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摘要
背景:克罗恩病是人类主要的慢性炎症性肠道疾病之一。虽然其病因尚不清楚，但其复杂的发病机制涉及环境、免疫和遗传因素。CARD15是第一个与克罗恩病易感性有关的易感基因，已知仅在单核细胞中表达。然而，其在原位的表达尚未被研究。
目的:分析克罗恩病患者和对照组结肠样本中CARD15的组织分布并鉴定产生CARD15的细胞。
患者及方法:我们通过免疫组织化学、原位杂交和逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)分析了8例克罗恩病患儿和9例对照组结肠手术标本中CARD15基因的表达。
结果:我们发现CARD15仅存在于正常结肠巨噬细胞的细胞质中。在克罗恩病病变中检测到CARD15表达增加。卡15阳性细胞在克罗恩病病变区多于未受累区。在克罗恩病中，肠上皮细胞、巨噬细胞及其衍生物都过量产生CARD15。为了进一步评估CARD15在肠上皮细胞中的表达，我们对新鲜分离的肠上皮细胞进行了RT-PCR，结果表明，这些从克罗恩病样本中分离出来的细胞比对照的肠上皮细胞含有更多的CARD15 mRNA。
结论:我们已经证明，活动性克罗恩病的结肠受累与巨噬细胞和肠上皮细胞中CARD15基因表达的增加有关。因此，这种放松可以影响宿主-环境的相互作用，从而有助于该疾病的发病机制。
- CARD15 / Nod2
- 克罗恩氏病
- 巨噬细胞
- 上皮细胞
- 结肠
- 乳糜泻，克罗恩病
- CARD, caspase招募域
- LRR，富亮氨酸重复序列
- 有限合伙人,脂多糖
- PGN,肽聚糖
- PAMP，病原体相关分子模式
- NFκB，核因子κB
- RT-PCR，逆转录聚合酶链反应
- IEC，肠上皮细胞
- ISH，原位杂交
- TLR, toll样受体
- 肿瘤坏死因子α
数据来自Altmetric.com
- 乳糜泻，克罗恩病
- CARD, caspase招募域
- LRR，富亮氨酸重复序列
- 有限合伙人,脂多糖
- PGN,肽聚糖
- PAMP，病原体相关分子模式
- NFκB，核因子κB
- RT-PCR，逆转录聚合酶链反应
- IEC，肠上皮细胞
- ISH，原位杂交
- TLR, toll样受体
- 肿瘤坏死因子α
克罗恩病(CD)是一种慢性炎症性肠道疾病，起源复杂，具有环境因素，在遗传易感患者中可能由肠道细菌驱动的不适当或加剧的免疫反应。1 -，4在正常情况下，黏膜细胞有助于维持对腔内抗原刺激的局部适当反应，而乳糜泻的主要反应是th1型反应，具有高水平的白介素12、白介素18和干扰素γ。5 -，10相反，白细胞介素10和转化生长因子β等细胞因子具有反调节作用，并与疾病预防有关。11日,12环境因素如烟草和肠道菌群的作用也被确定。7利用定位克隆策略，发现了一个新的基因NOD2Gene，最近改名CARD15，2作为第一个乳糜泻易感基因在先前定位到16号染色体的位点。13该基因是细胞凋亡调节因子CED4/APAF1家族的成员，编码至少三个结构域的蛋白质14:两个氨基端caspase招募结构域(CARDs)连接到一个核苷酸结合结构域，以及一个C端部分包含富亮氨酸重复序列(LRR)。该LRR结构域可授予对细菌产物的反应性。CARD15最初被认为参与了脂多糖(LPS)反应途径，15但最近的一项研究表明，细菌肽聚糖(PGN)是通过CARD15诱导核因子κB (NFκB)激活的主要病原体相关分子模式(PAMP)。16LRR结构域或邻近区域的三种主要变体与CD相关，这表明PGN反应中的缺陷可能会导致CD易感性。的参与CARD15可以为影响这种疾病发展的几个因素提供一个统一的解释。首先，CARD15响应细菌细胞壁成分，将腔内细菌与CD连接起来。其次，LRR结构域突变影响其感知功能，导致NFκβ/Rel通路异常激活，在CD中异常激活。17第三，最近的研究表明CARD15基因与回肠受累、发病年龄小、肉芽肿形成频率高相关，一些基因表明它们与瘘和/或纤维狭窄表型相关。18岁，22因此CARD15对乳糜泻的发病机制有更深入的了解，现在需要分析健康组织和病变组织中CARD15基因的表达。体外研究表明CARD15基因仅在单核细胞中表达。2，14然而，关于CARD15基因在健康受试者或乳糜泻患者组织中的原位表达，特别是在结肠，即暴露于腔内细菌的主要部位，所知甚少。本报告描述了CARD15的组织分布，并在CD患者和对照组的结肠样本中鉴定了产生CARD15的细胞。
