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摘要
背景及目的已有研究表明，生长抑素类似物奥曲肽对内脏疼痛的镇痛作用涉及外周机制。我们评估了奥曲肽对大鼠毒性结直肠扩张反应的影响。
方法在一项行为学研究中，在静脉注射奥曲肽或鞘内注射奥曲肽之前和之后，对结直肠膨胀的升压和肌电图反应进行了评估。在骨盆神经传入纤维记录中，在奥曲肽前后测试支配结肠的机械敏感纤维对有害结直肠膨胀(80毫米汞柱，30秒)的反应。
结果奥曲肽在静脉给药时不能减弱正常或醋酸炎症结肠对结直肠膨胀的反应，但在鞘内给药时反应减弱。大剂量奥曲肽(0.5 μg/kg ~ 2.4 mg/kg)对未处理结肠、乙酸处理结肠或酵母聚糖处理结肠中传入纤维对毒性结直肠膨胀的反应没有改变。
结论奥曲肽对大鼠内脏痛觉无外周(盆腔神经)调节作用。奥曲肽在内脏痛觉模型中的抗痛觉作用是由中枢部位的作用介导的。
- octreotide
- 结直肠扩张
- 肌的反应
- 传入纤维
- 发自内心的痛苦
- 镇痛效果
- 老鼠
本文中使用的缩写
- 肠易激综合症
- 肠易激综合症
- CRD
- 结直肠扩张
- 肌电图
- 肌动电流图
- 地图
- 平均动脉压
- VMR
- 内脏运动的响应
- HAc
- 醋酸
- 缓释肥
- 刺激反应函数
- SSTR
- 生长激素抑制素受体
数据来自Altmetric.com
不适和疼痛是功能性肠道疾病(如肠易激综合征)患者的常见抱怨。IBS症状管理的治疗策略多种多样，而且大多不成功。1然而，一些临床研究表明，生长抑素类似物奥曲肽可以减轻正常受试者结肠球囊扩张所产生的不适和疼痛2，3.肠易激综合征患者。4，5
奥曲肽的作用部位和作用机制尚不清楚。生长抑素及其受体已在外周神经系统中被检测到6 - 9生长抑素有抑制大鼠膝关节传入纤维的作用。10没有直接的证据支持奥曲肽抑制内脏传入纤维，尽管这一作用部位已被一些作者提出。2，11因此，本研究的目的之一是在内脏痛觉大鼠模型中测试奥曲肽的外周作用。由于外周组织中的炎症介质可能改变感觉信息的处理，奥曲肽在急性结肠炎症中的作用也进行了测试。
奥曲肽镇痛作用的中心部位也存在证据。在一些临床报告中，发现奥曲肽脊髓输注可以缓解疼痛。12，13Chrubasik和同事们表示支持14报道了鞘内生长抑素-14减轻了一系列癌症患者的疼痛。生长抑素定位于脊髓背角浅表的初级传入纤维末端6，15脊髓应用生长抑素可抑制痛觉性背角神经元。16因此，本研究的第二个目的是评估奥曲肽在内脏痛觉中的脊椎作用部位。
材料与方法
雄性Sprague-Dawley大鼠体重340-580 g (Harlan, Indianapolis, Indiana, USA)，用戊巴比妥钠麻醉(40 - 45mg /kg腹腔注射;Nembutal, Abbott Laboratories，北芝加哥，伊利诺伊州，美国)。股动脉和静脉分别插管测量动脉压并给予戊巴比妥钠或药物。在行为和电生理实验结束时(见下文)，大鼠被过量静脉注射戊巴比妥杀死。该实验方案得到了爱荷华大学动物护理和使用委员会的批准。
行为研究
特氟龙涂层不锈钢丝电极(Cooner Wires, Chatworth, California, USA)被缝合到腹股沟韧带正上方的外斜肌组织，用于肌电图(EMG)记录。动脉和静脉导管和肌电图电极经皮下隧道植入，并置于颈后。在一些实验中，鞘内导管(PE10, 8.5 cm)通过寰枕膜的狭缝延伸至腰椎肿大。在这些实验中，鞘内导管与动脉导管和肌电图电极一起外置于颈后。从麻醉中恢复后，在测试前将大鼠分开安置至少三天。
