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摘要
背景与目的:最近的分子数据表明，遗传因素可能是溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)的疾病异质性的基础。染色体5q上的一个位点与乳糜泄易感性有关，最近通过连锁不平衡映射到一个保守的250kb单倍型(5q31)而得到了改进。没有关于该位点对临床表型的贡献的数据存在。在本病例对照研究中，我们研究了该单倍型对CD和UC的易感性和表型的贡献。
患者及方法:我们研究了330名白种人乳糜泻患者和457名UC患者，这些患者都是从一个英国中心招募来的。与疾病易感性和表型的关联是用从三个单核苷酸多态性重建的单倍型来分析的，这些单核苷酸多态性被选择来跨越该易感性区域。可能的遗传上位的证据IBD5寻找NOD2/CARD15。
结果:该区域的连锁不平衡被证实，两种单倍型占所有染色体的88%。对CD的易感性与普通单倍型H2的纯合子性相关，而对UC的易感性则不相关c= 0.002;相对风险(RR) 2.0)。基因型-表型分析表明，这种相关性在肛周疾病患者中特别强(pc= 0.0005;RR 1.7)，特别是在该单倍型纯合的个体中(pc= 0.0005;RR 3.0)。重要的是，在186例无肛周疾病的患者中未发现H2的相关性。之间无上位性的证据IBD5NOD2/CARD15。
结论:的IBD5单倍型风险仅与乳糜泻相关。基因型-表型分析显示，在肛周乳糜泻患者中观察到最强的相关性。虽然相关的精确基因尚不清楚，但这些数据为乳糜泻临床异质性的遗传基础提供了进一步的分子证据。
- 遗传学
- 克罗恩氏病
- 溃疡性结肠炎
- IBD5
- genotype-phenotype分析
- 乳糜泻，克罗恩病
- caspase招募结构域包含蛋白15
- IBD，炎症性肠病
- ,白介素
- PAR，人群归因风险
- 相对风险
- SNP，单核苷酸多态性
- UC，溃疡性结肠炎
数据来自Altmetric.com
慢性特发性炎症性肠病(IBD;克罗恩病(CD;MIM 266600)和溃疡性结肠炎(UC;MIM 191390)是西方世界发病率的一个重要原因，在英国发病率为200/10万。1流行病学、临床和分子研究为遗传学在决定疾病易感性方面的作用提供了强有力的证据。全基因组扫描揭示了一些易感位点:一些影响IBD的易感性，而另一些则赋予CD或UC的易感性。2 -10此外，流行病学证据表明，遗传因素也决定了CD和UC的临床异质性特征，在多患病家庭中，疾病表现年龄、位置和行为的一致性较高。11 -14越来越多的分子数据支持了这一观点。关于乳糜病，包括我们自己在内的六个独立研究小组现在报告了16号染色体(IBD1)上NOD2/caspase招募结构域含有蛋白15 (CARD15)易感基因的变异与回肠疾病之间的联系。15 -20.此外，我们还发现，HLA区域的特定扩展单倍型(IBD3)与结肠和肛周疾病相关。15这些分子数据越来越多地表明，乳糜泻不是一种单一的疾病，而是一组有限的异质寡源性疾病，表现出相似但特定的临床特征。很可能，个体表现出的精确表型取决于一个或多个遗传变异与一种未知的腔内抗原的具体相互作用。
全基因组扫描已经确定了一些其他假定的乳糜泻易感位点，但这些区域对疾病表型的贡献尚不清楚。在两项仅针对乳糜泻的研究中，已经证明了与染色体5q31-33上一个区域的联系，6，8尽管很少有UC感染家庭被研究。精细映射此轨迹，指定IBD5，定义了一个在以早期CD发病为特征的家族中实现全基因组显著性(LOD评分3.9)的区域。8通过连锁不平衡映射进一步表征该区域，确定了一个与CD相关的高度保守的250kb单倍型。21该易感单倍型包括11个仅在该单倍型上发现的单核苷酸多态性变体，所有这些都在传播不平衡试验中显示出显著性。识别这种单倍型的因果突变一直受到连锁不平衡程度和编码的免疫调节基因密度的阻碍，包括细胞因子基因簇(白细胞介素(IL)-4, IL-5和IL-13)。
