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摘要
客观的肠道菌群与炎症性肠病(IBD)和结直肠癌(CRC)有关。Akkermansia muciniphila（答:muciniphila)是一种革兰氏阴性厌氧菌，在IBD患者的粪便菌群中选择性减少，但其在钝化结肠炎相关结直肠癌(CAC)中的致病作用和分子机制尚不确定。这项研究调查了答:muciniphila参与CAC的免疫反应。
设计小鼠给予右旋糖酐硫酸钠诱导结肠炎，随后给予偶氧甲烷，经或不经巴氏消毒建立CAC答:muciniphila或特定的外膜蛋白(Amuc_1100)处理。收集小鼠和IBD或CRC患者的粪便进行16S rRNA测序。的影响答:muciniphila观察Amuc_1100对急性结肠炎和CAC免疫应答的影响。
结果答:muciniphila在IBD患者和结肠炎或CAC小鼠中显著降低。答:muciniphila或Amuc_1100可改善结肠炎，浸润巨噬细胞和CD8减少+结肠中的细胞毒性T淋巴细胞(ctl)他们的治疗也降低了CD16/32+结肠炎小鼠脾脏和肠系膜淋巴结(MLN)中的巨噬细胞。Amuc_1100升高PD-1+脾脏中的ctl。此外,答:muciniphilaAmuc_1100通过扩大结肠和MLN中的ctl来减弱肿瘤的发生。值得注意的是，它们激活了MLN中的ctl，如TNF-α诱导和pd -1下调所示。Amuc_1100能在CT26细胞条件培养基中刺激并激活脾细胞的ctl。
结论这些数据表明巴氏消毒答:muciniphila或Amuc_1100可以通过调节ctl来钝化结肠炎和CAC。
- 结肠微生物区系
- 结肠直肠癌
- 肠道免疫
- 营养补充
- 实验性结肠炎
这是一篇开放获取的文章，根据创作共用署名非商业(CC BY-NC 4.0)许可证发布，该许可证允许其他人以非商业方式分发、混音、改编、在此基础上进行构建，并以不同的条款许可其衍生作品，前提是正确引用原始作品，给予适当的荣誉，任何更改都已注明，并且使用是非商业性的。看到的:http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/．
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本研究的意义
关于这个问题我们已经知道了什么?
丰富的Akkermansia muciniphila在炎症性肠病患者和结肠炎小鼠中显著降低。
答:muciniphila对慢性结肠炎有抗炎作用。
Amuc_1100是一种特异性的外膜蛋白答:muciniphila，在用于巴氏杀菌的温度下是稳定的，可以改善肠道屏障，并部分概括了答:muciniphila．
新的发现是什么?
答:muciniphila在患有结肠炎相关结直肠癌(CAC)的小鼠中，
答:muciniphilaAmuc_1100通过减少结肠炎小鼠的结肠浸润巨噬细胞和细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)来改善结肠炎。
答:muciniphilaAmuc_1100通过CTLs的扩增和激活来钝化CAC，这可以通过TNF-α诱导和PD-1下调来证明。
在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?
巴氏杀菌答:muciniphila或Amuc_1100有望成为预防和治疗结肠炎和结直肠癌的新策略。
简介
结直肠癌(CRC)是全球癌症相关死亡的第四大原因。1CRC的发生和发展涉及遗传、饮食、生活方式和环境因素之间复杂的相互作用。2炎症性肠病(IBD)，包括克罗恩病和溃疡性结肠炎(UC)，是CRC(即CAC)发展的已知危险因素。3 4IBD患者的炎症负担指数每增加10个单位，CRC的风险就增加2.1%。5肠道菌群组成的变化与IBD和CRC风险的增加有关。6 7梭菌属nucleatum可增加CRC细胞增殖和肿瘤发展，并通过调节自噬促进CRC化疗耐药性。8 9消化链球菌属anaerobius可促进结直肠癌发生，调节肿瘤免疫。10然而，在许多研究中，重点放在假定的微生物群的有害影响上，而它们的有益影响在某种程度上被忽视了。
