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摘要
目标肠道菌群失调与克罗恩病(CD)有关。细菌在慢性小肠炎症发展中的因果作用的功能性证据是缺乏的。与人类病理相似，TNFdeltaARE小鼠出现肿瘤坏死因子(TNF)驱动的cd样透壁炎症，主要累及回肠。
设计杂合的肿瘤坏死因子deltaARE将小鼠和野生型(WT)同窝小鼠分别置于常规(CONV)、无特异性病原体(SPF)和无菌(GF)条件下。微生物群落分析采用高通量16S核糖体RNA基因测序。采用LC-MS法测定代谢蛋白组。在抗生素治疗和将微生物群落转移到GF小鼠后，跟踪疾病发展的时间和空间分辨率。通过免疫荧光和基因表达分析评估粒细胞浸润和Paneth细胞功能。
结果GF-TNFdeltaARE小鼠没有肠道炎症和抗生素治疗convn - tnfdeltaARE小鼠对回肠炎减毒，但对结肠炎不减毒，这表明疾病的严重程度和部位依赖于微生物群。SPF-TNFdeltaARE小鼠出现明显的回肠炎表型，与抗菌素防御的逐渐丧失有关。16S分析和宏蛋白质组学显示炎症小鼠中细菌群落的特定组成和功能改变。疾病相关但不健康的微生物群移植将cd样回肠炎传播给GF-TNFdeltaARE受体和引发溶菌酶和cryptdin-2表达缺失。GF-TNF的单联作用deltaARE小鼠与人类cd相关大肠杆菌LF82未诱发回肠炎。
结论我们提供了明确的实验证据，肠道细菌生态失调在慢性回肠炎症发展中的因果作用，随后的潘氏细胞功能衰竭。
- 肠道微生物
- 小肠病
- 肿瘤坏死因子
- 克罗恩氏病
- Ibd基础研究
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本研究的意义
关于这个问题我们已经知道了什么?
IBD与肠道细菌组成的变化有关。
建立了无菌小鼠ibd相关结肠炎模型。
Paneth细胞功能与克罗恩病的回肠疾病表型相关。
新的发现是什么?
克罗恩病样回肠炎在TNF中的发展和定位deltaARE小鼠依赖微生物群，在无菌条件下完全不存在。
抗生素降低了疾病的严重程度，炎症的复发伴随着微生物群成分的复发。
回肠炎的严重程度与肠道共生菌群的组成和功能失调有关。
将非生物菌群转移到无菌受体会导致基因易感受体的克罗恩病样炎症。
Paneth细胞相关抗微生物防御的丧失是在TNF中发生回肠炎的后续反应deltaARE老鼠。
在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?
该研究基于肠道微生物生态系统(生态失调)的动态改变，为克罗恩病中微生物-宿主相互作用的因果关系提供了基础认识。
本研究将有助于阐明微生物群移植在克罗恩病中的治疗相关性。
简介
克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)是炎症性肠病(IBD)的两种主要形式。CD患者的炎症主要发生在回肠末端，偶尔出现在结肠近端，而UC患者的炎症则局限于结肠。1，2尽管病因不明，粘膜免疫系统的慢性激活是由肠道共生菌触发的。3.，4全基因组关联研究确定了疾病与参与微生物信号传递的基因之间的联系，强调了肠道微生物在IBD发病机制中的作用。5宿主的遗传易感性和炎症被证明可以诱导微生物群落的组成和代谢活性的改变，被定义为生态失调，6 - 8正如预期的那样，IBD患者的特征是肠道微生物生态系统的非生物变化。9 - 11细菌群落的变化被证明是由潘氏细胞(PC)衍生的抗菌肽形成的。12PC位于小肠隐窝基部，靠近上皮干细胞室，PC功能的丧失与CD的回肠表型相关。12 - 14在IBD治疗中，抗生素或粪流分流的临床益处支持了细菌的病理作用。15粪便菌群移植(FMT)能有效地恢复肠道内稳态艰难梭状芽胞杆菌感染。16 - 19因此，人们对FMT在UC和CD中的治疗应用越来越感兴趣。然而，来自对照临床试验的证据仍然有限，成功供体微生物群的特征尚未确定。此外，在一个对微生物刺激反应过度的环境中引入新的抗原池的理由是值得怀疑的。对于结肠炎，已经在动物模型中广泛研究了细菌在疾病发展中的重要性，例如，通过显示结肠炎中IL-10的减少−−/抗生素治疗小鼠或各种菌株诱导无菌(GF)结肠炎模型炎症的能力。20由于缺乏cd样回肠炎的GF模型，在回肠炎发病过程中缺乏微生物或生态失调的因果关系的证据。