该基因座对疾病表型的贡献仍然未知。在这个病例对照研究中，我们确定的关联IBD5在精确定义的CD和UC患者的大型英国队列中，具有特定疾病表型的风险单倍型。
方法
患者与对照组
本研究得到了中央牛津研究伦理委员会(COREC 00.083)的批准，并获得了所有参与者的书面知情同意。总共有330名高加索乳糜泻患者和457名UC患者被从一个单一的三级转诊中心招募。在CD患者中，240例之前曾被纳入IBD1和IBD3的研究。15IBD的诊断由常规的临床、放射学、内窥镜和组织学标准确定。22表型细节由两名研究人员(TA, AA)通过回顾性病例记录回顾2001年1月至2002年3月间所有患者获得。随访时间定义为从诊断到病例记录复查的时间间隔。关于种族、家族史和吸烟史的细节通过患者填写的邮寄问卷进一步补充。如果祖父母中有三个或三个以上是犹太人，则将其定义为犹太人。只包括一个来自多个受影响家庭的成员。
CD表型
如前所述，乳糜泻的表型按诊断年龄、位置和疾病行为进行分类。15简单地说，疾病的位置是根据三个部位(回肠、结肠、肛周)的当前或过去病史进行分类的。肛周疾病的定义是存在肛周脓肿、瘘管或溃疡，但不存在皮赘。疾病行为按当前或过去的行为类型分类。狭窄疾病的存在是通过手术史或小肠灌肠来确定的。瘘管病的定义是两个上皮表面之间存在异常通信。这包括坐骨直肠脓肿、括约肌间脓肿和盆腔直肠脓肿，如果它们与上皮表面相连，无论是自发的还是手术干预后的。然而，单纯肛周脓肿不在此定义范围内。
加州大学表型
根据疾病程度和疾病严重程度对UC表型进行分类。疾病程度由结肠镜检查或钡灌肠时发现的最近端炎症点确定。脾屈曲被用作区分局限性疾病与广泛性疾病的标志。如果同一时间点的宏观和微观范围不一致，则记录微观范围。对于经历过结肠切除术的个体，疾病程度由切除标本的显微镜范围来定义。疾病严重程度的判断依据是药物治疗失败后是否需要结肠切除术，而不是使用结肠炎活性指数或免疫抑制药物。患有不确定结肠炎或结直肠癌合并UC的患者不符合纳入条件。
对照组870人是从贝德福德郡全科医生健康筛查诊所收集的两个独立人群的匿名血液样本中随机抽取的(n=516, OXCHECK研究)23牛津郡(n=354)。这两组在年龄、性别、吸烟史和基因型(数据未显示)方面是相同的，因此将所有分析合并。虽然对照组没有人患有IBD，但没有关于他们家族史的信息。
基因分型
我们研究了三种单核苷酸多态性(IGR2060a_1 C/G, IGR2198a_1 G/C和IGR3096a_1 C/T)，这三种snp之前由加拿大的一个研究小组发现，是唯一的IBD5风险单倍型(网址:http://www-genome.wi.mit.edu/humgen/IBD5)．为了确认我们英国人群的单倍型结构和连锁不平衡的程度，这些snp是根据它们在250kb风险单倍型两端和中间的位置选择的。这些被认为在功能上不相关的snp，在这里被用作CD相关风险单倍型的标记。
所有基因分型均使用聚合酶链反应-序列特异性引物进行。24引物使用已发表的基因组序列(GenBank登录号18562169)设计。CD患者和对照组也使用之前描述的引物对NOD2/CARD15基因(R702W, G908R和1007fsinc)的多态性进行了分型(表1)。15所有反应均含有对照引物，以验证适当的扩增和电泳。所有反应都采用单一的热循环程序。产物用1%琼脂糖凝胶和溴化乙锭电泳，在紫外线下观察，并以数字方式记录图像。
数据分析
在缺乏亲本基因型数据的情况下，使用统计单倍型重建方法将横跨IBD5单倍型的三个snp构建成单倍型，并在计算机软件PHASE中实现。25这个软件被重新编译，在Macintosh OS10操作系统下运行。对于构造单倍型，使用了PHASE算法的30,000次迭代，每次迭代包括通过马尔可夫链的100次运行。然后分析每种单倍型与CD和UC易感性和表型的相关性。
