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摘要
背景和目的:阳离子胰蛋白酶原(蛋白酶，丝氨酸，1(胰蛋白酶1))突变;PRSS1基因与急性和慢性胰腺炎复发有因果关系。我们研究了PRSS1基因突变是否与遗传性和非遗传性胰腺炎相关。胰蛋白酶抑制剂(丝氨酸蛋白酶抑制剂，Kazal I型;SPINK1)突变，SPINK1突变在这些患者中的作用也被分析。
对象和方法:对290例对照和198例患者的PRSS1和SPINK1基因编码区进行了测序，其中120例诊断为特发性(ICP)， 41例诊断为酒精性(ACP)， 37例诊断为遗传性胰腺炎(HP)。对24个HP先证者不受影响的亲属进行了分析，并进行了基因型-表型相关性和统计分析。
结果:在所有患者(包括HP患者)中均未检测到PRSS1基因突变，而在大多数HP患者(73%)的SPINK1基因中观察到N34S突变。同样，26.8%的ACP(41例中有11例)和32.5%的ICP患者(120例中有39例)也有SPINK1突变。在纯合和杂合条件下均观察到N34S突变。相比之下，只有2.76%的对照组人群携带N34S等位基因(p<0.001)。在1例ICP患者和1例ACP患者以及3例正常人中观察到P55S突变。无论N34S SPINK1的等位基因状态如何，无论SPINK1突变或未突变的患者，基因型-表型相关性均未表明发病年龄、疾病严重程度或胰腺内分泌功能不全有任何显著差异。
结论:无论病因如何，PRSS1基因突变与慢性胰腺炎(包括HP)无关。相比之下，SPINK1基因的N34S突变在这些患者中显示出显著的相关性。在有或无SPINK1突变和N34S纯合子和杂合子的患者中，在发病年龄、糖尿病和其他表型特征方面具有可比的表型，提示可能仍有其他遗传或环境因素的参与。
- 阳离子胰蛋白酶原基因
- 慢性胰腺炎
- 突变
- 胰分泌胰蛋白酶抑制剂
- N34S SPINK1突变体内
- 美联社,急性胰腺炎
- ACP酒精性慢性胰腺炎
- 囊性纤维化跨膜调节剂
- 惠普、遗传性胰腺炎
- ICP，特发性慢性胰腺炎
- PRSS1蛋白酶丝氨酸1(胰蛋白酶1)
- PSTI/SPINK1，胰分泌胰蛋白酶抑制剂/丝氨酸蛋白酶抑制剂，Kazal I型
- TCP，热带钙化性胰腺炎
来自Altmetric.com的统计
- 美联社,急性胰腺炎
- ACP酒精性慢性胰腺炎
- 囊性纤维化跨膜调节剂
- 惠普、遗传性胰腺炎
- ICP，特发性慢性胰腺炎
- PRSS1蛋白酶丝氨酸1(胰蛋白酶1)
- PSTI/SPINK1，胰分泌胰蛋白酶抑制剂/丝氨酸蛋白酶抑制剂，Kazal I型
- TCP，热带钙化性胰腺炎
慢性胰腺炎是胰腺的一种进行性炎症性疾病，其特征为慢性炎症和进行性纤维化，外分泌和/或内分泌功能均丧失。1，2酒精通常被认为是慢性胰腺炎发展的一个重要危险因素。然而，其他因素如遗传、吸烟、解剖学变异和代谢紊乱(例如高脂血症和高钙血症)也已被确定。近三分之一的患者被归类为特发性慢性胰腺炎(ICP)，因为不能确定与上述任何病因有关。2无论病因如何，慢性胰腺炎的临床模式的特点是早期伴有急性胰腺炎(AP)的反复发作，随后是晚期伴有胰腺钙化、胰腺功能不全和大多数患者的糖尿病。3.慢性胰腺炎的发病机制尚不清楚，也不清楚不同形式的慢性胰腺炎是否有共同的病因。3.4
慢性胰腺炎通常被认为是一种继发于胰腺内胰蛋白酶原过早激活的自身消化疾病，尽管最近许多研究报告了孤立性和综合征性自身免疫性胰腺炎。5这种类型的胰腺炎经常与自身免疫性疾病(如干燥综合征)相关，提示自身免疫性机制可能与某些胰腺炎患者有关。3.慢性胰腺炎的几种遗传危险因素最近已被确定。两个错义突变，R122H6N29I,7在人阳离子胰蛋白酶原基因(蛋白酶，丝氨酸，1(胰蛋白酶1);PRSS1)常在遗传性胰腺炎(HP)患者中检出。其他几种罕见的PRSS1变异的临床意义和遗传，如A16V，8D22G,9K23R,10R122C,11和N29T12也不太清楚。随后对HP相关PRSS1突变的研究表明，ICP中HP相关PRSS1突变的发生率非常低7，8，13 -15酒精相关性胰腺炎(ACP)完全消失。16最近，我们发现热带钙化性胰腺炎(TCP)患者缺乏PRSS1突变，17热带地区的一种特发性胰腺炎，表型与酒精性胰腺炎不同。18
