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摘要
客观的衰老伴随着多种身体功能的退化和炎症，这些共同导致虚弱。我们和其他人已经证明，虚弱与肠道菌群的改变共同变化，并在某种程度上加速了食用限制多样性的饮食。地中海饮食(MedDiet)与健康有关。在NU-AGE项目中，我们调查了1年的MedDiet干预是否可以改变肠道菌群和减少虚弱。
设计我们对来自5个欧洲国家(英国、法国、荷兰、意大利和波兰)的612名非体弱或前期体弱受试者的肠道菌群进行了分析，研究对象为老年受试者实施为期12个月的MedDiet干预(nuage饮食)前后。
结果坚持饮食与特定微生物组的改变有关。通过坚持饮食而富集的类群与降低虚弱程度和改善认知功能的几个标志物呈正相关，与包括c反应蛋白和白细胞介素-17在内的炎症标志物呈负相关。对微生物代谢物图谱的分析表明，饮食调节的微生物组的变化与短链/分支链脂肪酸产量的增加和次生胆汁酸、对甲酚、乙醇和二氧化碳产量的降低有关。微生物群落生态系统网络分析表明，对MedDiet干预反应积极的细菌类群在网络中处于关键交互位置，而与脆弱相关的类群在网络中处于外围。
结论总的来说，我们的研究结果支持了通过改善习惯性饮食来调节肠道菌群的可行性，从而有可能促进更健康的衰老。
- 饮食
- 肠道细菌菌群
- 老化
- 炎症
- 肠道细菌
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本研究的意义
关于这个主题我们已经知道了什么?
衰老与多种身体功能的恶化和炎症有关，导致虚弱的开始。
虚弱的开始与肠道菌群的变化有关，这与限制性的多样性饮食有关。
地中海饮食制度与健康呈正相关。
新的发现是什么?
坚持地中海饮食导致特定类群的丰富程度增加，这些类群与减轻虚弱和改善认知功能的几个标记物呈正相关，与c反应蛋白和白细胞介素-17等炎症标记物呈负相关。
这些关联与宿主因素如年龄和体重指数无关。
推测的微生物代谢物图谱显示，饮食调节的微生物组的变化与短链/分支链脂肪酸产量的增加和次生胆汁酸、对甲酚、乙醇和二氧化碳产量的降低有关。
微生物群落生态系统网络分析表明，由于MedDiet干预而富集的细菌类群在网络中占据着关键交互位置，而与脆弱相关的类群在网络中处于边缘位置。
本研究的意义
在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?
我们的研究结果支持了通过改变习惯性饮食来调节肠道菌群的可行性，从而有可能促进更健康的衰老。
我们的研究结果还提供了一个候选类群的简短列表，可以进一步研究作为活体生物治疗剂直接给老年受试者以减少衰弱的发作。
简介
伴随衰老而来的虚弱包括多个生理系统的衰竭1以及先天免疫炎症反应的持续激活2虚弱可能包括慢性低级别炎症(即炎症老化)的发展，3.丧失认知功能，4sarcopenia5以及糖尿病和动脉粥样硬化等慢性疾病的发展。3.改变饮食模式，如采用地中海饮食(MedDiet)已被建议作为解决虚弱的主要治疗策略。6MedDiet养生法的特点是多吃蔬菜、豆类、水果、坚果、橄榄油和鱼，少吃红肉、乳制品和饱和脂肪。7坚持MedDiet与降低死亡率、提高抗氧化活性、减少几种疾病的发病率以及减少炎症有关。8一些研究表明，增加对MedDiet的坚持与减少虚弱有关。9除了与疾病的负相关外，更高水平的坚持MedDiet还与肠道微生物组组成的有益变化有关，变形菌丰度的减少伴随着短链脂肪酸产量的增加。10 11在全球范围内，大多数老年人不吃MedDiet，事实上，老年人保健的一个主要挑战是限制饮食的消费，这与肠道微生物群的低多样性有关，特别是在长期住院护理的受试者中。12日13在之前的工作中，我们使用精细的生物信息学(双聚类)分析来识别在从高多样性微生物组健康受试者向低多样性脆弱受试者过渡的增量阶段中丢失的特定微生物类群。14在最近完成的一项为期6个月的膳食干预中，老年人每天补充多达20克的五种益生元，多种肠道微生物类群对益生元补充剂有反应，15但总体菌群多样性没有变化，炎症标志物减少的趋势没有达到总体的统计意义。因此，我们认为需要更有力的饮食干预。
NU-AGE饮食干预项目旨在研究在1200多名65-79岁的老年人中实施定制MedDiet 12个月的效果，16分布在五个不同的国家(波兰、荷兰、英国、法国和意大利)。这项研究的基线和干预后的结果报告了测量代谢物水平和身体成分数据的性别和国家差异。在nuage MedDiet的坚持与整体认知能力和情景记忆的增强之间观察到显著的关联。17此外，高依从性已被证明可以降低骨质疏松患者的骨质流失率18为了提高先天免疫功能，19血压和动脉硬化。20.在目前的研究中，我们分析了NU-AGE MedDiet对NU-AGE试验参与者肠道微生物群落的影响，该试验包括612名个体(289名对照组(145名男性和144名女性)和323名NU-AGE MedDiet组(141名男性和182名女性)。多种有益结果与微生物组的改变相关。
