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摘要
客观的巯基嘌呤(MP)和硫唑嘌呤是维持IBD缓解的“一线”口服疗法。据信，它们的药理学作用是由于被激活的淋巴细胞返回发炎的肠道缓慢累积减少。我们研究了相关硫鸟嘌呤(TG)对宿主代谢、淋巴细胞和微生物群的改善作用。
设计C57Bl/6小鼠有或没有特定基因改变，以阐明TG的作用机制，每天用口服或直肠内TG, MP或水治疗。每天对疾病活动度进行评分。在牺牲时，分析结肠组织学、细胞因子信息、盲肠腔和粘膜微生物群。
结果口服和直肠内甘油三酯可迅速改善自发性慢性结肠炎温妮小鼠(Muc2分泌粘蛋白点突变)。TG在野生型(WT)小鼠和缺乏T和B淋巴细胞的小鼠中改善右旋糖酐硫酸钠诱导的慢性结肠炎。值得注意的是，在没有宿主次黄嘌呤(鸟嘌呤)磷酸核糖转移酶(Hprt)介导的TG转化为活性药物硫鸟嘌呤核苷酸(TGN)的情况下，结肠炎得到改善而没有免疫抑制作用。结肠细菌将TG和较少的MP转化为TGN，这与肠道细菌将TG转化为TGN以减少缺乏宿主Hprt小鼠的炎症一致。TG可快速诱导上皮细胞、巨噬细胞和WT细胞的自噬通量产生Hprt−−/成纤维细胞系和增强上皮细胞内细菌杀灭。
结论TG治疗并不一定依赖于适应性免疫系统。TG治疗温尼自发性结肠炎的疗效优于MP。TG的快速局部细菌转化与减少肠道炎症和免疫激活相关。
- 硫唑嘌呤
- 炎症性肠病模型
- 药物代谢
- 结肠细菌
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本研究的意义
关于这个问题我们已经知道了什么?
硫唑嘌呤或巯基嘌呤(MP)是前药物，需要肝脏和白细胞将前药物转化为活性代谢物，以阻止活化T淋巴细胞的增殖并诱导细胞凋亡。
这些硫嘌呤类药物与许多不必要的副作用有关，这限制了它们的使用，因此需要其他通常更昂贵的治疗方法。
副作用包括对肝脏和骨髓的脱靶效应，以及胰腺炎、药物热和肌痛。
新的发现是什么?
其中一种硫嘌呤，硫鸟嘌呤(TG)的有益临床作用可以独立于淋巴细胞发生。
这种作用可以独立于宿主向活性代谢物的转化而介导。
另一种转化TG前药物的途径是通过细菌。肠道细菌将前药物完全转化为活性药物的研究尚未见报道。
在我们的体内小鼠模型中，口服和直肠内TG比MP更有效。
在体外，TG作用自噬和细胞内细菌杀灭肠道上皮细胞的快速增强。
在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?
在IBD中，优先将TG递送到肠道炎症部位将减少炎症和免疫激活，导致快速的治疗反应，同时避免主要的门脉和血液白细胞代谢发生不必要的影响。因此，靶向给药以利用局部转化可以重塑克罗恩病和溃疡性结肠炎的口服治疗。
简介
IBD的发病机制是多因素的，涉及肠腔环境、肠上皮屏障以及适应性和先天免疫反应之间的相互作用。免疫反应是大多数IBD医学治疗的目标。糖皮质激素、(抗肿瘤坏死因子α (TNF-α))药物、硫嘌呤、甲氨蝶呤和钙调神经磷酸酶抑制剂都是通过调节免疫反应起作用的，尽管最近关于糖皮质激素的研究显示不排除其他作用机制。1
维持中度至重度IBD缓解的常用口服治疗，硫嘌呤前药，硫唑嘌呤和巯基嘌呤(MP)，2，3.被认为是通过(i)核苷酸代谢物硫鸟苷三磷酸(thioGTP)竞争性结合ras相关C3肉毒毒素底物1 (RAC1)诱导活化CD4+ T淋巴细胞凋亡起作用的，4(ii) thiopurine nucleotide (TGN)代谢物对淋巴细胞抑制增殖T淋巴细胞的作用5(iii)通过巯基嘌呤甲基转移酶生成甲基-硫代肌苷单磷酸(methyl-thioIMP)以抑制嘌呤的从头合成。6硫鸟嘌呤(TG)，另一种硫嘌呤前药，被认为通过硫代嘌呤起类似的作用，但不产生甲基硫代嘌呤。TG在临床上也可能有更快的起效时间7号到9号而不是硫唑嘌呤或MP;然而，由于在门静脉循环中硫代嘌呤或相关代谢物的快速生成会引起与剂量相关的血管肝毒性，因此很少使用。10
