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Neurogastroenterology
原文
Apelin以肠道收缩为目标，通过大脑控制葡萄糖代谢
  1. Audren Fournel1，2，3.，
  2. 安妮Drougard1，2，3.，
  3. 鲍特Duparc2，4，
  4. Alysson马林1，2，3.，
  5. Stuart M Brierley5，6，7，
  6. 乔尔·卡斯特罗5，
  7. 苏菲Le-Gonidec1，2，3.，
  8. 伯纳德•马斯里8，
  9. 安德烈·科罗姆1，2，3.，
  10. 亚历山大·卢卡斯1，2，3.，
  11. Perrine Rousset3.，9，
  12. 尼古拉斯Cenac3.，9，
  13. 娜塔莉Vergnolle3.，9，
  14. 菲利普的管家1，2，3.，
  15. 帕特里斯·D·卡尼2，4，
  16. 克劳德。可耐福1，2，3.
  1. 1法国国家疾病研究所Santé et de la Recherche Médicale (INSERM)， U1048，法国疾病研究所Métaboliques et cardiovascular (I2MC)，图卢兹Cedex 4、法国
  2. 2NeuroMicrobiota，欧洲联合实验室(EAL)
  3. 3.Université保罗·萨巴蒂尔，图卢兹、法国
  4. 4Université鲁汶天主教(UCL)，鲁汶药物研究所，LDRI，代谢和营养研究小组，WELBIO(瓦隆卓越生命科学和生物技术)，布鲁塞尔、比利时
  5. 5内脏疼痛组，阿德莱德大学医学科营养和胃肠道疾病中心，南澳大利亚健康和医学研究所，南澳大利亚的阿德莱德、澳大利亚
  6. 6消化内科和肝病科“，，皇家阿德莱德医院，南澳大利亚的阿德莱德、澳大利亚
  7. 7健康科学学院生理学学科“，，阿德莱德大学，南澳大利亚的阿德莱德、澳大利亚
  8. 8国家研究中心Santé和研究中心Médicale (INSERM)， U1037，图卢兹研究中心Cancérologie (CRCT)， CHU Rangueil，图卢兹，Cedex 4、法国
  9. 9国家研究所Santé和研究中心Médicale (INSERM)， U1043，图卢兹Purpan生理病理中心(CPTP)， CHU Purpan，图卢兹，Cedex 03、法国
  1. 对应到Patrice D Cani教授，Université鲁汶天主教(UCL)，鲁汶药物研究所，LDRI，代谢和营养研究组，WELBIO, WELBIO(瓦隆卓越生命科学和生物技术)，Av. E. Mounier, 73 B1.73.11，布鲁塞尔B-1200，比利时;Patrice.cani在{}uclouvain.be
  2. Claude Knauf教授，法国国家研究所Santé et de de la Recherche Médicale (INSERM)， U1048，法国疾病研究所Métaboliques et cardiovascular (I2MC)， Université Paul Sabatier, CHU Rangueil, 1 Avenue Jean Poulhès, BP84225, 31432 Toulouse Cedex 4，法国;Claude.knauf在{}inserm.fr

摘要

客观的肠-脑轴被认为是控制葡萄糖稳态的主要调节检查点。十二指肠中营养物质和/或激素的检测通知下丘脑宿主的营养状况。这一过程可能通过下丘脑神经元调节中心释放一氧化氮(NO)发生，一氧化氮(NO)反过来控制葡萄糖进入组织。肠神经系统(ENS)调节肠道收缩以应对各种刺激，但这种相互作用在通过大脑控制葡萄糖稳态中的重要性尚不清楚。我们研究了apelin(一种存在于肠道中的生物活性肽)是否调节ens诱发的收缩，从而确定了通过下丘脑控制葡萄糖利用的新的生理伙伴。

设计我们通过遥测探针和等张传感器测量了apelin对正常和肥胖/糖尿病小鼠十二指肠电和机械反应的影响。在apelin调节十二指肠收缩时下丘脑NO释放的变化，用特定的安培探针实时评估。通过口服放射性标记葡萄糖来测量组织中葡萄糖的利用。

结果在正常和肥胖/糖尿病小鼠中，由于apelin引起下丘脑NO释放增加，ENS/收缩活动减少，从而改善了葡萄糖的利用。结果，葡萄糖进入肌肉显著增加。

结论在这里，我们确定了肠和下丘脑之间控制葡萄糖利用的一种新的通信模式。此外，我们的数据确定口服apelin是治疗代谢紊乱的一个新的潜在靶点。

  • 肥胖
  • 肠神经系统
  • 肠道激素
  • 胃肠生理
  • 葡萄糖代谢

这是一篇开放获取文章，根据创作共用属性非商业(CC BY-NC 4.0)许可证发布，该许可证允许其他人以非商业方式分发、混音、改编、在此作品的基础上进行构建，并以不同的条款许可其衍生作品，前提是原始作品被正确引用且使用是非商业性的。看到的:http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/

http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl-2015-310230

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    本研究的意义

    关于这个问题我们已经知道了什么?

    • 循环apelin是一种生物活性肽，在各种器官(脑、肌肉、脂肪组织)中发挥多效作用，以控制葡萄糖的利用和血糖。

    • 肠-脑轴在控制葡萄糖稳态中至关重要，在代谢疾病(如2型糖尿病)中会发生深刻改变。

    • 肠神经系统(ENS)受到各种生物活性因子的影响，如瘦素，瘦素能够从管腔转胞到肠壁。

    新的发现是什么?

    • 腔内表皮可以通过肠道转胞到达十二指肠内结构。

    • Apelin控制ENS神经递质释放，即乙酰胆碱和一氧化氮，与十二指肠收缩的变化有关。

    • Apelin触发ens诱导的十二指肠收缩，通过下丘脑继电器导致肌肉葡萄糖吸收。

    • 长期口服apelin可改善正常和肥胖/糖尿病小鼠的糖耐量，并与十二指肠运动能力下降密切相关。

    在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?