用χ分析表型-基因型相关性2测试，使用知识探索者计划(安格斯，吉尔福德，萨里，英国)。在适当的地方应用Bonferroni校正因子，当应用时用p表示c．根据Schlesselman方法计算人群归因危险率(PAR%)，26假设对照人群中所有变异的频率反映了一般人群的频率。
结果
共有330名CD患者(表2)，457名UC患者(212名男性和245名女性)和870名对照组被研究。CD和UC患者的平均诊断年龄分别为28.1岁(范围3.0-82.2)和33.8岁(范围0.8-80.3)。整个队列患者的中位随访时间为14.5年(范围0.9-59.9年)。在年龄和性别方面，病例和对照组之间没有显著差异。118例(35.7%)CD患者和102例(22.3%)UC患者报告有IBD (UC或CD)家族史。
疾病的易感性
我们研究了之前报道的三种常见snpIBD5CD相关单倍型。如前所述，这三个snp中的每一个都与乳糜泻的易感性显著相关(IGR2060a_1 C: pc=0.0003，相对危险度(RR) 1.4;IGR2198a_1 G: pc=0.0003, rr 1.4;IGR3096a_1 C: pc=0.0001, RR 1.5)(表3)。
单倍型分析可能比单多态性分析信息更丰富，因为它有助于监测连锁不平衡区域内的变异。27因此，单倍型是由这三个snp构建的。在没有亲代数据的情况下，使用统计计算机软件推断出一个SNP与另一个SNP(阶段)的关联。25对99%的染色体，准确的单倍型指定概率为>90%。鉴定出8种单倍型，其中4种出现在总人群中的频率超过2%。两种单倍型(H1和H2，表4)占所有染色体的87.7%，与之前在加拿大队列中的发现相似。21只有单倍型2 (H2)与整体CD显著相关(46.8%)v38.9%;p = 0.0004, pc=0.003)(表4)。相反，H1(包括风险单倍型上缺失的等位基因)与CD呈负相关(39.8%)v控制48.8%;p = 0.00007, pc= 0.0006)。UC患者和对照组的单倍型频率没有差异(表4)。
为了研究单倍型剂量效应的存在，进行了进一步的分析(表5)。在整个CD患者中，与H2单倍型相关的风险仅见于纯合子(纯合子23.0%)v14.7% (pc=0.001, RR=2.0, 95%可信区间(CI) 1.4 ~ 2.8);杂合的47.6%v48.4% (NS))。CD风险单倍型H2的PAR%估计为20.3%。
CD表型
疾病的位置
流行病学研究表明，疾病的解剖位置是乳糜泻患者的一个稳定的决定性特征。28在本研究中，63.3%的患者在一个以上的部位有疾病。疾病位于回肠、结肠和肛周区域的患者分别为77.3%、60.9%和43.6%(表2)。
单倍型H2在144例肛周疾病患者中出现频率最高(52.1%)。与对照组相比，单倍型H2仅与两个重叠的表型亚组相关，其中一个由肛周疾病的存在定义(pc=0.0005, RR 1.7)，回肠疾病(pc=0.02, RR 1.4)(表6)。重要的是，在没有肛周疾病的情况下，回肠疾病和H2之间的关联没有被观察到(无论是在回肠组，无肛周组，还是在纯回肠组)，这表明与回肠疾病的总体关联是由于其中46例患者同时存在肛周疾病。然而，当有肛周疾病的患者与没有肛周疾病的患者进行比较时，统计学意义并不经得起严格的Bonferroni校正(肛周疾病)v非肛周:p=0.01, pc= NS, RR = 1.5)。
再次观察到单倍型剂量效应(表7)。与对照组相比，H2单倍型纯合子的患者肛周疾病风险增加了3倍(H2/H2: 25.7%)v14.7%;pc=0.0005, rr 3.0(1.8-5.0))。
IBD5和疾病部位按NOD2/CARD15状态分层