现在人们普遍认为，肠道内的微生物群落是IBD病因学的关键因素。IBD的粘膜炎症与肠道微生物群的改变有关，其特征是物种水平上微生物多样性的降低和“生态失调”，这可能是由于炎症生态位的优先定殖所致。11，12微生物群也可能在IBD的慢性炎症中发挥因果作用，如一些实验模型中关于传染性结肠炎的报告所述。13IBD的全基因组关联研究已经确定了与微生物反应相关的多种途径，强调了宿主-微生物组相互作用对IBD发病机制的重要性。14特别是，自噬途径是一种高度保守的稳态途径，涉及多种细胞过程，包括细胞内细菌的控制和促炎细胞因子的产生。15抗生素在治疗IBD，特别是克罗恩病中的作用一直是人们的兴趣16，17最近的研究报告了通过粪便微生物移植操纵微生物组的可能作用。18
在这篇论文中，我们表明TG可以独立于适应性免疫系统。这可以在没有宿主代谢和/或局部粘膜代谢TG的情况下通过细菌激活发生，这可能避免了体循环中高浓度硫代tp的作用。因此，将TG局部递送到活动性IBD的肠道部位可以快速治疗肠道炎症，而不会对肝脏、系统免疫系统或造血系统产生不利影响。
材料与方法
动物实验与治疗
所有动物实验均经昆士兰大学动物伦理委员会批准。C57Bl/6野生型(WT)小鼠购自西澳大利亚动物资源管理局，次黄嘌呤(鸟嘌呤)磷酸核糖转移酶(产生Hprt）−−/，温妮而且生老鼠是在一个无病原体的动物设施中饲养的。雄性和(或)雌性小鼠每天灌胃，分别给予载体对照或巯基嘌呤药物(TG或MP)，持续14 - 28天。TG或MP也经直肠内给药温妮老鼠。TG(分子量(MW) 167, Sigma)制备为水中悬浮液，并在给药前充分混合。MP (mw170, MP monohydrate Sigma)溶于水。车辆控制是水。
右旋糖酐硫酸钠(DSS) (36-50 kDa;MP Biochemicals)在饮用水中长期使用(0.5% (w/v)，连续4个周期，连续5天，然后是7天(前两个周期)或9天(后两个周期)。
结肠炎组织学评分
对自发性和dss诱导的结肠炎进行组织学评估，对小鼠基因型和治疗方法进行盲法分析。19
补充数据
RNA提取、cDNA合成和基因表达、样品采集和微生物组分析方法参见在线补充数据。20-26荧光活化细胞分选(FACS)分析，TGN测量，27细胞培养，自噬和细菌复制实验，28类器官培养和治疗，29操作分类单位(MTS)细胞活力测定及引物(补充表1)。
统计与分析
Mann-Whitney用于非参数数据，其图形为具有中位数、四分位数和范围的盒须图。对于与时间和剂量相关的实验，采用双向方差分析(ANOVA)和Bonferroni后验校正来评估显著性。结果的显著性由a *表示，以表明测试与WT TG 0 mg/kg和a＃表示测试和产生Hprt−−/，温妮或生TG 0 mg/kg。统计数字:*或＃或＆P <0.05， ** or# #或& &P <0.01， *** or＃＃＃或&&&p < 0.001。
结果
高剂量TG对大鼠自发性结肠炎有改善作用温妮在14天内建立UC模型
温妮小鼠在4周龄时出现类似UC的自发性结肠炎。启动因素是杯状细胞粘蛋白生产缺陷，由于单核苷酸多态性的D3结构域Muc2，这导致蛋白错误折叠和内质网(ER)的粘液分泌细胞应激，导致Th17显性结肠炎。1，19，30.，31
少年温妮和WT C57Bl/6 (WT)对照小鼠每天灌胃0.5、1或2.5 mg/kg浓度的对照或TG，持续14天，以研究这种硫嘌呤药物治疗对自发性结肠炎的影响。TG以剂量依赖的方式改善自发性结肠炎(图1A).结肠炎及其治疗的改善(图1A, B)在结肠远端(DC)更明显温妮小鼠与之前的报道一致。30.，32炎症因子的Th1和Th17 mRNA肿瘤坏死因子-α,白介素(Il)-1b，干扰素γ (Ifn-γ)而且Il-17治疗组的近端结肠(PC)和DC (图1C)。常规H&E组织学和评分显示炎症浸润减少，杯状细胞形态、隐窝结构和长度的剂量依赖性恢复，隐窝脓肿和粘膜侵蚀数量减少(见在线补充图S1A)。H&E组织学证实粘蛋白生产恢复，表达增加Muc2（图1C)和粘蛋白特异性Agr2伴侣(见在线补充图S2)。内质网应激和未折叠蛋白反应随着处理的降低而降低Grp78(见在线补充图S2)和sXbp1(见在线补充图S2)。在tg治疗中，结肠炎的改善与外周血白细胞(WBC)计数呈负相关温妮(见在线补充图S1B)，与剂量依赖性免疫抑制一致。