Akkermansia muciniphila革兰氏阴性厌氧菌，是其中第一个也是唯一具有代表性的成员疣微菌门在人类肠道中发现的门。11日12近年来，它被认为是一种很有前途的益生菌。丰富的答:muciniphila显著减少代谢紊乱，如糖尿病和肥胖症。13 - 15补充巴氏消毒答:muciniphila改善肥胖志愿者的代谢功能障碍和肠道屏障的完整性，降低血浆脂多糖水平。16答:muciniphila诱导抗原特异性T细胞反应，在稳态中调节宿主免疫功能。17此外,答:muciniphila通过增加CCR9的招募，恢复了程序性死亡-1 (PD-1)阻断的功效+CXCR3+CD4+T淋巴细胞进入小鼠肿瘤床。18我们之前的研究表明，丰富的答:muciniphila在右旋糖酐硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎小鼠中显著降低。19答:muciniphila改善慢性结肠炎的临床参数，包括脾重、结肠炎症指数和结肠组织学评分。20.Amuc_1100是从细胞外膜分离出来的特异性蛋白答:muciniphila，在巴氏杀菌温度下仍能保持生物活性，发挥有益作用。21然而,是否答:muciniphilaAmuc_1100是否可以通过调节免疫反应来改善CAC仍不确定。
目前的研究表明答:muciniphilaUC患者和结肠炎或CAC小鼠的丰度显著降低。口服巴氏消毒补充剂答:muciniphila或Amuc_1100减轻dss诱导的结肠炎并延迟CAC的发生。答:muciniphila/Amuc_1100降低结肠巨噬细胞浸润和CD16/32比例+结肠炎小鼠脾脏和肠系膜淋巴结(MLN)中的巨噬细胞。Amuc_1100还能显著降低结肠浸润细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)和脾脏中CTLs的比例，而增加PD-1+CTL子集。对于CAC，巴氏消毒答:muciniphila/Amuc_1100治疗增加了结肠肿瘤和MLN的ctl。他们的治疗增加了TNF-α+并降低PD-1的比例+MLN中的ctl。Amuc_1100增加了体外CT26细胞条件培养基培养的原代脾细胞中ctl的比例。此外，这些ctl诱导的细胞凋亡率高于未经Amuc_1100处理的细胞。总的来说，这些结果强调了Amuc_1100在CAC中的保护作用，这是通过调节ctl的比例和功能发生的。这项研究提供了一个新的证据答:muciniphila可作为CRC患者的潜在治疗靶点。
材料与方法
培养和巴氏杀菌答:muciniphila
答:muciniphila助理主任(ATCC BAA-835) (在线补充图1A)在严格厌氧条件下，在含10mg /L再青嘌呤(氧化还原指标)的脑心灌注液中培养。在厌氧条件下，用含有1%琼脂糖的粘蛋白培养基进行平板计数，以确定有代表性的培养液CFU/mL。用含2.5%甘油的厌氧PBS将培养物稀释至最终浓度1.5×108CFU / 100µL。然后,答:muciniphila经70°C巴氏杀菌30分钟灭活。经巴氏消毒后，无活菌答:muciniphila可以在培养中恢复。
Amuc_1100的表达与纯化在体外
Amuc_1100蛋白是根据之前的研究合成的。21将his标记的Amuc_1100 PCR产物克隆至pET-26b(+)载体(GenScript, Nanjing, China)构建表达质粒(在线补充图1B和C)，通过在琼脂糖凝胶上观察Mlu I和Xho I消化片段(在线补充图1D)．质粒pET-26b-Amuc_1100转化为大肠杆菌BL21 (DE3)，在含卡那霉素(50µg/mL)的LB肉汤中培养，37℃，220 rpm震动。在LB肉汤中加入异丙基β- d -1-硫半乳糖苷(1 mM)诱导Amuc_1100在对数生长期的表达。当OD600值大于1时收获细菌，然后超声裂解，离心上清液用Ni-16NTA His·Bind (Novagen, Merck Millipore, Massachusetts, USA)纯化Amuc_1100蛋白。考马斯亮蓝染色结果(在线补充图1E)和western blotting (在线补充图1F)显示Amuc_1100蛋白在体外成功合成。Amuc_1100的浓度采用Enhanced BCA Protein Assay Kit (Beyotime Biotechnology, China)检测。Amuc_1100蛋白保存在−80°C直到使用。
病人
根据经批准的机构审查委员会协议，经患者知情同意，从江苏省中医医院(中国南京)获得UC、腺瘤(Ad)和CRC活跃患者以及健康对照组的人类粪便样本。患者的特征列于在线补充表1．所有的CRC患者都是先诊断后组织学证实的。排除标准如下:糖尿病、高血压、冠心病和有结直肠癌史。
动物实验
将6-8周龄的雄性C57BL/6J小鼠在控制湿度(50%±5%)和温度(22±2℃)的条件下，以每笼5只小鼠为一组，以12/12小时的昼夜周期饲养，免费获得食物和水。
