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背景TFF2,三叶草因子蛋白家族的一员,是一种糖基化的蛋白106个氨基酸。它是由胃分泌窦的布鲁尼尔腺和幽门腺的十二指肠。TFF2发现高浓度的溃疡的网站。它刺激细胞的能动性和可能是校长cytoprotective三叶草肽的腹部。
的目标是确定生产TFF2遵循一个昼夜节律并测量TFF2分泌的变化以应对食物摄取和睡眠。
主题年轻健康的成年人被招募。他们是无症状的,没有接受药物治疗。24小时方案旨在允许正常刺激胃液分泌,以应对食物摄取和睡眠。胃液收集两个小时通过鼻胃管。
方法糖化和non-glycosylated TFF2蛋白质定量衡量西方转移分析。用SPSS软件进行统计学上的结果进行了分析。
结果有一个戏剧性的昼夜变化TFF2的浓度。在傍晚最低平均浓度(0.29μg /毫升),逐渐增加在晚上,然后急剧夜里到达7.9μg /毫升。糖化比non-glycosylated TFF2多样,下午在夜间高于。pH值、总蛋白和胃液中胃蛋白酶浓度没有显著变化超过24小时。
结论数据显示,昼夜变化TFF2分泌发生独立于胃蛋白酶和胃酸分泌。浓度的糖化TFF2胃腔下跌应对食物摄入量。缺乏运动和睡眠期间TFF2分泌增加。这些结果表明,TFF2分泌的胃是最高的在夜间,cytoprotective TFF2对胃黏膜的影响主要发生在睡眠中。
- 三叶草的蛋白质
- 人类TFF2
- 胃酸
- 日
- 胃蛋白酶
- 昼夜节律
来自Altmetric.com的统计
TFF2最初叫做人类的解痉的多肽,是第二个三叶草肽的人类大家庭的成员。1有三个人类三叶草集群21号染色体上基因的蛋白质TFF112.5 kb的上游TFF2∼30 kb上游的是哪一个TFF3。2,3三叶草肽小分泌蛋白质特征42-43保守域的氨基酸残基。3 - 6三叶草的六个保守的半胱氨酸残基域形成三个分子内二硫键,因此三个循环,堆积在一个结构特征。7 - 1012 kDa TFF2成熟,这是一个106个氨基酸的蛋白质,包含两个三叶草域由一个短序列分开七残留物(见图1一个)。1这两个x射线晶体学、核磁共振的解决方案7号到9号被用来解决TFF2猪同系物的结构。它由两个球状域,采用相同的三级结构紧凑,通过加入一个小接口。
TFF2蛋白质的检测胃液在24小时。(一)修改TFF2成熟蛋白的序列。两个三叶草域表示的位置,就像氨基酸包含在这三个循环中形成折叠的三叶草域。单一N-glycosylation识别序列,这是一个潜在糖基化位点位于第一个三叶草的第1循环域,是盒装的。赖氨酸残基(K)取代了天冬酰胺残留在先前发表的序列1在99年的位置也是盒装。16个氨基酸肽合成作为免疫原也表示。空间已经插入序列中的残留6后,49岁,98表示的极限三叶草域。(B)人工胃液收集每隔两个小时在24小时的时间从一个年轻的志愿者。整除受到变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,转移到PVDF膜,TFF2抗血清中描述的方法部分。向下的箭头表示吃饭时间。糖化TFF2 (Glyc的位置。TFF2)和non-glycosylated TFF2 (TFF2)右边所示。
三叶草肽表达在胃肠道站点特定的方式和人类TFF2集中在胃和十二指肠。人类的细胞分布TFF2 mRNA在胃里通过原位杂交为特征的。1,11人类TFF2信使rna存在于心脏腺体,腺体在极少数胃体粘膜的底部,并在大量幽门腺。1,11人类TFF2蛋白质存在于腺体正常胃的底部窦的粘膜和布鲁纳的十二指肠腺。11
