条文本
PDF
摘要
客观的目的:探讨高脂饮食小鼠牙周炎后胰岛素抵抗和高血糖增强的因果机制。
设计我们在C57Bl/6雌性小鼠的牙周炎动物模型中，通过感染特定的活病原体，如Porphyromonas gingivalis（Pg)，梭菌属nucleatum而且普氏菌媒介物．然后用糖尿病性/非致肥性脂肪丰富的饮食喂养小鼠长达3个月。对牙槽骨丢失、牙周菌群失调和糖代谢特征进行量化。最终，颈椎(区域)和全身免疫细胞的过继转移被执行，以证明颈椎免疫系统的因果作用。
结果牙周炎引起牙周菌群失调，但主要不影响肠道菌群。该疾病同时影响区域和系统免疫反应，损害葡萄糖代谢。颈淋巴细胞从受感染的小鼠转移到未接种的受体可以预防牙周炎加重的代谢性疾病。用灭活治疗Pg牙周感染前诱发特异性抗体Pg并保护小鼠免受牙周炎引起的代谢障碍。最后，1个月皮下慢性输注低比例的脂多糖Pg模拟牙周炎对免疫和代谢参数的影响。
结论我们发现高脂肪喂养小鼠的胰岛素抵抗因病原体诱导的牙周炎而增强。这是由针对病原体的适应性免疫反应引起的，并与牙周生态失调有关。
- 糖尿病
- 饮食
- 细菌感染
- 细菌的发病机理
- 免疫反应
这是一篇开放获取文章，根据创作共用属性非商业(CC BY-NC 4.0)许可证发布，该许可证允许其他人以非商业方式分发、混音、改编、在此作品的基础上进行构建，并以不同的条款许可其衍生作品，前提是原始作品被正确引用且使用是非商业性的。看到的:http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/
数据来自Altmetric.com
本研究的意义
关于这个问题我们已经知道了什么?
横断面研究显示牙周炎与2型糖尿病呈正相关。
糖尿病性脂肪丰富的饮食通过增加牙周病原体和脂多糖(LPS)信号激活诱导牙周炎。
在人类动脉粥样硬化斑块的微生物群中发现了牙菌斑的细菌成员。
肠道菌群失调可诱发代谢性疾病。
适应性免疫系统诱发代谢性疾病。
新的发现是什么?
高脂肪饮食(HFD)增加小鼠牙周微生物群的多样性，与肠道微生物群的报道相反。
Porphyromonadaceae牙周菌群丰度与胰岛素抵抗相关，并与牙槽骨丢失呈正相关。
牙周炎诱发抗体Porphyromonas gingivalis（Pg)，这些特异性抗体的减少与hfd喂养小鼠的糖代谢受损有关。
Pg-LPS被证明是牙周炎诱导的代谢损伤在HFD下的原因。
区域(宫颈)适应性免疫系统的调节是牙周炎诱导胰岛素抵抗的因果关系。
在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?
增加Porphyromonadaceae糖尿病患者牙周微生物群的丰度可能是牙周炎加重胰岛素抵抗的一种新的预后标志物。
Pg-基于lps的抑制疗法和抗生素直接针对Porphyromonadaceae可能有助于预防牙周炎对糖尿病患者葡萄糖稳态的有害影响。
针对局部免疫系统的抗炎策略可以降低胰岛素抵抗和2型糖尿病的发病率。
预防接种策略Pg可减少牙周炎对葡萄糖代谢的影响。
简介
2型糖尿病(T2D)现在被认为是一种大流行疾病。这种加速发育的原因与几个相互作用的因素有关，如久坐不动的生活方式、超重(BW)、压力和不良的饮食习惯。1值得注意的是，牙周炎在糖尿病人群中的患病率为60%，而在普通人群中则为20%至50%。2，3.在患有牙周病的患者中，糖尿病前期或未诊断的T2D发病率增加了27-53%。4，5值得注意的是，治疗牙周病可使T2D患者糖化血红蛋白降低0.4%。5然而，牙周炎和T2D之间的因果关系仍然未知。过去十年表明，代谢和心血管疾病的发病率6也与肠道菌群失调有关。7，8因此，我们推断牙周微生物群的失调可能是代谢性疾病发生的原因，至少是部分原因，9来自革兰氏阴性细菌的脂多糖(LPS)可以在局部和全身器官中释放，导致小鼠代谢内毒素血症和胰岛素抵抗10和人类。11