外显率变异的根本原因尚不清楚，但观察表明，环境和其他遗传因素的参与。最近，丝氨酸蛋白酶抑制剂Kazal I型(SPINK1)的N34S突变被报道与特发性和家族性胰腺炎密切相关。13日,19然而，随后的研究报告称，在ICP患者中，突变的SPINK1基因的患病率非常低，20 -22而在最近的一项研究中，47%的TCP患者中发现了SPINK1突变。17虽然酒精是胰腺炎的一个已知的诱发因素，但只有5-10%的酗酒者会患病23他们可能有患上胰腺炎的遗传倾向。威特和他的同事们24据报道，ACP患者中N34S SPINK1的患病率为5.8%，提示其发病机制中存在SPINK1突变。SPINK1通过抑制胰腺内约20%的胰蛋白酶活性，作为对抗过早激活的胰蛋白酶原的第一道防线。25SPINK1突变的作用，特别是N34S突变，是一个有争议的问题，有些人认为有因果关系13而另一些人则主张该分子起修饰作用。19
在印度，胰腺炎的遗传基础很少被探索，少数研究只专注于TCP。17，26我们对遗传性和非遗传性胰腺炎(ICP和ACP)患者进行了一项大型队列研究，以确定PRSS1和SPINK1突变是否与印度慢性胰腺炎相关，并了解它们各自在疾病病因中的作用。我们在HP、ICP和ACP患者中未发现PRSS1基因突变，但仅检测到SPINK1基因突变。因此，我们提出了印度慢性胰腺炎的遗传基础(不考虑其病因)，不同于在西方国家观察到的。在印度，这项研究的观察结果可能对咨询和改善易感性风险有影响，避免接触可能的诱发因素，如酒精、吸烟、营养不良等。
方法
选择的病人
在海得拉巴的亚洲胃肠病学研究所对患者进行了鉴定和调查。慢性胰腺炎的诊断基于至少两次单独的腹痛和ct、超声内镜下胰腺钙化的放射学表现，以及/或逆行内镜胰管造影术中胰腺导管不规则和扩张的病理表现。3.收集了一份详细的问卷，包括临床和家族史和各种调查，从所有患者及其不受影响的亲属愿意参与研究。临床病史包括病因、疼痛类型及严重程度、发作频率、有无糖尿病、发病年龄及糖尿病等。ICP诊断的排除标准包括:无酒精、胆结石、感染、创伤、药物和代谢紊乱等诱发因素，年龄超过65岁，家族史阳性。3.糖尿病诊断为空腹血糖值为>126 mg/dl，两小时血糖值为>200 mg/dl，并/或需要胰岛素或口服降糖药。27酒精被认为是导致慢性胰腺炎患者的原因，每天摄入相当于超过80克乙醇至少两年。4HP的诊断是基于两代或两代以上的至少两个受影响的一级亲属或三个或更多的二级亲属。28
因此，共有198名患者(120名ICP, 41名ACP和37名HP)和24名来自HP家族的未受影响的亲属参与了研究。来自同一研究所的290名健康志愿者构成对照人群。在获得书面知情同意后，提取血液样本，使用EDTA作为抗凝剂。机构伦理委员会根据印度医学研究理事会人体研究指南批准了这项研究。
DNA的研究
所有的血液样本都在海得拉巴的细胞和分子生物学中心进行分析，每个样本都被分配了一个唯一的识别号，数据被输入到自主开发的软件中以获取患者的详细信息。按照标准方案从白细胞中分离基因组DNA。由于在印度人群中没有关于遗传性或非遗传性胰腺炎的遗传学报道，我们决定对PRSS1和SPINK1基因进行测序，以筛查已报道的突变以及任何新的变异。用公开的引物序列扩增了这两个基因的编码区和侧翼非编码区，6,13根据之前发布的协议。17使用ABI 310基因分析仪(应用生物系统公司，Perkin Elmer, New Jersey, USA)上的Big染料终止剂循环测序试剂盒对两条链进行测序。共对580个对照等位基因进行测序，以确定PRSS1和SPINK1变异及其在一般人群中的患病率。
统计分析
所有值都以中位数表示(范围，95%置信区间(CI))。的χ2用SPINK1和N34S突变在ICP、ACP和HP患者以及对照组中的患病率差异进行分析。我们根据N34S SPINK1突变的存在与否及其合子度对研究队列进行了分类。采用Mann-Whitney U检验分析这些组间发病年龄、有无糖尿病等特征的表型变异性。使用SPSS for windows软件(SPSS Inc, Chicago, Illinois, USA)进行分析。p值小于0.05被认为有统计学意义。