在本研究中，我们评估了肠道细菌群落在慢性cd样回肠炎自发模型中的影响。肿瘤坏死因子deltaARE小鼠携带肿瘤坏死因子(TNF) AU-rich(腺苷-尿嘧啶)元件(ARE)的缺失导致肿瘤坏死因子回肠远端驱动透壁炎症。24我们之前的研究表明，铁诱导的微生物群调节与TNF疾病活性的显著变化相关deltaARE老鼠。25然而，微生物-宿主相互作用在cd样回肠炎发病机制中的因果作用的机制证据缺失。在这里，我们使用抗生素和不同的卫生条件(GF，特异性无病原体(SPF)或常规(CONV)环境)来解剖TNF中微生物群变化与回肠炎发展之间的关系deltaARE老鼠。为了评估非生物微生物群落在回肠炎症中的因果作用，我们使用GF-TNF进行了微生物群移植实验deltaARE小鼠和表征PC功能。
方法
道德声明
动物使用是由当地主管机构批准的(Regierung von Oberbayern，批准编号:;55.2-1-54-2531- 7510和55.2-1-54-2531-99-13)。所有动物都被安置在Technische Universität München(维亨斯蒂芬生命科学学院)的老鼠设施中。
住房
肿瘤坏死因子deltaARE小鼠由George Kollias (Alexander Fleming BSRC，希腊)提供，在我们的CONV设施中繁殖，并通过胚胎移植转移到SPF。肿瘤坏死因子deltaARE实验动物研究所;汉诺威)。通过在Luria肉汤(LB)或威尔金斯琼脂(WCA)肉汤(OXOID)中培养粪便，以及每10-14天和采样时显微镜下观察革兰氏染色的粪便涂片来检查不育性。模具陷阱被用来表示模具的存在。实验过程中未观察到污染。杂合的肿瘤坏死因子deltaARE将WT窝仔(C57BL/6N)置于CONV、SPF或GF条件下(光照/暗循环12 h, 24-26℃)饲养至18周龄。小鼠自由喂食标准饲料(SPF和CONV为蒸压R/M-H饲料，gf动物为M-Z V1124-300饲料，ssnif, Soest, Germany)， CO处死2．
抗生素治疗
CONV-TNFdeltaAREconvn - wt小鼠8 ~ 12周龄给予抗生素(VM: 0.25 g/L万古霉素和1.0 g/L甲硝唑、Sigma-Aldrich和Fluka)。每周两次配制新鲜抗生素，并通过装在防光瓶中的饮用水随意给药。在VM治疗停止后0周、2周、4周和6周处死小鼠。
GF小鼠的定植
收集SPF小鼠的盲肠内容物，立即悬浮在过滤灭菌的磷酸盐缓冲盐水(PBS)/甘油(20%)中(1:10，重量/体积)，快速冷冻并储存(−80°C)。等分物离心(300克/3分钟/4°C)至颗粒碎片。将上清液离心(8000 g/10 min/4°C)，并将颗粒重悬于等体积的PBS中。每只小鼠在8周龄时灌胃100 μ L盲肠微生物悬液(一个spf供体(约1-5×10))8每只小鼠的细胞，由THOMA计数室确定)。小鼠被安置在每笼混合基因型的微生物群特异性隔离器中，并在定植4周后被处死。为了研究回肠炎随时间的发展，如上所述，对额外的小鼠进行定植，并在定植后1周、2周和4周收集样本。参见在线补充方法的小鼠与大肠杆菌低频- 82。
肠道细菌的培养
参见在线补充方法。
组织病理学
通过评估固有层单个核细胞浸润、隐窝增生、杯状细胞衰竭和结构扭曲，对回肠末端和结肠近端组织切片进行H&E染色(盲)评分，评分从0到12分。26，27使用M8数码显微镜(PreciPoint GmbH)获取图像。
免疫荧光染色
参见在线补充方法。
基因表达分析
根据制造商的说明(NucleoSpin RNAII试剂盒;machery - nagel GmbH, KG)。使用随机六聚体和moloney小鼠白血病病毒(M-MLV)逆转录酶(RT)点突变合成系统(Promega)从500ng RNA合成互补DNA。使用LightCycler 480通用探针库系统(Roche)进行定量。引物序列和相应探针参见补充方法。计算(2-ΔΔCt方法28)被正常化到gapdh．
16S核糖体RNA基因序列分析
参见在线补充方法。
质谱和代谢蛋白组分析
参见在线补充方法。
统计数据
使用R或Sigma Plot 11.0进行统计分析，采用方差分析(ANOVA)，然后进行两两比较检验(Holm-Sidak检验)。使用GraphPad Prism V.5.00创建图形。除非另有说明，数据以均数±SD表示，p值低于0.05被认为有统计学意义。多次试验后采用Benjamini-Hochberg法进行调整。为了可视化细菌剖面之间的关系，使用包vegan和ade4计算非参数多维标度图。
结果
TNF中的炎症deltaARE小鼠依赖微生物群