大量革兰氏阴性lps释放的牙周病原体位于牙周生物膜内。举个例子，普氏菌媒介物（π)诱导牙周组织破坏12糖尿病患者的患病率更高。13有趣的是，牙周细菌，如梭菌属nucleatum（Fn)，已在动脉粥样硬化斑块内发现，提示其可能向体循环转移。14此外,Porphyromonas gingivalis（Pg)与慢性疾病有关，如心血管疾病，15风湿性关节炎、16胰腺癌17非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。18事实上,Pg存在于受伤的肝脏中，并通过促进炎症加重NASH。18代谢性疾病的特征是一种慢性低度炎症，称为代谢性炎症，19其中，巨噬细胞和t淋巴细胞在肝脏和脂肪库等代谢组织中被招募，并释放促炎细胞因子，如肿瘤坏死因子(TNF)-α，白细胞介素(IL)-1β， IL-6和纤溶酶原激活物抑制剂(PAI)-11会损害胰岛素的作用。因此，胰岛素抵抗似乎是继发于炎症过程的发生，1其中先天和适应性免疫反应可能促进肠道菌群驱动的炎症反应。20.，21
总之，这些证据表明，牙周菌群失调可能首先引发区域代谢炎症，然后是全身代谢炎症，促进胰岛素抵抗和T2D。为了证明牙周病作为T2D危险因素的因果作用以及先天和适应性免疫反应的相关性，我们通过在小鼠体内的革兰氏阴性细菌牙周病原体定植建立了一个独特的牙周炎模型。研究了牙周菌群和糖代谢的特征。我们报道了区域适应性免疫系统反应在牙周炎引起的胰岛素抵抗恶化中的因果作用Pg．一种受损的特定免疫反应Pg可能与T2D发生率的增加和加重有关。
材料与方法
动物及实验程序
将C57Bl/6J野生型(WT)雌性小鼠(Charles River, L’arbresle, France)置于特定的无致死率控制环境(倒12小时日光周期，10:00熄灯)中，每笼6只。5周大的小鼠随机分为两组:第1组为定植(Co)，第2组为对照组。对于第1组，1毫升10的混合物9每种牙周病原体的菌落形成单位(CFU)，如Pg写明ATCC 33277,Fn而且π之前确认,22在下颌磨牙表面应用2%羧甲基纤维素，每周4次，持续1个月。对照组小鼠只接受载体。每组分为两个亚组，饲喂正常饲料(NC，能量含量:12%脂肪，28%蛋白质和60%碳水化合物;A04, Villemoisson-sur-Orge，法国)或一种导致糖尿病的高脂肪无碳水化合物饮食(HFD;能量含量:脂肪(玉米油和猪油)72%，蛋白质28%，碳水化合物<1%;SAFE, Augy，法国)，为期3个月。23各组被标记为:NC+载体(NC)、NC+定殖(NC- co)、HFD和HFD+定殖(HFD- co)。
牙周和肠道菌群分析
如前所述，从冷冻下颌骨和粪便中提取牙周DNA。24对于牙周组织，28F-519R引物靶向整个16S细菌DNA V2区，并在研究与测试实验室(http://www.researchandtesting.com/美国德克萨斯州)。平均每个样本生成4907个序列。对于肠道菌群，研究与测试实验室应用MiSeq技术平均每个样品生成10,000个序列。这个分支程序图1K和线性判别分析(LDA)得分在线分析补充图S1已经通过胡滕豪尔实验室的银河网站生成。25
口腔定植Porphyromonas gingivalis（Pg)，梭菌属nucleatum（Fn),普氏菌媒介物（π)诱导牙周炎与局部和全身免疫紊乱相关。(A)老鼠被殖民Pg, Fn而且π或用载液处理1个月，然后随机分为4组:正常饲料(NC，蓝色条，n=6)、正常饲料(NC- co，紫色条，n=6)、高脂肪饲料(HFD红色条，n=7)和高脂肪饲料(HFD- co，绿色条，n=10)。(B)每组的下颌骨，显微ct重建(Viva CT40;Scanco Medical, Bassersdorf，瑞士)。(C)各组牙槽骨损失(黄线)。(D)肿瘤坏死因子(TNF)-α，纤溶酶原激活物抑制剂(PAI)-1，白介素(IL)1-β和IL-6在牙周组织中的表达。(E)半下颌骨的组织学检查(PT，牙周组织;T，牙齿)用H&E, F4/80, CD3和CD20抗体染色:每个面板系列右侧显示细胞计数。