结果
病人的细节
我们的研究队列包括来自16个家庭的37名HP患者和161名非遗传性胰腺炎患者(120名ICP患者和41名ACP患者)。其中男性156例，女性42例，但所有ACP患者均为男性。大多数HP家族(n = 13)有两个或更多一级亲属患有胰腺炎，而在两个或更多代中，有三个家族中有三个或更多二级亲属患有胰腺炎。包括24名HP患者的无感染亲属，其中14名男性和10名女性。大多数患者表现为腹部疼痛(88%)，其余患者以糖尿病为主要症状。HP和ICP患者的中位发病年龄具有可比性，分别为24.5岁和23.5岁，显著低于ACP患者的36岁(p<0.001)。然而，与ICP和ACP相比，HP患者报告的病程更长(表1)。
DNA分析
我们对所有患者和对照组的PRSS1和SPINK1基因的整个编码区进行了测序。患者和对照组均未携带PRSS1基因编码区常见突变或任何新变异。然而，在大多数患者(88%)和对照组(90%;p > 0.05)。相比之下，77例(38.9%)慢性胰腺炎患者至少有一个SPINK1突变。大多数患者(n = 75)携带N34S等位基因，包括15个纯合子和60个杂合子(表2)。N34S突变被发现与IVS-37T >C处于完全连锁不平衡状态。P55S在杂合状态下仅2例(1.01%)。此前报道的中性多态性−253T>C在3.5%的患者和27.9%的对照组中被鉴定为杂合状态。290例健康对照中8例也携带N34S突变(2.76%，等位基因频率= 0.014)，而P55S突变仅在3例个体中出现(1.03%，等位基因频率= 0.0017)。这两种突变均以杂合子状态存在，既往未在这些患者中检测到2T>C、41T>C等其他突变。
120例ICP患者中有38例(31.7%)携带N34S突变(p<0.0001)v对照组)，其中7个为纯合子。然而，早发型(35.7%)和晚发型(22.2%)N34S SPINK1突变频率无显著差异;p = 0.3872)。ICP和ACP患者各有1个P55S杂合子。有趣的是，我们在41例ACP患者中发现了10例(24.4%;p < 0.0001v相比之前的报告显示的5.8%的频率，246.0%,29和5.6%。30.除1个P55S杂合子和1个N34S纯合子外，其余均为N34S携带者。到目前为止，在这组患者中未见N34S纯合子的报道。这名患者是一名31岁的患者，从20岁开始持续疼痛，并有两年的糖尿病，过去5年的酒精摄入量非常低。尽管ACP的诊断是基于AP反复发作的背景下过量饮酒的历史，但据报道，5年来酒精摄入量从25克/天到80多克/天不等。4符合HP标准的16个家系中，检出N34S SPINK1突变的有12个(75%)。37例HP患者中27例(73.0%;p < 0.0001v对照组)携带N34S突变，包括7个纯合子。有趣的是，该组N34S纯合子均为糖尿病患者，发病年龄在5 - 12岁之间。在24个未受影响的亲属中，6个(25%)携带N34S SPINK1突变，包括一个纯合子。唯一的纯合子是一个23岁的个体，没有胰腺炎或糖尿病，尽管他的杂合子父母有这种疾病。
Genotype-phenotype相关性
我们根据病因对研究队列进行分类，然后将每个类别中SPINK1 N34S阳性和阴性患者作为各种表型标记的函数进行比较(表3)。与各类别中携带野生型SPINK1的患者相比，N34S SPINK1组的症状出现年龄较低，但除HP患者外(p = 0.045)，无统计学意义。将我们的研究队列按年龄分组后，分析N34S载频显示出有趣的结果。<20岁组的载频为52.8%(28 / 53)，显著高于20 - 65岁组的24.8% (36 / 145)(p<0.016)。有趣的是，大多数纯合子(14 / 15)在20岁前患有慢性胰腺炎。老年组中唯一的纯合子是一名54岁的轻度疾病和糖尿病患者，已有6年。后一组中环境因素的影响增加可能是造成这一显著差异的原因。31