方法
研究参与者和饮食干预
NU-AGE研究是一项为期1年的随机、多中心、单盲对照试验(在clinicaltrials.gov注册)。NCT01754012)．关于招募参与者和饮食干预的细节以及与人体测量学、虚弱和认知反应相对应的元数据的收集已经在前面描述过。17日21在线补充表1按国家提供参与者的描述性统计数据，其在基线和最终时间点的配对微生物组概况均可获得。
生物信息和生物统计分析
在线补充文本3提供了用于生物信息学和扩增子序列数据的多元统计分析的方法的完整描述。这包括对序列读取的预处理，25嵌合体的鉴定和清除，26日27日业务分类单位(OTUs)的分类，28 29基于机器学习的微生物类群识别与膳食干预相关30.(描述的在线补充图1)、利用迭代二元双聚类(iBBiG)方法识别分类模块;31饮食依从性和饮食相关的分类标记与饮食的各种成分以及与虚弱和炎症标记的关联分析，meddiet相关的微生物组指数的计算(如图所示)在线补充图2)和这些指标与膳食成分、炎症和虚弱的关联分析，根据每个样本的物种丰度和先前策划的实验验证的物种-代谢产物联系的映射，获得推测的代谢物概况32 33以及共现网络的生成和可视化以及中心性度量的计算在线补充文本3)．30 34
结果
基线时，饮食和微生物组概况在各国之间共同变化和不同
总体而言，在基线和1年(称为“最终”)时间点收集了612个个体(控制组和干预组)的配对微生物组数据。虽然各国对照组和干预组中个体的年龄范围相似，但干预组中女性的代表性略高(Fisher检验p<0.12;在线补充表1)．主坐标分析(PCoA)表明，在基线水平上，国家之间的饮食差异显著，表现为三个不同的亚组(图1一个) (PERMANOVA p<0.001: R2=0.33):第一个包含意大利主题;第二个包含英国和法国科目;第三个则是荷兰和波兰的移民。在PCoA水平(基于斯皮尔曼距离)，使用基线(图1 b显著性:PERMANOVA p<0.001;虽然有相当多的重叠:R2= 0.036)。意大利受试者的微生物组组成不同，而来自英国/法国和波兰/荷兰的受试者更相似。Procrustes对食物消耗和OTU丰度谱的分析证实了饮食与微生物组组成之间的显著关联(图1 a, B；在线补充图3；Procrustes RV系数0.23;p < 0.001)。在基线时，特定微生物组成分驱动国家特定分离(曼-惠特尼检验fdr校正p<0.15;在线补充图4A-B)．如预期的那样，干预组的饮食变化与对照组有显著差异(envfit p<0.006) (图1 c)．干预组的这些变化主要是由纤维、维生素(C、B6、B9、硫胺素)和矿物质(Cu、K、Fe、Mn、Mg)摄入量的增加引起的，而与MedDiet干预组相比，对照组的变化与脂肪摄入量(饱和脂肪和单不饱和脂肪酸)的增加有关(图1 d)．
基线习惯饮食和菌群组成因国家而异或共变，饮食干预改变了宏量营养素分布。主成分分析(PCoA)图(A)五个不同国家的基线膳食概况和(B)基线16S微生物组概况。对于这两个国家，还表明了与国家联系的重要性的PERMANOVA p值。对于饮食频率、微生物组特征之间的联系，R2并给出了用Procrustes分析得到的显著性值。结果表明，在饮食习惯方面存在着国家特有的模式，这些模式也反映在微生物组概况中。(C) PCoA图显示干预组和对照组饮食模式的显著差异。还指出了这些差异的PERMANOVA p值。这反映了饮食干预的效果，以检测导致这些影响的特定饮食成分。计算了组分的摄入频率与两个PCoA轴(PCoA1和PCoA2)之间的关联。这些关联见(D)。干预组主要由纤维、维生素(C、B6、B9、硫胺素)和矿物质(Cu、K、Fe、Mn、Mg)消耗的增加驱动，而对照组的变化则与脂肪消耗的增加有关。
增加对NU-AGE MedDiet的坚持会影响之前与健康相关的肠道微生物群的特定成分