为了评估肠道菌群在cd样炎症发展中的作用，我们生成了GF-TNFdeltaARE小鼠或处理convn - tnfdeltaARE用抗生素。在convc -housing下，TNFdeltaARE小鼠在18周大时出现回肠末端组织病理(图1A, B).在没有微生物的情况下(GF条件)，TNFdeltaARE小鼠无回肠(图1A, B)和结肠疾病(见在线补充图S1A)。尽管肿瘤坏死因子deltaARE小鼠被称为cd样回肠炎的模型，24在所有convc小鼠中观察到近端结肠炎症(见在线补充图S1A)。回肠炎与结肠炎严重程度之间没有相关性，例如几只患有严重回肠炎(评分> - 4)的小鼠发展为中度结肠炎(评分<4)。
肠道微生物生态系统的变化与TNF中的炎症相关deltaARE老鼠。(A) 18周TNF回肠炎评分deltaARE(ARE)和WT窝仔在CONV或GF房。根据炎症严重程度对回肠炎评分组进行颜色编码:评分=0(蓝色);得分<4(灰色);得分>4(红色)。雄性小鼠显示为三角形，雌性小鼠显示为圆形。(B)有代表性的回肠远端h&e染色切片。(C) NMDS图显示convn - tnf的质心偏移(箭头表示)和粪便细菌分布(圆圈区域)的差异deltaAREWT小鼠在4周龄、8周龄和12周龄时。在MiSeq平台上对粪便V3/V4区(407 bp)的16S核糖体RNA基因扩增子进行测序。(D) TNF的回肠炎评分deltaARE从8周龄开始，用万古霉素和甲硝唑(VM)治疗小鼠4周。VM治疗后回肠炎复发6周(n= 5-6 /组)。(E)回肠表达肿瘤坏死因子作为倍增增加convi - wt小鼠(归一化至Gapdh)．(F)可培养厌氧菌的回肠细菌密度(每克回肠含量的菌落形成单位(cfu)为log 10)。(G)肠道细菌多样性(Shannon有效计数)。(H)盲肠细菌组成在门水平上的变化(总序列的相对丰度)。* p < 0.05;* * p < 0.01;***p<0.001(双因素方差分析后进行Holm-Sidak检验)。CONV传统;女朋友,无菌;ARE，富含au元素; TNF, tumour necrosis factor; NMDS, non-parametrical multiple dimensional scaling.
我们之前的研究表明，回肠炎在convn - tnf中逐渐发展deltaARE并在12周时达到最高水平。29利用16S核糖体RNA测序，我们鉴定了TNF中不同年龄的粪便细菌多样性和组成deltaARE和WT窝友。在无炎症(4周龄)时，TNF中的细菌系统发育组成deltaARE和WT小鼠重叠(图1C).群落结构的变化在8周时开始明显，此时组织病理学达到显著性(回肠炎评分为3.92±0.52;p < 0.01)。与年龄相关的炎症增加平行，来自WT的微生物群落与TNF的差异deltaARE小鼠和个体间的差异在基因型内减少。成分上的主要显著差异包括类杆菌，Erysipelotrichaceae，Peptostreptococcaceae而且Verrucomicrobiaceae在肿瘤坏死因子deltaARE小鼠(p < 0.001;见网上补充图S1B)。的增加类杆菌主要是由于与?密切相关的三个操作分类单位(OTUs)拟杆菌acidifaciens而且拟杆菌sartorii．
为了评估微生物群落的变化是否可以拮抗已建立的炎症，我们治疗了发炎的convn - tnfdeltaARE从8周龄开始使用抗生素的小鼠。经vm治疗后，回肠炎明显减轻，抗生素治疗结束后6周回肠炎完全复发(图1D).结肠炎活动在整个期间保持不变(见在线补充图S1C)。肿瘤坏死因子-表达水平反映回肠疾病活动的动态变化(图1E).在厌氧条件下生长的菌落形成单位数目(图1F)和总细胞计数(见在线补充图S1D)在VM处理后没有变化，表明VM耐药细菌种的生长。然而，在vm处理的小鼠中，细菌多样性急剧减少(图1G). TNF中的门分布分析deltaARE小鼠表现出优势厚壁菌门而且拟杆菌门在对照组中，而VM处理导致的拟杆菌门绽放在厚壁菌门（乳酸菌spp)和变形菌门（大肠杆菌) (图1H).有趣的是，细菌群落组成在整体组成上表现出快速的恢复力，即在停止治疗2周后，炎症复发前，门的分布恢复到vm前的值。
远端回肠的疾病严重程度与pc相关抗菌防御的丧失有关