用2%右旋糖酐硫酸钠(DSS) (MP Biomedicals，分子量35-50 kDa)连续8天(在线补充图2A)．的影响答:muciniphila在结肠炎时，对小鼠进行口服巴氏消毒答:muciniphila(1.5×108CFU)或蛋白Amuc_1100(3µg)，从DSS治疗前2周开始，在含2.5%甘油的等量无菌PBS中使用。根据我们之前的研究，每天观察体重和疾病活动指数(DAI)。22平均体重减轻、腹泻及出血的情况包括:在线补充表2)．
小鼠CAC模型建立方法为:1次腹腔注射10mg /kg氮氧甲烷(AOM)，随后给予2% DSS治疗3个周期(每个周期1周)(在线补充图3A)．来测试的影响答:muciniphila在CAC上，对小鼠进行巴氏消毒答:muciniphila(1.5×108CFU)或Amuc_1100(3µg)，从AOM注射前2周开始，直到牺牲。每天观察体重和DAI。分别于第7、10、23周采集粪便标本。分别在第8周、第12周和第23周对小鼠实施安乐死。
16S rRNA测序
从粪便样本中提取微生物DNA，在V3高变区扩增16S rRNA。测序由Illumina MiSeq (PE300)进行，数据由Majorbio Bio-pharm Biotechnology (www.i-sanger.com)．采用操作分类单位(OTUs)进行alpha多样性、丰富度和稀少度曲线分析，阈值为0.97。此外，基于OTU水平，采用Bray-Curtis进行偏最小二乘判别分析(PLS-DA)。
答:muciniphila量化
丰富的答:muciniphila采用定量PCR (qPCR)方法，参照我们的前期研究结果，对粪便样品进行定量分析。19本地化的答:muciniphila如前所述，通过荧光原位杂交(FISH)在结肠炎和CRC的肠粘膜表面进行检测。8异硫氰酸荧光素(FITC)标记答:muciniphila探针(FITC-CCTTGCGGTTGGCTTCAGAT)由GENERAY生物技术(上海，中国)合成。混合样品用蔡司LSM710共聚焦显微镜(卡尔蔡司，德国)成像。
实时定量聚合酶链反应(qPCR)
从结肠组织或CT26细胞中提取总RNA，然后用HiScript II Q RT SuperMix合成cDNA进行qPCR (Vazyme Biotech)。qPCR使用QuantStudio 5系统(Thermo Fischer Scientific)进行。qPCR引物由GENERAY biotech (Shanghai, China)设计合成，引物序列列于在线补充表3．GAPDH作为内参基因。
组织学与免疫组化(IHC)
为了进行组织学评估，结肠组织切片固定、脱水、包埋和切片(5µm)进行H&E染色。对于免疫组化检测，石蜡切片脱蜡，内源酶灭活，抗原热修复。然后用CD8a、F4/80、aved-caspase 3、γH2AX或Ki67抗体对切片进行阻断和染色，随后使用相应的二抗和Streptavidin Biotin Complex试剂盒(Boster生物工程公司，武汉，中国)。用于IHC分析的抗体的详细信息列在在线补充表4．染色切片采用Pannoramic SCAN (3DHISTECH Kft, Budapest, Hungary)扫描。采用Image-Pro-Plus软件定量IHC，并根据积分光密度和面积的比值确定平均密度。
流式细胞术(FCM)
为了分析ctl，脾细胞和mln细胞用荧光标记抗体(在线补充表4)包括固定活力染料e面粉780、PerCP-eFluor 710抗小鼠CD3、FITC大鼠抗小鼠CD8a、PE大鼠抗小鼠TNF、BD Horizon BV421仓鼠抗小鼠CD279。为了去除荧光标记抗体与Fc受体的非特异性结合，用纯化的抗小鼠CD16/32阻断Fc受体。对于TNF-α的细胞内染色，细胞用白细胞活化鸡尾酒处理12小时。然后使用Foxp3/转录因子染色缓冲试剂盒(#85-00-5523-00,eBioscience)固定、渗透和洗涤细胞。
对巨噬细胞、脾细胞和mln细胞进行荧光标记抗体染色，包括FITC大鼠抗小鼠CD11b、PE大鼠抗小鼠F4/80、PerCP-Cy5.5抗小鼠CD16/32、抗小鼠CD279 (PD-1)和FcR block。门和象限基于荧光减1 (FMO)控制。样品用BD FACSVerse (BD Biosciences)检测。数据采用FlowJo_V10软件进行分析。
原代小鼠ctl与CT26细胞共培养