急性给药硫鸟嘌呤(TG)可改善自发性温妮小鼠结肠炎。C57Bl/6(野生型(WT)，开放符号)和温妮(灰色符号)每天给予TG 0、0.5、1或2.5 mg/kg，持续14天。(A)近端结肠(PC)和远端结肠(DC)组织学结肠炎的盲法评分;(B) WT的PC和DC的代表H&E温妮每日TG为0或2.5 mg/kg， (C) mRNA折叠变化归一化至β肌动蛋白基因对WT的控制肿瘤坏死因子-α干扰素-γ,白介素(Il)-1b, Il-17和Muc2．中位数、四分位数和范围的盒须图，N= 4-6。符号:* vs WT TG 0 mg/kg;＃与温妮TG 0 mg/kg。统计分析:Mann-Whitney非参数检验。比例尺=100 μm。
在28天内给予临床相关的低剂量TG(而不是MP)可以改善患者的自发性结肠炎温妮以及WT小鼠的慢性dss诱导的结肠炎
低剂量TG (0.5 mg/kg/天)在给药14天没有显著改善组织学结肠炎评分，但该剂量与下降相关Il-17消息(图1C)，这表明较长时间的低剂量服用可能会改善疾病。因此，通过将0.5 mg/kg/天TG持续28天与广泛使用的巯基嘌呤药物MP的超药理学剂量(2.5 mg/kg/天)进行比较，测试了临床更相关的TG场景。(对于巯基嘌呤甲基转移酶活性正常的IBD患者，TG和MP的日剂量分别为0.4和1.5 mg/kg。)
TG而不是MP都能改善PC和DC患者的盲性组织学结肠炎评分(图2C). TG而非MP倾向于减少外周血白细胞(p=0.09，图2一个)。温妮在28天内，在腹泻和直肠出血综合评分方面，TG改善了小鼠，而MP没有改善(图2B)，但结肠的重量/长度比没有变化(见在线补充图S3A)。
临床相关的低剂量硫鸟嘌呤(TG)的管理改善自发温妮结肠炎。(a - c):温妮分别以TG 0、0.5和巯基嘌呤(MP) 2.5 mg/kg/d灌胃28天。(A)外周血白细胞(WBC)计数;(B) 28天联合腹泻评分单因素方差分析p<0.05; (C)年近端结肠(PC)和远端结肠(DC)组织学结肠炎评分温妮．(D和E)急性给药TG温妮而且生（破布−−/×温妮)小鼠每日给予TG 0或2.5 mg/kg/d，持续14天;(D) PC和DC的组织学结肠炎评分温妮(浅灰色符号)和生(黑暗的象征);(E)代表H&E/阿利新蓝染色为DC温妮而且生的老鼠每天用TG 0或2.5 mg/kg治疗12天。统计分析:Mann-Whitney非参数检验。符号:*和温妮TG 0 mg/kg;＃与生TG 0 mg/kg。
低剂量TG也可以改善饮用水中0.5% DSS诱导的C57Bl/6 WT慢性结肠炎，持续4个周期。这些小鼠从第25天开始每天给予TG 0.5 mg/kg，共28天(最后两个断断续续的DSS周期)。DSS结肠炎在TG治疗后得到改善，这可以从结肠炎总评分中得到证实补充图S3B-E)和免疫和上皮损伤评分(见在线补充图S3F)。TG治疗与dss治疗和未治疗WT小鼠外周血白细胞减少相关(见在线)补充图S3G)。TG显著改善了腹泻评分和结肠重量，但没有改善体重和结肠长度(见在线)补充图S3B-D)。
本节的结果总体上证实了(i)在这些小鼠模型中TG比MP更有效，(ii)累积剂量和白细胞计数之间存在负相关，这与这些免疫调节药物在IBD中的临床经验一致。因此，在WT中，DSS治疗与DSS诱导的结肠炎相关，总肠系膜淋巴结(MLN)细胞数量预计会增加，但TG治疗会减少(见在线)补充图S3H)。有趣的是，这与MLN CD3e+CD4+淋巴细胞数量减少有关，也与MLN CD11b+髓系细胞和CD11c+主要组织相容性复合体II类(MHCII+)树突状细胞数量减少有关，这些细胞在低剂量TG处理后显著减少(见在线)补充图S3I)。MLN的CD19+和CD8+淋巴细胞没有改变(数据未显示)。
TG的治疗作用与T淋巴细胞无关
为了进一步探索TG对不同白细胞亚型和区室的免疫调节作用，研究人员在WT动物中评估了每日TG对骨髓(BM)和脾脏的影响，TG剂量为0.05至5 mg/kg，持续28天。不出所料，TG剂量与BM白细胞数量呈负相关(见在线)补充图S4A)，但有趣的是，虽然FACS分析显示CD3e−CD19+ B淋巴细胞和CD3e−CD11b+髓系细胞比例下降，但CD3e+CD4+和CD3e+CD8+ T淋巴细胞分数在BM中没有比例下降(见在线补充图在脾脏中，CD3e+CD4+和CD3e+CD4+CD69+ T辅助细胞数量在TG给药28天后下降，但CD3e−CD19+ B淋巴细胞数量也减少(参见在线补充图自己,D)。