材料与方法
手术标本
手术标本取自8名患有乳糜泻的儿科患者(4名女性，4名男性，平均年龄14岁(3.25岁)。肠切除指征为药物治疗失败(n=6)、穿孔(n=1)或肠狭窄(n=1)(表1)⇓）.根据临床、内镜和组织学标准诊断乳糜泻。6例出现上皮样和巨细胞肉芽肿(表1)⇓）.如前所述，三个主要的CD相关CARD15突变进行了基因分型。18
由于在儿童中很难获得正常的结肠样本，对照是9个来自赫什普隆氏病患者未受病部位的手术标本(4名女性，5名男性，平均年龄5个月)。炎症对照为2例急性阑尾炎。冷冻组织切片用于免疫组化和原位杂交。
结肠上皮细胞和外周血单个核细胞的分离
如Toy及其同事所述，从结肠标本中分离和纯化上皮细胞。23结肠取自4名CD患者(2男2女，平均年龄34(6.5)岁)和5名对照组(4男1女，平均年龄59(14)岁)，均为憩室炎(n=3)或结肠癌(n=2)，均行结肠切除术。将粘膜层从肌肉层和浆膜层剥离，并在含有0.5 mM DTT的RPMI中孵育。粘膜碎片用不含钙和镁的Hank’s平衡盐溶液冲洗，辅以热灭活胎牛血清(5%)，l-谷氨酰胺和500mm EDTA。上皮细胞收集在一个Percoll梯度界面。台盼蓝染色评价上皮细胞活力大于85%。经过几次清洗后，细胞被冷冻在- 20°C。逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)如下所述。比较肠上皮细胞(IEC)中CARD15 mRNA水平与外周血单个核细胞中CARD15表达水平(2×106/ ml)按Ficoll梯度分离，并从5例既往对照患者中的4例中采集。
免疫组织化学
将冷冻组织切片(7 μm)，用100%丙酮固定，- 20℃保存。我们使用了两种兔多克隆抗体，一种针对LRR区域(来自G Thomas教授的礼物，详情见下文免疫血清)，另一种针对CARD15的CARD域(Cayman Chemical, Ann Arbor, USA)。切片在pH 7.6的Tris HCl中清洗两次，并在含有1%聚合牛白蛋白的缓冲液中短暂清洗。然后将它们与两种阻断试剂(10%正常人血清和10%正常山羊血清)孵育30分钟，并将一抗在稀释试剂(Biogenex, San Ramon, California, USA)中稀释至1/1400(抗lrr)和1/1000(抗card)，室温孵育1小时。使用Biogenex公司的Stravigen Multilink Kit检测CARD15，其中Multilink是生物素化的，标签是过氧化物酶偶联链霉亲和素。阴性对照通过省略一抗和重组CARD15-LRR蛋白孵育制备。采用PCR扩增CARD15-LRR编码cDNA，用SfiI-NotI克隆到pTrc Ha-His (Invitrogen, Rockville, USA)中。将含有组氨酸标签的重组蛋白(密码子578 ~ 1039)表达于大肠杆菌使用NiNTA Superflow (Quiagen, Valencia, California, USA)色谱柱(Bio-Rad, Marnes La Coquette, France)进行纯化。通过考马斯蓝染色和anti-His western blot实验(数据未显示)验证所制备的重组蛋白的大小和特异性。
免疫血清、转染和免疫荧光