CT 26细胞购自中国科学院细胞库(中国上海)，在含10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养基中培养，37℃，5% CO2湿润的气氛。分离脾细胞，在含20% FBS的新鲜rmi -1640培养基和CT26条件培养基(v/v, 1/1)中加入或不加入10µg/mL Amuc_1100培养24小时。然后用流式细胞仪对培养的脾细胞进行ctl分类。这些悬浮的CTLs和粘附的CT26细胞以1:1的比例共培养48小时。使用FITC Annexin V细胞凋亡检测试剂盒I (#556547, BD Biosciences)根据制造商说明书检测CT26细胞的凋亡率。
统计分析
采用spss22.0软件(芝加哥，伊利诺伊州，美国)进行受试者工作特征曲线(ROC)分析。采用双尾Student 's t检验比较CT26细胞的细胞凋亡率及相关基因表达。所有人类和动物数据均采用Tukey多重比较的普通单向方差分析进行分析。所有图均以均数±SEM表示。P<0.05为差异有统计学意义。
结果
丰富的答:muciniphila在患有结肠炎或结直肠癌的人和小鼠中
16S rRNA测序表明，UC与健康对照之间的群体组成可以通过PLS-DA和稀疏曲线明显分离(在线补充图4A-B)．与对照组相比，UC患者肠道菌群的多样性(Shannon指数)和丰富度(Chao, ACE和Sobs指数)显著降低(在线补充图4C-F)．测序数据显示答:muciniphila患有UC、Ad和CRC的患者(图1 a - b)，并由FISH核实(图1 c)和qPCR数据(图1 d)．ROC分析显示预测值为答:muciniphila(AUC=0.674, p=0.0007) (图1 e)．与人类数据一致，结肠炎小鼠体内微生物群的多样性和丰富度显著降低(在线补充图2C-F)．出乎意料的是，添加Amuc_1100增加了答:muciniphila在结肠炎小鼠中(在线补充图2G-I)．在不同的时间点，CAC小鼠的肠道菌群完全分离(在线补充图5A-B)．CAC小鼠肠道菌群的多样性和丰富度在早期显著降低(在线补充图5C-F)．在CAC过程中，答:muciniphila随时间而递减(图1做减法)．FISH和qPCR数据进一步证实了这一点答:muciniphila在结肠炎和CAC小鼠中丰度降低(图1设定h)．
减少答:muciniphila与人类和小鼠的结肠炎和结直肠癌有关。(A) UC、Ad、CRC患者和健康对照的粪便菌群热图。(B) UC、Ad、CRC与对照组粪便菌群在门水平上的比较。(C) FISH检测答:muciniphila在人类患者的结肠中使用fitc偶联答:muciniphila特定探针(绿色)。比例尺，50µm。(D)相对丰度的qPCR验证答:muciniphila在人类患者中。(E)的ROC曲线答:muciniphila在预测UC方面。(F) CAC小鼠不同时间点粪便菌群热图。(G)门水平CAC小鼠粪便菌群的比较。(H) FISH检测答:muciniphila在患有结肠炎和CAC的小鼠中(第23周)。(I)的相对丰度答:muciniphilaqPCR检测结肠炎小鼠和CAC小鼠(第23周)。数据以均数±均数表示，采用Tukey多重比较的普通单因素方差分析进行分析。* * * P < 0.001。广告中,腺瘤;方差分析;CAC，结肠炎相关结直肠癌;结直肠癌;UC，溃疡性结肠炎
巴氏杀菌答:muciniphila或Amuc_1100改善小鼠结肠炎
口服巴氏消毒补充剂答:muciniphila或Amuc_1100不能恢复结肠炎小鼠的体重损失(图2一个)．而Amuc_1100显著缓解DAI (图2 b)．两个巴氏杀菌答:muciniphilaAmuc_1100明显缓解结肠缩短(图2 c)及脾肿大(图2 d)．它们还减弱了近端结肠的组织学损伤，如组织学结构的丧失，上皮屏障的破坏和明显的炎症细胞浸润(图2 e)．免疫组化分析显示经巴氏消毒答:muciniphila或Amuc_1100降低了切割caspase 3个阳性细胞的数量(图2 f)．治疗后的结肠炎小鼠结肠qPCR分析显示TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6、IL-18和IL-33显著下调(图2 g)．总的来说，这些结果表明巴氏消毒处理答:muciniphila或Amuc_1100可改善dss诱导的急性结肠炎。