根据测序、培养和实验动物科学协会联合会(FELASA)推荐的分析，我们观察到小鼠的存在诺瓦克病毒，30.幽门螺杆菌，巴斯德菌，Syphacia，毛滴虫，假丝酵母，Kazachstania而且衣原体(见网上补充表S1)。因此，为了研究微生物群落在严格控制的环境中的作用，我们转移了convn - tnfdeltaARE将小鼠胚胎移植到特定的无病原体(SPF)环境。与年龄匹配的convc小鼠相比，SPF-TNFdeltaARE小鼠出现cd样回肠炎，但未出现结肠炎(图2A, B和网上看补充图S2A)。有趣的是，我们从SPF设施中观察到动物回肠炎严重程度的梯度，包括三种主要的TNF类别deltaARE小鼠:(1)20只小鼠中有4只小鼠无回肠炎，这里称为“无反应”(NRs);(2) 9只小鼠回肠炎评分为>4，定义为“反应者”(Rs);(3) 7只评分在1 - 4之间的小鼠被定义为“低反应”(lowR)。值得注意的是，所有未发炎的小鼠都是雄性，没有观察到笼效应。在三种回肠炎表型和GF-TNF中检测炎症相关标志物，如细胞因子表达、粒细胞浸润和PC功能deltaARE老鼠。类似于convn - tnfdeltaARE老鼠,肿瘤坏死因子表达水平(图2C)和粒细胞浸润回肠粘膜(图2B, D)反映了SPF-TNF中疾病活动性的逐渐增加deltaARE老鼠。肿瘤坏死因子-转录水平降低，在GF-TNF中完全没有ly6g阳性粒细胞deltaARE老鼠。
特定无病原体(SPF)环境中的回肠炎表现出不同的严重程度。(A) 18周TNF回肠炎评分deltaARE(AU-rich elements, ARE)和SPF设施中的WT凋落物。三个回肠炎评分组用颜色标记为“无应答者”(NRs)，蓝色(评分=0)，灰色(评分<4)，红色(评分>4)。雄性小鼠显示为三角形，雌性小鼠显示为圆形。(B)上面板:回肠远端有代表性的h&e染色切片。下面板:有代表性的末端回肠切片被Ly-6G染色(红色)。(C)回肠表达(正常化至Gapdh)肿瘤坏死因子NRs、低应答者(lowRs)和应答者(Rs)的spf - wt -小鼠(虚线)均为倍增。(D)每毫米ly6g阳性粒细胞的定量2回肠末端的组织切片。
评估PC功能，溶菌酶和α-聚焦蛋白(由Ulex europaeus凝集素-1 (UEA-1))在SPF-TNF回肠黏膜染色deltaARE和WT窝仔(图3A和网上看补充图开通)。免疫荧光分析清楚地显示，在炎症的lowR和R SPF-TNF隐窝基底中，溶菌酶显著减少，而UEA-1阳性细胞没有减少deltaARE与GF对照组相比(图3B)，而NR TNF中溶菌酶和UEA-1阳性细胞的数量deltaARE小鼠与WTs相当(虚线)。这些数据表明炎症存在时PC活性下降，但PC数量没有下降。除溶菌酶表达缺失外，Cryptdin 2阳性细胞的信号也在严重回肠炎中减少(图3A, B).与R小鼠PC功能丧失一致，抗菌肽转录水平血管生成素4与NRs相比显著降低(见网上补充图S2C)。而Cryptdin 5(防御素a5)表现出较高的个体间差异，但在炎症下有相同的减少趋势(p>0.05)， Reg3 γ表达保持不变(见在线补充图S2C)。GF小鼠显示出较低的测试抗菌肽转录水平，这与以前的出版物一致。31，32回肠隐窝中caspase -3阳性细胞数量未见增加(图S2D)。
疾病严重程度与PC功能丧失有关。(A)溶菌酶Paneth细胞染色(绿色;上面板)结合UEA-1(红色)。放大图显示的是一个有代表性的地窖。下图:隐蛋白2的潘氏细胞染色(红色)。放大图显示的是一个有代表性的地窖。(B) are小鼠与WT小鼠相比，每个隐窝碱基溶菌酶、UEA-1和cryptdin-2阳性细胞的定量(虚线)。* * p < 0.01;* * * p < 0.001;双因素方差分析后采用Holm-Sidak检验。
回肠炎的严重程度与成分和功能失调有关
为了研究SPF小鼠回肠炎严重程度与肠道菌群之间的关系，我们进行了16S核糖体RNA基因测序。3种回肠炎表型间α-多样性无明显变化(图4A).然而，β-多样性分析显示R TNF明显分离deltaARE-小鼠及其WT窝仔(图4B).最有趣的是NR TNF的细菌群落结构deltaARE-小鼠与WT小鼠聚集在一起，但与R TNF分离deltaARE小鼠。这清楚地表明炎症和细菌群落之间存在联系。细菌种类的相对丰度显示，细菌多样性的变化与细菌组成的变化(图4C).回肠炎评分与的相对丰度负相关Porphyromonadacaeae(r =−0.79;p < 0.001)。相反，骑士团的无名成员梭菌属的在R小鼠中比例显著升高，且与组织病理程度呈正相关(R =0.48;p = 0.016)。断奶后直接对粪便样本进行的额外序列分析表明，母体向子代的微生物群转移与生命后期的疾病易感性无关，与疾病相关的微生物群变化与窝友效应无关。肿瘤坏死因子deltaARE同一窝小鼠均出现在回肠炎严重程度的三组中，因此断奶后盲肠菌群出现了非非非生物的情况(见在线补充图S3A)。