用CARD15残基1030-KLGCRDTRLLL-1040对应的11 mer肽段免疫兔(Spi-Bio;开曼群岛化学)。编码全长CARD15 (EMBL接入号CAC42117)的整个cdna(约3.1 kb对)在CMV启动子(Stratagene, La Jolla, California, USA)的控制下克隆。HeLa细胞以10的密度被镀5细胞/室在六孔板上，使用Dulbecco的改良Eagle培养基(Life Technologies, Invitrogen)，辅以10%的胎牛血清、抗生素和谷氨酰胺培养。用于免疫荧光实验的HeLa细胞使用dmry - c (Life Technologies, Invitrogen)与500ng CARD15编码pBK-CMV载体脂质体转染24小时，按照制造商的说明进行。细胞固定在3%的多聚甲醛中，在磷酸盐缓冲盐水中冲洗，渗透，并在含有0.2% Triton X100和0.1%牛血清白蛋白的缓冲液中阻塞。然后依次用抗card15多克隆抗体孵育HeLa细胞，然后用山羊抗兔继发IgG抗体偶联FITC (Amersham-Pharmacia Biotech, Piscataway, USA)。核用DAPI染色。最后使用vectasshield (Vector Laboratories, Burlingam, California, USA)和由Zeiss Axioplan共聚焦荧光显微镜定位的CARD15将载玻片安装到玻璃覆盖物上。
原位杂交
地高辛素标记的反义核糖探针是通过线性化含有人CARD15 cDNA片段的pBK-CMV质粒(Stratagene)获得的(CARD15序列登录号的核苷酸577-2847:NM_022162)与EcoN1结合，合成T3启动子RNA。用Bam-H1线性化质粒并使用T7启动子获得地高辛标记的意义核蛋白探针。在冷冻组织切片上进行原位杂交(ISH)实验。24在双标记实验中，我们使用CARD15反义探针进行ISH，并使用针对上皮细胞的抗细胞角蛋白抗体(Dako, Glostrup，丹麦)进行免疫组化，采用三级免疫过氧化物酶法。
半定量RT-PCR检测人CARD15
整个结肠的手术标本立即冷冻在冷冻管中，并保存在−80°C。所有样品在提取RNA前进行检查。采用RT-PCR方法检测冷冻手术标本和纯化的IEC中β-actin和CARD15基因的表达。根据制造商的说明，将标本置于RNA B (Q Biogene, Illkirch, France)中，并加入35 μl的无RNA水。使用无DNA试剂盒(Ambion, Austin, Texas, USA)在37°C下进行DNAse酶解30分钟。使用SuperScript版本II (Gibco BRL, Grand Island, New York, USA)和oligo(dT)对2 μg总RNA进行逆转录合成互补DNA。12 - 18引物(Gibco BRL)。阴性对照为不含逆转录酶的上述反应。使用Taq聚合酶(Gibco BRL)扩增CARD15，在以下条件下进行35个循环:95℃(40秒)，58℃(45秒)退火，72℃延伸(1分钟)，最终在72℃延伸5分钟。在94°C(1分钟)、60°C(1分钟)和72°C(1分30秒)的条件下，进行30多次PCR扩增β-actin。用于CARD15扩增的引物对为5 ' -AGCGAGACTGAGCAGACAC-3 '(上游)和5 ' -CAGGTTGCCGATCTTCACAC-3 '(下游)，扩增出197 bp的片段;β-actin序列为5 ' -GGGTCAGAAGGATTCCTATG-3 '(上游)和5 ' -GGTCTCAAACATGATCTGGG-3 '(下游)，扩增片段为237 bp。用NIH Image 1.62软件对扩增产物进行凝胶电泳和计算机辅助密度测定分析。
PCR产物经核苷酸测序确认为CARD15。所有测序均使用双脱氧终止剂化学(perkins - elmer, Foster City, California, USA)进行，并在自动DNA测序仪上电泳。