在干预组和对照组中，来自个别国家的受试者的全球肠道菌群多样性没有显著变化(在线补充图5)．然而，我们观察到，在整个研究中，越来越多地坚持这种饮食与微生物群落多样性的减少有关(表1)．为了进行更详细的微生物-饮食关联分析，我们使用了MedDiet的依从性评分，之前是根据NU-AGE食品基础膳食指南(FBDG)计算的。35这些建议是促进或衡量对健康饮食倡议或改善公共健康的饮食干预措施的坚持程度的基础。NU-AGE FBDG涵盖了15种膳食目标，包括Berendsen详细描述的维生素D补充剂等。35我们创建了随机森林(RF)模型，从基线和最终(1年)时间点的微生物组概况预测饮食依从性。对于这两个模型，预测食物评分(使用随机森林模型)和实际食物评分之间观察到的相关性是显著的(基线:R=0.27;p < 1.2 e-11;最后:R = 0.30;p < 2.2 e-14) (在线补充图6A,B)，表明微生物组和坚持MedDiet之间有明显的关联。对于任意一个时间点，75个otu的最优集合提供了最高的预测性能(合计129个otu;看到在线补充图6C,D)，以确定微生物组对MedDiet的反应。在整个研究中，我们将这些称为“饮食响应型”otu /类群/标记。总的来说，使用这个最佳的otu集，预测的和观察到的依从性评分之间的相关性为0.39 (p<2.2 e-16) (图2一个)．顶级预测otu的列表以及它们的分类分类(使用SPINGO获得)28)载于在线补充表2。
基于机器学习的饮食响应分类群识别。(A)使用随机森林方法获得的实际和预测饮食评分之间的相关性。(B)对饮食做出积极和消极反应的顶部标记的操作分类单位(OTUs)的特征重要性评分，以及它们的分类学关联(参见与食物评分显著相关的顶部标记的选择方法部分)。与饮食评分有显著正相关或负相关的顶级标记分别被标记为“饮食积极”和“饮食消极”。这两个类群在分类学上有明显的分类。而饮食阳性标记有过度代表的物种，如Faecalibacterium prausnitzii，真细菌而且Roseburia阴性标记的特征是存在瘤胃球菌属扭矩，Collinsella aerofaciens，Coprococcus来，Dorea formicigenerans，ramosum梭状芽胞杆菌。关联不同组的依从性得分也反映在变化在时间点之间的干预和控制军团(见C)。(C)箱线图显示log-fold收益/损失比率变化的各种分类单元(即个人的数量给定OTU增加的数量除以个人在减少在时间点)干预组与不干涉的两组。与非干预组相比，干预组饮食阳性的OTUs有相对积极的增加，而饮食阴性的变化表明干预组显著减少。(D)箱形图显示的是在按照NU-AGE饮食的积极变化增加的基础上，将个体分为三个分组(低、中、高)后，饮食阳性和饮食阴性otu在跨时间点变化的变化。关联显著性的p值表示为****p<0.0001， ***p<0.001， **p<0.01， *p<0.05。
共有44个最具预测性的OTUs与依从性评分呈正相关(随着饮食依从性的增加而增加)，45个与依从性评分呈负相关(随着MedDiet依从性的减少)(见方法部分)。我们将这些分别称为“积极饮食”和“消极饮食”的选择单位。这些otu的一个子集(带有定义的分类分类)及其绝对特征重要性评分显示在图2 b。组成这两个类群的类群是截然不同的。饮食阳性OTUs主要分配给Faecalibacterium prausnitzii，连同Roseburia（r . hominis)，真细菌（大肠rectale，大肠eligens，大肠xylanophilum)，叫多形拟杆菌，普氏菌copri而且Anaerostipes hadrus。这些类群中的大多数都曾被报道与健康有积极的联系，包括产生短链脂肪酸(SCFAs)和抗炎特性，以及与2型糖尿病和结直肠癌等疾病的负相关。36-38f . prausnitzii也与老年人的虚弱发病呈负相关。39相反，饮食负性OTUs主要属于瘤胃球菌属扭矩，Collinsella aerofaciens，Coprococcus来，Dorea formicigenerans，ramosum梭状芽胞杆菌，韦永氏球菌属dispar，Flavonifractor plautii而且放线菌lingnae。的丰度增加r .扭矩，c . aerofaciens，c . ramosum而且诉dispar与2型糖尿病、结直肠癌、动脉粥样硬化、肝硬化和炎症性肠病有关。38 40-43这些发现共同表明，坚持MedDiet有可能调节微生物群，使其朝着与健康呈正相关的方向发展。
值得注意的是，尽管各国在基线时微生物组组成存在差异(图1 b；在线补充图4A、B)和不同的饮食习惯(在线补充图7A)(正如之前对该队列的研究所报告的那样)，35 44在整个队列中识别出的饮食响应分类群在不同的民族中基本相同——也就是说，它们与饮食的关联并不特定于任何国家(见在线补充文本4；在线补充图4A、B；在线补充图7)．它们与MedDiet依从性的关系在干预组和对照组的丰度变化模式中得到了进一步的验证，也在按依从性增加排名的个体中得到了验证在线补充文本5；在线补充图8，图2 c, D)．