箭头显示解剖区浸润细胞，插图显示玻片放大。3个月时，观察各组颈部淋巴结(F和G)、脾脏(H和I)和血液(J)中免疫细胞类型的数量和相对丰度。(K)基于线性判别分析效应量(LEfSe)分析的牙周菌群分支图。(L)利用欧氏距离的完全连杆聚类。 Data (mean±SEM) and one-way analysis of variance (ANOVA) followed by Tukey's test used for *p<0.05 and ****p<0.0001 when compared to HFD,§p < 0.05;§§p < 0.001§§§§p<0.0001与NC和＄与NC-Co相比p<0.05。
继续
继续
下颌牙槽骨吸收的定量研究
使用高分辨率µCT扫描下颌骨(Viva CT40;Scanco Medical, Bassersdorf，瑞士)。26数据采集在45 keV下，各向同性体素尺寸为10 μm。使用带有屏幕上计算机辅助测量包的立体显微镜对每颗磨牙进行6个线性测量。测量每颗磨牙的牙槽骨损失(ABL) (mm)，从牙釉质-牙釉质交界处到牙槽骨嵴。27三维重建由一组400个切片生成。
牙周组织实时定量PCR分析
使用TriPure试剂(Roche, Basel, Switzerland)从牙周组织中提取总RNA。cDNA使用逆转录酶(Applied Biosystems, Fost City, USA)从先前探索的1µg总RNA合成。28所用引物(Eurogentec, San Diego, USA)为(5 ' - 3 '):肿瘤坏死因子-α，转发TGGGACAGTGACCTGGACTGT;相反,TCGGAAAGCCCATTTGAGT;il - 1β，转发TCGCTCAGGGTCACAAGAAA;反向CATCAGAGGCAAGGAGGAAAAC;PAI-1，转发ACAGCCTTTGTCATCTCAGCC;反向CCGAACCACAAAGAGAAAGGA;而且il - 6向前ACAAGTCGGAGGCTTAATTACACAT;反向TTGCCATTGCACAACTCTTTTC。对于核糖体蛋白L19的RNA负载，将每个mRNA的浓度归一化(RPL19)(转发GAAGGTCAAAGGGAATGTGTTCA;反向CCTTGTCTGCCTTCAGCTTGT)作为内部标准，并根据2−ΔΔCT方法。28
腹腔葡萄糖耐量试验和体内正糖/高胰岛素夹钳
禁食6小时的小鼠腹腔注射葡萄糖(1 g/kg)。在葡萄糖注射后- 30、0、30、60和90分钟，用血糖仪(Roche Diagnostics, Meylan, France)从尾静脉尖端采集2 μL血液，测量血糖。为了评估胰岛素敏感性，如前所述，在股静脉内留置导管。10手术完全恢复并禁食6小时后，在正糖/高胰岛素情况下评估全身葡萄糖利用率，如其他地方所述。10
组织学分析
切除下颌骨，4%多聚甲醛固定48小时，石蜡包埋。用切片刀沿牙髓主轴从冠状到根尖的横向方向切开半下颌骨样本。然后用H&E染色4µm厚度的切片。免疫组织学分析使用抗F4/80 (AbD Serotec, Colmar，法国)、CD3 (Spring Bioscience, Pleasanton，美国)和CD20 (Thermo Scientific, Rockford，美国)的一抗(由R.T.U. (Ready-to-Use) Vectastin Elite (Vector Laboratories, Burlingame，美国)和抗二氨基苯联胺(DAB)的一抗(impact DAB Substrate, Vector Laboratories)进行，以量化免疫细胞的浸润。切片用带Z-Stack功能的全景数字扫描仪250，物镜40× (3DHISTECH)扫描。使用全景观察软件(3DHISTECH)进行细胞亚群计数，并在平均0.1 mm的牙龈固有层和牙周韧带中进行计数2在每个组织切片上。两名独立的naïve调查人员在每张幻灯片上计算了五个微观领域。