结果
CARD15在结肠手术切除标本中的免疫组化分布
两种CARD15抗体的检测结果相同。对照结肠样本中，在表面上皮下的固有层浅表部分含有分散的阳性单个核细胞(图1A)⇓）.这些阳性细胞细胞质丰富，核泡状，呈组织巨噬细胞样，细胞质中检出CARD15(图1A)⇓插入)。对照的结肠样本中不含其他产生CARD15的细胞类型。乳糜泻结肠标本中含有许多产生CARD15的单个核细胞，它们在固有层形成簇(图1B, 1C)⇓）.它们也在粘膜下层和肠道的深层发现，通常在血管周围(图1C)⇓插入)。CARD15阳性细胞数与炎症浸润强度相关，在溃疡部位较高。也有含有上皮样细胞和巨细胞的肉芽肿，对CARD15进行免疫染色(图1D)⇓）.除巨噬细胞和相关细胞外，IEC的细胞质中也含有CARD15。在严重炎症的CD样本中，这些CARD15阳性上皮细胞在上皮和腺室中均有发现(图1C, 1E⇓）.在炎症程度较轻的CD样本中，上皮细胞的免疫染色强度较低，仅在少数腺体和腺体内的部分上皮细胞中观察到CARD15。我们在淋巴滤泡或上皮内淋巴细胞中未检测到CARD15，但淋巴滤泡周围的上皮细胞表达CARD15(图1B)⇓）.无论是否忽略CARD15抗体，阴性对照均无染色(图1E⇓(插入，底部)或重组CARD15预孵育后(图1E⇓，插入，顶部)。
使用抗CARD15多克隆抗体和正常结肠(A)和发炎的克罗恩病结肠(B-E)的冷冻组织切片进行免疫组化，通过共聚焦荧光显微镜观察CARD15在人细胞中的亚细胞分布(F)。(A)在正常黏膜中可见上皮表面下分散的单核细胞，看起来像巨噬细胞(插入)。克罗恩病结肠固有层中含有大量阳性细胞，而淋巴滤泡内未检测到CARD15表达(B，插入(*))。在结肠深层和血管周围也检测到阳性细胞(C，插入)。肉芽肿中的上皮样细胞和巨细胞(D)以及浅表上皮细胞和腺上皮细胞也产生CARD15 (B，插入;C, E)。(E，插入)阴性对照(使用重组蛋白和一抗遗漏)显示无背景染色。(F)细胞核用DAPI染色(蓝色)。原始放大倍率×160在(B)， ×250在(A)， ×400在(A，插入)，(C)， (D)和(E，插入)，×1000在(E)。
CARD15在人类细胞中的亚细胞分布
通过免疫荧光和共聚焦显微镜检查，发现CARD15遍布细胞质，有轻微的标点符号(图1F⇑)，如先前对CARD4/NOD1所示。与BCL-10不同，没有大的聚集物或细丝。使用HA标记的CARD15构造(数据未显示)确认了CARD15分布的配置文件。
结肠标本中CARD15 mRNA的表达
原位杂交研究
ISH证实了免疫组化数据。使用特异性CARD15地高辛标记的反义核蛋白探针进行ISH检测显示，在对照组的固有层中，只有分散的单个核细胞含有CARD15 mRNA(图2A⇓）.相反，表达CARD15 mRNA的细胞在CD样本的肠壁中大量存在(图2B)⇓)，包括肉芽肿(数据未显示)。
使用CARD15反义探针(a - d)和正常结肠(a)和炎症克罗恩病结肠(B-D)的冷冻组织切片进行原位杂交。(A)仅单个核细胞含有CARD15 mRNA，上皮细胞中未检测到CARD15 mRNA。许多表达CARD15 mRNA的细胞存在于CD黏膜(B)。表达CARD15 mRNA的上皮细胞(C)通过双标记鉴定，原位杂交检测CARD15，抗细胞角蛋白抗体免疫组化鉴定上皮细胞(D)。感觉探针没有信号(E)。原始放大倍率×250 (B)， ×1000 (A)， (C)， (D)和(E)。
IEC在CD样品中也表达CARD15 mRNA(图2B, 2C⇑)，但正常IEC未检测到CARD15(图2A⇑）.我们使用抗细胞角蛋白抗体进行了双重标记实验，用ISH和免疫组化方法检测CARD15，以证明腺体内的染色是由于上皮细胞，而不是单个核细胞浸润上皮。这些实验证实，细胞角蛋白标记的IEC也表达CARD15 mRNA(图2D)⇑）.最后用CARD15核探针进行阴性对照实验;这没有信号(图2E⇑）.