糖尿病作为胰腺内分泌功能不足的特征在两组中同样普遍，其他疾病严重程度的参数，如疼痛、假性囊肿、胰管异常，(表3)。几乎一半的慢性胰腺炎和糖尿病患者有N34S SPINK1突变(42.9%)，而非糖尿病患者只有36.5%(表4)。在糖尿病患者中观察到的N34S纯合子(50%)相对于非糖尿病组(10.5%)。这可能是由于额外的遗传或环境因素，特别是在HP队列中，N34S突变的患病率在两组中是相当的。然而，N34S与糖尿病之间的相关性在所有三类患者中均未达到统计学意义。我们没有发现任何胰腺癌患者，尽管许多患者有长期的慢性胰腺炎。
来自HP家族的数据显示，个体家族的基因型-表型之间存在差异。在其中一个家庭中，先发者是一名40岁的女性，21岁患胰腺炎，23岁患糖尿病(图1)。她被检测出N34S SPINK1基因纯合子，遗传自其专性杂合子的健康父母。她的父亲过去30年一直患有糖尿病，但她的两个专门的N34S杂合子儿子中，小儿子在过去5年里同时患有胰腺炎和糖尿病，而大儿子是健康的。她的三个兄弟N34S阳性，患有糖尿病，但没有胰腺炎的证据。在另一个家庭中，先发者为一名18岁的N34S杂合子，遗传自其同样有早期发病的杂合子父亲。然而，他的哥哥和祖母虽然是N34S SPINK1杂合子，但健康，而两个N34S/WT的阿姨有严重的胰腺炎和糖尿病，另一个杂合子阿姨只有糖尿病。
两个家系的遗传性胰腺炎(HP)和SPINK1基因的N34S突变共遗传。N34S / N34S,比如;N34S / WT,杂合子;WT / WT,野生型。
讨论
慢性胰腺炎是一种异质性疾病，其遗传基础在印度尚未得到研究。我们分析了198例遗传性和非遗传性(特发性和酒精性)胰腺炎患者，主要目的是了解PRSS1和SPINK1突变在其病因中的各自作用。由于对SPINK1突变的作用存在相当大的困惑，我们也研究了这些突变及其合子性与表型的关联。在目前的研究中，除了之前报道的两个csnp外，7在任何患者或对照个体中均未发现PRSS1突变。在HP和ICP患者中PRSS1突变的缺失是很有趣的，因为据报道在高达60%的HP中存在这种突变32约20%的ICP患者。33我们首次在不同病因的印度慢性胰腺炎患者中描述了PRSS1突变的缺失，这证实了之前在印度TCP患者中所做的观察。17，26这很可能与他们的基因组成有关，因为国外没有其他研究报道在HP和非遗传性慢性胰腺炎患者中没有PRSS1突变，同时与SPINK1突变有很强的相关性。然而，与环境和营养影响等其他因素的相互作用也可能发挥重要作用。尽管之前的研究表明，在白人HP家族和蒙古人中存在相同的突变，这表明了异质性，但没有种族特异性，34我们的结果表明，这种现象是存在的。我们的研究结果有力地表明，无论其病因如何，在印度人群中，已确定的PRSS1突变都不是慢性胰腺炎的常见原因。
然而，SPINK1突变被发现与所有类型的慢性胰腺炎密切相关。大多数SPINK1突变的患者都有N34S突变，HP的患病率明显高于ICP和ACP (p<0.001)。大多数HP患者中N34S SPINK1突变的存在是特别有趣的，因为这些患者缺乏PRSS1突变。对照组的N34S SPINK1患病率(2.76%)与来自印度的其他研究相当26日,35高于法国人口的1.5%，20.1.58%来自美国,19德国占0.36%13但远低于利物浦健康对照人群的4%。29因此，N34S等位基因在不同人群中的分布可能比最初设想的更加多变。29，36ICP患者中观察到的SPINK1突变患病率(32.5%)明显高于6.4%，3718.0%,29和21.0%30.但远低于Pfutzer和同事报告的40.4%。19尽管突变的SPINK1基因与家族性ICP之间有很强的相关性，但与真正的ICP没有相关性，29我们没有试图进一步分类，因为我们的ICP诊断是在缺乏已知的病因因素(包括遗传)的情况下考虑的。最近，早发性ICP比晚发性ICP有更强的遗传基础38但本研究未发现N34S SPINK1患病率的显著相关性，尽管老年组的大多数患者(36例中有12例)出现糖尿病，而84例早期发病患者中只有7例出现糖尿病(p = 0.0103)。