接下来，我们研究了肠道微生物群内的共发生模块。这些模块类似于微生物群中的“行会”，具有类似或相关的功能属性。我们使用iBBiG来识别肠道微生物群中的模块，31这是我们之前在ELDERMET队列中用来确定微生物组颗粒差异作为健康老龄化功能的方法14(见在线补充文本3；在线补充图9；在线补充表3和4)．iBBiG在NU-AGE数据集中确定了6个重叠的分类模块(命名为A到F)。值得注意的是，我们发现了一个特定的模块C，它在虚弱程度增加的个体中显著过度丰富，在饮食负性OTUs集合中也有增加的表现在线补充文本6；在线补充图9C,D)．这表明模块C类似于我们在ELDERMET个体中识别的长停留样模块。14然而，在遵循MedDiet而消耗的otu组中，模块C的特异性富集表明，MedDiet可能成功地以一种与虚弱负相关的方式调节了肠道微生物群。
坚持NU-AGE MedDiet干预会以一种与虚弱和炎症负相关的方式调节微生物组
NU-AGE饮食干预的主要目标是减少虚弱和炎症老化。根据弗里德评分，研究对象被分为非体弱(或明显健康)、前期体弱和体弱组。21当饮食负性分类群显示出在三个虚弱分组(即，虚弱>前虚弱>非虚弱)中逐步显著减少时，饮食正性分类群在健康(非虚弱)个体中显示出明显高于虚弱个体的丰度(见在线补充图10A)．饮食阳性分类群显示虚弱减轻的个体有显著的积极变化(见在线补充文本7；在线补充图10B)．在干预期间，在对照组队列中，虚弱程度增加的个体比例略有显著增加(与干预组相比)(Fisher检验p<0.06;在线补充图10C)．然而，我们不能观察到饮食坚持评分和虚弱之间的直接联系(在线补充图10D)．我们假设，坚持饮食对虚弱的影响可能是间接的，因此增加对地中海饮食的坚持可以调节微生物组(可能与一些没有反应的人)，这种微生物组的反应可能与衰弱的衰减或降低风险和其他健康指标的改善有直接联系。
为了研究这一点，我们计算了整个研究队列中饮食响应性OTU标记物与虚弱、认知功能和炎症的特定指数之间的关联(见在线补充表5查看测试的元数据列表)。研究的目的是测试饮食反应型类群是否与这些指数表现出显著不同的关联趋势在线补充图11)．总体而言，尽管相关性的绝对值相对较弱，但我们观察到五种不同细胞因子/生物标志物(即促炎高敏C反应蛋白(hsCRP)和白细胞介素17 (IL-17)、抗炎sGP130以及脂联素和瘦素)的饮食阳性和饮食阴性OTUs的关联模式存在显著差异;三项与虚弱相关的测量(Fried Score, Hand Grip Strength和步态速度时间);巴布科克记忆评分和建构练习(均与认知功能相关)。然而，最值得注意的观察是这些关联的模式。饮食阳性OTU标记物与炎症标记物hsCRP和IL-17水平以及Fried评分和步态速度时间(这两项指标均与虚弱程度增加有关)具有一致的负相关(显著低于饮食阴性标记物)。图3一)．相反，它们与改善认知功能(如，构造练习，BabCock记忆评分)，减少虚弱(握力)和两种细胞因子(脂联素和sGP130)(与饮食负OTU标记完全相反的趋势)的关联始终是积极的。虽然脂联素作为一种抗炎标志物的作用已被充分证实，45sGP130是促炎反式IL-6信号通路的负调控因子。46值得注意的是，尽管各国在饮食摄入、微生物组得分和依从性得分方面存在差异，但每一种关联(除了BabCock记忆得分)都可以在至少三个国家复制(无论是从关联的方向还是意义上)(10个关联中的6个在5个国家中的4个复制)(图3 b)．这些结果清楚地表明，坚持NU-AGE MedDiet与以一种相对一致的方式(在各国)调节微生物组相关，进而与减少虚弱、改善认知功能和减少炎症相关。
饮食反应类群与衰弱、认知功能和炎症的不同指标的一致关联。(A)显示粘附相关标记操作分类单位(OTUs)与选定的衰弱、认知功能和促炎/抗炎细胞因子水平的相关模式(使用Spearman rhos获得)的变化的热图(从上到下按其与粘附评分的相关性递增顺序排列)。对于每个单元格，颜色表示斯皮尔曼值(如图所示)。**与fdr校正p值<0.15显著相关。*与名义p值的边际关联<0.05。饮食阳性和饮食阴性OTUs也进行了划分。不同指标与饮食阳性和饮食阴性OTUs的关联模式存在特定差异。对于某些指标，如高灵敏度C反应蛋白(hsCRP)水平、白介素17 (IL-17)水平和步态速度时间，饮食阳性OTUs与饮食阴性OTUs相比具有显著的负相关性。对于与减少虚弱和改善认知功能相关的其他措施，以及脂联素和sGP130水平，观察到完全相反的趋势。(B)热图，显示这些趋势在每个特定国家队列内的个别复制情况。 Brown indicates those cases where the correlations of the DietPositive OTUs were significantly more negative than the DietNegative group, green indicates those cases with the opposite trend and yellow indicates those cases of no significant change.