    • 这项研究提供了明确的证据，证明十二指肠ENS/收缩的调节是一种通过大脑控制外周葡萄糖利用的新生理系统。更重要的是，口服apelin可被认为是治疗胰岛素抵抗状态的一个有前途的治疗靶点。

    简介

    肠-脑轴在能量稳态的控制中起着至关重要的作用。检测或“感应”肠道脂质1和葡萄糖2激活肠壁的外部传入神经，告知下丘脑消化道中营养物质的存在。下丘脑神经元对这些外周信号的反应的后续调节导致代谢功能的改变，包括产热，3.食物摄入和葡萄糖在组织中的利用。4

    最近的研究证明了肠道营养感应在控制葡萄糖稳态中的重要性。5十二指肠和/或空肠营养物质检测的改变6干扰下丘脑反应，可能有助于建立增加肝脏葡萄糖生产7还有胰岛素抵抗，22型糖尿病的特征。能够改变肠-脑轴的新的分子机制的鉴定对于发现新的和成功的治疗策略具有重要意义。例如，瘦素分泌在肠腔部对营养物质作出反应，可以改变空肠中磷脂酰肌醇3激酶的活性，以减少肝脏葡萄糖的产生。7除瘦素外，apelin是另一个在全身发挥多效作用的潜在靶点。值得注意的是，apelin被认为是一种涉及葡萄糖代谢控制的生物活性肽。8在中枢神经系统(CNS)中，apelin是一种能够靶向下丘脑神经元控制血糖的神经递质。9在外围，apelin是一种脂肪因子，可以改善正常和肥胖/糖尿病小鼠肌肉的胰岛素敏感性。8，10最近的数据表明，apelin也存在于肠腔部分，并释放以刺激葡萄糖吸收。11

    在胃肠道中，肠神经系统(ENS)参与各种生理功能，包括调节肠道收缩。ENS主要由兴奋性(胆碱乙酰转移酶(ChAT))运动神经元或抑制性运动神经元(神经元一氧化氮合酶(nNOS))组成，刺激或抑制肠道收缩和运动。12这些ENS神经元已知表达各种因素的受体，如瘦素13以及胰高血糖素样肽-2 (GLP-2)。14在糖尿病晚期，肠近端(最先受到影响的部分)ENS的改变与肠高收缩性有关。12此外，一些研究表明，在糖尿病期间，肠道近端抑制神经元的损失和胆碱能神经的增加。12由ENS控制的十二指肠收缩是否与大脑控制葡萄糖稳态有关尚不清楚。

    在这里，我们研究GI apelin是否可以修改“ENS/收缩”对的活动，以通过大脑控制全身葡萄糖的利用。总的来说，我们的研究揭示了一种涉及十二指肠机械收缩性的新的通信模式，可以被认为是2型糖尿病患者通过大脑改善组织葡萄糖利用的潜在治疗靶点。

    材料与方法

    老鼠

    雄性C57BL/6J小鼠(法国查尔斯河实验室，l'Arbresle)免费获得食物和水。小鼠被喂食正常食物或含有20%蛋白质、35%碳水化合物和45%脂肪的高脂肪饮食(Research diet, New Brunswick, New Jersey, USA)。这些小鼠在3个月的HFD后变得肥胖和胰岛素抵抗。9在喂食的小鼠中记录了相应的数据，即产生肠段波以增加营养吸收率的阶段。15

    急性注射(apelin, APJ受体拮抗剂，NOS抑制剂，β-肾上腺素受体激动剂，烟碱受体拮抗剂和辣椒素)

    联机补充方法部分描述了协议。

    长期给药阿匹林

    在其他实验组小鼠中，100 μ L的[Pyr]apelin-13，浓度为1 μ M或100 μ L的H2O给予口服负荷(灌胃)，每日1次，连续1周。

    胃内和脑室内手术、遥测、等张收缩、免疫组化、转胞作用、乙酰胆碱释放、葡萄糖和apelin吸收、葡萄糖利用、qPCR、代谢参数、胰岛素和apelin测定、口服糖耐量试验

    联机补充方法部分描述了协议。

    细胞培养和荧光显微镜

    HEK-293T细胞如前所述培养16来测试apelin-TAMRA的功能。在线补充方法部分详细描述了协议。apelin - tamra是一种功能性apelin分子，能够结合并激活其受体APJ(见在线补充图S1)。

    体外十二指肠实时NO测量

    小鼠在喂食条件下安乐死。解剖后，十二指肠碎片在95% O的气氛中用krebbs - ringer碳酸氢盐/葡萄糖缓冲液(pH 7.4)洗涤2-5%的公司2然后浸入含有400 μ L相同介质的Eppendorf管中。在10分钟的恢复期后，使用直接植入十二指肠的NO特异性安培探针(ISO-NOPF, 100微米直径，5毫米长，World Precision Instruments, Aston Stevenage, UK)在37°C下20分钟测量NO的自发释放。数据表示为基础条件下NO释放量的变化(delta)。9

    活体下丘脑实时NO测量

    在喂食条件下用异氟醚麻醉小鼠。在颅骨顶部做一个1厘米的中线切口，并将动物放置在立体定向仪上，如前所述。6结果以均数±标准差表示。在安培测量中，动物接受H2O或药物通过10 μ L/min的胃内注射，使用注射泵10分钟。我们之前已经证明H2O是葡萄糖给药的首选载体。2，6，17此外，我们还证明了H2与NaCl(0.9%)相比，O没有改变下丘脑中c-Fos的表达(神经元活动的标志)。因此，所有对照组都注入了水，如前所述。2

    统计分析

    数据以均数±标准差表示。在适当的情况下，使用未配对的学生和单向或双向方差分析评估实验组之间的差异，然后进行事后Bonferroni检验。数据分析使用GraphPad Prism V.5.00 for Windows (GraphPad Software, San Diego, California, USA)。p<0.05时认为结果有统计学意义。

