗肿瘤反应，这一联系需要进一步研究。

    CD127的存在- - - - - -CD56+CD45RO+ILCs与组织常驻CD103密切相关+CD69+在mmr缺陷的CRCs中共表达激活标记HLA-DR、CD38和PD-1的γδ T细胞。研究表明，人外周血γδ T细胞可以表达PD-1，并表现出类似自然杀手的活性。43PD-1的表达及其细胞毒性潜能表明肿瘤常驻γδ T细胞在抗肿瘤免疫应答中具有积极作用，并可能作为PD-1检查点阻断的靶点。这将是进一步研究的课题。

    在适应性区室中，我们发现了显性的肿瘤组织特异性CD8+和CD4+显示高度相似的活化组织常驻表型的T细胞群。这样CD8+T细胞群在卵巢癌中有过描述，44 45肺癌46最近在黑色素瘤中，47宫颈癌48和CRC,22日23日它们的存在与临床预后的改善有关。单细胞rna测序显示CD8+结直肠肿瘤中的T细胞表现出细胞毒性，表明其具有潜在的抗肿瘤反应性。此外，我们还发现了ico的主要肿瘤组织特异性人群+CD4+T细胞。ICOS属于CD28/CTLA-4家族，是T细胞活化的共刺激分子。49激动剂激活ICOS已被提议用于抗癌治疗。50在这里，我们发现了一个CD161+PD-1+以及CD25+肿瘤居民ico的数量+CD4+T细胞。后者对应于显示高水平FOXP3表达的调节性T细胞子集，有趣的是，与CD161相比，FOXP3表达更高水平的ICOS+PD-1+同行。因此，使用ICOS激动剂也可能导致ICOS的激活+肿瘤微环境中具有抑制和调节特性的T细胞。与肿瘤细胞CD8相反+T细胞，ICOS+CD4+T细胞在mmr缺乏和mmr精通的肿瘤中均有相似程度的存在。

    我们观察到CD161+和CD161- - - - - -肿瘤细胞毒性和辅助T细胞和CD127的对应物- - - - - -CD56+CD45RO+ilc。CD161已被证明标记了组织常驻记忆CD8的一个子集+增强效应功能和细胞因子产生的T细胞。51 52在我们的研究中，CD161- - - - - -与mmr精通的CRCs相比，肿瘤驻留T细胞和ILC群体的对应物在mmr缺乏的CRCs中特别丰富。这一观察结果的功能相关性将是未来研究的主题。然而，我们观察到PD-1高细胞中CD161的表达比PD-1中位/阴性细胞中肿瘤CD8的表达增加+和CD4+T细胞群(在线补充图S9)．由于人类癌症中PD-1高水平细胞与T细胞功能障碍状态有关，53-55CD161的表达可能是这种功能状态的另一个标记。

    有趣的是，我们发现了CD103的非激活对应物+PD-1+肿瘤和健康结直肠组织中的细胞毒性和γδ T细胞。这些细胞从结肠直肠健康粘膜到肿瘤组织的动员和激活可能有利于CRC的免疫治疗。引人注目的是，虽然淋巴结传统上被视为抗肿瘤免疫反应的关键参与者，但除了肿瘤阳性淋巴结外，我们没有在淋巴结样本中检测到肿瘤常驻免疫细胞群的非激活前体。此外，我们观察到淋巴结中含有大量CD4细胞+CD25+CD127- - - - - -这表明它们可能是癌症微环境中treg的主要来源。肿瘤常驻免疫细胞群也没有反映在外周血中，尽管应该用补充方法对它们在这些组织中的存在进行深入调查。

    值得注意的是，大规模细胞仪抗体组主要用于描述T细胞、γδ T细胞和ILC区室，在未来的研究中，需要进一步探索髓系细胞和B细胞区室。此外，浸润淋巴细胞的数量和模式可受各种肿瘤特征的影响。在本研究中，我们展示了区分mmr缺陷和mmr精通的CRCs在淋巴细胞浸润方面的深刻差异。本研究中未调查的其他影响肿瘤淋巴细胞浸润的因素包括，例如，体细胞突变(新抗原)的发生和炎症性肠病的共同发生。虽然这些结果是初步性质的，但它们指出了在对CRC的免疫应答中，除了T细胞外，还有其他亚群参与，特别是ILCs和γδ T细胞。这在缺乏HLA I类表达的检查点阻断治疗反应的背景下尤其相关。56未来的方法可能会选择对这些特定谱系进行深入调查，以详细描述表型，补充本研究中使用的标记。下一步将调查这些亚群在检查点封锁治疗患者的临床环境中的参与情况。

    总之，我们发现了一种以前未被重视的先天性免疫细胞群，该细胞群在CRC组织中被特异性富集，显示出细胞毒活性，并强烈地促进了免疫原性(mmr缺乏)和非免疫原性(mmr精通)肿瘤之间的数据区分。此外，我们发现这些先天细胞的存在与肿瘤常驻CD8之间存在很强的相关性+, CD4+和在mmr缺陷肿瘤中具有激活表型的γδ T细胞，它们共同可能在肿瘤控制中发挥关键作用。

    致谢

    我们感谢M G Kallenberg-Lantrua、A M E G Voet-van den Brink和F A Holman在收集和提供结直肠癌患者样本方面的帮助;J van den Bulk用于CRC患者中PBMCs的分离;W E Corver为流式细胞分选提供帮助，R J McLaughlin为大规模细胞仪实验提供帮助，莱顿基因组技术中心为单细胞rna测序提供帮助，J Oosting帮助进行统计分析。

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    脚注

    • VU、MEI和TA的贡献相当。

    • FK和NFCCM贡献相同。

    • 贡献者NLdV构思了这项研究，进行了实验并撰写了手稿。NLdV、VvU、MEI、TA和AM对数据进行分析。AFS和KCMJP提供了患者的样本。MEI、RvdB和NFCCdM对样品进行了处理和实验。TH、VvU和BPFL开发了Cytosplore和HSNE应用。FK和NFCCdM发起并领导了该项目，并撰写了手稿。所有作者讨论了结果并对手稿进行了评论。

    • 资金作者感谢来自“对抗结直肠癌-迈克尔使命- aacr青年发病、晚期结直肠癌研究2015”(15-40-1645-DEMI)、KWF Bas Mulder奖UL(2015-7664)、ZonMw Veni奖(016.176.l44)、nwho - aes奖(12720:VANPIRE)和欧盟委员会MSCA-ITN奖(675743:ISPIC)的资助。

    • 相互竞争的利益没有宣布。

    • 伦理批准莱顿大学医学中心医学伦理委员会(P15.282议定书)。

    • 出处和同行评审不是委托;外部同行评审。

    • 患者发表同意书不是必需的。