NOD2/CARD15突变最近被报道与回肠乳糜泻相关。15 -20.为了确定遗传上位的证据，与IBD5在按NOD2/CARD15状态分层后，对风险单倍型H2进行了重新分析(表8)。NOD2/CARD15阳性患者被定义为拥有至少三种常见CD相关变异等位基因中的一种。在整个CD队列和回肠疾病患者亚组中进行的分层分析表明，单倍型H2的频率在NOD2/CARD15阳性和NOD2/CARD15阴性患者之间没有差异。这表明，这些遗传位点可能在两个不同的解剖位置独立地决定疾病。因此，在107例回肠和肛周疾病患者中，发现了NOD2/CARD15变异的相关性(至少一个NOD2/CARD15变异等位基因:CD 42.1%v控制15.4%;p = 2×10−10)及IBD5危险单倍型(IBD5H2频率:CD 53.3%v控制38.9%;p = 0.00005;pc= 0.0004)。
疾病的行为
的IBD5风险单倍型与特定的疾病行为无关，也与肠外表现的存在无关。肛周疾病是否可以合理地归为“瘘”29尚不清楚，因此取决于研究定义。重要的是，没有发现与IBD5单倍型H2和瘘管病(包括肛周瘘)的风险总体(H2频率:瘘管病(n=118) 51.3%v无瘘管病(n=212) 44.3%。此外，没有关联IBD5在其他部位有瘘管的患者中，6.7%为单倍型(H2频率:瘘管性疾病，无肛周疾病(n=22) 50.0%v无瘘管病44.3%)。这些数据表明IBD5仅与肛周疾病相关，而与瘘管病无关，但后一组患者数量太少，无法得出确切的结论。
诊断年龄
早期诊断年龄与回肠相关(平均(SEM)年龄:回肠26.4 (0.7))v无回肠34.0(1.8)岁;pc=0.00001)，肛周(肛周26.0 (1.0)v无肛周29.8(1.0)年;pc=0.02)，狭窄(狭窄26.8 (0.7)v非狭窄31.5(1.5)年;pc(0.009)，瘘管病(25.3 (1.0))v不造瘘29.7(0.9)年;pc= 0.01)。在整个CD患者组中，诊断年龄之间无相关性(平均诊断年龄:H2阳性，27.4岁vH2阴性，29.8年)或有家族史(H2频率:家族史45.8%)v无家族史(47.4%)，或拥有或纯合子IBD5单体型H2。
UC疾病表型
显微镜下炎症的最近点决定了疾病的程度。在本研究中，242例(52.9%)有广泛的疾病，定义为脾屈近端炎症。没有发现与疾病程度和是否拥有或纯合子IBD5危险单倍型H2。共有124例(27.1%)患者患有严重疾病，需要结肠切除术。的IBD5风险单倍型H2与疾病严重程度无关(结肠切除术41.9%v未结肠切除术38.7%)。早期诊断年龄与广泛疾病相关(平均(SEM)年龄:广泛疾病32.2 (0.8))v远端疾病35.6(0.9)年;P =0.009)和需要结肠切除术(需要结肠切除术31.0 (1.0))v无结肠切除术35.0(1.0)年;p = 0.005)。与乳糜泻患者的发现一致，未发现与肠外表现的存在相关。此外，诊断年龄(平均诊断年龄:拥有H2 32.9v无H2 35.3年)或有IBD家族史(H2频率:家族史38.5%)v无家族史(39.9%)IBD5危险单倍型H2。
讨论
在乳糜泻中，越来越多的人认为，不仅易感性，而且临床表型都是由基因决定的。的IBD5通过连锁和传递不平衡试验，发现5号染色体上的基因座与乳糜泻的易感性有关。6，8日,21然而，这一遗传区域在决定临床特征方面的作用尚不清楚。在本病例对照研究中，我们对330名明确定义的英国白种人CD患者、457名UC患者和870名健康对照进行了研究，我们试图确定这些因素的贡献IBD5首先是CD和UC易感性，然后是表型，根据发病年龄、位置、程度和疾病行为进行分类。
的IBD5基因座最近被精确地映射为一个250 KB的单倍型。21我们选择三个snp进行基因分型，不是为了功能相关性，而是为了跨越这个易感性区域。该区域存在紧密连锁不平衡被证实，并确定了两种常见的三位点单倍型，占所有染色体的88%。通过单倍型进行关联，因为这可能提供更多信息，特别是在实际引起疾病的突变尚未确定的情况下，如在本例中。30.然而，该区域高度保守的单倍型结构，加上两种常见单倍型的高患病率，意味着单个snp几乎与单倍型分析一样具有信息量。