补充巴氏消毒答:muciniphila或Amuc_1100改善DSS所致结肠炎。(A)权重变化表示为起始权重的平均变化量。(B) DAI， (C)结肠长度，(D)脾脏重量。(E) H&E染色结肠组织代表性组织学图像。比例尺，200µm。(F)近端结肠中裂解caspase 3的免疫组化染色和定量。比例尺，50µm。(G)结肠组织中促炎细胞因子的mRNA表达，包括TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6、IL-18和IL-33。数据以均数±SEM表示，采用Tukey多重比较的普通单向方差分析进行分析。*P<0.05， ** P< 0.01， *** P< 0.001;# #p < 0.01,# # #p<0.001，与DSS组比较。方差分析;DAI，疾病活动指数;DSS，葡聚糖硫酸钠;包含IHC,免疫组织化学。
通过补充Amuc_1100或巴氏消毒，减少脾脏和MLN中ctl和巨噬细胞的浸润答:muciniphila
调查…的影响答:muciniphila流式细胞术(FCM)检测小鼠外周血ctl和巨噬细胞的比例及PD-1和TNF-α的表达(在线补充图6)．结肠炎小鼠脾脏中ctl的比例明显升高(图3一)．口服Amuc_1100可显著降低ctl的比例(图3一)，并挽救了PD-1的降低百分比+脾脏中的ctl (图3 b)．然而,答:muciniphilaAmuc_1100不能恢复CD4的降低+T细胞(在线补充图7A)．它们抑制了促炎CD16/32的升高+巨噬细胞(CD11b+F4/80+)在脾脏(图3 c)．
补充巴氏消毒答:muciniphila或Amuc_1100抑制CD8的活化和浸润+结肠炎小鼠的ctl和巨噬细胞。ctl (A)和PD1的代表性FCM分析和定量+脾脏中的ctl (B)。CD16/32的代表性FCM分析和定量+巨噬细胞(CD11b+F4/80+) (C)和PD1+CD16/32+脾脏中的巨噬细胞(D)。比例尺，50µm。CD16/32的代表性FCM分析和定量+巨噬细胞(E)和PD1+CD16/32+巨噬细胞(F)在MLN。免疫组化染色近端结肠CD8a (G)和F4/80 (H)。数据以均数±SEM表示，并采用普通的单向方差分析Tukey 's多重比较进行分析。*P<0.05， ** P< 0.01， *** P< 0.001;＃p < 0.05,# #p < 0.01,# # #p<0.001，与DSS组比较。方差分析;CTL，细胞毒性T淋巴细胞;DSS，葡聚糖硫酸钠;流式细胞术;包含IHC,免疫组织化学;MLN，肠系膜淋巴结。
ctl的比例(在线补充图7B)和PD-1+ctl (在线补充图7C)在经巴氏消毒或未经巴氏消毒的MLN中均无变化答:muciniphila或Amuc_1100处理。然而，他们的治疗抑制了CD16/32的增加+巨噬细胞(图3 e)，但不影响PD-1在CD16/32上的表达+脾脏中的巨噬细胞(图3 d)或MLN (图3 f)．此外，它们减轻了ctl的结肠浸润(图3 g)和巨噬细胞(图3 h)．
补充巴氏消毒答:muciniphila或Amuc_1100改善CAC临床症状
无论是巴氏杀菌答:muciniphilaAmuc_1100也不能抵消在CAC小鼠中观察到的体重减轻(图4一)．然而，它们显著降低了DAI，特别是在第23周(图4 b)．巴氏杀菌答:muciniphila或Amuc_1100没有改变冒号长度(在线补充图3B)，而它们的治疗可以减轻CAC小鼠的脾肿大(图4 c)．此外，他们的治疗延缓了肿瘤的形成(图4 d、G而且在线补充图3C)，并在第12周时减少肿瘤数量和面积(图4 e-f)．它们的处理也降低了γH2AX (图4 h)和cleaved caspase 3 (图4我这表明它们可以减弱CAC小鼠双链DNA断裂和随后的细胞凋亡。此外，经巴氏消毒后，Ki67的表达减少答:muciniphilaAmuc_1100处理(图4 j)，表明它们也可能抑制细胞增殖。总的来说，这些数据表明口服巴氏消毒答:muciniphila或Amuc_1100可通过减弱DNA损伤、细胞凋亡和异常增殖抑制AOM/ dss诱导的肿瘤发生。
补充巴氏消毒答:muciniphila或azoxymethane (AOM)/DSS诱导Amuc_1100钝化成瘤作用。(A)权重变化表示为起始权重的平均变化量。分析(B) DAI， (C)脾脏重量，(D)肿瘤发展，数量(E)和肿瘤面积(F)。(G) H&E染色结肠组织代表性组织学图像。比例尺，200µm。IHC染色并定量近端结肠γH2AX(8周，H)、aved-caspase 3(23周，I)和Ki67(23周，J)。比例尺，50µm。数据以均数±均数表示，采用Tukey多重比较的普通单因素方差分析进行分析。*P<0.05， ** P< 0.01， *** P< 0.001;＃p < 0.05,# #p < 0.01,# # #与AOM+DSS组比较，p<0.001。方差分析;DAI，疾病活动指数;DSS，葡聚糖硫酸钠;包含IHC,免疫组织化学。