我们课题组先前发表的T淋巴细胞和B淋巴细胞在自发性结肠炎的发生中不是必需的温妮老鼠。温妮×Rag1−−/（生)老鼠是温妮缺少T淋巴细胞和B淋巴细胞的小鼠。30.生小鼠自发发展结肠炎表型与更多的近端疾病比温妮．在一个实验中温妮而且生小鼠品系，TG 2.5 mg/kg给药14天可改善结肠重量/长度比(见在线补充图S5A)，改善了盲目组织学PC和DC结肠炎评分(图2D)并恢复了两者的杯状细胞形态生而且温妮老鼠(图2E). TG治疗与炎症减轻(改善干扰素-γ，il - 1β)和增加Muc2的PC和DC的表达式生老鼠和温妮控制(请参阅网上补充图S5B)。
低剂量TG改善慢性dss诱导的结肠炎产生Hprt−−/老鼠
ThioGTP是白细胞内TGN中含量最多的(thioGMP, thioGDP, ThioGTP)，33，34是热重反应所必需的。我们假设TG不能改善慢性DSS结肠炎产生Hprt−−/因为从TG前药合成硫鸟嘌呤核苷酸(TGN)绝对需要HPRT酶。10
没想到，在dss诱发的结肠炎中产生Hprt−−/TG治疗与所有结局指标的改善相关:疾病活跃性指数(包括腹泻、体重变化和直肠出血评分)、结肠重量/长度比(图3A, B)，冒号权重(见网上补充图S6A)和不同结肠节段的盲法组织学结肠炎评分(图3C，见在线补充图S6B)。代表性的H&E组织学显示较为正常的上皮细胞及完整的杯状细胞(图3D).正如预期的那样，TG治疗与免疫抑制无关产生Hprt−−/因为免疫抑制与thioGTP的产生有关(图3E).此外，MLN细胞计数在产生Hprt−−/预计DSS会增加小鼠的结肠炎，但不会因TG而降低(图3F).未处理或dss暴露的MLN中CD3e+CD4+、CD11b+和CD11c+MHCII+亚群数量未因TG施用而减少产生Hprt−−/老鼠(见网上补充图S6C)。
低剂量硫鸟嘌呤(TG)通过次黄嘌呤(鸟嘌呤)磷酸核糖转移酶(产生Hprt）−−/老鼠。产生Hprt−−/(A)疾病活动指数(DAIs)双因素方差分析(dual - ANOVA) p<0.05，从第42天开始p<0.001;(B)结肠重长比;(C)近端结肠(PC)、中端结肠(MC)和远端结肠(DC)的组织学结肠炎评分产生Hprt−−/加或不加DSS或TG处理;(D) MC的代表H&E产生Hprt−−/0.5% DSS，±TG 0.5 mg/kg;(E)外周血白细胞(WBC)计数和(F)肠系膜淋巴结(MLN)总细胞数。统计分析:Mann-Whitney非参数检验。符号:*和产生Hprt−−/TG 0 mg/kg;＃与产生Hprt−−/DSS TG 0 mg/kg。比例尺=100 μm。
总之，这些数据表明TG在改善慢性DSS结肠炎中的治疗作用产生Hprt−−/小鼠既不需要产生宿主硫代tp，也不与全身免疫抑制相关。
TG改变了宿主粘膜微生物群
TG是一种抗代谢物。为了探索TG对结肠炎的改善可能是由于TG对肠道微生物群落的生物效应，年龄匹配和性别匹配的WT，产生Hprt−/−而且温妮每天灌胃0.5 mg/kg TG，连续28天。而TG治疗对三种小鼠的腔内盲肠内容物(CC)无明显影响(图4A)， C57Bl/6 WT和盲肠黏膜(CM)相关群落结构均发生改变产生Hprt−−/系统发育依赖(双主坐标分析(DPCOA))和系统发育独立(对应分析(COA))方法都表明了这一点。CM微生物群温妮TG未显著改变(p>0.05)，提示其是受损的温妮而不是低剂量TG的影响，这是影响菌群组成的主导因素温妮CM利基。
盲肠黏膜(CM)相关的微生物群随着硫鸟嘌呤(TG)的处理而发生变化。在野生型(WT)、次黄嘌呤(鸟嘌呤)磷酸核糖转移酶(产生Hprt）−−/而且温妮或TG 2.5，持续14天温妮采用对应分析(COA)和双主坐标分析(DPCOA)对盲肠内容物(CC)和CM微生物群的影响进行了研究。(A)表明治疗组和对照组居民社区是否存在显著差异的蒙特卡罗排列检验的p值;(B)基于所有三株小鼠CM样品的细菌群落特征的DPCOA。左边是对照组，右边是tg处理过的。这些面板代表了样品剖面之间的相似性，来自同一菌株的样品被分组在一起;(C)基于WT小鼠CM样品细菌群落谱的DPCOA。有两个椭圆，一个红色，一个蓝色，代表每个处理的总方差(蓝色的控制;红色的TG)。每个质心点的位置(具有放射状的星形结构)表示每个OTU与每个样品的关联。点被着色，并根据它们的分类(从核糖体数据库项目算法获得，选择等级级别以方便可视化)进行集体标记。的相对丰度驱动的处理类型，分析表明样品的强分区拟杆菌门(但可能不包括该支系中的Rikenellaceae和Prevotellaceae)和该支系中的几个类群厚壁菌门和(D)从WT和中选择的系统发育群的相对丰度产生Hprt−−/CM样本(使用Wilcoxon检验分析对照和TG处理之间的差异(a=0.05，错误发现率(FDR))。N = 6。统计分析:*p<0.05)。