对乳糜泻的易感性仅与所研究的三个多态性中的每一个相关，并与常见的重构基因相关IBD5单体型H2。基因型分析显示，这种关联仅在纯合子个体中发现，与先前报道的剂量效应一致。21有趣的是，在我们的CD人群中，与单倍型H2相关的相对风险低于之前在加拿大队列中报道的风险21但与最近英国294例三组乳糜泻的多中心传输不平衡测试所确定的风险一致。31加拿大和英国人群之间的这种明显差异也许并不令人惊讶，因为前一个群体已经确定了与该地区的联系，8但在英国却没有。3.这些差异有许多可能的解释，包括这两个人群之间的遗传和疾病异质性。加拿大研究招募的患者的种族和疾病表型的细节可能在未来允许解剖这些差异。
在我们的种族同质和严格表型的单中心队列中，我们证明了单倍型H2在肛周疾病患者中的频率特别高。与控件相比，传输的是单个副本IBD5风险单倍型与肛周疾病的相对风险为1.9。在该单倍型纯合子个体中增加到3.0，与整个队列的发现一致。重要的是，在没有肛周疾病的情况下IBD5风险单倍型与CD无相关性。然而，与NOD2/CARD15变异等位基因与回肠CD的相关性相比，这代表了适度的相关性。因此，有和没有肛周疾病的患者之间单倍型H2频率的差异不足以承受严格的Bonferroni校正。
理想的基因型-表型研究使用明确定义的表型变量对患者进行分类，这些变量表现出良好的观察者间和观察者内变异性。分类最好适用于诊断，并随时间稳定。这些标准在IBD研究中很难达到，原因有很多。首先，现有的国际公认的分类系统不够详细，无法防止疾病亚组的模糊分配。因此，即使在专家之间，观察者之间和观察者内部的可变性也会很差，这并不奇怪。32这可能解释了为什么报告的肛周受累患病率差异很大。33 -35在本研究中，严格定义临床亚组，以尽量减少不明确的亚组分配的风险。其次，根据表型，特别是乳糜泻行为，对临床亚组进行分类可能很困难，因为它们随时间不稳定。28为了克服这一局限性，疾病亚型没有在诊断时进行分类，也没有在单个时间点进行分类，而是通过回顾性回顾病例记录，详细记录了中位随访时间14年的疾病病程。
其他多态基因也与CD的临床表型相关，最重要的是最近发现的NOD2/CARD15基因的变异36 -38都与回肠疾病有关15 -20.在本研究中，根据NOD2/CARD15状态对回肠疾病患者进行分层，没有证据表明两者之间存在上位性IBD5危险单倍型H2和NOD2/CARD15变异。这并不奇怪，因为这两个基因区域可能与不同部位的肠道炎症有关。事实上，在107名疾病同时影响肛周区域和回肠的个体中，确定了与H2单倍型和NOD2/CARD15变体的相关性。这表明疾病的位置是由拥有一个以上的表型决定等位基因或单倍型决定的。
相比之下，没有发现与UC总体易感性或疾病表型的关联，这与UC表型与该染色体区域的缺失联系是一致的。8
的IBD5风险单倍型H2跨越250kb，包括许多免疫调节基因。这一地区高度保守的单倍型阻碍了真正致病变异的鉴定，但有一些可能的候选者。这些包括IL-4、IL-5和IL-13，所有这些都至关重要地参与Th1-Th2免疫调节和炎症反应。39其他候选基因包括参与树突状细胞成熟的基因，包括编码粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的CSF2和IL-3。40有趣的是，这个人类基因座与11号染色体上的一个小鼠区域是同向的，该区域在结肠炎右旋糖酐硫酸盐模型的连锁研究中已被涉及。41为什么IBD5基因座是否只与肛周CD相关尚不清楚，但这些数据提出了一个有趣的可能性，即肛周疾病是由特定部位细菌定植的免疫反应失调引起的。
综上所述，我们已经确认了IBD5详细的基因型/表型分析显示，这种关联在肛周CD患者中最为明显。虽然相关的精确基因尚不清楚，但这些数据为CD临床异质性的遗传基础提供了进一步的证据。
致谢
这项工作得到了罗马天主教大学(AA)和全国克罗恩病和结肠炎协会(NACC，英国)(TA)的资助。作者感谢参与这项研究的患者。作者感谢Sue Goldthorpe对血液标本的组织和收集以及Robert Walton允许我们使用OXCHECK样本的贡献。