三叶草肽的生物学作用的第一迹象来自免疫组织化学和原位杂交研究的表达式在各种胃肠道疾病。12高浓度的TFF2信使rna在细胞邻近十二指肠粘膜损伤位点,小肠和结肠。13这种异位表达建议三叶草肽在组织修复的作用。3 - 6,12急性粘膜损伤后,胃肠道粘膜的修复启动几分钟。最早的过程快速迁移的细胞受损的边缘地区剥蚀地区重建上皮连续性,这一过程被称为上皮归还。三叶草肽刺激这种迁移的可能性是由细胞的观察,TFF2 motogenic文化。重组TFF214刺激人类结肠癌细胞迁移和入侵到胶原蛋白凝胶,15在塑料和刺激他们的迁移伤口修复的体外试验。15,16TFF2可能是特别重要的三叶草肽在修复过程中产生后30分钟内冷冻探针诱导大鼠胃溃疡。17
研究人类TFF2重组14表明,TFF2保护大鼠诱导吲哚美辛和克制,和乙醇诱导胃粘膜损伤。15,18,19保护作用的进一步证据TFF2从我们提供的演示室实验,TFF2降低质子通过胃粘液体外和体内渗透。20.它也表明,三叶草的正常作用肽可能维持胃肠道上皮细胞层的完整性。3 - 6
我们展示了最近大量12 kDa TFF2出现在人工胃液。21大量的蛋白质较高的表观分子量也被检测到。这是证明N糖化TFF2,糖基化的Asn15形成单一的一部分吗N在TFF2蛋白质糖基化的共识(无花果1A)。绝大多数的人类TFF2出现在胃粘膜是糖化。21糖基化可能是功能重要性和它已经表明,糖基化的重组TFF2比non-glycosylated蛋白质更有效防止体内消炎痛引起的胃损伤。15
由胃分泌细胞酸、胃蛋白酶、内在因素,胃肠调节肽是严格监管。酸和胃蛋白酶分泌后食物摄入量而其他蛋白质的分泌遵循生理模式。在目前的研究中,TFF2蛋白质在胃液量化来自年轻健康受试者在24小时时间。餐是标准化允许测量TFF2水平变化以应对食物摄入量。TFF2浓度的变化是与pH值、总蛋白和胃液中胃蛋白酶浓度。
方法
胃液样本的集合
十二20 - 24岁的志愿者(平均年龄21)这项研究招募了。四是女性和八个是男性。所有志愿者都是无症状的,没有接受药物治疗,没有明显的过去的病史。他们都不吸烟。所有的志愿者给书面知情同意。研究伦理许可获得联合纽卡斯尔/纽卡斯尔大学的伦理委员会。
志愿者禁食12小时之前开始的胃液的集合。他们参加了24小时的观察单位。24小时方案设计类似的自然状况与正常刺激胃液分泌,以应对食品摄入量。每个人有一个12 F Ryles鼻胃管(RT 2012,叶绿泥石医疗、英国)插入通过早晨8点钟前鼻孔不润滑。管的位置依赖胃的一部分是由水回收方法。22志愿者喝20毫升的水,然后恢复的愿望。第一个样本收集的上午9点,45分钟后管的正确定位。共有12个样本收集胃液:第一个上午9点和最后一个第二天上午7点。鼻胃管是15点删除。餐是标准化,以确保类似1:15摄入蛋白质和被点到下午5:15愿望后立即前样品。志愿者在30分钟后可以喝清洁的液体样本的每个愿望,因此没有采取液体至少1.5小时前的愿望成功样本。当胃排空是在一小时内完成,这确保摄入液体不妥协的结果。22没有允许饮酒。志愿者们在11点半上床睡觉,凌晨一点都睡着了。
胃液样本通过鼻胃管吸气用20毫升无菌注射器每隔两个小时。样本过滤去除颗粒材料。这并不影响TFF2浓度每个样本的pH值测量和1毫升的每个样品被稀释10倍55毫米氯化钠,55毫米醋酸钠,醋酸,pH值4.1,灭活但不变性胃蛋白酶。这企稳TFF2和胃蛋白酶,不干扰后续分析的蛋白质。每个稀释胃液样本分为四个整除为存储−20°C。
测量TFF2
整除的稀释胃液对交联葡聚糖凝胶过滤到无菌水通过G25(法玛西亚)和真空蒸发浓缩。样本在聚丙烯酰胺凝胶电泳,含有0.1%钠十二烷基硫酸盐如前所述。23叠加凝胶含有10% (w / v)丙烯酰胺凝胶分离包含20% (w / v)丙烯酰胺,并均包含10%甘油。样品是分次被带到62.5毫米三羟甲基氨基甲烷盐酸,液pH值6.8,12.5毫米EDTA, 100毫米β-mercaptoethanol, 0.005%溴酚蓝和煮五分钟之前加载。分子量标记和重组TFF2包含在所有的凝胶。