对于结直肠膨胀(CRD)，在肛门内将一个长6 - 7cm，直径2 - 3cm的球囊插入降结肠和直肠。气囊导管通过低容量压力传感器连接到膨胀控制设备(生物医学工程，爱荷华大学，爱荷华市，爱荷华，美国)，并持续监测结肠内压力(见Gebhart和Sengupta)17详情)。清醒大鼠的CRD会导致两种容易量化的伪情感(即脊柱-球-脊髓)反应18:平均动脉压(MAP)增加，腹部和后肢肌肉组织收缩，称为内脏运动反应(VMR)。通过测量外斜肌肌电图活动来量化VMR。动脉导管连接到低容量压力传感器(Cobe Labs, Linkwood, Colorado, USA)，肌电图信号被放大(×10 000, 300-1000 Hz)并滤波(200 Hz高通，4极Butterworth;图形均衡器，雅马哈)。扩张压、动脉压和肌电图在1000hz (DT280, Data Translation, Marlboro, Massachusetts, USA)下进行数字化处理，并使用ASYST编写的程序进行处理。肌电图信号被校正，平均超过500毫秒，将有效采样降低到2 Hz。所有信号均在线查看，并记录以供后续分析。
CRD采用阶梯扩张法。19简单来说，从0毫米汞柱开始，在大约80秒内逐步增加结肠内压力(10-20毫米汞柱)，直到最终压力为80毫米汞柱。在每个扩张步骤的最初5秒内量化MAP和EMG的变化。在结肠内灌注生理盐水或1ml 5%醋酸(HAc) 6小时后，每隔4分钟给予3至5次阶梯扩张。20.建立用药前的基线反应幅度和阈值。奥曲肽使用单剂量或累积给药模式静脉注射或鞘内给药;在给药4分钟和8分钟后给予两次楼梯扩张，然后进行下一剂量的药物(鞘内研究)。
单纤维记录
气管插管是为了让室内空气人工通气。动脉内给药，导管通过左颈总动脉进入降主动脉。连续监测平均动脉血压，维持>80 mmhg，根据需要静脉注射5%的生理盐水葡萄糖1-1.5 ml。在左侧外侧开一个3-4厘米长的切口，露出下腹。盆腔神经与周围组织分离，用一对特氟龙涂层不锈钢丝包裹，顶端剥离，并用非活性Wacker凝胶(Wacker硅胶公司，Adrian, MI, USA)密封。脊髓通过椎板切除术(T13-S2)暴露，并覆盖温矿物油(37°C)。从S1背根的盆腔神经传入纤维远端切割端进行记录。背侧的细根被分裂成细丝以获得单个单位。用单极氯化银电极记录单个单元的电活动。动作电位通过模拟延时连续监测，并通过低噪声交流差分放大器进行初始放大后显示在存储示波器上。 Action potentials were processed through a window discriminator and counted (one second binwidth) using the spike2/CED 1401 data acquisition program. Peristimulus time histograms, intracolonic pressure, and blood pressure were displayed on line continuously. All parameters were also recorded for off line analysis.