    结果

    Apelin作用于ENS神经元以控制十二指肠收缩

    十二指肠是肠道内最先感知营养物质的部位5以及apelin对葡萄糖吸收的影响。11通过免疫组化，我们发现apelin受体APJ在ChAT和nNOS神经元上表达(图1A).为了确定apelin是否能够通过肠道进行胞吞作用，我们使用了apelin- tamra，一种能够结合apelin受体APJ的功能性apelin分子(见在线补充图S1)。我们观察到apelin能够到达底层结构，如神经丛(图1B)，表明阿佩林，像其他脂肪因子，如瘦素，18接受transcytosis。

    Apelin receptor (APJ) is expressed in enteric nervous system neurons. (A) Duodenal sections from mice stained with anti-APJ antibody (left panels, green: white arrows), anti-choline acetyl transferase (ChAT) or anti-neuronal nitric oxide synthase (nNOS) antibodies (middle panels, red: white arrows) and merge (right panels, yellow arrows). Pictures are representative of four mice per groups. Bars=10 µm. Right panel: schematic representation of a transverse section through the duodenum. (B) Duodenal sections from mice perfused for 5 min with H2O (Control) (left panel) or apelin-TAMRA (right panel). Apelin-TAMRA appears in red (red arrows). Pictures are representative of three mice per groups. Bars=10 µm.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    Apelin受体(APJ)在肠神经系统神经元中表达。(A)抗apj抗体(左图，绿色:白色箭头)、抗胆碱乙酰转移酶(ChAT)或抗神经元一氧化氮合酶(nNOS)抗体(中间图，红色:白色箭头)和合并(右图，黄色箭头)染色的小鼠十二指肠切片。图片代表每组四只小鼠。酒吧= 10µm。右图:通过十二指肠的横切面示意图。(B)小鼠十二指肠切片灌注H2O (Control)(左面板)或apelin-TAMRA(右面板)。Apelin-TAMRA显示为红色(红色箭头)。图片代表每组三只小鼠。酒吧= 10µm。

    为了评估apelin是否能够通过ENS控制十二指肠运动，我们使用等张传感器测量离体机械收缩(见在线补充图S2A)。该技术通过使用l - ng -硝基精氨酸甲酯(L-NMMA) (NOS酶的抑制剂)和异丙肾上腺素(肾上腺素能受体激动剂)进行验证19和抑制20.肠收缩，分别(见在线补充图S2B)。在体外十二指肠制剂中应用apelin可增加肠道收缩幅度(10 pM至100 nM) (图2A)但不影响宫缩频率(见在线补充图S2C)。由于apelin不调节空肠和回肠收缩，因此apelin对十二指肠的作用是特异性的(见在线补充图S2D)。然而，apelin >1 μ M浓度产生的收缩幅值与在基础水平下观察到的相似，这表明存在从刺激作用(10 pM至100 nM)到基础和/或抑制状态(1 - 10 μ M)的生理切换(图2最后一个结果表明，两种剂量存在两种不同的信号通路，所有这些影响都被APJ受体拮抗剂F13A(见在线补充图S2E)拮抗。为此，我们选择将我们的意图集中在与这一生理开关有关的最接近剂量(即100 nM和1 μ M)上。阿匹林对肠道收缩的刺激作用需要ChAT神经元，因为六溴铵，一种尼古丁受体拮抗剂，阻碍了它的作用(图2B)。此外，apelin 100 nM刺激十二指肠收缩与十二指肠乙酰胆碱释放增加相关(图2C)没有剂量效应(见在线补充图S3A)，而NO在暴露于100 nM apelin后不受影响(图2D). Apelin 1µM对十二指肠乙酰胆碱释放的影响与Apelin 100 nM相同(图2C)。相反，apelin 1µM增加了实时十二指肠NO释放，这表明apelin浓度依赖于nNOS神经元来调节其对十二指肠收缩的作用(图2D)。这种效应被APJ拮抗剂F13A拮抗(见在线补充图S3B)。

    Apelin acts on the enteric nervous system to control duodenal contractions. (A) Ex vivo measurement of duodenal mechanical contraction amplitude in response to Krebs–Ringer solution (Control) or increasing concentrations of apelin (1 pM to 10 µM). n=5–6 per group. *p<0.05 vs Control. (B) Ex vivo measurement of duodenal mechanical contraction amplitude in response to Krebs–Ringer (Control), apelin 100 nM, hexamethonium (Hx) 500 µM alone or with apelin 100 nM. n=5–6 per group. *p<0.05 vs Control. ##p<0.01, ###p<0.001. (C) Ex vivo measurement of duodenal acetylcholine release in basal condition and in response to Krebs–Ringer (Control), apelin 100 nM or apelin 1 µM. n=4 per group. *p<0.05. (D) Ex vivo measurement of duodenal nitric oxide (NO) release in response to Krebs–Ringer (Control), apelin 100 nM or apelin 1 µM. n=5–8 per group. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs Control. #p<0.05, ##p<0.01, ###p<0.001 vs apelin 100 nM. (E) In vivo measurement of duodenal electrical activity in response to H2O (Control), apelin 100 nM or apelin 1 µM. n=4–5 per group. *p<0.001 vs Control and versus apelin 1 µM. #p<0.001 vs Control and versus apelin 100 nM. (F) Schematic representation of the results: apelin modulates ENS activity causing a modification of duodenal contractions.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    Apelin作用于肠神经系统以控制十二指肠收缩。(A)体外测量十二指肠机械收缩振幅对克雷布斯-林格溶液(对照)或增加apelin浓度(1 pM至10µM)的响应。每组N = 5-6。*p<0.05 vs对照组。(B)体外测量十二指肠机械收缩振幅对克雷布斯-菱格仪(对照)、阿匹林100 nM、六溴铵(Hx) 500 μ M单独或阿匹林100 nM的响应。每组N = 5-6。*p<0.05 vs对照组。# #p < 0.01,# # #p < 0.001。(C)在基础条件下和对Krebs-Ringer反应(对照)、apelin 100 nM或apelin 1µM的十二指肠乙酰胆碱释放的体外测量。每组N =4。* p < 0.05。(D)体外测量十二指肠一氧化氮(NO)释放对Krebs-Ringer(对照)，apelin 100 nM或apelin 1µM的响应。每组N = 5-8人。*p<0.05， **p<0.01， ***p<0.001对照。＃p < 0.05,# #p < 0.01,# # #p<0.001 vs apelin 100 nM。(E)在体内测量十二指肠电活动对H2O(对照)，apelin 100 nM或apelin 1µM。每组N = 4-5人。*p<0.001与对照和与apelin 1µM。＃p<0.001与对照组和与阿匹林100 nM。(F)结果示意图:apelin调节ENS活性，导致十二指肠收缩的改变。