颈部淋巴结、脾、血免疫细胞表面染色及抗体处理
单核细胞悬液与抗cd16 /32一起孵育15分钟以阻断Fc受体，然后与抗体、抗cd4 APC (RMA4-5, eBioscience)、CD8 V450 (53.6.7, BD Bioscience)、抗cd11b APC- efluor780 (g1 /70, eBioscience)、CD45 V500 (30F11, BD Bioscience)、抗cd19 FITC (1D3, BD Bioscience)和抗tcr PerCP-Cy5.5 (H57, eBioscience)在冰上孵育30分钟。活/死固定细胞染色试剂盒(Life Technologies)用于去除死细胞。所有数据均使用数字流式细胞仪(LSR II Fortessa, Becton Dickinson)采集，并使用FlowJo软件(Tree Star)进行分析。
免疫疗法
颈部淋巴结采集自上述细菌混合物定植或未定植的小鼠。颈部淋巴结细胞(107从患有牙周炎(牙周炎转移细胞)或没有(健康转移细胞)的小鼠注射到腹腔，并在转移和牙周病原体定植后评估腹腔葡萄糖耐量试验(IPGTT)。
免疫接种
注射10支6CFU的Pg,Fn或π或者将这三种细菌的混合物，在48小时内暴露在氧气中灭活，注入足垫肌肉。对照组小鼠注射生理盐水。然后，在3个月hfd喂养的小鼠免疫后1个月诱导牙周炎(如上所述)。
Pg有限合伙人的待遇
小鼠皮下植入渗透微型泵(Alzet模型2004;Alza，帕洛阿尔托，加利福尼亚州，美国)提供任何超纯LPS从Pg如先前报道的300µg/kg/天10(CAYLA-InvivoGen, Toulouse, France)或NaCl(0.9%)，以确保连续输液28天。然后，给小鼠喂普通饲料或高热量饲料1个月。最后采用颈椎脱位法处死小鼠，收集组织在液氮中快速冷冻。
反Pg抗体测定
对脂多糖特异性免疫球蛋白G抗体Pg均采用自制ELISA法测定。在96孔平板微量滴度板的孔中涂覆LPS，重复3次Pg．洗净并封板后，将血清样本加入到单独的孔中，用碱性磷酸酶偶联抗鼠免疫球蛋白检测特定的小鼠IgG抗体。在405nm处用ELISA平板阅读器读取吸光度。结果以ELISA指数(EI)表示，EI为给定血清样本的平均OD 405除以校准器(参考血清)的平均OD 405。29
血浆生化分析
在清醒状态下，从6 h禁食小鼠的眶后窦中抽取50微升血液。对于胰岛素，分离血浆并在- 80°C冷冻。此外，按照制造商的说明，使用10µL血浆用Elisa试剂盒(Mercodia, Uppsala, Sweden)测定胰岛素浓度。通过MILLIPLEX MAP系统(Luminex, Austin 12212 Technology Blvd)测定血浆细胞因子浓度。， Austin, Texas, USA/默克Millipore总部290 Concord Road Billerica, Massachusetts, USA)。
统计分析
结果以均数±标准差表示。采用单向方差分析(ANOVA)后Tukey后验评估组间差异，IPGTT除外，采用双向方差分析后Bonferroni后验。* p < 0.05;* * p < 0.01;***p<0.001和****p<0.0001与HFD相比，§p < 0.05;§§p < 0.001§§§§p<0.0001与NC和＄p<0.05，与NC-Co定义有统计学意义。使用GraphPad Prism V.5.00 for Windows Vista (GraphPad Software, San Diego, California, USA)进行统计分析。树状图图1L由PermutMatrix软件绘制;30.图2I(主坐标分析(PCoA))是用XLSTAT为Microsoft Windows Excel绘制的。