首先通过电刺激盆腔神经(3-8 mV单次0.5 ms方波脉冲)确定盆腔神经输入S1背根。纤维根据传导速度进行分类;传导速度<2.5 m/s的被认为是无髓C纤维，传导速度>2.5 m/s的被认为是薄髓Aδ纤维。如果纤维对CRD有反应，则测定其对5、10、20、30、40、60、80和100毫米汞柱相膨胀压力的反应，每隔4分钟30秒;随后在这些实验中使用有害强度的CRD(80毫米汞柱，30秒)。
对于急性结肠炎症，取下球囊，经肛门内注入1.5-2 ml 5% HAc生理盐水至降结肠。刺激物在结肠中停留15分钟，用温生理盐水冲洗结肠，然后球囊重新插入。其他大鼠接受同样的载体(生理盐水)处理。在3只大鼠中，去除球囊，将zymosan (25 mg/ml, 2 ml在30%乙醇中)注入结肠，作为CRD反应的第二个敏化模型。21在结肠内治疗30分钟后，再次置入球囊并研究80mmhg CRD的反应。
研究了奥曲肽对力敏传入纤维对80 mm Hg CRD的响应。奥曲肽采用累积剂量模式经动脉内或静脉给药。每次给药时间均在发胀前90秒。对未处理结肠和HAc或zymosan处理结肠中记录的纤维进行药物反应测试。作为阳性对照，kappa阿片受体激动剂u50488减弱盆腔神经传入纤维对有害膨胀的反应，22，23在奥曲肽测试后进行了两次测试。
数据分析
用非参数Wilcoxon检验比较给药前后静息肌电图活性和MAP的差异，以确定这些参数的变化是否可归因于药物作用。构建了剂量-反应关系，以显示在无害(20 mm Hg)和有害(60 mm Hg)膨胀强度下反应幅度的剂量依赖变化。
传入纤维的静息活性在CRD前计算60秒，对扩张的响应被确定为扩张期间放电的增加超过其静息活性。采用方差分析(ANOVA)对重复测量结果进行分析。
所有数据均以均值(SEM)表示。p<0.05为差异有统计学意义。
药物
市售的醋酸奥曲肽(Sandostation;Sandoz Pharmaceutical Co.， East Hanover, New Jersey, USA)全程使用。奥曲肽是一种环状八肽;醋酸盐的分子量为1019.3。U50,488(分子量465.4)购自Research Biochemicals Inc. (Natick, Massachusetts, USA)。Zymosan购自Sigma Chemical Co. (St Louis, Missouri, USA)。
结果
行为研究
所有大鼠对分级强度CRD (10-80 mm Hg, 20秒)的内脏运动和压力反应均单调增加(图1，2)．在6小时前用盐水(21 (3)mmhg)或5% HAc (18 (2) mmhg)进行结肠内治疗的大鼠，80 mmhg CRD的平均最大压力反应没有差异，这与该模型的先前结果一致。20.在80 mm Hg CRD下，盐水和HAc处理的大鼠VMR的反应幅度分别为对照组的150(10.6)%和249 (21)% (p<0.05)，表明对有害强度的膨胀(即痛觉过敏)的反应增强。20.反应阈值无变化。
奥曲肽(100 μg)静脉注射盐水和醋酸处理大鼠(灌胃)前后，内脏运动(A)和加压(B)对结直肠膨胀反应的刺激-反应函数(SRFs)。折线表示对80 mm Hg膨胀的控制响应为100%。所有数据均表示为最大控制响应的百分比(平均值(SEM))。n的基础是用于构建每个SRF的大鼠数量。*与对照组差异显著(ANOVA)。