rt - pcr研究
全组织样本
在提取mRNA前检查所有样本，并记录炎症浸润的强度以及肉芽肿的存在。所有CD样品均检测到CARD15 mRNA。然而，CARD15 mRNA的数量因样品而异。CARD15 mRNA表达量与炎性浸润强度相关，与肉芽肿有无无关。相比之下，9个正常样本中只有4个被检测出CARD15。此外，CARD15 mRNA与对照β-actin的比值比(图4A⇓)在乳糜泻患者的结肠样本中明显高于对照组(对照组平均为207.77v乳糜泻组765例;未配对学生的t测试中,p = 0.0056)。
逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)分析了全结肠组织样本(A)和对照组(C)和克罗恩病(CD)患者的结肠上皮细胞(B, C)中的CARD15。(A)与对照组组织样本相比，CD患者全组织样本中CARD15与β-actin mrna水平的比值显著增加。每个柱状图代表平均值(SEM)。用NIH Image 1.62软件对扩增产物进行凝胶电泳和计算机辅助密度分析。(B)从本研究中所有CD患者和对照组的手术标本中提取的所有肠上皮细胞均检测到CARD15。(C)从CD患者提取的上皮细胞中CARD15 mRNA水平比对照组高5倍以上。对于等量的β-actin，在提取的正常上皮细胞中发现CARD15 mRNA水平与外周血单个核细胞(PBMC)相似。表示患者人数(n)。OD，光密度。
讨论
我们研究了CARD15在正常结肠和乳糜泻结肠中的肠道表达及其亚细胞定位。免疫组化和ISH实验结果完全一致，表明CARD15在正常结肠中低水平存在。然而，这一观察结果与先前基于北方印迹的报道一致，该报道未能证明可靠的CARD15在肠道组织中表达2，14(个人资料)。利用原位技术，我们发现CD患者炎症结肠中CARD15的表达量远高于正常结肠，正常结肠中仅有分散的巨噬细胞在浅表固有层中表达CARD15。已知乳糜泻结肠含有单核细胞的局灶性顶叶细胞浸润，特别是巨噬细胞、上皮样细胞和巨细胞。含有CARD15的巨噬细胞数量在整个CD结肠壁显著升高，特别是在血管附近，并与炎症浸润强度相关。这种分布与腔内腔内细菌等应激环境诱导CARD15阳性巨噬细胞的招募和激活是一致的。由于单核细胞分化为巨噬细胞、巨细胞和上皮样细胞，导致肉芽肿的形成，我们分析了CARD15在肉芽肿中的表达。肉芽肿的上皮样细胞和巨细胞都能有效地产生CARD15。通过激活NFκB, CARD15的过表达可能解释了肉芽肿内依赖于NFκB的促炎细胞因子如肿瘤坏死因子α (TNF-α)的产生。25有趣的是，在Blau综合征中发现了CARD15的突变，这是一种罕见的常染色体显性疾病，其中也有肉芽肿性炎症反应。26此外，尽管有边缘显著性统计检验，Lesage在CD患者中进行了基因型-表型相关性研究等主要显示双剂量突变患者与肉芽肿的存在相关。18因此CARD15可能在慢性炎症性疾病肉芽肿形成期间和/或之后发挥关键作用。