    为了评估在体内条件下是否观察到这种开关，我们通过一种新的方法实时测量十二指肠电活动，该方法使用环绕十二指肠的电极与遥测系统相连(见在线补充图S3C)。Apelin通过胃内导管直接注入十二指肠，因此十二指肠的电活动与机械活动密切相关。21我们发现apelin 100 nM引起十二指肠电活动的显著增加，而apelin 1µM则降低了这种活动(图2E)。APJ拮抗剂消除了所有作用，证明apelin作用的特异性(见在线补充图S3D)。因此，apelin能够通过涉及ENS的机制改变十二指肠收缩(图2F)。

    十二指肠和空肠是近端肠的两个部分，在各种动物中都参与控制葡萄糖的吸收。22，23十二指肠也表达肠道葡萄糖转运蛋白和传感器。24 - 27日先前的研究表明，肠道运动的刺激与营养吸收的增加有关。15我们的数据显示，与apelin 1µM相比，apelin 100 nM可增加十二指肠葡萄糖吸收(图3A).在我们的实验模型中没有观察到apelin吸收的显著变化(图3B)，但在apelin处理的十二指肠碎片中，十二指肠壁apelin水平显著升高(见在线补充图S6A)。在体内条件下，肠apelin灌注不改变门静脉中的apelin浓度(图3C).这些最后的结果加强了ENS中apelin对十二指肠壁具体作用的概念。

    Apelin modulates duodenal glucose absorption. (A) Ex vivo glucose absorption in duodenal everted sacs in response to Krebs–Ringer (Control), apelin 100 nM, apelin 1 µM, F13A alone or with apelin 100 nM. n=5–7 per group. *p<0.05, **p<0.01. (B) Ex vivo apelin absorption in duodenal everted sacs in response to Krebs–Ringer (Control), apelin 100 nM or 1 µM, and F13A alone or F13A plus apelin 100 nM. n=4–6 per group. (C) In vivo measurement of plasma apelin in portal vein, in response to oral gavage of H2O (Control), apelin 100 nM or apelin 1 µM. n=5–6 per group.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
    图3

    Apelin调节十二指肠葡萄糖吸收。(A)十二指肠外节囊的体外葡萄糖吸收对Krebs-Ringer(对照)、apelin 100 nM、apelin 1µM、F13A单独或与apelin 100 nM的反应。每组N = 5-7人。* * * p < 0.05, p < 0.01。(B)十二指肠外节囊对Krebs-Ringer(对照)、apelin 100 nM或1µM和单独F13A或F13A加apelin 100 nM的体外apelin吸收。每组4-6人。(C)静脉灌胃H .2O(对照)，apelin 100 nM或apelin 1µM。每组N = 5-6。

    十二指肠顶层控制下丘脑NO释放

    NO是控制葡萄糖稳态的下丘脑中枢作用体。28此外，与肠-脑轴相关的肠道葡萄糖传感的改变与2型糖尿病中异常的NO下丘脑反应有关。6十二指肠收缩是否能改变下丘脑NO的释放尚不清楚。通过使用植入小鼠下丘脑的特定探针，我们发现异丙肾上腺素减少十二指肠收缩导致下丘脑NO释放增加(见在线补充图S4A)，证明肠道运动能够控制下丘脑活动。使用相同的技术，肠道给药apelin 100 nM可减少下丘脑NO释放，而apelin 1µM可使NO恢复到基础水平(图4重要的是，这种作用被APJ拮抗剂F13A阻断(见在线补充图S4B, C)。此外，用六溴铵阻断烟碱受体或用辣椒素破坏传入神经末梢，可消除肠顶elin对下丘脑NO释放的影响(图4B-D，见在线补充图S4D, E)。

    Duodenal apelin controls the gut motility-to-brain axis. (A) In vivo effect of intragastric perfusion of H2O (Control), apelin 100 nM or apelin 1 µM, on nitric oxide (NO) hypothalamic release frequency. n=5–7 per group. **p<0.01 vs Control. (B) In vivo effect of intragastric perfusion of H2O (Control), apelin 100 nM, hexamethonium (Hx) 500 µM alone or with apelin 100 nM, on NO hypothalamic release frequency. n=5–8 per group. *p<0.01, ***p<0.001 vs Control. ###p<0.001 vs apelin 100 nM. (C) In vivo effect of intragastric perfusion of H2O (Control), apelin 1 µM, Hx 500 µM alone or with apelin 1 µM, on NO hypothalamic release frequency. n=5–8 per group. ***p<0.001 vs Control. ###p<0.001 vs apelin 1 µM. (D) In vivo effect of intragastric perfusion of H2O (Control) and apelin 100 nM in mice pretreated or not by capsaicin on NO hypothalamic release frequency. n=4–7 per group. *p<0.01, ***p<0.001 vs Control. ###p<0.001 vs apelin 100 nM. (E) Schematic representation of the results: by modifying duodenal contractility, apelin modulates NO hypothalamic release.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
    图4