牙周炎增强高脂饮食(HFD)诱导小鼠代谢紊乱。腹腔葡萄糖耐量试验(IpGTT;正常饲料(NC，蓝色条，n=6)，正常饲料(NC- co，紫色条，n=6)，高脂饲料(HFD，红色条，n=7)和高脂饲料(HFD- co，绿色条，n=10))和血糖指数为插图;1个月(A和B)， 2个月(C和D)， 3个月(E和F)，各组的脂/瘦比值。(G)通过正糖-高胰岛素钳夹技术评估胰岛素敏感性。(H)葡萄糖输注速率(GIR)与牙槽骨损失(ABL)的相关性。(I)牙周菌群优势菌科(丰度>1%，至少在一只小鼠中检测到)与ABL、GIR、牙龈炎症(TNFaG、IL1bG、PAI1G、IL6G，其中“G”代表牙龈)、免疫球蛋白G评分、血糖指数、空腹血糖和3个月体重(分别为IgG3、GI3、FG3、BW3)等代谢参数之间的主坐标分析(PCoA):三幅图表示GIR与乳杆菌科的家庭,Porphyromonadaceae家庭和PorphyromonadaceaeABL家族。数据为均值±SEM。*p<0.05时结果显著;**p<0.01， ***p<0.001，§p < 0.05,§§§p<0.001，与NC和＄通过Bonferroni对(A)、(C)和(E)进行后验的双向方差分析(ANOVA)和Tukey对(B)、(D)、(F)和(G)进行后验的单向方差分析(ANOVA)，与NC-Co相比p<0.05。
继续
结果
Pg，Fn而且π在HFD期间，牙周病原体促进牙周、颈部和全身免疫疾病以及牙周微生物群失调
Pg，Fn而且π，31牙周病原体是小鼠牙周炎发展的驱动因素。在这里，为了证明牙周炎是饮食诱导代谢疾病的加重危险因素，我们生成了一个独特的小鼠模型。首先，用这三种病原体定植5周大的WT C57Bl6/J雌性小鼠诱导牙周炎;然后，给小鼠喂食NC或致糖尿病/非致肥胖的HFD (图1一个)。
我们通过在NC上显示牙周病原体诱导的下颌骨ABL(牙周炎的一个特征)来验证我们的模型。此外，该参数在HFD (图1B, C)。然后，我们研究牙周组织，寻找假定的炎症状态。如图1D, nc喂养的定植小鼠显示所有分析细胞因子的基因表达显著增加。此外，HFD增强了TNF-α和PAI-1的促炎作用(图1D).随后，鉴于这些证据，我们分析了半下颌骨的组织学切片。H&E染色显示细胞浸润于牙周组织(图1E)牙周病原体在NC上定殖后。此外，我们通过免疫染色对细胞类型进行了表征，发现在相同的实验条件下，巨噬细胞(F4/80+细胞)、淋巴细胞T (CD3+细胞)和淋巴细胞B (CD20+细胞)数量增加。在HFD处理的反应中，与nc喂养的小鼠相比，细胞数量增加。此外，在以HFD喂养的定植小鼠中，免疫细胞的数量甚至比NC、NC- co和HFD小鼠进一步增加，这表明饮食治疗和定植对牙周组织炎症过程的影响(图1E)。
接下来，为了确定牙周炎和局部炎症是否与免疫系统受损有关，我们量化了局部(颈部淋巴结)和系统(脾脏)的适应性和先天免疫系统细胞。与正常喂养的小鼠相比，高热量饮食增加了颈部淋巴结和脾脏的细胞数量。有趣的是，牙周炎只在hfd喂养的小鼠中使这种增加变钝(图1F, H)。在后者中，这种变化是由于颈部淋巴结和脾脏中先天CD11b+细胞(CD3-CD19-CD11c-CD11b+)的频率大幅降低，而牙周炎仅在高热量饮食期间增加了t淋巴细胞和b淋巴细胞(CD4+， CD8+和CD19+)的频率(图1克,我)。
为了进一步探索牙周炎的全身效应，我们分析了血液中的免疫细胞，其中上述报道的修饰被证实适用于所有细胞类型，特别是树突状细胞(CD11b+CD11c+)和先天性CD11b+CD11c−细胞(图1J).相比之下，牙周炎对NC下任何组织的任何细胞类型均无显著影响(图1f j)。事实上，牙周定殖增加了NC上抗pg抗体的数量，而HFD治疗仅降低了定殖小鼠的IgG血清水平和抗pg抗体(表1)．相反，在治疗2个月和3个月时，HFD均独立于定植而增加血清IgG水平(表1)．此外，牙周炎患者3个月时HFD患者血中IL-6水平升高，HFD和NC患者血中干扰素-γ水平降低(表1)．