此前体外研究表明CARD15基因表达局限于单核细胞。2，14这项研究表明，在病理条件下，其他类型的细胞也可以产生CARD15。我们使用体外研究表明，与仅检测到非常少量CARD15的正常结肠相比，从CD患者提取的上皮细胞中CARD15 mRNA的水平高出5倍以上。在CD中，表面和腺室的上皮细胞都参与了CARD15的产生，然后，作为抵御腔内细菌的第一道屏障，IEC在很大程度上参与了CD中CARD15整体表达的增强。我们发现CARD15与几个含有CARD和相关的植物R(抗性)蛋白一样，位于细胞质中，没有任何跨膜位置。这表明它可能参与检测抗原提呈细胞中摄入的细菌(即通过PGN识别)。这种细胞质定位很重要，因为有人认为CARD15是细菌产物的胞浆内传感器。15被称为toll样受体(TLR)的跨膜受体家族是负责免疫细胞活化以响应PAMP的关键受体。TLR2和TLR4是两种主要的tlr，在IEC的顶端以低浓度组成存在。也许重要的是，TLR-4的表达在CD结肠中增强，但TLR-2(细菌PGN的胞外病原体识别受体)的表达没有增强。27因此，正常的IEC表型为顶端极TLR2低/ CARD15低， CD IEC只过度产生胞内PGN识别受体，导致特殊的表型尖极TLR-2低/胞质CARD15高。IEC通常对细胞外LPS不敏感，当细胞内存在LPS时，能够引发炎症反应。28共生肠道菌群与正常肠粘膜和谐共存，其中上皮表型为“低反应型”。然而，乳糜泻肠对腔内细菌的产物不再耐受29；由此产生的“高响应型”表型可能导致PGN在顶端极和上皮细胞细胞质内的识别增加。CARD15类似于NOD家族的其他成员，与RICK相互作用，RICK是一种分子，可转导来自先天和适应性免疫反应受体的信号，允许NFκB的激活。最近的一项研究表明，缺乏RICK的细胞对通过Nod蛋白传递的信号反应迟钝。30.最近,Tadakazu等体外实验表明，在结肠上皮细胞中，TNF-α在mRNA和蛋白水平上上调了CARD15 (AGA abstract, 2002)。最近的一项研究表明TNF-α/NFκB与CARD15之间存在联系。31这些生化数据和对急性阑尾炎中CARD15表达的观察支持CARD15可能在不同炎症过程中上调的假设。产生CARD15的细胞可能有助于保护正常个体的肠壁免受攻击。由于CARD15参与先天免疫和一般炎症过程，其过度表达，由上皮细胞中特定的PAMPs触发，可使消化道敏感，可能在允许CD发展的遗传和环境因素的背景下具有重要意义。据报道，具有CARD15基因突变的对象结肠受病的风险较低和/或回肠疾病的风险较高。18日,21然而，在慢性炎症结肠中观察到的CARD15过表达可以解释为CARD15突变或CARD15表达维持不足。尽管患者人数较少，但第一种假设似乎不太可能成立。相反，CARD15表达的调控可能因此被未知的因素所解释，例如至少一个已确定的CD遗传易感位点。
这项研究首次证明了CARD15在CD结肠中过度产生，并在巨噬细胞和相关细胞中发现，在黏膜上皮细胞中也异常存在。这种CARD15基因的异常表达可能是由遗传和环境因素之间的不适当关系所解释的。目前还需要进一步的研究来确定CARD15基因在CD和其他炎症性肠道疾病中的表达是否不同，以及腔内细菌和/或CD易感位点在诱导病理性CARD15过表达中的作用。
致谢
我们感谢病学系的Regine Paris女士和Agnes Florentin女士Hôpital Robert Debré的技术支持。