在盐水和醋酸处理大鼠的鞘内累计剂量奥曲肽(5 ~ 15 μg)给药前后(灌胃)，内脏运动(A)和加压(B)对结直肠膨胀(CRD)反应的刺激反应函数(SRFs)。折线表示对80 mm Hg膨胀的控制响应为100%。所有数据均以对照响应百分比(平均值(SEM))表示。n的基础是用于构建每个SRF的大鼠数量。鞘内奥曲肽剂量依赖性地减弱了盐水处理大鼠对CRD的内脏运动(A)和加压(B)反应。
单剂量奥曲肽(100 μg/kg)对盐水或HAc处理大鼠的VMR无影响(图2)1)．然而，奥曲肽显著减弱了对CRD的反应中MAP的增加，但仅在HAc治疗的大鼠中(图2)1)．奥曲肽使HAc处理大鼠对80 mm Hg CRD的平均最大压力反应从20.5 (3.8)mm Hg降低到10.6 (3.6)mm Hg。在所有强度测试下的响应幅度较小，对响应阈值没有明显影响。奥曲肽对两组静息MAP均无影响(生理盐水处理135.8 (3.3)mm Hg;HAc处理134.2 (4.5)mm Hg。
在鞘内给药时，奥曲肽剂量依赖性地减弱了盐水处理大鼠对CRD的内脏运动和加压反应(图2)．奥曲肽(10和15 μg)显著降低了应答量，提高了VMR阈值。在HAc治疗大鼠中，奥曲肽对VMR影响不大，差异无统计学意义。这可能反映了结肠内灌注HAc产生的内脏痛觉过敏(见上文和Burton和Gebhart20.)．对HAc治疗大鼠的升压反应收集了不完整的数据。
单纤维研究
通过对骨盆神经的电刺激和对CRD的反应，研究了分散的S1背根中共有15条传入纤维。10根纤维为有髓Aδ纤维(平均传导速度13.0 (1.9)m/s)， 5根纤维为无髓C纤维(平均传导速度2.0 (0.2)m/s)。在降结肠球囊存在的情况下，11个纤维表现出持续放电(平均1.0 (0.3)imp/s;范围0.01 - -3.2)。所有15种纤维都表现出对CRD分级强度(5-100 mm Hg)的反应，并且都对CRD增加的压力做出单调的反应，这些压力与刺激有关。没有一种能快速适应提示粘膜传入纤维的反应。累积性血管内给药奥曲肽不影响13种机械敏感骨盆神经传入纤维对毒性CRD的反应。数字3.举例说明奥曲肽对两种不同的Aδ传入纤维对非炎症结肠和zymosan炎症结肠CRD的反应缺乏影响。注意结肠内灌注zymosan后对CRD的反应增强(即致敏)，而奥曲肽对其没有影响。两种纤维，其中奥曲肽没有减弱对CRD的反应，随后用U50,488，一种kappa阿片受体激动剂进行了测试。U50,488例患者对CRD的反应减弱3.)，正如我们先前所记录的。22，23
奥曲肽累积全身给药对骨盆神经传入纤维对毒性结直肠膨胀(CRD)反应的影响(80 mm Hg, 30秒)。奥曲肽对不同Aδ传入纤维对未炎症结肠(A)和发酵酵母炎症结肠(B)的CRD反应缺乏影响的例子。结肠内注射发酵酵母(25 mg/ml, 2 ml在30%乙醇中)30分钟后，(B)中的纤维被敏化(反应量从679 imp/30s增加到897 imp/30s，增加到发酵酵母前对照(“C”)反应的132%)。奥曲肽按箭头所示的累积剂量经动脉内注射。纤维的反应以刺激周时间直方图(一秒宽度)表示;膨胀压力(80毫米汞柱，每四分钟30秒)如下所示。在(C)中，U50,488 (16 mg/kg)对先前接受累积剂量奥曲肽(2.4 mg/kg)的纤维的影响显示出来。
数字4总结了未处理(n=8)和HAc (n=2)或zymosan (n=3)处理的结肠在大范围累积剂量奥曲肽存在时纤维的个体反应。当奥曲肽剂量为50和100 μg/kg时，两种传入纤维对CRD的反应均无抑制(数据未显示)。