我们进行了第二次实验温妮每天服用五倍剂量的TG (2.5 mg/kg)的小鼠。就每个样品检索的序列而言，该实验的覆盖范围更大，因此可以评估对微生物群落结构的更微妙的影响。基于非系统发育(COA)的方法检测了差异，显示了特定OTU(物种)丰度的变化，但总体上群落的遗传结构没有显著改变(图4A).与低剂量TG一样，在腔内盲肠样品中未观察到差异。
基于所有三株小鼠CM样品的细菌群落特征的DPCOA表明，群落特征受到菌株来源的强烈影响(图4B左面板)，TG处理主要对产生Hprt−−/和WT C57Bl/6小鼠主要是由于减少拟杆菌门增加了厚壁菌门（图4C, D, p<0.05)。的社区概要之间的重叠增加证明了这一点，这导致了相似性的增加产生Hprt−−/和WT (图4B右侧面板相对于左侧面板)。
总之，这些数据显示了WT和CM菌群的显著变化产生Hprt−−/用TG处理的小鼠，但对CM菌群只有轻微的改变温妮TG处理小鼠．对3个品系小鼠腔内CC均无明显影响。综上所述，肠道菌群结构的改变不太可能是导致TG在改善肠道健康方面有益作用的主要因素温妮自发的结肠炎。
直肠内TG可在14天内改善自发性结肠炎
为了确定硫嘌呤是否能在结肠中局部发挥作用，温妮每天给予小鼠直肠内TG 1 mg/kg、MP 1 mg/kg或对照。TG 9.8(6.4-10.6)、MP 12.3(11.6-12.8)和对照组11.0(9.7-12.1)的中位数WBC计数(IQR)在该治疗后没有显著改变。从第11天开始，只有tg处理的小鼠的综合腹泻评分有统计学上的显著改善(图5A)和结肠重量/长度比(图5B). DC的盲法组织学评分证实TG有显著改善，但DC的MP没有改善(图5C, p<0.01，见在线补充图S7)。结肠中部或PC的结肠炎没有改善，这表明对结肠炎的有益作用仅限于与TG直接接触的结肠区域(图5C，见在线补充图S7)。
每天在直肠内注射硫鸟嘌呤(TG)，而不是巯基嘌呤(MP)， 1毫克/公斤，对自发性结肠炎有快速的局部改善。(A)腹泻综合评分;(B)结肠重量/长度比和(C)结肠炎在远端结肠(DC)、中端结肠(MC)和近端结肠(PC)段的组织学评分温妮老鼠。肠道代表细菌将TG(和较少的MP)转化为硫鸟嘌呤核苷酸(TGN)。体外实验:(D)平均(SEM) TGN大肠杆菌(革兰氏阴性),粪肠球菌(革兰氏阳性),叫多形拟杆菌(革兰氏阴性厌氧菌)用1mm TG或MP培养120分钟，N= 3-4， *versus T0，＃相对于T30和＆诸如与T60;(E)散点图，次黄嘌呤(鸟嘌呤)磷酸核糖转移酶6小时平均TGN (产生Hprt）−−/小鼠粪便与0、5或10 μ M TG孵育。体内:(F)野生型(WT)和产生Hprt−−/小鼠灌胃5 mg/kg TG:散点图，肝脏和粪便中TGN平均值。统计分析:Mann-Whitney非参数检验。符号:* vs WT鼠标。
细菌将TG转化为TGN，但较少将MP转化为TGN
已经在产生Hprt−/−在完全没有全身免疫抑制的情况下，TG可以改善结肠炎的小鼠，我们探索了宿主的微生物代谢是否可以产生thioGTP。HPRT: EC 2.4.2.8及相关嘌呤挽救酶在细菌中高度保守。35
首次利用具有代表性的肠道细菌在体外研究了TG的细菌代谢大肠杆菌，粪肠球菌而且叫多形拟杆菌．用1 mM TG对三种菌株进行对数相培养120分钟后，在细菌球中检测到TGN (thioGMP, thioGDP和thioGTP)。图5D)，而在用1 mM MP培养的培养基中TGN最少。采用液相色谱-双质谱联用(LC-MS/MS)检测猪粪便中TGN的含量产生Hprt−−/5 μM TG和10 μM TG孵育6 h (图5E).这些数据表明，实验室和肠道细菌能够将TG代谢为活性TGN代谢物。