    十二指肠顶皮控制肠道运动到大脑的轴。(A)灌胃H2O(对照)，apelin 100 nM或apelin 1µM，对一氧化氮(NO)下丘脑释放频率的影响。每组N = 5-7人。**p<0.01 vs对照组。(B)胃内灌注H2O(对照)，阿匹林100 nM，六甲铵(Hx) 500 μ M单独或与阿匹林100 nM，对NO下丘脑释放频率。每组N = 5-8人。*p<0.01， ***p<0.001与对照组相比。# # #p<0.001 vs apelin 100 nM。(C)胃内灌注H2O(对照)，apelin 1µM, Hx 500µM单独或与apelin 1µM合用，对NO下丘脑释放频率有影响。每组N = 5-8人。***p<0.001 vs对照组。# # #p<0.001 vs apelin 1µM。(D)胃内灌注H2O(对照)和apelin 100 nM对辣椒素预处理或未处理小鼠下丘脑NO释放频率的影响。每组N = 4-7人。*p<0.01， ***p<0.001与对照组相比。# # #p<0.001 vs apelin 100 nM。(E)结果示意图:通过改变十二指肠收缩力，apelin调节NO下丘脑释放。

    在这里，我们的数据证明了肠道和大脑之间存在一种通信模式，即十二指肠收缩性在apelin诱导信号传导后能够改变下丘脑NO的释放(图4E)。

    十二指肠顶层通过下丘脑NO控制肌肉葡萄糖的利用

    为了测量十二指肠收缩的改变对大脑葡萄糖利用的影响，我们测量了小鼠口服apelin和放射性葡萄糖示踪剂后不同组织的葡萄糖进入情况。胃内apelin 100 nM可减少肌肉中葡萄糖的进入，但在肝脏和脂肪组织中没有(图5a - c)。与观察到的十二指肠机械和电活动的影响类似，apelin 1µM没有改变肌肉中的基础葡萄糖入口。为了进一步研究NO的脑释放是否与胃内apelin 1 μ M处理葡萄糖肌肉进入后观察到的影响有机制关系，我们使用脑室内注射L-NMMA来阻止NO在大脑中的释放。我们发现，阻止NO在大脑中的释放会减少葡萄糖进入肌肉(见在线补充图S5A-C)，从而显示了大脑NO在大脑-肠道-大脑-肌肉轴上的关键作用。

    Duodenal apelin modulates muscle glucose utilisation. In vivo measurement of glucose entry in liver (A), muscle (B) and adipose tissue (C) in response to oral gavage of radiolabeled glucose in combination with H2O (Control), apelin 100 nM alone or with F13A, apelin 1 µM alone or with F13A and F13A alone. n=9–11 per group. *p<0.05 vs Control and versus F13A. #p<0.01 vs apelin 1 µM and versus apelin 1 µM+F13A. $p<0.001 vs apelin 100 nM+F13A. (D) Schematic representation of the results: duodenal apelin controls muscle glucose utilisation via a hypothalamic relay.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5
    图5

    十二指肠表皮调节肌肉葡萄糖的利用。在体内测量葡萄糖进入肝脏(A)、肌肉(B)和脂肪组织(C)，以响应放射性标记葡萄糖与H的口服灌胃2O(对照)，apelin单独100 nM或与F13A, apelin单独1µM或与F13A和F13A单独。每组N = 9-11人。*p<0.05与对照和与F13A。＃p<0.01与apelin 1µM和与apelin 1µM+F13A。＄p<0.001 vs apelin 100 nM+F13A。(D)结果示意图:十二指肠顶层通过下丘脑继电器控制肌肉葡萄糖的利用。

    总之，我们的数据表明，apelin 100 nM增加十二指肠收缩力，降低肌肉葡萄糖利用(图5D)通过下丘脑NO继电器。

    慢性apelin灌胃可通过降低十二指肠运动来增加葡萄糖耐量

    我们假设高水平的apelin的慢性刺激可引起十二指肠收缩力的下降，并可能与改善糖耐量有关。为了测试慢性apelin治疗是否可以改变十二指肠的基础收缩力，以及随后的葡萄糖利用，我们测量了口服apelin(1µM) 1周小鼠十二指肠的基础机械活性。在这里，我们表明，长期口服apelin治疗增加了十二指肠的apelin浓度，但在空肠和回肠没有;这一观察结果强化了十二指肠是经细胞转运的apelin的主要目标这一事实(见在线补充图S6B)。慢性apelin治疗可降低十二指肠基础收缩力(图6A)、葡萄糖耐量增加(图6B)和胰岛素释放对葡萄糖的反应(图6C)。此外，这与葡萄糖转运蛋白4型(GLUT 4) mRNA表达的增加有关(图6D)和葡萄糖进入肌肉(图6E)。在葡萄糖进入肝脏和脂肪组织方面未观察到显著变化(见在线补充图S6C, D)。糖耐量的改善与体重的改变无关(对照组=25.2±0.8 g vs apelin 1µM=23.3±0.9 g)。

    Chronic oral gavage of apelin 1 µM increases glucose tolerance via a decrease in duodenal contractility. (A) Ex vivo measurement of duodenal mechanical contraction in mice orally gavaged for 1 week with H2O (Control) or apelin 1 µM. n=4–5 per group. *p<0.05 vs Control. (B) Oral glucose tolerance test (OGTT) in 6 h fasted mice, orally gavaged for 1 week with H2O (Control) or apelin 1 µM. n=4–5 per group. *p<0.05, ***p<0.001 vs Control. The adjacent graph represents the average area under the curve. (C) OGTT-associated insulinemia in 6 h fasted mice, orally gavaged for 1 week with H2O (Control) or apelin 1 µM. n=4–5 per group. *p<0.05. (D) Relative expression of glucose transporter type 4 mRNA in muscle of mice orally gavaged for 1 week with H2O (Control) or apelin 1 µM. n=9–10 per group. *p<0.05 vs Control. (E) In vivo measurement of glucose entry in muscle in response to oral gavage of radiolabeled glucose, in mice orally gavaged for 1 week with H2O (Control) or apelin 1 µM. n=7 per group. **p<0.01 vs Control.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图6
    图6