然后，为了评估免疫特征的变化是否与牙周菌群失调有关，我们研究了nc喂养和hfd喂养的定植小鼠牙周菌群的组成。在NC上，定殖显著增加了该属Lactococcus，由基于LDA效应量(图1K).在HFD上，定殖显著增加Porphyromonadaceae家，依Pg殖民统治(图1K)。我们还表明，高热量膳食诱导了牙周菌群的失调，这是基于属的显著增加拟杆菌，梭状芽胞杆菌而且瘤胃球菌属．LDA评分及详情(门来物种)，因为所有牙周菌群的变化都已在网上报告补充图S1。有趣的是，根据家族水平的聚类分析，牙周炎对hfd喂养小鼠的整体牙周微生物群分布的影响比nc喂养小鼠更大(图1L)。
我们还研究了牙周病原体的定植是否会引起肠道菌群的变化。在nc喂养的小鼠中，上述牙周菌群的变化与肠道菌群的微小改变有关，这是由于定殖引起的，这增加了肠道菌群的成员放线菌而且Deltaproteobacteria分组(见网上补充图S2A)。在HFD喂养的小鼠中，我们还观察到由于定植(仅未分类的细菌)肠道微生物群的微小变化，而HFD增加了肠道菌群的比例变形菌门(见在线补充图开通)。从门到种，每个组的所有肠道微生物概况都在网上提供补充图S2C-H。
总之，该数据集提供了牙周病原体诱导小鼠牙周炎的证据，改变牙周微生物群，随后的牙周炎加重了hfd诱导的牙周和全身炎症。
牙周炎增加了hfd诱导的代谢性疾病
为了证明牙周病原体引起的牙周炎可能是饮食引起的代谢性疾病的加重危险因素，我们描述了糖代谢对营养应激的反应。我们的数据显示牙周炎在治疗的第一个月和第三个月加重了hfd诱导的葡萄糖耐受不良(图2A, C, E)。这些数据与脂肪/瘦肉质量比(图2B, D, F)。此外，根据时间进程，牙周炎在3个月时增加了HFD的血清瘦素和胰岛素浓度(表1)．胰岛素抵抗(以葡萄糖输注率(GIR)为指标，由正糖/高胰岛素钳夹技术评估，仅由hfd喂养小鼠的牙周炎诱导(图2重要的是，ABL是强而显著的相关(R2= 0.52;P <0.0001)有胰岛素抵抗(图2H)。
然后，我们用PCoA分析牙周菌群家族丰度与GIR、血糖指数(GI3)、空腹葡萄糖(FG3)、ABL、BW3、牙龈炎症因子、3个月时血液免疫球蛋白水平和牙龈(IgG)细胞因子等代谢参数是否存在相关性。我们发现乳杆菌科牙周菌群丰度与GIR呈显著正相关(图2我，左上插图)。相比之下,Porphyromonadaceae丰度与GIR呈显著负相关(图2I，右上插入)，但与ABL (图2I，右下插图)。总的来说，PCoA允许为每个组识别一个特定的集群，尽管NC-Co和HFD组之间有微小的叠加。此外,Porphyromonadaceae丰度与牙龈TNF-α表达相关(图2I(左下插图)，而我们也发现3个月时ABL与空腹血糖呈正相关(图2我，右中插图)。
综上所述，这些数据表明牙周炎加重了hfd诱导的葡萄糖耐受不良和胰岛素抵抗，同时牙周菌群发生了变化，其中一些变化与代谢表型有关。
Pg定植从适应性免疫系统中招募细胞来控制葡萄糖耐量
为了证明适应性免疫系统是由牙周微生物生态的变化所触发的，并且是牙周病原体对代谢性疾病的有害影响的因果机制，我们首先将患有或没有牙周炎的小鼠的颈淋巴细胞转移到健康的受体小鼠(图3A).在这种条件下，两组受体小鼠的葡萄糖耐量相似(未显示)，这表明需要其他因素来触发代谢性疾病。因此，我们在细胞转移后4周内用牙周病原体向受体小鼠发起挑战(图3A)，并证明，与接受非感染小鼠免疫细胞的小鼠相比，接受感染小鼠免疫细胞的小鼠的葡萄糖耐量有所改善(图3B, C). BW增益没有显著影响(未显示)。然后，为了研究来自患有牙周病的小鼠的宫颈免疫细胞的定植和转移对HFD诱导的葡萄糖耐受不良的影响，我们随后用HFD对定植和转移的小鼠进行了4周的挑战。经过4周的高热量饮食，IPGTT显示，尽管血糖指数仍然显著，但保护作用开始消失(图3D, E)。数据显示，当用患有牙周炎的小鼠的免疫细胞移植hfd喂养的小鼠时，葡萄糖耐量得到改善，尽管略有改善(图3D, E)。相比之下，免疫细胞本身的转移，没有定植受体小鼠，并不足以影响葡萄糖耐量(图3抵扣)。然而，当免疫细胞特异性地适应牙周病原体时，葡萄糖代谢会受到影响。这表明营养压力和牙周炎都是触发代谢表型的必要因素。