细菌分布和功能失调反映了回肠炎的严重程度。(A) SPF-WT和SPF-TNF中Shannon有效种数deltaARE老鼠。(B)根据基因型和回肠炎严重程度显示盲肠细菌群落分离的非参数多维标度分析。急救员(R;红色)与TNF明显分离deltaARE回肠炎评分低(低反应者，低r;灰色)和无反应者(NR;蓝色)。在定植实验中使用的微生物群供体小鼠显示有光晕。(C)细菌类群与回肠炎评分的相关性。(D)结肠菌群的代谢蛋白组分析。偏最小二乘法(PLS)分析区分响应因子(红色)和NR(蓝色)TNFdeltaARE小鼠。(E)属于同源基团簇(COGs)主要作用的蛋白质功能丰度的显著变化新陈代谢R和NR样品之间。热图代表了COGs丰度的差异。记录蛋白质组数据10通过对细菌蛋白质数据的中位数进行转换和归一化。灰色方框中显示R或NR所特有的蛋白质功能。COG子角色有:C，能源生产和转换;E，氨基酸转运与代谢;F，核苷酸转运与代谢;G，碳水化合物的运输和代谢;H，辅酶转运与代谢;一、脂质转运与代谢。* * * p < 0.001;双因素方差分析后采用Holm-Sidak检验。
通过LC-MS/MS代谢蛋白组分析，微生物群落的功能变化强调了这些组成上的差异。偏最小二乘分析显示R和NR小鼠有明显的分离(图4D).使用同源基团簇将蛋白质分配到功能上。的subroles翻译核糖体结构与生物发生(折叠变化(fc) 103, p=0.028)，碳水化合物运输与代谢(fc 59.8, p=0.018)氨基酸的转运和代谢m (fc 23.4, p=0.027)在R组显著升高。这些蛋白质在两组老鼠的分类中有显著不同新陈代谢或细胞过程和信号显示在图4E和在线查看补充图S3B。有10种蛋白只存在于Rs中，只有2种蛋白是NRs所特有的。
回肠炎可通过肠道微生物群传播
GF-TNFdeltaARE小鼠无肠道炎症，spf壳回肠炎的发生与生态失调有关。我们首先测试了GF-TNF的单定殖deltaARE带有革兰氏阴性粘附性入侵细菌的小鼠大肠杆菌LF82，一种与乳糜泻相关的著名菌株。33，34定植4周后，LF82在TNF中未引起回肠炎deltaARE小鼠(p=0.07)，尽管盲肠细胞密度达到10.2±0.3 log10 cfu/g(见在线补充图S4A)。
测试TNF中与cd样回肠炎发展相关的非生物微生物群的因果关系deltaARE接下来，我们从SPF-TNF转移盲肠微生物群落deltaARE小鼠转化为gf受体(图5A).因此，GF-TNFdeltaARE用来自Rs或NRs的供体微生物群定植GF-WT小鼠。供体微生物区系用光晕突出显示图4b .肿瘤坏死因子deltaARE小鼠被Rs (+R;红色)在4周后出现炎症，模拟相应供体的回肠炎严重程度(受体小鼠和各自的供体小鼠用相同的符号显示)。WT窝仔没有表现出炎症的迹象，这支持了遗传易感性在转移后发生回肠炎的事实。最值得注意的是GF-TNFdeltaARE被来自NRs的微生物群定植的小鼠也没有出现回肠炎的迹象(+NR;蓝色)。在两个受体组中，gf小鼠被相当密度的细菌定植(大约109cfu/g)和组织成熟通过盲肠重量的降低来证实(见在线补充图S4B)。与GF-TNF相比，两个受体组的肠系膜淋巴结重量与体重的比值显著增加deltaARE老鼠(图5B)，提示存在独立于组织病理的粘膜免疫细胞激活。增加肿瘤坏死因子-转录本水平(p<0.001)与组织病理诱导相关(图5C)。
回肠炎可通过肠道微生物群传播。(A) GF-WT和GF-TNFdeltaARE(ARE)小鼠在8周龄时，用SPF应答者(+R)或无应答者(+NR)供体- tnf的复杂盲肠微生物群定植deltaARE老鼠(橙色晕在图4；每n = 3)。年龄匹配和时间匹配的GF-WT和GF-TNFdeltaARE-小鼠作为对照。定殖4周后发生回肠炎。spf供体小鼠和各自的受体显示相同的符号。(B)肠系膜淋巴结重量增加。(C)回肠表达(正常化至Gapdh)肿瘤坏死因子为倍增的SPF-WT小鼠。(D) NMDS图显示R受体(红色)和NR受体(蓝色)根据各自的供体(R1-3或NR1-3;捐赠者和接受者使用相同的符号显示)。ARE和WT分别显示为填充符号和开放符号。(E)与R或NR定殖相关的OTUs。每一列代表一个接收ARE鼠标。供体和总序列的百分比(彩色刻度)列于表下。* * * p < 0.001;双因素方差分析后采用Holm-Sidak检验。ARE，富含au元素; GF, germ-free; NMDS, non-parametrical multiple dimensional scaling.