    慢性灌胃apelin 1 μ M可通过降低十二指肠收缩力来增加葡萄糖耐量。(A)体外测量十二指肠机械收缩小鼠口服H2O(对照)或apelin 1µM。每组N = 4-5人。*p<0.05 vs对照组。(B)小鼠空腹6 h口服糖耐量试验(OGTT)，灌胃h2O(对照)或apelin 1µM。每组N = 4-5人。*p<0.05， ***p<0.001与对照组相比。相邻的图形表示曲线下的平均面积。(C)禁食6小时的小鼠出现ogtt相关性胰岛素血症，口服h2O(对照)或apelin 1µM。每组N = 4-5人。* p < 0.05。(D) H灌胃1周小鼠肌肉中葡萄糖转运蛋白4mrna的相对表达2O(对照)或apelin 1µM。每组N = 9-10个。*p<0.05 vs对照组。(E)在小鼠口服H灌胃1周后，体内测量葡萄糖进入肌肉的反应2O(对照)或apelin 1µM。每组N =7人。**p<0.01 vs对照组。

    Apelin在肥胖/糖尿病小鼠中恢复正常的十二指肠运动和改善葡萄糖耐量

    与在血浆和各种组织(如脂肪组织、肌肉)中观察到的相似，我们发现HFD小鼠十二指肠中的apelin mRNA水平显著升高，但在空肠和回肠中没有(见在线补充图S7A)。与对照小鼠相比，HFD小鼠肠道近端APJ mRNA的表达没有改变(见在线补充图S7B)。首先，我们测量了HFD小鼠对急性apelin 1µM的十二指肠收缩反应。我们发现apelin 1µM在体外和体内条件下平衡了HFD处理产生的十二指肠高收缩性(图7A、B和在线补充图S7C)。这种效应与十二指肠NO释放的增加有关(图7C)与正常小鼠观察到的相似(图2D).然后，十二指肠收缩力的降低首先与肠道葡萄糖吸收的减少相关(图7D)，对apelin吸收无影响(图7E)，第二，HFD apelin处理小鼠下丘脑NO释放增加(图7F和在线补充图S7D)。apelin对肠-脑轴的调节与肌肉中葡萄糖利用的改善有关(图7胃肠道)。

    Apelin 1 µM decreases duodenal contractility and improves glucose utilisation in obese/diabetic mice. (A) Ex vivo measurement of duodenal mechanical contraction amplitude in response to Krebs–Ringer (Control) (in normal chow or high-fat diet (HFD) mice) and apelin 1 µM (in HFD mice). n=5–6 per group. *p<0.05. (B) In vivo measurement of duodenal electrical activity in response to H2O (Control HFD) and apelin 1 µM. n=4–7 per group. ***p<0,001 vs Control HFD. (C) Duodenal nitric oxide (NO) release in response to Krebs–Ringer (Control HFD) or apelin 1 µM. n=4–7 per group. *p<0.05, **p<0.01 vs Control HFD. (D) Ex vivo glucose absorption in duodenal everted sacs in response to Krebs–Ringer (Control HFD) and apelin 1 µM. n=4–6 per group. *p<0.05 vs Control HFD. (E) Ex vivo apelin absorption in duodenal everted sacs in response to Krebs–Ringer (Control HFD) and apelin 1 µM. n=6 per group. (F) In vivo effect of intragastric perfusion of H2O (Control HFD) and apelin 1 µM on NO hypothalamic release frequency. n=6 per group. **p<0.01 vs Control HFD. In vivo measurement of glucose entry in liver (G), muscle (H) and adipose tissue (I) in response to oral gavage of radioactive glucose in combination with H2O (Control HFD) and apelin. n=4–6 per group. *p<0.05 vs Control HFD.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图7
    图7

    Apelin 1µM可降低肥胖/糖尿病小鼠的十二指肠收缩力并改善葡萄糖利用。(A)对Krebs-Ringer反应(对照组)(正常饲料或高脂饮食(HFD)小鼠)和apelin 1µM (HFD小鼠)的十二指肠机械收缩振幅的体外测量。每组N = 5-6。* p < 0.05。(B)对H2O(对照HFD)和apelin 1µM。每组N = 4-7人。***p<0,001 vs对照HFD。(C)十二指肠一氧化氮(NO)释放对Krebs-Ringer(对照HFD)或apelin 1µM的响应。每组N = 4-7人。*p<0.05， **p<0.01。(D)十二指肠外翻囊对Krebs-Ringer(对照HFD)和apelin 1µM的体外葡萄糖吸收。每组4-6人。*p<0.05 vs对照HFD。(E)十二指肠外翻囊对Krebs-Ringer(对照HFD)和apelin 1µM的体外吸收。 n=6 per group. (F) In vivo effect of intragastric perfusion of H2O(对照HFD)和apelin 1µM对NO下丘脑释放频率的影响。每组N =6。**p<0.01对照HFD。在体内测量肝脏(G)、肌肉(H)和脂肪组织(I)对放射性葡萄糖联合H口服灌胃的反应2O(对照HFD)和apelin。每组4-6人。*p<0.05 vs对照HFD。

    为了测试通过apelin靶向十二指肠运动是否可以被认为是治疗2型糖尿病的潜在治疗靶点，我们测量了HFD小鼠慢性(1周)口服apelin的影响。首先，我们发现长期口服apelin改善了HFD小鼠的空腹血糖血症和稳态模型评估胰岛素抵抗(图8A).第二，慢性口服apelin治疗可降低十二指肠基础运动能力(图8B)与改善葡萄糖耐量有关(图8C)和胰岛素抵抗指数(图8D) HFD小鼠。第三，慢性apelin治疗增加了肌肉中GLUT4 mRNA的表达(图8E)。