微生物组反应伴随着肠道代谢谱的特定有益变化，是饮食坚持与健康之间的关键中间因素
基于之前的发现，似乎与饮食坚持有关的微生物群对改善健康状况比仅仅坚持饮食本身更重要。验证这一假设需要计算可测量的“微生物组分数/指数”(类似于饮食依从性分数)，这将考虑到与单个标记OTUs相关的变化。转向nuage MedDiet的特点是改变特定膳食成分的消费模式，即增加纤维(蔬菜、水果)、碳水化合物(全谷物)、植物蛋白质(豆类)、多不饱和脂肪酸(鱼类)和维生素(维生素C)的消费，同时减少脂肪、酒精、钠和糖(糖果)的消费。35我们首先通过检查其与不同食物成分的消费模式(考虑到年龄、体重指数、性别、国家和多药混合因素的部分斯皮尔曼相关性)的关联来验证饮食响应型otu(根据其与整体NU-AGE FBDG评分的关联来确定)。我们观察到，与FBDG依从性评分呈正相关的OTU标记物与纤维、维生素C、维生素D、植物蛋白和碳水化合物呈正相关，与在MedDiet改变期间减少摄入的酒精、脂肪和糖成分呈负相关35(见在线补充图12)．因此，上述结果表明，标记物OTUs不仅与FBDG总分相关，而且与与NU-AGE MedDiet干预相关的个体膳食成分相关(即使考虑了所有与宿主相关的混杂因素，如年龄、体重指数、性别、国家和综合用药)。这验证了膳食指标与膳食干预的相关性。此外，每一个饮食响应型OTUs都与饮食坚持评分有特定程度的相关性，并与饮食组成部分有特定的关联趋势(见在线补充图12)．基于饮食相关标记物OTUs与依从性评分的整体相关性以及给定样本中OTUs标记物丰度的相关性，我们计算了样本特定的饮食调节微生物组指数(见方法部分;在线补充图2)．正如预期的那样，微生物组指数与总体依从性评分呈正相关，并也获取了单个标记OTUs的整体关联模式(即与纤维、碳水化合物、植物蛋白、维生素C、多不饱和脂肪酸呈正相关，与脂肪、酒精和糖呈负相关)，表明其作为与MedDiet消费相关的分类标记的代理有效性(见在线补充图12、13；在线补充文本8)．
然后，我们检查了该指标与虚弱、认知功能和炎症(在整个队列中)的不同衡量指标之间的关联，将坚持评分作为混杂因素。11个与改善认知、减少虚弱和炎症有关的指标中有10个可以重现。我们还观察到与炎症相关的细胞因子白细胞介素(IL)-2和巨噬细胞炎症蛋白(MIP)-1b有额外的负相关，与语言流畅性(图4)．这些结果表明，饮食调节的微生物组成分与虚弱、炎症和独立于坚持评分的认知功能相关(即，这些不是与坚持饮食相关的间接后果)。我们之前已经证明，这些关联在不同的国家是稳定的(图3 b)．我们接下来检查了混杂因素(如年龄、体重指数、性别、疾病病理生理和药物摄入)对饮食分类关联程度的影响。研究发现，患有多种疾病的个体，特别是糖尿病、心脏病和炎症性疾病的个体，其微生物组得分明显低于未患病的对照组(癌症组得分较低，但略有显著性差异)在线补充图14A-E；在线补充文本9；在线补充表6)．然而，微生物组指数与10个炎症标志物和虚弱指数中的7个的关联模式(在图4)在很大程度上保持不变，即使考虑了所有混杂因素，包括年龄、体重指数、性别、多用药和不同的疾病病理生理学(见在线补充文本9；在线补充图15)．
MedDiet微生物组指数与减少虚弱、改善认知功能和减少炎症相关，与坚持评分无关。小提琴图显示的关联(部分斯皮尔曼相关性)的不同措施的虚弱，认知功能和炎症标志物水平与meddiet调节微生物组指数后，考虑到依从性评分作为混杂因素。x轴表示斯皮尔曼值，y轴表示p值的−log(以10为底)。大多数负相关的测量值预计在图的最左边，最正相关的测量值预计在图的最右边。根据获得的关联的重要性对点进行着色(红色表示与fdr校正的p<0.1的关联，橙色表示与fdr校正的p<0.2的关联)。MedDiet微生物组指数被观察到与减少虚弱、减少炎症和改善认知功能的一些措施相关，这种关联与坚持评分无关。
即使就跨时间点的变化而言，虽然饮食依从性评分的变化与微生物组指数的变化显著相关，但正是微生物组指数的变化与认知功能、身体健康的改善呈正相关，与hsCRP等炎症标志物呈负相关(见在线补充文本10；在线补充图16)．微生物组指数的阳性变化也与抗炎细胞因子IL-10水平的阳性变化和hsCRP与抗炎细胞因子水平的比值的阴性变化相关，进一步表明与饮食相关的微生物组指数与炎症细胞因子水平的负相关(见在线补充图16C而且在线补充文本10)．