为了验证传染性回肠炎是由于非生物性细菌群落的转移，我们使用高通量测序分析了受体小鼠的盲肠内容物。α-多样性分析显示基因型和供体组之间没有差异(见在线补充图S4C)。β-多样性分析再次显示炎症受体和非炎症受体之间存在明显的分离(图5D).受体组之间的差异仍然可以分配给各自的捐赠者，包括WT和TNFdeltaARE老鼠。的增加梭菌属的的SPP和下降Porphyromonadacaeae在炎症供体SPF-TNF中观察到deltaARE小鼠也发生在受体中，但结果未达到显著性(见在线补充图S4D)。差异丰度分析鉴定出两种OTUs分类为Hungatellasp只存在于NRs中，相对丰度可达15%。另外3个同属的OTUs只在Rs中出现(图5E)，表明R和NR小鼠的种特异性差异。
炎症先于PC功能丧失
为了更好地理解PC在回肠炎发展中的作用，我们分析了cd样回肠转移模型中组织病理和PC功能的时间序列。GF-TNFdeltaAREGF-WT受体在8周龄时被R SPF-TNF的非生物菌群定植deltaARE小鼠1周，2周，4周。如图6A，回肠炎在1周后消失(0.13±0.28)，但随着TNF定植时间的延长而增加deltaARE但在WT小鼠中没有。肿瘤坏死因子在定殖1周后，相对于gf对照，mRNA表达水平已显著增加(图6C;p<0.001)，而粒细胞浸润和肠系膜淋巴结重量稍后增加，与TNF的疾病严重程度平行deltaARE老鼠(图6D和在线查看补充图S5A)。定殖对盲肠重量和黏液聚焦的影响在定殖后1周就已可见，显示整个隐绒毛轴的染色增加(图7一个;上面板和在线查看补充图S5B)。uea -1阳性隐窝细胞的数量在整个定殖期保持不变。最重要的是，再定植TNF的溶菌酶阳性隐窝细胞的丢失deltaARE小鼠未出现组织病理(图7B)，提示PC功能丧失与cd样回肠的发展相关，但不是因果关系。每个隐窝中Cryptdin 2阳性细胞的定量(图7下图和7B右侧图)显示，在定植4周后，小鼠的Cryptdin 2表达没有减少，尽管存在中度的组织病理学和炎症激活(增加肿瘤坏死因子表达水平和ly6g阳性粒细胞浸润)。
不良微生物群的转移导致疾病的逐渐发作。(A) GF-WT和GF-TNFdeltaARE(ARE)小鼠在8周龄时，用发炎的SPF反应小鼠的复杂盲肠微生物群定植(开放符号)。在1周、2周和4周定植后，评估回肠炎。(B)上面板:are -小鼠回肠末端经H&E染色后被应答菌群定植1周、2周和4周(wk)。年龄匹配的GF-AREs(左)作为对照。下面板:有代表性的末端回肠切片被Ly-6G染色(红色)。(C)回肠表达(正常化至Gapdh)肿瘤坏死因子为倍增的SPF-WT小鼠。肿瘤坏死因子GF-ARE-mice的表达以虚线表示。(D)每毫米ly6g阳性粒细胞的定量2在R菌群定殖1周、2周和4周后，在回肠末端的组织切片上。ARE，富含au元素;女朋友,无菌。
抗微生物肽的丧失是炎症发展的次要原因。(A)溶菌酶、UEA-1和Cryptdin 2的Paneth细胞染色，如图所示(上面板，10倍放大;其他人,120×)。(B)与WT小鼠相比，富au元素(ARE)小鼠每个隐窝碱基溶菌酶阳性、uea -1阳性和cryptdin 2阳性细胞的定量(虚线)。* p < 0.05;***p<0.001(单向方差分析后Tukey检验)。
讨论
在目前的工作中，我们首次为实验性cd样回肠炎中细菌生态失调的疾病相关因果关系提供了证据。我们展示了GF-TNFdeltaARE小鼠受到肠道炎症的保护，从而在一个具有CD主要临床特征的模型中证明了微生物触发因素的重要作用。在几个结肠炎模型中，在GF条件下的无病状态已经显示出来，例如IL-10−−/或T-bet(−/−)×Rag2(−/−)溃疡性结肠炎(TRUC)小鼠模型(TRUC)小鼠和HLA/B27-β2m转基因大鼠。23，35，36然而，包括TNF在内的与ibd相关的回肠炎模型很少deltaARE和SAMP1/YitFc小鼠。37GF壳诱导SAMP1/YitFc小鼠的疾病活性减弱或无疾病活性，但关于微生物群落在回肠炎发展中的具体贡献的信息尚缺乏。38，39粪便菌群的连续采样显示炎症的逐渐影响，如TNF中细菌群落随着时间的推移而增加的分歧所示deltaAREvs . WT窝友。TNF中有几个类群明显更丰富deltaARE老鼠，包括家族成员类杆菌这些物质经常被报道会增加人类和小鼠患肠道炎症的风险。7，9，23，40-42