分离蛋白从凝胶转移至0.2μm孔隙大小PVDF膜(Schleicher和Schuell)使用半干转移装置(Schleicher和Schuell) 15分钟在100毫安,一夜之间,发现了在室温下。他们固定在0.2%戊二醛45分钟,阻止了3% (w / v)牛血清白蛋白在磷酸缓冲盐一小时37°C,和孵化1:1000稀释的老鼠多克隆anti-TFF2抗血清在3% (w / v)牛血清白蛋白和磷酸缓冲盐两小时37°C。鼠标抗血清对纠正长大16个氨基酸的羧基末端肽EVPWCFFPKSVEDCHY人类TFF2(见图1一)共轭锁眼坚守岗位的血蓝蛋白。21进一步的膜被孵化两小时在37°C和碱性磷酸酶共轭兔子antimouse免疫球蛋白在磷酸缓冲盐含有0.1%渐变20和发达如前所述。21,24
的强度TFF2免疫反应性的蛋白质乐队使用图像分析测量。初步实验表明,蛋白质带检测的强度是成正比的重组蛋白在凝胶上加载。的TFF2测定胃液样本中的蛋白质与已知标准的反应相比数量的糖化和non-glycosylated重组TFF2包括凝胶,如前所述。21
测量的胃蛋白酶活动,总蛋白质含量,胃液pH值
样本化验为胃蛋白酶活动两周内的集合。胃蛋白酶活性的氨基末端试验评估了pH值2.2,与丁二酰白蛋白衬底和猪胃蛋白酶作为标准。25蛋白质浓度的胃液样本测量使用bicinchoninic酸蛋白质分析。26之前与醋酸钠缓冲液稀释,每个胃液样本的pH值测量。
数据使用SPSS软件进行分析。配对样本统计量用于分析的数据显示在无花果2 - 4,图6和表1。参数和非参数统计检验被用于分析的数据图所示7详细的文本。
总TFF2浓度与总蛋白浓度的比较,胃蛋白酶活性,在正常的人类胃液pH值24小时。胃液收集来自12个青年志愿者每隔两个小时和24小时的浓度TFF2 (A)和蛋白质(B),胃蛋白酶活动(C)和pH值(D)中描述样本测量的方法。意思是(SEM)值显示。
胃蛋白酶活性和TFF2浓度之间的关系在个人胃液样本。(A)胃液收集从12 7点年轻健康的志愿者。TFF2胃液的浓度和胃蛋白酶活动测量方法中描述。值TFF2胃液的浓度显示每个策划对胃蛋白酶活性。(B)胃液收集来自12个年轻健康的志愿者每隔两个小时下午7点到7点之间。TFF2胃液的浓度和胃蛋白酶活动测量方法中描述。褶皱增加TFF2浓度在这个时间计算和绘制反对平均为每个单独的胃蛋白酶活动。
结果
测量糖化和NON-GLYCOSYLATED TFF2胃液
检测人类TFF2胃液样本,蛋白质相同体积的每个样本被变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,转移到PVDF膜,反应与抗血清的方法部分中描述。获得的结果的一个示例的一个12个人图所示1b两个主要TFF2免疫反应性的蛋白质发现了乐队。迁移更慢的异构蛋白质的表观分子量∼20 kDa之前的研究已经证实,成熟的分泌TFF2糖化通过N第一天冬酰胺连接在循环1(无花果1一个)。21不太突出的蛋白质,迁移速度,的表观分子量12 kDa, TFF2与重组TFF2 co-migrates修改的成熟。21糖化TFF2更高比例的样本中,检测出超过non-glycosylated TFF2。
图1B显示有一个戏剧性的变化的浓度TFF2胃液中个体的24小时。TFF2浓度是最低在下午和傍晚和夜间上升达到最高浓度在清晨。TFF2发现在第一样品的数量,和一些人在第二个样本,胃液可能减少由于稀释胃内容物的方法用于位置鼻胃管。这涉及到志愿者喝20毫升的水,然后从胃吸气。