免疫细胞从牙周炎小鼠颈部淋巴结转移减少定植诱导的葡萄糖耐受不良。(A)来自有或没有牙周炎的供体小鼠的颈部淋巴结的免疫细胞转移到受体小鼠。然后，每个群体都被殖民Porphyromonas gingivalis（Pg)，梭菌属nucleatum（Fn),普氏菌媒介物（π)，持续四周。在移植后(未显示)、定殖后(B)和高脂饮食(HFD) 4周后(D)对受体小鼠进行腹腔葡萄糖耐量试验;(C)和(E)血糖指数。定殖后(±):HTC+NC- co(黑色条形n=4):健康转移+定殖，PTC+NC- co(绿色条形n=4)牙周炎转移+定殖，HTC+NC(蓝色条形n=4)和PTC+NC(紫色条形n=4)牙周炎转移+无定殖，HFD 4周后:HTC+HFD- co(黑色条形n=4):健康转移+定殖，PTC+HFD- co(绿色条形n=4)牙周炎转移+定殖，HTC+HFD(蓝色条形n=4)和PTC+HFD(紫色条形n=4)牙周炎转移+无定殖。数据为均值±SEM。与HTC+NC相比，当***p<0.001时，经Tukey检验(C)和Bonferroni后验(B)的单向方差分析(ANOVA)和双向方差分析(B)确定结果显著。
在第二组实验中，为了进一步验证适应性免疫系统在葡萄糖耐量控制中的作用，我们用不同组灭活的牙周病原体治疗小鼠，使淋巴细胞免疫牙周病原体(图4A).三种灭活牙周病原体的肌内治疗在1个月时阻止了上述报道的牙周炎对hfd诱导的葡萄糖耐受不良的加重作用(见在线补充图S3A-F)、2个月(未显示)和3个月(图4B-F)。重要的是，这种预防效果是由于Pg因为用这种独特的细菌治疗小鼠足以预防牙周炎引起的代谢性疾病。此外，具体处理由Pg阻止了牙周定殖后1个月和3个月HFD中观察到的抗pg抗体的下降(见在线补充图S3G和S4G)。在HFD 3个月时，用Pg预防牙周组织中牙周定植引起的ABL (图4H)。
用灭活预处理Porphyromonas gingivalis（Pg)在高脂饮食(HFD)喂养的小鼠中预防牙周炎加重的葡萄糖耐受不良。(A)小鼠被注射106灭活菌落形成单位(CFU)Pg或灭活梭菌属nucleatum（Fn)或灭活普氏菌媒介物（π)或所有灭活细菌的混合物或载体溶液。一个月后，老鼠被Pg, Fn，π和/或用载体溶液进行1个月，然后随机分为7组:nc -载体(载体+正常食物，黑色条，n=4)， HFD(载体+HFD，红色条，n=4)，高脂肪定殖饮食(HFD- co)(载体+HFD+定殖，绿色条，n=4)， HFD- co +I B混合(灭活混合细菌+定殖+HFD，黑蓝色条，n=4)， HFD- co +IPg(灭活Pg +定殖+HFD，紫色条，n=4)， HFD- co +IFn(灭活Fn +定殖+HFD，浅蓝色条，n=4)和HFD- co +Iπ(灭活Pi +殖民+HFD，橙色条，n=4)。各组在高脂饮食3个月后进行腹腔糖耐量试验(IpGTT)和血糖指数评估(B-F);(G)测定脂多糖(LPS)特异性免疫球蛋白G抗体Pg的血液。(H)每组实验结束后，观察牙槽骨丢失情况。数据为均值±SEM。与HFD车辆相比，**p<0.01， ***p<0.001和****p<0.0001时，结果显著，§p < 0.05,§§§§与NC车辆相比，p<0.0001＃p < 0.05,# # # #通过Bonferroni对(B)、(C)、(D)和(E)进行后验的双向方差分析(ANOVA)和Tukey对(F)和(G)进行后验的单向方差分析(ANOVA)，与hdd - co相比p<0.0001。
LPS来自Pg增强hfd引起的代谢疾病
在寻找分子决定因素时Pg-加重饮食引起的代谢疾病，我们评估了LPS的影响Pg（图5A).低速率连续输注1个月Pg-LPS加重hfd诱导的葡萄糖耐受不良和胰岛素抵抗(图5罪犯)。此外，预处理小鼠的脂瘦比显著提高Pg -LPS与盐水(载体)预处理小鼠相比(图5E)，提示LPS来自Pg可能是解释牙周炎对代谢性疾病代谢影响的主要分子机制。