饮食调节的微生物组变化对健康状况的积极影响可能是由特定的微生物代谢物驱动的。由于无法获得个体的粪便代谢组数据，我们使用相应的16S物种组成谱来预测肠道微生物组的功能代谢谱(见方法部分)。将这些预测代谢谱丰度的跨时间点变化与微生物组指数变化相关联，发现在微生物组反应格局中存在显著差异(见在线补充图17)．积极的微生物组变化与纤维相关的非淀粉多糖的微生物消费增加相关(可能指示地中海饮食的变化)。相反，与微生物单糖摄入量增加相关的是负变化。微生物组的阴性反应还伴随着胆汁酸的牛磺酰胆酸或糖酰胆酸衍生物(如牛磺酰胆酸或糖酰去氧胆酸)通过胆酸和鹅酰去氧胆酸向次生胆汁酸(石胆酸、脱氧胆酸)的微生物消耗量的预计增加(见在线补充图18A)．胆汁酸调节失调与不同的疾病有关，47具体来说，石胆酸和去氧胆酸产生的增加与结直肠癌有关。48相反，支链脂肪酸(BCFAs)和SCFAs产量的增加与阳性微生物组反应相关。SCFAs与宿主健康的正相关已被广泛认可。49先前的研究测量了与摄入MedDiet相关的代谢组学变化，也观察到SCFA水平的类似升高，10 50还有一个完全相似的联系，即meddiet类饮食调整(增加纤维摄入量和减少脂肪摄入量)被观察到与粪便中SCFA水平呈正相关，与粪便中次生胆汁酸呈负相关。51 52此外，在目前的研究中，我们获得了意大利和波兰队列中一部分个体的血浆胆酸(CA)、糖鹅脱氧胆酸(GDCDA)和鹅脱氧胆酸(CDCA)水平的测量数据。对于GCDCA和CDCA，将这些胆汁酸的血浆水平与饮食相关标记物的丰度相关联，发现与饮食阴性OTUs相比，饮食阳性OTUs与GCDCA水平显著正相关，与CDCA水平显著负相关(在线补充图18B)．通过根据GDCDA/CDCA比值将这类个体分组为三个类群，我们观察到GCDCA/CDCA比值增加的个体与其饮食相关的微生物组指数(在线补充图18C)．这些结果证实了预测的代谢产物谱，即饮食相关微生物组指数增加的个体预测GDCDA向CDCA的微生物转化减少(然后是石胆酸(LCA)和脱氧胆酸(DCA))，从而导致更高的GDCDA/CDCA水平。因此，我们检测到的一些关键的全球变化(胆汁酸和SCFA水平)，以及我们预测的与饮食相关的微生物组反应有关的变化，已经在多项研究和血浆水平分析的文献中得到报道。唯一有冲突的趋势是CA水平，观察到的模式与预期相反。然而，这可能是因为测量的是血清样本(与粪便水平相反)，而CA/CDCA是由肝脏和微生物群产生的(见在线补充图18C)．
微生物组的阴性反应也与其他有害代谢物有关，如对甲酚、乙醇和二氧化碳，这些代谢物的相对过量生产与结直肠癌、胰岛素抵抗、非酒精性脂肪肝、细胞毒性和小肠细菌过度生长有关。53-57值得注意的是，在基线时，饮食相关微生物组指数被观察到与多种疾病呈负相关，包括高血压、糖尿病和癌症(在线补充图14)．因此，尽管推测而不是测量，数据表明与积极的微生物组反应相关的代谢变化有利于影响宿主的健康。
饮食阳性OTUs是肠道微生物群落中的关键物种
最后，我们评估了饮食响应型类群在整个微生物群落结构中的作用，用Reboot方法定义的网络表示(见方法部分)。30.共现网络提供了这些节点之间的节点和边(相互连接的线)的表示，其中节点代表类群(在本例中为otu)，节点之间的边表示它们之间的显著共现关系(跨所提供的观察集或样本)。类群在共现网络中的位置表明了该类群在群落稳定性中的相对重要性。我们首先获得了所有样本在两个队列的时间点上的共现网络。共现网络的主要组成部分是类群的聚集，其他类群充当相互联系的枢纽。然而，大多数饮食积极和饮食消极类群的定位是显著不同的。饮食阳性分类群要么位于网络的中心枢纽，要么作为主要子节点中的连接节点(图5一个)．这显示了这些类群在肠道群落结构中的中心地位，这种现象被称为“关键物种”。58相比之下，大多数饮食阴性分类群位于网络的外围。我们通过计算网络中每个分类单元的两个中心性度量来探讨这一观察结果:“度中心性”，即连接到给定节点的节点数量，以及“中间中心性”，即连接任意两个节点通过给定节点的路径数量。饮食阳性分类群的中介性中心性显著高于饮食阴性分类群或非相关标记(图5 b, C)．我们重新建立了每个不同国家的网络，以及增加饮食依从性样本的重叠窗口在线补充图19；在线补充图20；在线补充图21A)．尽管个体网络的整体结构存在重大差异，但在不同国家，分类群的布局模式及其在肠道微生物网络中的相对重要性都是不变的。饮食阳性分类组具有显著较高的中心性指标，而不考虑国籍和个体的饮食依从性。正如预期的那样，饮食阳性和饮食阴性类群的相互作用也有不同的模式，特别是关于iBBiG识别的虚弱相关模块C，它与饮食阳性类群具有负的共发生倾向(图5 d)．有趣的是，随着饮食习惯的增加，共现倾向的强度明显变得更加消极(图5 e)．这在其他任何分类模块中都没有观察到(参见在线补充图21B)．