巴氏杀菌答:muciniphila或Amuc_1100调节CAC小鼠的免疫反应
研究表明，ctl在人类肿瘤微环境中进行侵袭性增殖、克隆和动态分化。23CTLs在MLN中的比例仅在第23周后才显著增加(图5 b而且在线补充图8B)，而PD-1的比例+到第12周时ctl显著增加(图5 a, C)．巴氏杀菌答:muciniphilaAmuc_1100显著增强了CAC小鼠MLN中ctl的增加(图5 a - b)，而他们降低了PD-1的百分比+第8周开始的ctl (图5 c)．肿瘤坏死因子-α+在治疗8周和12周后，ctl细胞亚群百分比显著升高(图5 a, D而且在线补充图8A)．脾脏经巴氏消毒答:muciniphilaAmuc_1100显著降低PD-1的比例+第8周的ctl (在线补充图9)．此外，它们的治疗抑制了CAC小鼠中ctl的结肠浸润(图5 e)．这些数据表明巴氏消毒答:muciniphilaAmuc_1100增加了CTLs的比例，增强了其对CAC小鼠的细胞毒作用。
巴氏杀菌答:muciniphila或Amuc_1100增强了CAC小鼠ctl的激活。ctl、PD-1的流式细胞术分析+ctl和TNF-α+第12周MLN中的ctl (A)。ctl的定量(B)， PD-1+ctl (C)和TNF-α ctl (D)分别在第8周、第12周和第23周。(E)结肠内CD8a的免疫组化染色。比例尺，50µm。数据以均数±SEM表示，采用Tukey多重比较的普通单向方差分析进行分析。* * * P < 0.05, P < 0.01, * * * P < 0.001,与控制;＃p < 0.05,# #p < 0.01,# # #与AOM+DSS组比较，p<0.001。方差分析;急性中耳炎,azoxymethane;CAC，结肠炎相关结直肠癌;CTL，细胞毒性T淋巴细胞;DSS，葡聚糖硫酸钠;流式细胞术;包含IHC,免疫组织化学。
巴氏杀菌答:muciniphilaAmuc_1100自第8周起抑制CAC小鼠脾脏巨噬细胞的增加百分比(图6 a, B)，而对巨噬细胞的比例没有影响(在线补充图10A)或CD16/32+巨噬细胞在MLN (在线补充图10B)．然而，它们的处理显著抑制了PD-1在CD16/32上的表达+巨噬细胞在MLN和脾脏(图4 b而且在线补充图10C)，并减轻巨噬细胞的结肠浸润(图6 c)．
经巴氏杀菌处理的CAC小鼠巨噬细胞比例和浸润减少答:muciniphila或Amuc_1100。(A)流式细胞术分析和(B)巨噬细胞(CD11b)定量+F4/80+)在第8周、第12周和第23周脾脏淋巴细胞中表达。(C)结肠中F4/80的免疫组化。比例尺，50 μm。数据以均数±均数表示，采用Tukey多重比较的普通单因素方差分析进行分析。* * * P < 0.05, P < 0.01, * * * P < 0.001,与控制;＃p < 0.05,# #p < 0.01,# # #p<0.0001，与AOM+DSS组比较。方差分析;急性中耳炎,azoxymethane;CAC，结肠炎相关结直肠癌;DSS，葡聚糖硫酸钠;流式细胞术;包含IHC,免疫组织化学。
Amuc_1100诱导CT26细胞条件培养基培养的ctl活化
为了探索Amuc_1100潜在的抗肿瘤机制，从正常小鼠脾脏中分离出CTLs，并与CT26细胞体外共培养(图7)．Amuc_1100显著增加CT26细胞条件培养基培养的原代脾细胞中ctl的比例(图7 b)．Amuc_1100预处理的纯化CT26细胞在条件培养基中的凋亡显著增加(图7 c)．共培养CT26细胞的qPCR结果显示Bcl-2下调(图7 d)和caspase 3的上调(图7 e)．肿瘤内切割caspase 3的表达(图7 f)在经巴氏消毒处理的CAC小鼠中增加答:muciniphila或Amuc_1100。
Amuc_1100在CT26细胞条件培养基中诱导CTL活化。(A) CTL分离和与CT26细胞共培养的示意图。(B)用含有或不含Amuc_1100的CT26细胞条件培养基培养72小时的脾细胞中ctl的比例。(C) CT26细胞与分选CTLs共培养48小时的凋亡率(n=3)。qPCR检测CT26细胞中Bcl-2 (D)和caspase 3 (E) mRNA的表达。(F)免疫组化分析CAC小鼠瘤内切割caspase 3。比例尺，20µm。数据以均数±SEM表示，采用t检验进行分析。*P<0.05， ** P< 0.01， *** P< 0.001。CAC，结肠炎相关结直肠癌; CTL, cytotoxic T lymphocyte; IHC, immunohistochemistry.