当WT和产生Hprt−−/小鼠每天灌胃TG 5 mg/kg，连续10天，剂量大，预计不会被小肠完全吸收，在WT小鼠的粪便和肝脏中均发现TGN，但在WT小鼠的肝脏中未发现TGN产生Hprt−−/老鼠(图5F).因此，TG的作用机制可能源于细菌Hprt将TG转化为thioGTP。
TG以依赖于TG的方式增强体外自噬
基于前面的结果部分，我们进一步假设TG可能通过局部影响细菌-上皮相互作用来快速改善结肠炎。上皮细胞依赖自噬对腔内细菌作出反应并维持稳态。肠道中的抗菌自噬受损已被假设为IBD的一个因素。15因此，我们通过监测自噬体标记物LC3-I向LC3-II的转化来分析TG对大量自噬的影响。将HeLa细胞分别用载体对照和TG 1、10、100 μM加或不加Pepstatin A和E64D (PE)孵育16 h，检测细胞自噬通量。TG处理增加了LC3-II与LC3-I的比率(图6A、Cii和网上看补充图S8A)，表明自噬体积累增加。PE阻断自噬体成熟和LC3-II循环回LC3-I，进一步增强了效果，表明TG的作用是由于增加自噬诱导，而不是抑制成熟。在人肠道上皮细胞系(HT29, HCT116)和肝细胞(HepG2)中也观察到这种效应(图6B和网上看补充图S8B)和小鼠Ralph和William细胞系(RAW)中的巨噬细胞样细胞(图6网上见补充图S8C)。为了确定TG处理是否对细胞内细菌处理有影响，我们使用了一个沙门氏菌细胞内复制模型，已知对抗菌自噬的影响敏感。用载体对照或TG预处理HeLa细胞，并用生物荧光感染鼠伤寒沙门氏菌(SL1344)和通过测量发光来监测复制。50或100µM TG的处理显著降低了细菌的细胞内复制(图6D)。我们进一步通过荧光显微镜定量了在表达lc3 -绿色荧光蛋白(GFP)的HeLa细胞中，用TG 50µM处理或不处理细菌的自噬体包封情况。与对照组相比，该剂量的TG显著增加了LC3与细胞内细菌的共定位，与增加的抗菌自噬一致(图6E)。
硫鸟嘌呤(TG)促进自噬。TG增强体外自噬:western blot检测LC3-I, LC3-II和β-肌动蛋白(A)用二甲基亚砜(DMSO) 0.1%、TG(10或100µM)±Pepstatin A和E64D (PE)处理HeLa细胞16小时;(B) HT29、HCT116和HepG2细胞系用TG 50µM处理16小时;(C) LC3-II:LC3-I在tg处理的(i) RAW细胞和(ii) HeLa+PE细胞中的比例。细菌复制试验:(D) HeLa预处理DMSO 0.1%或TG(10、50和100µM)感染沙门氏菌(SL1344):感染后12小时发光读数;在含有TG的培养基中，SL1344的生长在这段时间内没有改变。N = 4 - 8实验;(E)荧光显微镜定量和LC3-II与SL1344细菌感染的HeLa细胞+TG 50µM共定位的代表性图像。蓝- 4 '，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)核染色;红色- - - - - -沙门氏菌；green-LC3。柱状图，均值±SD, N=3。统计分析:未配对t检验*p<0.05。TG对自噬的影响依赖于次黄嘌呤(鸟嘌呤)磷酸核糖转移酶(Hprt):(F) LC3-II与β-肌动蛋白的比例定量。野生型(WT)和产生Hprt−−/用DMSO 0.1%或50µM TG处理16小时。N = 5 - 6。Western blot图像。(G) WT结肠类器官分化72小时，然后用DMSO 0.1%或TG 50µM处理16小时。Western blot图像。LC3-II与β-肌动蛋白比值定量，bars, mean±SD, N=2，来自6孔/条件/重复。统计分析:Mann-Whitney非参数检验:*p<0.05 WT TG 50 vs 0µM;# #p<0.01 TG 50µM产生Hprt−−/WT TG 50µM。
为了区分TG效应和thioGTP效应，将原代成纤维细胞从WT和产生Hprt−−/分别用对照和TG 50 μM对小鼠孵育16 h。在成纤维细胞中观察到极少的LC3-I，但在tg处理的wt来源的成纤维细胞中，LC3-II与β-肌动蛋白的比例显著增加，与自噬诱导一致，但在没有Hprt的情况下没有影响(图6F)，虽然自噬可以诱导产生Hprt−−/由mTor抑制剂Torin1，表明完整的自噬装置(见在线补充图S8D)。综上所述，这些数据表明TG对上皮细胞的处理以硫代tp依赖的方式诱导自噬，并改善了对细胞内细菌生长的限制，可能是通过诱导抗菌自噬。