在微生物组网络中，对地中海饮食干预反应积极的细菌类群占据着外围虚弱相关类群的关键相互作用节点。(A)操作分类单位(OTU)共现网络的表示，通过时间点和队列获得的所有样本，分别用绿色、红色和灰色表示饮食阳性、饮食阴性和不相关OTU。该网络显示了饮食阳性和饮食阴性标记(或OTUs)的两个不同特征。虽然饮食阴性标记(除了少数例外)被观察到作为网络中的外围节点，但饮食阳性标记大多作为中心连接的枢纽节点或枢纽之间的互连节点，表明它们对微生物群的中心地位。这也反映在(B)和(C)分别显示为箱线图的程度和中介中心性度量的比较中。(D)饮食阳性和饮食阴性otu与属于不同迭代二元双聚类基因集(iBBiG)模块的otu之间的相对共现倾向(以正边数与负边数的对数比值计算)。结果发现，特别是在与虚弱相关的长停留样模块C中，饮食负相关标记为正共现，而饮食正相关标记为负相关，进一步说明对饮食有积极反应的类群与与虚弱相关的类群呈负相关。(E)通过建立W1-W5样本的五个重叠窗口的网络(见方法部分)进一步研究负相关性，并增加对饮食的依从性。饮食阳性和模块C之间的相对共现倾向通过网络得到的重叠窗口的样本与饮食的依从性增加。随着饮食依从性的增加，饮食阳性otu和属于模块C的otu之间的相对共现倾向变得越来越负。 The p values of the significance of association are indicated as ****p<0.0001, ***p<0.001, **p<0.01, *p<0.05.
讨论
目前的结果提供了一个系统的观点，食用NU-AGE MedDiet对微生物组和随后的老年人健康生物标志物的影响。当前研究面临的一个重大挑战是，在五个国家的个体之间微生物组的高度可变性，导致低信噪比，这意味着较弱的分类信号与元数据的关联。使用传统方法进行的分析是有用的，并提供了统计上的严谨性，即使自变量的假设并不能真实反映菌群中的群落结构。然而，由于个体间微生物群结构配置的多样性和差异性，加上在一个已建立的肠道菌群群落中，一年的饮食对生活的影响相对较小，以及其他方面，如预期对社区居住个体的饮食测量的主观性质，以及饮食测量准确测量实际饮食变化的假设，传统的统计方法无法识别与遵循MedDiet相关的统计上显著降低多样性损失相关的类群。为了建立饮食响应的分类群并生成饮食相关的微生物组指数，我们应用了一种新的遗漏交叉验证机器学习方法，以良好的准确性预测每个个体的依从性得分，并使用这些预测模型来探测和识别最能预测MedDiet依从性增加的特定分类信号。
我们观察到，增加对MedDiet的坚持可以调节肠道菌群的特定成分，这与降低虚弱风险、改善认知功能和减少炎症状态有关。由于上述原因，只有在相对较弱的阈值(rho <−0.09和rho >0.07, fdr校正p值<0.2)下，才能观察到某些饮食调节微生物组标记物的这些关联。这允许可视化和重新检查最具预测性的otu。然而，引人注目的观察是饮食调节的微生物组标记物与衰老的生物标记物的相关性的一致性(独立于国籍)。单一样本特异性微生物组指数的制定和计算进一步阐明了这些联系。对于单个样本，该指数提供了饮食响应标记的丰度模式的定量总结(该值越高，饮食阳性类群的丰度越高，反之亦然)，从而解决了与单个标记相关的样本特异性变异性。我们表明，它们不仅与饮食依从性相关，而且始终与虚弱和炎症标志物相关，从而证实了它们对健康维护的重要性，独立于其他人体测量混杂因素，如年龄、体重指数和性别。事实上，坚持得分与虚弱之间明显缺乏直接联系，这进一步暗示了个体对饮食的反应可能是由微生物群的变化介导的。除了这些联系外，肠道微生物群内饮食阳性标记的关键性质在多个国家仍然保持显著稳定。这些饮食阳性标记的基石属性为所谓的安娜·卡列尼娜原则提供了支持59该理论认为健康个体的微生物群是相似的，而不健康个体的微生物群各有不同。通过保护肠道微生物群落的“核心”，坚持这种饮食可以促进微生物群落中稳定的群落状态的保持，提供弹性，并保护不健康受试者不受变化的影响。