讨论
肠道内稳态的维持依赖于微生物群、肠上皮和宿主免疫系统之间的协调相互作用。24在这项研究中，UC患者粪便中的微生物群组成与健康个体不同。然而，由于个体间差异和样本量小，在Ad或CAC患者中没有观察到微生物群落结构的显著变化。在结肠炎和CAC小鼠中，丰富度和多样性显著降低。与之前的研究一致，12丰富的答:muciniphilaUC和dss诱导的结肠炎小鼠的炎症反应减少。的作用答:muciniphila仍不确定。尽管如此,答:muciniphila之前与人类和小鼠CRC负担的增加有关，25日- 27日在本研究中，在小鼠和CRC患者的CAC进展过程中，它都有所下降。因此，本研究的目的是探索是否和如何答:muciniphila抑制结直肠肿瘤发生。最近的研究表明，两者都经过巴氏消毒答:muciniphilaAmuc_1100(巴氏杀菌后稳定)可以部分概括活菌的有益作用。16日21因此，它们被用来验证的作用答:muciniphila急性结肠炎和CAC的发展
的答:muciniphilaATCC BAA-835型菌株和小鼠菌株(指定为139)对慢性结肠炎具有抗炎作用。20.之前的研究也揭示了维生素d的保护作用答:muciniphila-来源的细胞外囊泡在dss诱导的结肠炎。28在本研究中，口服巴氏消毒答:muciniphila或Amuc_1100显著改善急性结肠炎，包括DAI、脾肿大、结肠缩短和组织学损伤。答:muciniphila已知对改善肥胖和糖尿病患者的宿主代谢功能很重要。29因此，似乎是合理的答:muciniphila和Amuc_1100未能恢复结肠炎或CAC小鼠中观察到的体重减轻。他们的治疗也抑制了促炎细胞因子的结肠表达，如IFN-γ， TNF-α和IL-1β。然而，BAA-835菌株之前未能促进gnotobioil -10缺陷小鼠的短期肠道炎症。30.口服巴氏消毒补充剂答:muciniphila或Amuc_1100不能塑造结肠炎小鼠的微生物群落，但它们确实提高了细菌的丰度答:muciniphila．这种保护作用似乎取决于微生物群。CTL正在成为人类IBD的主要介质，这也与CTL分析有关。31对结肠炎发展的主要贡献是由细胞因子的产生，增殖，小鼠上皮内隔间中的ctl介导的。32Amuc_1100显著降低了ctl在脾脏和结肠浸润的比例。此外，Amuc_1100通过上调PD-1抑制ctl的激活。总之，Amuc_1100可以通过调节CTLs的数量和激活来改善dss诱导的结肠炎。
除了对结肠炎的作用外，这项研究还发现Amuc_1100在CAC中引起了抗肿瘤免疫反应。口服巴氏消毒补充剂答:muciniphila或Amuc_1100延缓肿瘤形成，减少肿瘤数量和大小。作为一种已知的基因毒性应激，AOM可引起DNA损伤，进而引起细胞凋亡和异常增殖。33这项研究揭示了巴氏消毒答:muciniphilaAmuc_1100抑制结肠组织中γH2AX和Ki67的表达，并在体外和体内诱导肿瘤细胞凋亡。ctl被认为是抗肿瘤免疫的主要细胞介质和CRC的预后标志物。34-36巴氏杀菌答:muciniphilaAmuc_1100显著提高了MLN和结肠中的CTL百分比。有趣的是，它们还上调了ctl中的TNF-α，这加剧了肿瘤细胞的凋亡。37 38结肠炎和CAC不同的微环境可能部分解释了这种差异。答:muciniphilaAmuc_1100可能通过增加肿瘤细胞中特定趋化因子的分泌来促进ctl的募集，这些趋化因子由于MHCI上调而被激活。39然而，潜在的机制需要进一步研究。