大量的糖化和non-glycosylated TFF2胃液样本的12个人被比较与已知量的糖化和量化non-glycosylated TFF2重组。21意味着(SEM)浓度的糖化和non-glycosylated TFF2胃液样本的12名志愿者图所示2。糖化TFF2恢复的浓度在早上然后下降到最低的意思是晚上7点集中。随后上升,起初逐渐尖锐,达成最大平均浓度大约在早上5点6μg /毫升。的平均浓度non-glycosylated TFF2低得多(低于0.1μg /毫升)在早晨,在下午和晚上几乎没有检测到,但在清晨急剧上升。糖化TFF2成为显著的浓度(p = 0.004)高于糖化TFF2出现在胃液的浓度晚上7点11.00点。的浓度non-glycosylated TFF2也变得明显高于在11:00点(p = 0.046)。
糖化TFF2浓度和non-glycosylated TFF2在正常人体胃液在24小时内。胃液收集来自12个健康志愿者每隔两个小时和24小时TFF2浓度测量中描述的方法。意味着(SEM)浓度的糖化TFF2和non-glycosylated TFF2所示。向下的箭头表示吃饭时间。
TFF2浓度变化的原因和个体差异性
水平的糖化、non-glycosylated和总TFF2急剧上升9点到5点之间(图2)。糖化TFF2从0.29(0.09)上升到5.91(0.73)μg /毫升(p < 0.0001), non-glycosylated TFF2从检测水平上升到1.4(0.3)μg /毫升(p = 0.002),和总TFF2从0.29(0.09)到7.32(1.02)μg /毫升(p < 0.0001)。最初更逐步增加TFF2浓度发生在上午7点到晚上11点,而志愿者们休息和更戏剧性的增加发生在下午1点到5点在他们睡着了。
在夜间浓度的糖化和non-glycosylated TFF2玫瑰在所有12个人但有相当大的变化在TFF2浓度和增加的程度。TFF2浓度是最高的一个人,凌晨3点在早上5点在五个人,六个人凌晨7点。程度的变化见图3显示TFF2浓度胃液晚上7点到早上7点。浓度的TFF2胃液凌晨7点不同个体间从2.38到10.2μg糖化TFF2 /毫升,从0.56到3.2μg /毫升non-glycosylated TFF2。
睡眠对胃腔的TFF2浓度。胃液收集来自12个健康志愿者在傍晚和晚上7点后7点醒来。浓度的糖化TFF2 non-glycosylated TFF2, TFF2总浓度测量中描述的方法。获得所有的志愿者都显示的值。
图3还说明了变化的程度的增加胃腔的TFF2浓度个体之间发生。糖化TFF2的浓度增加三倍至250倍。总TFF2浓度的增加胃液在睡眠中发生的3.7倍至340倍。
图中所示的数据1B和无花果2表明可能有TFF2浓度减少食物摄入后,下午1:15发生点和下午5:15。糖化TFF2浓度和总TFF2午餐(表后显著降低1)。很少non-glycosylated TFF2检测这些时间和减少每餐后并不重要。的降低糖化和总TFF2晚饭后显著(表1)。排空后的液态食品消费发生在45分钟22和不太可能减少食物摄入后TFF2浓度稀释效应。这表明,摄入的食物可能抑制TFF2分泌。
意味着TFF2浓度面具相当大的可变性TFF2浓度和食物摄入量的影响。变化引起的12名志愿者通过食物摄入是图所示4。午饭后,总TFF2浓度下降9个科目两倍和10.5倍之间,TFF2成为察觉一个个体,增加三个对象之间的1.3倍和1.6倍。第二顿饭之后,TFF2浓度下降1.3倍和7倍之间的八个学科,TFF2成为探测不到三人,三人保持不变,在只有一个1.2倍。