这些微生物类群对宿主健康的积极影响通过预测代谢物分析进一步表明，增加对饮食的坚持专门选择了在生产SCFAs/BCFAs中富集的类群，同时选择了与胆油酸调节失调和生产如丙酮、对甲酚、乙醇和二氧化碳等有害代谢物相关的类群。虽然这是一种硅片内预测，但之前已经证明，食用MedDiet(或使用MedDiet的特定成分)会增加短链脂肪酸的产量。10百分比较Pagliai的研究等该研究比较了MedDiet和素食饮食中的微生物组和代谢组的变化，报告了碳水化合物摄入(在MedDiet中增加)与粪便中SCFA丁酸盐水平显著正相关，脂质和脂肪摄入(在MedDiet中减少)与SCFA丙酸盐和乙酸盐水平显著负相关。SCFAs也与炎症细胞因子IL-17水平呈负相关。50尽管Pagliai的研究等在MedDiet中没有观察到BCFA水平的显著差异(与我们目前研究中所进行的硅油预测代谢物分析相反)，也观察到BCFA水平与脂肪摄入量的负相关(与我们目前的发现一致)。meddiet相关微生物组调节、SCFA产生和致癌次生胆汁酸产生之间的联系与之前两项针对非裔美国人和农村非洲人的研究结果完全一致。51 52有趣的是，在次级胆汁酸生产领域，而粪便代谢组的研究结果来自O 'Keefe的研究等证实了预测的关于CA和致癌次生胆汁酸DCA和LCA的代谢物变化，血浆代谢物水平(在当前研究中)证实了预测的关于CDCA和GCDCA的变化(尽管血浆代谢物水平预计不能准确反映粪便代谢组)。因此，从这些研究中得到的结果在很大程度上是相辅相成的，与我们当前的发现产生共鸣，而预测的其他潜在有害代谢物生产的下调提供了一个候选化合物的信息列表，可以在未来的研究中通过靶向代谢组分析进一步验证。
饮食、微生物群和宿主健康之间的相互作用是一个复杂的现象，受多种因素的影响。它也可能是一个由特定的机械规则决定的多步骤过程。虽然这项研究的结果揭示了这种三方相互作用的一些规则，但年龄、体重指数、疾病状况和最初的饮食模式等几个因素可能在决定这些相互作用的成功程度方面起着关键作用。有趣的是，通过微生物组介导的MedDiet干预的有益效果并不局限于老年人，这在Meslier的研究中得到了证明等60(本卷;co-submitted来肠道)表明，对肥胖受试者进行类似的干预会导致与能量摄入无关的肠道微生物组和代谢组发生多种与健康相关的变化。尽管有这种理论和实践上的强化，但在许多国家，通过长期维持MedDiet(或补充特定成分)来促进老年人健康的策略可能昂贵得不切实际，或者在后勤上是不可能的，因为这些成分既不是主食，也不是全年都有。对于一些有牙列、唾液分泌、吞咽困难或肠易激综合症等问题的老年受试者，采用MedDiet可能不是一个现实的选择。我们在这里对与健康相关的医疗饮食响应分类群的定义，加上我们最近在2500名受试者的大型元队列中确定的与健康老龄化相关的分类群，61提供了一个候选类群的简短列表，用于开发作为活性生物治疗剂，直接给老年受试者，以减少衰弱的发作。
参考文献
补充材料
脚注
TSG、SR、IBJ和AS的贡献相当。
贡献者TSG, IBJ, POT, CF和AS的分析构思和设计。MN, AS, MC, EG, AJ, MC, ST, EGZ, gdae, CE, NM, CMB, EP-G, AM, JK, BP, BC, MN, MM-F等收集和/或贡献数据。TSG、IBJ和SR进行了分析。TSG、IBJ和POT在SR、AS、PB、EGZ和WMDeV的协助下撰写了论文。WMDeV、SF-T、AC、PB、CF、POT等人进行了分析和审稿。
资金作者得到了爱尔兰科学基金会(APC/SFI/12/RC/2273)的部分资助，成立了爱尔兰APC微生物组研究中心。IBJ银行获得了爱尔兰科学基金会的资助(13/SIRG/2128)。nuage项目由欧盟第七框架计划支持，资助协议编号为no。266 486(“NU-AGE:解决欧洲老年人口健康老龄化具体需求的新饮食策略”)。
相互竞争的利益没有宣布。
病人同意发表不是必需的。
来源和同行评审不是委托;外部同行评审。
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