针对PD-1/程序性死亡配体1 (PD-L1)轴的免疫检查点抑制剂被广泛使用。40 41患者共生菌群的组成与抗pd -1单克隆抗体的治疗效果有关。42口服灌胃答:muciniphila增加了PD-1阻断剂对肿瘤生长的抑制作用。18PD-1在结肠和回肠黏膜CD4、CD8αβ和TCRαβ细胞上表达上调，与CAC进展相关。43虽然大多数高ctl浸润的CRCs具有良好的疗效，但同时高PD-L1基因表达的CRCs临床疗效较差。44在本研究中，PD-1的比例+巴氏消毒后CAC小鼠的ctl显著减少答:muciniphila或Amuc_1100。与高表达PD-1的T细胞相比，低表达PD-1的T细胞产生较高水平的IFN-γ和TNF-α，这可能反过来触发细胞凋亡并诱导肿瘤微环境中PD-L1的表达，从而形成T细胞PD-1状态。45
巨噬细胞是肠道免疫稳态的把关人，M1巨噬细胞引起感染和组织损伤的快速促炎反应。46个47在本研究中，结肠炎被钝化答:muciniphila或Amuc_1100通过减少巨噬细胞的比例，特别是CD16/32+巨噬细胞(M1)。既往研究表明，ctl在炎症过程中可促进巨噬细胞的招募和激活。48因此,答:muciniphila或Amuc_1100可能通过减少ctl抑制巨噬细胞的招募和激活。相反，它们也可以通过增加ctl抑制巨噬细胞的激活。临床和实验证据表明，肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)促进癌症的发生和发展。CAC小鼠脾脏巨噬细胞比例及结肠巨噬细胞浸润明显增加。答:muciniphila或Amuc_1100治疗减少了这些巨噬细胞的数量，但没有破坏它们CD16/32或PD-1的表达，这表明它们的抗肿瘤能力与巨噬细胞的激活无关。最近的一项研究报道，TAMs可以通过CXCL9的产生促进CTL肿瘤的浸润。49因此,答:muciniphila或Amuc_1100也可能抑制巨噬细胞功能，如趋化因子分泌，并增强ctl的肿瘤浸润。然而，巨噬细胞与ctl的相互作用答:muciniphila或Amuc_1100治疗尚不清楚。
这项工作揭示了一个关键的作用答:muciniphila作为肠道内稳态的关键调节器。巴氏杀菌答:muciniphila或Amuc_1100可以重塑免疫景观，以钝化炎症相关的肿瘤发生。因此,答:muciniphila可能是结肠炎和结直肠癌的一个有前途的治疗靶点。
致谢
作者要感谢使这项研究成为可能的参与者。我们也感谢Majorbio Bio-pharm生物技术有限公司提供的16S测序和数据分析平台(www.i-sanger.com)。
参考文献
脚注
LW、LT和YF的贡献相当。
贡献者LW, LT和YF进行了大部分实验并分析了数据。SZ、MH、CZ提供临床样本并进行数据分析。GY和JZ帮助进行动物实验和分析。SC, QW, ZZ和LL设计实验并分析数据。ZZ和LL指导了这项研究，并根据合著者的意见撰写了手稿。
资金国家自然科学基金项目(81973096和81502801)和江苏省研究生研究与实践创新计划项目(KYCX18_1513)资助。
相互竞争的利益没有宣布。
患者和公众参与患者和/或公众没有参与本研究的设计、实施、报告或传播计划。
患者发表同意书不是必需的。
伦理批准所有实验程序均获得南京医科大学动物伦理与福利委员会(IACUC-1812031)批准。
出处和同行评审不是委托;外部同行评审。
数据可用性声明数据可以在一个公共的、开放访问的存储库中获得。所有与研究相关的数据都包含在文章中或作为补充信息上传。人类和小鼠粪便的16S测序数据已提交给NCBI (Sequence Read Archive, SRA)。本BioProject登录号为PRJNA596333 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA596333)．