    Apelin 1 µM treatment increases glucose tolerance via a decrease in duodenal contractility. (A) Effects of high-fat diet (HFD) on metabolic parameters in mice orally gavaged for 1 week with H2O (Control HFD) or apelin 1 µM. n=6 per group. (B) Ex vivo measurement of duodenal mechanical contraction in HFD mice orally gavaged for 1 week with H2O (Control HFD) or apelin 1 µM. n=6 per group. **p<0.01 vs Control HFD. (C) Oral glucose tolerance test (OGTT) in 6 h fasted HFD mice, orally gavaged for 1 week with H2O (Control HFD) or apelin 1 µM. n=6 per group. **p<0.01, ***p<0.001 vs Control HFD. The adjacent graph represents the average area under the curve (AUC). (D) OGTT-associated insulin resistance index in 6 h fasted HFD mice, orally gavaged for 1 week with H2O (Control HFD) or apelin 1 µM. n=6 per group. *p<0.05 vs Control HFD. (E) Relative expression of glucose transporter type 4 (GLUT-4) mRNA in muscle of HFD mice orally gavaged for 1 week with H2O (Control HFD) or apelin 1 µM. n=9–10 per group. *p<0.05 vs Control. HOMA-IR, homeostasis model assessment insulin resistance; NC, normal chow.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图8
    图8

    Apelin 1µM治疗可通过降低十二指肠收缩力来增加葡萄糖耐量。(A)高脂饮食(HFD)对H2O(对照HFD)或apelin 1µM。每组N =6。(B) HFD小鼠经口灌胃H2O(对照HFD)或apelin 1µM。每组N =6。**p<0.01对照HFD。(C)空腹6 h的HFD小鼠口服糖耐量试验(OGTT)，灌胃h2O(对照HFD)或apelin 1µM。每组N =6。**p<0.01， ***p<0.001对照HFD。相邻的图形表示曲线下的平均面积(AUC)。(D)空腹6 h的HFD小鼠ogtt相关胰岛素抵抗指数，灌胃1周h2O(对照HFD)或apelin 1µM。每组N =6。*p<0.05 vs对照HFD。(E) H灌胃1周的HFD小鼠肌肉中葡萄糖转运体4型(GLUT-4) mRNA的相对表达2O(对照HFD)或apelin 1µM。每组N = 9-10个。*p<0.05 vs对照组。HOMA-IR，稳态模型评估胰岛素抵抗;NC，正常进食。

    讨论

    循环顶elin被公认为是通过调节直接作用于组织(脂肪组织、肌肉、肠道)的葡萄糖利用来控制葡萄糖稳态的一个因素。在大脑中，视营养状态及其在下丘脑中的水平而起双重作用。我们先前已经证明，低剂量阿匹林脑室内给药可改善喂养小鼠的血糖。9这种效应可能与在黑暗期观察到的血浆apelin轻微而持续的增加有关(对应于喂食状态)。所有这些数据都表明，在急性静脉注射后，全身apelin的生理性上升对葡萄糖代谢有有益的影响。10在这里，我们表明apelin对ENS神经元有双重作用，类似于在CNS中观察到的作用。特别是，我们发现apelin诱导十二指肠收缩性的调节，随后通过改变下丘脑NO释放来调节下丘脑活动，以控制肌肉葡萄糖的利用。因此，可以将apelin对ENS和CNS神经元的作用进行类比。在大脑中，阿匹林对下丘脑释放因子的影响取决于给药剂量的不同。低剂量apelin刺激NO释放，而中央高剂量apelin对葡萄糖代谢有不良作用9)释放过氧化氢而不是NO。29在十二指肠中，也观察到类似的对NO释放的差异影响，这表明十二指肠nNOS神经元对apelin的反应依赖于注射剂量。事实上，apelin在100 nM和1µM时能够刺激乙酰胆碱的释放，但apelin对十二指肠收缩的这种潜在刺激作用被apelin 1µM对十二指肠NO释放的作用所抵消。由于这些原因，apelin 1µM对正常小鼠十二指肠收缩的影响与对照相似。这一假设得到了HFD小鼠实验数据的支持，因为apelin 1µM刺激十二指肠NO释放以降低十二指肠高收缩性。我们不能完全排除apelin 1µM在我们的实验模型中下调APJ表达的可能性，类似于在肥胖大鼠下丘脑中观察到的情况，30.但我们的数据倾向于限制这种可能性。首先，我们发现HFD小鼠十二指肠中apelin mRNA的表达增加，而APJ mRNA的表达没有改变。这一结果支持了文献中的数据，表明apelin的外周表达增加可能是平衡胰岛素抵抗的一种适应性途径。8其次，十二指肠片段对apelin 1µM有响应，但对100 nM无响应，这表明存在两种不同的分子作用体分别阻断和刺激十二指肠收缩。因此，我们的数据表明，ENS神经元是apelin作用于十二指肠运动的潜在靶点，因为(1)apelin调节十二指肠乙酰胆碱和NO的释放，(2)apelin的刺激作用被六溴铵阻断，(3)apelin受体APJ在ENS神经元上表达。由于apelin受体APJ在肠壁中表达，我们可以推测apelin可能对其他肠细胞也有作用。因此，我们不能排除apelin对肠平滑肌直接作用的潜在存在。

    在本研究中，我们提出了一种新的和生理相关的肠道和大脑之间的通信模式，控制葡萄糖的利用。具体来说，我们的数据表明，外周葡萄糖利用可以通过下丘脑继电器控制十二指肠收缩力。在生理条件下，我们的数据表明，apelin在消化过程中对ENS神经元产生不同的影响。因此，我们提出以下模型，在食物摄入之初，apelin通过对GLUT2易位的作用促进肠道葡萄糖吸收(1)11(2)十二指肠运动。这种对肠道收缩的刺激作用导致下丘脑NO阻断，减少组织中葡萄糖的利用，以避免潜在的低血糖。在用餐结束时，高水平的apelin靶向nNOS神经元(1)减缓十二指肠波并停止葡萄糖吸收，(2)恢复下丘脑NO释放和(3)增加肌肉葡萄糖利用。由于下丘脑NO释放的增加刺激周围血管流量，导致葡萄糖进入肌肉，因此我们的研究小组先前已经证明了中枢NO和外周葡萄糖利用之间的联系。28