为了解决TG治疗的体内相关性问题，我们培养了WT小鼠的结肠类器官。TG明显提高了LC3-II与β-actin的比值，这与原代培养细胞的自噬诱导一致(图6G)。我们还尝试在动物模型中证明LC3-II/LC3-I增加。我们发现了自噬减少的趋势(p=0.07，见在线补充图S8F)与直肠内TG治疗改善结肠炎(图5a - c)，这与更健康的结肠上皮一致，但我们无法使用我们的方法证明结肠黏膜自噬通量与急性TG暴露之间的任何趋势或关联。
讨论
这项研究有一些重要的新颖的观察结果。最值得注意的是慢性DSS结肠炎在临床和组织学上的显著改善产生Hprt−−/老鼠。这是相当出乎意料的，因为硫嘌呤的作用被广泛认为涉及硫ogtp。ThioGTP是TGN中含量最丰富的(thioGMP, thioGDP, ThioGTP)。33，34与缺乏hprt的小鼠宿主无法将TG转化为TGN相一致的是，外周血或MLN区室的白细胞计数没有减少。这让我们研究了TG对微生物群的影响:我们假设TG既具有生物效应，又被微生物群代谢。TG改变了C57Bl/6 WT和C57Bl小鼠盲肠腔内的微生物群产生Hprt−−/老鼠。而粘膜微生物组的这些变化可能导致结肠炎性更低(更耐受性)的细菌群落，因为相似的门和亚门的变化厚壁菌门而且拟杆菌门在炎症性肠病患者炎症和非炎症样本之间的粘膜微生物组中，36CM微生物群只有最小程度的改变温妮用TG处理的小鼠。这表明改变的粘液屏障温妮小鼠在TG对该微生物生态位的影响中占主导地位。因此，甘油三酯的有益作用不太可能是自发的温妮结肠炎是由于TG对微生物群的生物效应。
另一方面，我们证明了细菌将TG转化为TGN。这就提出了一种可能性，即肠道细菌在局部产生TGN，包括thioGTP，有可能通过影响粘膜上皮细胞或免疫细胞来局部缓解炎症。虽然最近的文献强调了巯基嘌呤对抗原呈递细胞- T淋巴细胞突触的作用，TG的作用已被证明与CD28共刺激时阻断T淋巴细胞中的GTPase活化有关，4，37在炎症的结肠黏膜中，除了循环的T淋巴细胞外，还有许多其他类型的细胞，这些细胞可能会受到TG处理的影响。巯基嘌呤对其他类型细胞的作用偶有报道。38-40结肠炎的改善生（温妮×Rag1−−/)老鼠(图2)表明TG的治疗作用不需要T淋巴细胞或B淋巴细胞的存在。此外，虽然TG治疗降低了(hprt完整的)WT和外周血和BM区总体白细胞计数温妮在WT小鼠的骨髓、脾脏和MLN区室中，髓系/树突状细胞计数比例更低(见在线)补充图S3和S4)。
TG对改善结肠炎的作用是迅速的。这与口服立即释放TG的临床印象在定性上是一致的，即TG比传统的口服硫嘌呤有更快的作用，7，9，41但我们的实验中反应的速度之快出乎意料。口服和直肠内TG治疗前列腺癌的药效学效果温妮TG 1或2.5 mg/kg/day改善了小鼠的结肠组织学(图1)， WT和dss诱导的结肠炎症状的快速改善产生Hprt−−/低剂量TG处理的小鼠(图3，见网上补充图S3)和快速的症状和组织学改善温妮低剂量直肠内TG小鼠(图5A-C，见网上补充图S7)。TG还与杯状细胞粘蛋白生产的恢复显著相关，H&E组织学证实了这一点Muc2（图1)和粘蛋白特异性Agr2伴侣蛋白(见在线补充图S2)。与地塞米松的直接作用相反1或il - 1032在杯状细胞中，内质网应激和未折叠蛋白反应的降低导致杯状细胞粘蛋白的恢复，我们认为TG使杯状细胞粘蛋白的恢复是由于炎症细胞因子环境的减少(图1)，而不是因为TG对上皮细胞内质网应激和未折叠蛋白反应有任何直接影响(未发表数据)。
在我们的小鼠结肠炎实验中，TG而不是MP的快速药动力学效应不能完全用药代动力学差异来解释，因为在IBD中静脉注射硫唑嘌呤并不影响其治疗作用开始的时间。42口服MP 4周后外周血中TGN达到稳定状态，早于其药效作用。然而，TG对TGN稳态的影响更快，43-45这可能是因为TG转化为活性药物的速率不受肌苷单磷酸脱氢酶(IMPDH)的限制。33