吃对胃腔的TFF2浓度。胃液收集来自12个健康志愿者前15分钟和后一小时45分钟的午餐和晚餐。总TFF2浓度测量中描述的方法。显示值获得所有的志愿者。
比糖化和NON-GLYCOSYLATED TFF2
我们以前报道,糖化TFF2比non-glycosylated TFF2胃液5:1之间的不同和10:1。白天的可能性,这一比率可能会改变被认为是。图中所示5、糖化的相对比例和non-glycosylated TFF2改变在书房的24小时。关系表示为的百分比non-glycosylated TFF2因为当non-glycosylated TFF2是察觉不可能计算两种蛋白质的比例。
的TFF2比例不是糖化。胃液收集来自12个健康志愿者每隔两个小时和24小时TFF2浓度测量中描述的方法。意味着(SEM)总数的百分比TFF2不是糖化。
值得注意的是non-glycosylated蛋白质的比例明显高于在夜间和清晨。在研究开始的24小时,的百分比non-glycosylated TFF2大约是15%。在早上和下午晚些时候,的百分比non-glycosylated TFF2晚上7点下降达到0%。的比例non-glycosylated TFF2出席下午一点仍明显高于比例(p = 0.002)晚上7点,再次成为更高比例至凌晨1点(p = 0.003)。此后的百分比non-glycosylated TFF2玫瑰再次达到大约15%由凌晨三点(p < 0.0001)。糖化TFF2比non-glycosylated TFF2晚上7点,当non-glycosylated TFF2浓度最高,差异之间的2.7:1,7:1。
测量血清总蛋白
的可能性,人类TFF2胃液的浓度(无花果6)反映总体的变化被认为是蛋白质浓度超过24小时。意味着(SEM)蛋白质浓度在胃液的12个人在每个时间点图所示6b蛋白浓度过程造成的第一个样品是用来插入胃管。下午一点左右,蛋白质浓度是2.22(0.32毫克/毫升,和其余的研究范围内的变化小,2.45 - -3.42毫克/毫升。蛋白质含量没有显著的增加在第一或第二顿饭(图6B)。
比较平均的浓度在胃液总TFF2 24小时(图6),是指总蛋白浓度(无花果6B)清楚地证明,TFF2的浓度变化独立于总蛋白浓度。这意味着TFF2浓度的增加从活跃的特定TFF2分泌胃液结果,并没有反映出一般分泌活动。平均浓度的TFF2胃液样本凌晨7点是3.15μg /毫克的蛋白质和总范围从1.5μg /毫克的蛋白质4.9μg /毫克的蛋白质。这意味着TFF2蛋白质代表总数的0.15%和0.49%之间时胃腔的最高浓度。
比较TFF2浓度与胃蛋白酶活性和pH值在正常人类的胃
TFF2浓度与胃蛋白酶浓度在胃液样本。意味着(SEM)胃蛋白酶活动12样本在每个时间点图所示6c与总蛋白一样,看来胃蛋白酶活性的影响水回收方法用于位置鼻胃管。下午一点左右,意思是胃蛋白酶水平已经达到0.89毫克/毫升,之后0.7和1.1毫克/毫升之间的不同。意思是胃蛋白酶活性不受食物摄入量,尽管在夜间有更高水平的趋势,这并没有达到统计学意义(无花果6C)。没有关系的意思TFF2浓度和胃蛋白酶浓度在24小时内。因此TFF2分泌不镜胃蛋白酶分泌的胃,也不是周日增加TFF2浓度促进日降低胃蛋白酶活性。
最后,TFF2浓度日变化与胃液pH值的比较。意味着(SEM) 12胃液pH值样本在每个时间图所示6d第一批样本的pH值是相对较高(pH值4.4(0.67)),可能由于稀释造成的胃内容物的方法用于鼻胃管位置。到了上午11 pH值下降到2.4(0.5),之后并没有发生显著的变化。没有明显的食物摄入量的影响或胃酸分泌的休息。因此,昼夜变化TFF2分泌不似乎与胃酸分泌有关。
TFF2浓度和胃蛋白酶之间的关系