抗生素治疗引起的微生物组成变化确立了炎症复发的病程，与IBD患者的观察结果相似。43包括抗生素、益生菌和FMT在内的微生物治疗乳糜泻的临床疗效尚未得到很好的证实。荟萃分析显示，益生菌在维持乳糜泻患者的缓解方面没有明显优势，但提示抗生素的有益作用。44，45有趣的是，在TNF中结肠炎的发展deltaARE小鼠仅在CONV壳中检测到多种与小鼠相关的病原体，而不受抗生素治疗的影响，这表明在该cd样炎症模型中回肠炎和结肠炎的发病机制不同。
convn - tnf的胚胎移植deltaARE将小鼠转移到屏障控制的环境导致极端回肠表型的进展，即大约一半的SPF-TNFdeltaARE小鼠出现了严重的回肠炎，而20%的小鼠没有出现回肠炎。疾病活动性和炎症组织激活，以粒细胞浸润和水平测量肿瘤坏死因子-表达，与溶菌酶阳性或隐素2阳性PCs和回肠的减少显著相关ANG4表达式。pc在黏膜防御中发挥重要作用，在IBD中功能受损，特别是在CD患者中。46-49遗传风险变异如自噬相关atg16l2 - t300a和内质网应激反应有助于PC功能障碍和上皮细胞特异性敲除模型，即Caspase-8−−/或ATG16L1−−/和XBP-1−−/小鼠，允许对cd样疾病表型的机制理解。百分比较有趣的是，这些新生成的小鼠模型都认为PC功能丧失是回肠发病的重要机制。然而，针对谱系的PC消融没有显示出特定的ibd相关表型，这表明PC功能的丧失本身不足以初始化疾病的发病，而是促进了上皮中复杂调节回路的丧失。53干扰素-γ抑制pc衍生抗菌肽的释放，54支持我们的观察，炎症相关介质废除PC功能。因此，与小肠中抗菌肽产生减少相关的PC功能的丧失可能是疾病的加速剂。我们显示了TNF驱动的回肠炎的严重程度deltaARE使用联合溶菌酶- uea -1和cryptdin-2染色，小鼠的PC功能下降而不是数量减少。对GF受体中疾病调节微生物群转移实验的时间序列分析清楚地表明，PC功能的丧失是在tnf驱动的炎症发展之后发生的，这表明PC功能的丧失可能导致了疾病相关细菌群落的分化或生态失调的发展，但似乎不是原因。
SPF-TNFdeltaARE患有严重回肠炎和抗菌肽损失的小鼠的特征是在分类和功能上的肠道菌群失调。对肠道菌群的分析显示，未知菌群的相对丰度与肠梗阻相关梭菌属的减少了大量的Porphyromonadacaeae(顺序细菌性的)．而成员梭菌属的在CD患者中发现较低的丰度，TNFdeltaARE回肠炎和TM-IEC-C1galt1−−/结肠炎模型，表明这个非常广泛的分类组的模型特异性特征。55，56与我们的代谢蛋白组分析的变化一致，对CD和UC患者的微生物群的鸟枪宏基因组分析显示，特别是在回肠CD中，功能转移由代谢途径驱动碳水化合物的转运及机理而且氨基酸生物合成。57宏蛋白质组学揭示，在其他研究中，聚焦利用酶的丰度是SPF-TNF中生态不良生态系统独有的deltaARE老鼠。炎症引起的宿主源性病灶的增加被证明影响表达聚焦酶的共生细菌的代谢功能。58再加上人体机能的丧失Fut2基因被证明与乳糜泻患者肠道菌群的变化有关，我们可能推测焦点代谢酶在产生肠道疾病相关微生物环境中的作用。59，60
我们发现炎症与失调的发展相关，最重要的是，微生物群转移实验证实了TNF中微生物失调与疾病起始之间的因果关系deltaARE老鼠。我们首次证明，来自具有相同遗传背景但病理不同的供体的组成和功能多样化的微生物群可以传播回肠炎症。加勒特等在TRUC小鼠中证明，一种基因型特异性微生物群将结肠炎转移到RAG2−−/收件人老鼠。然而，WT笼型动物也有炎症，这表明这是一种病原性而非非生物性的特征。36，61有趣的是,鲍威尔等62确认幽门螺杆菌typhlonius作为TRUC小鼠发病机制的关键驱动因素。在我们的实验中，炎症仅在疾病相关微生物群转移到GF-TNF后发生deltaARE而不是WT受体小鼠，支持了回肠炎发展的遗传易感性的必要性，以及非生物性微生物群落的非传染性。反之亦然， NR动物的菌群在GF-TNF中未能诱导cd样炎症deltaARE小鼠，清楚地展示了与疾病相关的非生物微生物群的特异性。