奥曲肽对个别盆腔神经传入纤维对毒性结直肠膨胀的反应无剂量依赖效应(80 mm Hg, 30秒，作为对照组的百分比)。奥曲肽不能减弱骨盆神经传入纤维的反应，无论是未处理的结肠还是发酵聚糖处理的结肠。
讨论
目前的研究已经证明了奥曲肽在内脏痛觉模型中的剂量依赖的抗痛觉作用，但仅当它被给予鞘内空间。在未麻醉的大鼠中，奥曲肽全身给药对减弱CRD的脏器运动或加压反应无效。之前的研究24报道了同样剂量的奥曲肽(100 μg/kg静脉滴注)明显降低了小鼠的急性心肌梗死德戊巴比妥麻醉大鼠对CRD的加压反应。我们在McKeen和同事报道奥曲肽的同时测试了奥曲肽的效果24使对CRD的反应减弱约80%。他们还报告了随后的奥曲肽(100 μg/kg静脉注射)无效。然而，在我们在一些实验中采用的累积鞘内给药模式中，奥曲肽的作用是剂量依赖性的，没有明显的过敏反应或脱敏。目前尚不清楚为什么这些报告的结果存在差异。这可能是奥曲肽给药后在不同的外周和中心室的分布和浓度不足。然而，这似乎不太可能，因为同样的剂量，同样的给药途径，在其他人手中是有效的。24有文献记载麻醉影响对CRD的反应18这可能是造成实验结果差异的主要原因。
在未炎症的醋酸或酵素炎症结肠中，奥曲肽的累积剂量为0.5 μg/kg ~ 2.4 mg/kg，也不影响盆腔神经传入纤维对毒性CRD的反应。作为阳性对照，两种相同纤维的反应被kappa阿片受体激动剂U50,488减弱。因此，这里研究的机械敏感骨盆神经纤维与之前研究的相似，22，23都能被周围的药物作用所调节。McKeen等报道了奥曲肽的调节作用24是由于一个外围部位的作用，在这里测试的大范围剂量应该揭示了一个影响。另外，奥曲肽的外周效应可能作用于此处未研究的部位(例如，腰椎结肠，内脏或迷走神经)。结肠的盆腔神经支配是奥曲肽最有可能的外周候选作用部位，原因如下。当在大鼠盆腔神经末端的脊髓节段(L6-S1)鞘内给药时，奥曲肽剂量依赖性地减弱了对CRD的反应。此外，当骨盆神经被横切时，对CRD的内脏运动和压力反应几乎消失(S Coutinho和GF Gebhart，未发表的观察)。奥曲肽对迷走神经传入输入的可能影响，可能会激活完整动物脑干的下行调节系统，但不会被注意到，因为骨盆神经传入纤维记录在分散的S1背小根。因此，我们解释目前的结果支持在内脏痛觉模型中奥曲肽的中枢(可能是脊柱)作用部位。
奥曲肽对人体内脏疼痛的镇痛作用不影响结肠张力或依从性。3.，5Plourde和同事2Chey和同事11结论奥曲肽的镇痛作用是在外周部位产生的。Chey和同事11比较奥曲肽全身给药前后直肠刺激产生的脑和脊髓诱发电位。他们报告奥曲肽使脊髓诱发电位降低51%，大脑诱发电位降低35%，结论是奥曲肽的作用部位是在脊髓传入神经上。相比之下，Johnston和他的同事25发现奥曲肽对健康志愿者食管球囊扩张所产生的三个皮层诱发电位峰的振幅和潜伏期均无影响。然而，奥曲肽确实显著增加了第一感觉的阈值体积，作者推测这是一种外周作用部位。Plourde和同事2发现直肠内注射利多卡因阻断了奥曲肽对慢性强直性直肠扩张反应阈值的增加，并得出奥曲肽对直肠感觉的抑制作用可能是对粘膜传入神经的外周效应，也可能是对接受粘膜和非粘膜传入神经汇流输入的背角神经元的脊髓效应。所有研究的盆腔神经纤维都是肌肉传入纤维，对阶段性结直肠膨胀有反应;没有对粘膜传入纤维进行研究，我们不能排除奥曲肽作用的外周粘膜部位。然而，我们认为这不太可能，因为对气球膨胀作出反应的机械敏性粘膜受体数量相对较少，很少编码刺激的强度。