在我们的研究中，HP患者的高发病年龄(24.5岁)与国外进行的大多数研究相比，可能是由于N34S SPINK1突变的存在，假设与西方HP患者中PRSS1突变所起的因果作用相比，N34S SPINK1突变发挥了修饰作用。19在我们的ACP患者队列中，SPINK1突变的高度显著流行表明该基因变体在我们的人群中扮演着重要的角色。据报道，与没有酒精中毒的对照组相比，酒精中毒患者的胰液中胰蛋白酶抑制剂降低到胰蛋白酶原水平。39酒精也可能影响SPINK1在人酒精性胰腺炎复杂炎症过程中的调节。40早期的研究表明，与白人患者相比，黑人患者因慢性胰腺炎住院的可能性是酒精性肝硬化的2-3倍。41因此，印度的酗酒者可能更容易患慢性胰腺炎，这是由基因组成、饮食的种族差异、酒精的种类或数量、或吸烟等因素综合造成的。尽管目前的知识表明，与其他类型的慢性胰腺炎相比，ACP患者可能与环境因素有更高的相互作用，但在印度，ACP患者有很强的遗传基础。由于SPINK1突变似乎使人类的发病年龄更早，19它们可能对ACP的表型表现有影响。
我们研究中的队列代表慢性胰腺炎患者的集合，通常在发展中国家如印度的常规临床实践中看到。在R122自溶位点完好的野生型PRSS1存在的情况下，突变的抑制剂(尤其是N34S SPINK1)是如何引起疾病的，这一直是人们强烈猜测的问题。PRSS1突变如R122H和N29I已被证明导致活性胰蛋白酶的自溶降解失败或促进胰蛋白酶原的激活。这种胰腺蛋白酶-蛋白酶抑制剂系统可能在慢性胰腺炎的发病机制中发挥重要作用，因为SPINK1可以阻断约20%的胰蛋白酶活性。25虽然确切的机制还不清楚，但有人假设，N34S突变的抑制剂可能会产生功能后果，这可能是由于蛋白质结构的改变。19
目前关于N34S SPINK1的作用的研究是令人困惑的，既描述了因果作用，也描述了修饰作用。20.13日,19最近的一项研究支持SPINK1突变的意义，该突变基于SPINK1纯合敲除小鼠的胰腺消失，尽管杂合小鼠的胰腺组织没有发生改变(引用在Hirota和同事中)42)．我们没有观察到SPINK1突变阳性和突变阴性组之间的表型差异，也没有观察到SPINK1 N34S杂合子和纯合子之间的表型差异，这也是我们在印度TCP患者中报道的。17虽然N34S与糖尿病之间的相关性在所有三类患者中均无统计学意义，但N34S纯合性与糖尿病呈正相关。这表明N34S SPINK1突变可能只参与表型的修饰。
一些研究认为SPINK1突变是常染色体隐性遗传还是常染色体显性遗传。我们的结果可能提示一种常染色体显性遗传模式与低水平外显。同时，患者中N34S纯合子的高患病率(7.6%)也提示常染色体隐性遗传模式。尽管N34S和HP之间存在显著的强相关性，但在我们的研究中，HP家族的分析显示了不同的遗传模式和与表型的相关性。这种遗传异质性现象是复杂疾病的特征，与环境有重要关系。因此，N34S突变显著降低胰腺炎的阈值可能是合乎逻辑的，这是由于其他遗传或非遗传因素，包括环境。基于发现这些患者绝大多数是N34S SPINK1杂合子，其他基因如囊性纤维化跨膜调节因子(CFTR)43 -45和α1-抗胰蛋白酶被推测为修饰基因。46岁,47对这些患者进行CFTR突变筛查可能是有趣的。尽管在我们的人群中CFTR基因突变的频率很低，但我们可能很容易推测，CFTR中轻度突变与N34S突变共存可能是SPINK1低外显的原因。ICP与SPINK1、PRSS1、CFTR基因的相关性48岁的49提出了一种遗传基础，并挑战了ICP作为一种非遗传疾病的概念。这种对遗传性慢性胰腺炎的理解上的混乱需要在未来的研究中适当地加以解决，以便为这些患者创造一个统一的术语。
综上所述，SPINK1基因N34S突变与慢性胰腺炎密切相关，尽管外显率很低。然而，阳离子胰蛋白酶原基因突变并不是印度人群胰腺炎的重要原因。到目前为止，N34S SPINK1突变是印度患者慢性胰腺炎的唯一遗传基础因素。这可能对症状前基因检测有影响，但需要对更多这样的患者进行分析来验证这一结论。
致谢
作者对所有自愿参与研究的患者、他们的家人和个人表示诚挚的感谢。该研究得到了印度医学研究委员会的资助。还要感谢Yogendra Sharma和Ramesh K Aggarwal博士对手稿提出的宝贵建议。