我们认为，在我们的小鼠模型中，灌胃TG的药理学作用的快速性是由于TG的局部作用，在小鼠模型中，由于肠吸收有限，TG到达发炎的远端肠，以增强粘膜屏障功能，以及增强先天免疫功能。(据报道，小鼠的胃-肛门转运时间峰值<7小时，我们证明了高剂量TG灌胃可在粪便中发现TGN，直肠内TG可快速局部改善远端结肠炎，图5。)我们还证明了TG对上皮细胞的影响，这在以前没有得到重视:(i) TG处理恢复了杯状细胞的形态(图1B,2E和3.D)1，32(ii)在体外，TG还改善了细菌的体积自噬和细胞内处理(图6)．此前有报道称，巯基嘌呤通过错配修复途径长时间暴露后可诱导自噬，可能是由于掺入DNA合成。46然而，我们证明TG在上皮细胞和巨噬细胞系以及原代成纤维细胞和类器官中诱导自噬通量相对较快，并且通过增加抗菌自噬对细胞内细菌复制有增强的限制。这种效应似乎依赖于TGN(或相关代谢物)，因为这种效应在Hprt中被取消了−−/成纤维细胞(图6)．这些数据包括TG增强的杀菌功能，TG对白细胞亚群的影响以及TG对白细胞亚群的改善生小鼠结肠炎合并tg的结果与最近的报道一致，该报道表明RAC1抑制可以增强先天免疫。47由此可见，相对于装载循环效应淋巴细胞所产生的缓慢药效学作用，通过粘膜或微生物HPRT将TG局部转化为thioGTP, TG治疗IBD的速度更快。
我们目前的模型TG作用的小鼠结肠炎总结在图7．在WT小鼠中，进入门静脉循环的TG经历了TGN的首通道门静脉代谢，TGN具有骨髓抑制作用，导致激活循环T淋巴细胞数量减少。另一方面，到达结肠腔的TG对粘膜细菌有轻微的生物作用，并在hprt完好的小鼠中被微生物群和结肠粘膜转化为TGN。微生物组对药物的代谢是相对未被探索的，人们认为其将药物代谢为非活性或有毒产物的能力与肝脏相当。48虽然在IBD中有众所周知的细菌酶从惰性载体释放药物的例子，但我们认为这是微生物组将前药物转化为活性药物代谢物的第一个证明。IBD炎症部位的粘膜相关细菌增加，49粘膜屏障的完整性降低，从而促进了细菌的易位。因此，TGN可通过TG的局部腔内或粘膜代谢，或携带TGN的细菌自噬，在炎症的远端肠黏膜中积累。tgn增强的自噬将导致细菌处理的快速改善，免疫激活降低，肠道炎症减少，并可能通过恢复粘液层改善分泌功能。与MP或硫唑嘌呤不同，TG由宿主或细菌转化为活性药物的速率不受IMPDH的限制。因此，与目前的口服免疫调节疗法相比，在IBD中将TG局部递送到肠道炎症部位具有临床上显著的优势。特别是，局部给药TG可以更快地治疗IBD，这也将避免对肝脏或造血系统产生不必要的不良影响。
漫画展示了(1)硫鸟嘌呤(TG)前药物转化为硫鸟嘌呤核苷酸(TGN)药物的全身和(2)局部效应。WT,野生型。
致谢
我们非常感谢MR-UQ研究副主任Michael McGuckin教授，以及免疫感染、炎症和癌症护理与生物学项目;Mark Morrison教授，微生物生物学和宏基因组学主席，昆士兰大学迪亚曼蒂纳研究所和Deon Venter教授，mr -昆士兰大学癌症护理和生物学项目，感谢他们对本项目的支持。
参考文献
脚注
贡献者IO在实验设计、数据采集分析、解读和稿件撰写等方面发挥了主要作用;RM在IO实验的指导下进行图3- - - - - -6；ID涉及数据的获取和分析图1而且2；DAdC制作了细菌群落概况，并进行了微生物组分析和主导解释图4；VS和BH为的数据采集和分析做出了贡献图6；YY与IO在图3；MP对数据采集有重要的贡献图2- - - - - -7；RW对数据采集的贡献图3，5而且6；YS为数据采集做出了贡献图2- - - - - -4；AP和IO对类器官培养和直肠内实验有贡献;RL在我们的实验室中推动了类器官培养系统;ML对方法开发做出了贡献，图5；PÓC对微生物学进行了监督，并对手稿的撰写做出了贡献;JAD提供了关于硫嘌呤生物化学测量和中间代谢的专业知识;JB对实验设计、方法开发和数据分析做出了贡献图6并参与稿件撰写;THJF负责整体项目和实验设计，全面负责数据的完整性、数据的分析和解释以及最终稿件的撰写。
资金THJF感谢来自Gutsy慈善机构(维多利亚，澳大利亚)的资助。IO和THJF还获得了NHMRC项目赠款1064440的资助。IO和JB获得了昆士兰大学Reginald Ferguson奖学金。JB和THJF接受Mater基金会的资助。
相互竞争的利益没有宣布。
出处和同行评审不是委托;外部同行评审。
数据共享声明2015年9月29日申请临时专利。PAT-02211-AU-01《新配方及处理方法》。数据和材料可用性:登录号PRJEB10595(存放在欧洲核苷酸档案馆)。