在感觉背根神经节中存在生长抑素免疫阳性细胞已被一些研究人员记录(见Lawson)26概述)。最近的报道显示，只有小型和中型大小的周核具有生长抑素免疫反应性，这表明生长抑素与无髓鞘和薄髓鞘的感觉轴突有关(例如，见Hanesch和同事)27)，其中许多可能是伤害感受器。的确，在有害的外周刺激后，生长抑素会在脊髓中释放。28有趣的是，在两项研究中没有发现生长抑素免疫阳性的内脏传入29，30.但最近的一份报告记录了大鼠体内含有生长抑素的结肠感觉神经元的存在。31在脊髓中，生长抑素免疫阳性纤维大量出现在背角浅处，这是痛觉传入纤维终止的区域。32，33然而，并非所有这些纤维末梢都是初级传入来源，许多末梢来自于背浅角中含有生长抑素的细胞。椎板I-III中大量的脊髓神经元含有生长抑素，但不含GABA或甘氨酸，这表明它们不是抑制性脊髓间神经元。34生长抑素受体(SSTRs)被定位于外周，包括胃肠道和中枢神经系统。在胃肠道中，SSTRs存在于胃、小肠和结肠的黏膜中，包括大鼠胃粘膜中的肠嗜铬素样细胞和人类结肠中的肿瘤中。35-37在炎症的人类肠道中，SSTRs的表达增加，提示参与炎症性肠道疾病的病理生理学。38发现5种sstr的mrna广泛分布在大鼠中枢神经系统和内脏器官中。39奥曲肽与SSTR2结合的亲和力最大，被发现广泛分布在大脑中(杏仁核、皮层、下丘脑和海马体最高)，主要分布在胃和外围的胰腺。
大剂量范围的奥曲肽系统给药不能减弱分散的骨盆神经传入纤维对毒性CRD的反应，这证明了一个中枢作用部位。这与先前关于皮肤痛觉模型的报道一致。Betoin和他的同事40报道了生长抑素类似物vapreotide给药大鼠足部时不能减轻卡拉胶诱导的痛感，但系统给药(皮下给药)有效。他们还报告了vapreotide在小鼠热板试验中有效，该试验被认为只对中枢作用镇痛药敏感。查普曼和迪肯森表示支持41发现鞘内给药生长抑素类似物抑制神经元对后爪注射福尔马林的反应，而皮下给药仅对最初的早期福尔马林反应有效，除非使用了相当高的剂量(在这种情况下，两种反应都受到影响)，这表明药物对第二阶段的影响取决于中枢神经系统中的受体。其他作者也研究了生长抑素或其类似物对脊髓伤害感受加工的影响，报告了背角神经元对有害刺激的反应减弱。16，42，43因此，有充分的证据表明生长抑素可以直接影响背角神经元，而在内脏痛觉模型中报道的奥曲肽的剂量依赖性抗痛觉作用表明奥曲肽的作用中心部位。作为支持，生长抑素及其类似物在鞘内注射或脊髓灌注后的镇痛作用已在人和动物中得到证实12 - 14，16，44-46最近的一份报告记录了生长抑素对皮层神经元的影响。47目前的结果与这一解释相一致，即报道的奥曲肽对内脏疼痛的有效性产生于作用的中心部位。
致谢
作者们感谢Mike Burcham制作的图表和Susan Birely的秘书支持。国家卫生研究院NS-19912奖资助。X Su部分得到了英国Sandwich的Pfizer Central Research的支持，MB Burton则得到了T32 GMO7069的支持。
本文中使用的缩写
- 肠易激综合症
- 肠易激综合症
- CRD
- 结直肠扩张
- 肌电图
- 肌动电流图
- 地图
- 平均动脉压
- VMR
- 内脏运动的响应
- HAc
- 醋酸
- 缓释肥
- 刺激反应函数
- SSTR
- 生长激素抑制素受体
参考文献
脚注
↵†现地址:美国南达科他大学生物化学和医学生物学系，414E Clark Street, Vermillion, SD 57069
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