    在消化过程中，这种涉及肠-脑轴和肠道传感器的葡萄糖稳态调节已经明确确立。我们之前已经证明，在高血糖期间，肠道葡萄糖感测会通过中枢继电器产生肝糖生成的增加，以防止下一段禁食期。17这一现象涉及下丘脑的GLP-1通路;GLP-1与apelin类似，是一种存在于大脑中的肠道激素，作为神经递质发挥着重要作用。2所有这些涉及肠道激素感应和机械感应的数据都强调了“肠-脑-外周”轴在控制葡萄糖代谢中的重要性。

    2型糖尿病与胰岛素抵抗有关。我们之前已经证明，肠道葡萄糖感知的改变参与了在肥胖/糖尿病小鼠中观察到的胰岛素抵抗状态。2，6事实上，肠道炎症和氧化应激与葡萄糖感知异常有关，导致下丘脑NO释放异常。6这种葡萄糖检测的改变可能与机械检测的干扰有关。因此，有研究表明2型糖尿病与ENS中nNOS神经元数量的减少有关12肠蠕动的产生肠蠕动增加的12，31肠动亢进首先会引起十二指肠葡萄糖吸收增加，导致食源性高血糖;其次，根据我们的研究结果，它可能通过大脑引起胰岛素抵抗。在这里，我们已经证明了高水平的apelin能够恢复正常和肥胖/糖尿病小鼠的基础十二指肠收缩，特别是在肠道近端部分。靶向ENS神经元通过apelin或其他分子靶点来调节肠道收缩是减少十二指肠收缩的宝贵工具，这可能对治疗高血糖和胰岛素抵抗等2型糖尿病合并症的新治疗策略具有真正的潜在兴趣。我们的数据支持这一假设，因为慢性口服apelin改善了HFD小鼠的葡萄糖耐量。

    许多因素可以到达ENS神经元来调节它们的活动。其中一些可能有血浆来源，而另一些可能通过转胞作用从肠腔到ENS，就像瘦素一样。18已知Apelin在肠细胞对葡萄糖的反应中在管腔内释放，以帮助葡萄糖吸收。11在这项研究中，我们发现十二指肠中apelin的转胞作用通过一种依赖于ens的机制控制葡萄糖的吸收。因此，我们的数据强调了一种涉及肠道因子的葡萄糖稳态调节的新模式。肠道激素如GLP-1在控制葡萄糖代谢中的重要性已得到证实32代表了一种治疗代谢紊乱的创新方法。除了对胰岛素敏感组织的直接影响外，这些因子在“ENS/收缩-脑-外周”轴上的潜在作用可能为改善糖尿病状态带来新的可能性和组合。实际上，2型糖尿病治疗策略的目标是GLP-1，它是由位于回肠的l细胞释放的。我们工作的另一个创新之处在于瞄准了营养物质检测的第一个部位，也就是十二指肠，它现在被认为是空肠，7未来的目标是在糖尿病期间恢复葡萄糖稳态。5在2型糖尿病患者中，营养感知有很大的改变，5可通过调节十二指肠收缩作为抑制高血糖的治疗作用。这一假设得到了Sandoval的工作的支持等,33这表明禁食后对十二指肠的内部机械操作产生了肠道激素的释放。我们推测，在本研究中，除了辣椒素敏感的传入神经信号外，apelin或其他因素对肠道收缩的调节可能涉及激素介导的信号。

    总之，我们提供的证据表明，ENS、十二指肠收缩力和大脑之间的相互作用对控制生理条件下的葡萄糖利用至关重要。此外，我们证明，肠皮是一个关键的演员发挥主要作用，在这一系统。此外，存在多种可能性:(1)潜在的其他分子因子(如激素)靶向该系统或(2)对生理功能的潜在影响(如食物摄入、脂质代谢);我们的研究阐明了肠表皮的作用机制及其对葡萄糖稳态的影响。未来的探索有必要证明这一轴在治疗人类代谢疾病中的作用。

    致谢

    我们感谢Sophie Allart和Astrid Canivet为图卢兹INSERM UMR 1043的细胞成像设施提供技术援助，感谢Phénotypage UMS US006/INSERM为遥测测量提供服务，感谢Simon Nicolas和Isabelle Castan-Laurell进行有益的讨论。

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    补充材料

    • 补充数据

      此网页文件由BMJ出版集团从作者提供的电子文件制作而成，并没有对内容进行编辑。

    脚注

    • 贡献者AF和AD的作用相同。AF、AD、TD、AM、SMB、JC、SL-G、BM、AC、AL、PR、NC、PDC、CK采集数据。AF, AD, PDC和CK进行了研究概念和设计。AF、AD、PDC和CK对数据进行分析和解释。AF、AD、TD、SMB、JC、NC、NV、PV、PDC、CK撰写稿件。

    • 资金这项工作得到了法国科学研究基金会(Fonds de la Recherche Scientifique-FNRS)对FRFS-WELBIO的资助:welbio - cr -2012 - 02r。这项工作得到了InBev-Baillet Latour基金(2015年医学研究基金)的部分支持。作者感谢法国营养协会(SFN)和研究基金会Médicale (FRM)(赠款ING20150532586)的财政支持。PDC获得了来自FNRS(公约J.0084.15，公约3.4579.11)、PDR(研究项目，公约:T.0138.14)、FRM(医学研究基金会)和ARC(研究行动Concertée-Communauté française比利时公约:12/17-047)的资助。PDC还获得了ERC 2013年启动基金(欧洲研究委员会，启动基金336452-ENIGMO)。NV是ERC(整合者授权，PIPE)的接受者。SMB是NHMRC澳大利亚R.D Wright生物医学研究员。

    • 相互竞争的利益没有宣布。

    • 伦理批准实验按照欧共体有关实验动物保护的规定进行，并得到当地动物保护和使用委员会的批准。

    • 出处和同行评审不是委托;外部同行评审。