意思是胃蛋白酶活性变化没有陪意味着TFF2浓度的日变化但TFF2浓度之间有显著的负相关,胃蛋白酶浓度的个人。图7一个显示了7点TFF2和胃蛋白酶浓度之间的关系。这种关系是显著(p < 0.001)当皮尔森的参数使用正反测验,和p值< 0.007−0.729当斯皮尔曼相关系数的非参数使用正反测验。显著负相关还发现当TFF2浓度最高时的时间点是凌晨3点或平均值相比,5点,7点进行比较。这表明TFF2分泌降低胃蛋白酶分泌水平较高的个体。
我们还测试了如果褶皱增加TFF2浓度观察期间休息与胃蛋白酶的水平。褶皱增加TFF2浓度下午7点到7点之间对胃蛋白酶浓度平均每个显示在无花果7b的观察强负相关性最大的增加TFF2浓度较低的个体中胃蛋白酶活动;皮尔森的正反p < 0.05和枪兵的正反p < 0.003−0.781的相关系数。
讨论
这是第一个研究三叶草蛋白质浓度的日变化。这项研究旨在允许量化的影响进食和睡眠在胃液TFF2浓度在一个24小时期间。我们的结果表明,胃腔的TFF2不同浓度大大超过24小时,夜间最高浓度检测。
综上所述,昼夜变化的数据表明,胃腔的TFF2浓度是由TFF2分泌的增加引起的。变化不太可能是由于稀释因为其他蛋白质的浓度,胃蛋白酶活性,氢离子浓度不显示昼夜变化。另一种解释是,TFF2浓度变化反映TFF2蛋白水解作用差。然而,意味着TFF2浓度没有任何关系的意思是胃蛋白酶浓度在24小时的时间,和胃蛋白酶活动没有昼夜变化。蛋白酶除了胃蛋白酶不太可能负责TFF2因为三叶草肽浓度的日变化,包括TFF2,的特点是抗蛋白水解作用27和TFF2已被证明是稳定在胃液中孵化。15此外,在这项研究中,TFF2被西方转移分析,测量和免疫反应性的蛋白质乐队小于12 kDa没有发现没有迹象表明TFF2蛋白质水解发生(图1B)。似乎可能在胃腔的昼夜变化TFF2浓度是由于合成和分泌增加。
现有证据表明,糖化TFF2是人类TFF2的主要形式21而且它比non-glycosylated蛋白更有效。15的比例non-glycosylated TFF2最高是在夜间和清晨,这是符合晚上TFF2合成的增加。改变比不太可能是由于优惠糖化TFF2作为糖基化的蛋白水解降解通常保护蛋白质免受蛋白水解作用。28两种蛋白质的不同比例可能反映了它们的相对变化的合成和分泌。的TFF2N糖基化的共识序列Asn15参数16用力推17预计完全糖化吗29日因此增加的比例non-glycosylated TFF2可能是因为内质网的糖基化机械超载的合成和分泌大量的TFF2在夜间发生的。30.
控制TFF2合成和分泌的机制是未知的。可能的控制下neurogastric肽的浓度改变食物摄入量,睡眠,或昼夜节律。众所周知,等离子体浓度的几个胃肠调节肽受到昼夜变化31日:——血管活性肠多肽和缩胆囊素是最高的在傍晚和晚上。它已经表明,神经肽生长激素抑制素——血管活性肠多肽,碳酰胆碱,乙酰胆碱的模拟,刺激TFF3 HT-29信使rna合成的人类结肠上皮细胞系。32如果TFF2合成也受到这些监管分子,这可能是机制负责TFF2浓度的日变化。
TFF2被认为是校长cytoprotective三叶草肽的腹部33我们的数据表明,它执行这个角色在静止或睡眠。有趣的是,在溃疡发病率的1480名病人的一项研究中,一个强大的昼夜模式被发现与溃疡的一个重要低点演示4点到8点之间TFF2水平最高。34这表明,TFF2分泌增加专门晚上促进胃粘膜的修复。此外,我们的数据表明,进食后TFF2浓度下降。粘膜可能赔偿积极消化,期间可能会抑制,TFF2分泌可能会减少,直到胃的消化功能完成,恢复恢复活跃。
确认
这项工作是支持的癌症研究活动。JIS感谢癌症研究活动的研究资助和JLN谢谢阿斯特拉基础临床研究奖学金。我们感谢教授OFW詹姆斯和艾伦的建议和帮助在本研究的《盗梦空间》的讨论。