再次，R和NR菌群接受者之间的整体群落结构非常明显。基于otu的分析证实了家庭成员Porphyromonadacaeae的相对丰度，但HungatellaSPP有显著差异。值得注意的是，属的系统发育Hungatella与邻近物种(例如，梭状芽孢杆菌，空气耐受梭状芽孢杆菌，梭状芽孢杆菌而且xylanolyticum梭状芽胞杆菌)要求修订分类学。63因此，不同的代表HungatellaR和NR TNFdeltaARE老鼠，这暗示了以细菌形态的细微差异为特征的非生物条件，至少在物种水平上是如此。越来越多的证据表明，肠道细菌的保护或有害作用是菌株特异性或物种特异性的，例如，PrtP在肠道中的表达干酪乳杆菌，多糖A的存在脆弱拟杆菌，或通过结肠炎产生明胶酶E粪肠球菌．22，64，65例如，一些特定的病原体，Bilophila wadsworthia在il - 10−−/从具有将结肠炎转移到易感GF宿主的共生菌群中选择小鼠。66然而，我们未能在单相关TNF诱导回肠炎deltaARE使用cd相关病原体的小鼠大肠杆菌LF82。67，68我们所有的结果都指向复杂微生物群的群落效应和侵袭性保护机制的丧失或获得，而不是选择侵袭性系统型作为单一制剂，导致TNF中cd样回肠炎的发展deltaARE老鼠。
总之，我们报道了肿瘤坏死因子驱动的慢性炎症与cd样回肠病理依赖于微生物触发，炎症通过共生细菌的非生物群落传播。与先前发表的数据一致，母系遗传因素似乎与主导的非生物细菌群落的初始发展和晚年的疾病易感性无关。69了解异常生物和疾病调节微生物群的真实性质，对于判断IBD患者在治疗干预后复发的风险或在FMT试验中获得尽可能好的临床疗效至关重要。GF-TNF中ibd相关微生物群的转移deltaARE小鼠将是一个很好的工具，以获得复杂微生物群落在cd样炎症进展中的作用的翻译见解。
致谢
作者感谢Arlette Darfeuille-Michaud提供的信息大肠杆菌LF82, Sigrid Kisling为组织病理学评分，Melanie Klein, Caroline Ziegler和Kathleen Eismann为出色的技术工作，Benjamin Scheer帮助维护质谱仪，Ludovica Butto和Elena Lobner对手稿进行了关键校对。作者非常感谢使用亥姆霍兹环境研究中心的化学显微镜中心(ProVIS)的设施(由欧洲区域发展基金(EFRE-Europe Funds Saxony)支持)和亥姆霍兹协会。
参考文献
补充材料
脚注
MS和TC对目前的工作贡献相同，并共享第一作者身份。
调整通知这篇文章在Online First发布后已被更正。第一作者隶属关系和作者通信地址都已更正。Aline Dupont和Mathias Hornef的加盟细节也得到了更新。
贡献者MS、TC、DH设计实验并撰写稿件。MS、TC、JC进行实验。MS、TC和IL分析了测序数据。SBH、NJ和MvB进行了代谢蛋白组学研究。MB和AB产生无菌小鼠。AD、MH进行Cryptdin-2染色。TC和卫生署监督和协调这项工程。
资金无菌TNF的生成和保存deltaARE该小鼠由德国研究基金会(DFG)的优先项目SPP 16565资助，该项目已授予DH (HA3148/10-1)和AB(953/5-1)。所有实验均使用无菌TNFdeltaARE拨款予卫生署的DFG SPP1656 (HA3148/8-1)。
相互竞争的利益一个也没有。
出处和同行评审不是委托;外部同行评审。
数据共享声明我们很乐意提供我们的测序数据。
道德动物实验是根据德国动物护理指南进行的。