脂多糖(LPS)Porphyromonas gingivalis（Pg)会加重高脂饮食引起的代谢性疾病。(A)小鼠被植入Pg-LPS或车辆释放微型泵1个月;然后，给小鼠喂高脂饲料1个月。饮食1个月后，评估各组的葡萄糖耐量(B)、血糖指数(C)、胰岛素敏感性(E)和脂瘦比(D):(Pg-LPS，红条，n=7)或(NaCl，黑条，n=7)。当*p<0.05， **p<0.01和***p<0.001与HFD+车辆相比，通过单向方差分析(ANOVA)和Tukey's检验确定，除' B '(双向ANOVA和Bonferroni's后验)外，结果显著。
讨论
在这里，我们报告牙周炎和明显的LPSPg是hfd诱发葡萄糖耐受不良和胰岛素抵抗的加重因素。潜在的机制与产生特定抗体的能力有关Pg．
通过使用我们独特的动物模型，我们表明，在患代谢性疾病(即hfd喂养)的风险小鼠中，牙周组织先前的定植与Pg通过影响适应性免疫系统对葡萄糖不耐受的反应，增强葡萄糖不耐受的发展Pg．这组数据证实了人类代谢性疾病的发病率在与牙周炎相关时进一步增加的证据，2，3.在糖尿病前期或未确诊的T2D患者中也观察到这一流行病学特征。4，5我们的数据表明，牙周炎本身并不足以引起代谢障碍，因为在受感染的nc喂养的小鼠中没有观察到血糖或胰岛素抵抗的变化。HFD带来的佐证因素可能与代谢受损患者的肠道菌群失调有关。14然而，牙周炎似乎没有引起定植小鼠肠道菌群的重大变化。相反，牙周炎引起了严重的牙周菌群失调，在高热量饮食时加重。
在牙周病原体中，Pg是牙周炎和一般健康之间关系的一个关键候选者。32Pg具有特定的毒力因子库，使其能够侵入牙周组织，随后传播到体循环。第一，能力Pg细菌二肽基肽酶4 (DPP4)等特定的酶调控牙周生物膜。33作为一种适应症，DPP4抑制剂目前用于治疗T2D，这表明这种治疗策略的疗效可能包括抑制原核酶。34的确,Pg也能侵入宿主细胞，如上皮细胞和内皮细胞。35Pg通过其绒毛与上皮细胞表达的α5β1-整合素相互作用，被宿主细胞捕获，使其能够越过上皮屏障。36总而言之，这些观察结果对Pg关于它的传播。这里，我们展示了Pg特别归因于代谢性疾病的毒力是通过LPS的，因为LPS的持续低速率输注Pg与HFD一起影响免疫系统，从而影响胰岛素和葡萄糖耐量。通过提供一种机制，我们的结论因此证实并进一步扩展了文献中的数据，这些数据表明牙周炎患者的特征是存在Pg-脂多糖进入血液。32连续输注LPSPg可能引起慢性低度全身炎症，导致心脏内稳态复位。37这种机制涉及toll样受体(TLRs) TLR-2和TLR-438导致MyD88和核因子κB (NF-κB)的激活，负责TNF-α或IL-1β等促炎细胞因子基因的转录。38此外,Pglps刺激的牙龈成纤维细胞显示NF-κ b依赖性TNF-α的产生，导致炎症过程，包括ERK, p38和JNK的激活，以及PAI-1的表达。39在人牙周韧带干细胞中也观察到这种机制。40脂多糖对细胞串扰的作用对毒力至关重要Pg．我们之前提供了一种机制，表明被剥夺LPS受体CD14的小鼠没有代谢10，41和牙周22疾病，这加强了我们目前的结论。我们不能排除牙周炎在代谢性疾病中的假定作用可能与肠道菌群的变化有关。测序数据显示，在nc喂养的小鼠中，定植后发生了一些微妙的变化。然而，在我们的实验条件下，没有检测到对葡萄糖或免疫稳态的影响。因此，可以预期，即使在没有营养压力的情况下，牙周炎也会在较长时间内慢慢损害代谢特征。但我们不能排除这种机制，正如其他地方报道的那样，42在目前的实验条件下可能会有一些长期影响。这里报道的肠道菌群的细微变化很可能对葡萄糖稳态没有影响。通过这个机制Pg会促进代谢性疾病的发展可能是由于微生物群失调对免疫反应的强烈影响。43我们证明了Pg,一个促炎过程被触发。营养应激对宫颈和全身免疫反应的影响主要来自先天免疫细胞，对b淋巴细胞和t淋巴细胞的影响较小。然而，当与营养应激(HFD)结合时，这种反应是正常的，这表明先天免疫系统诱导的低级别炎症是在适应性免疫系统的控制下的。我们证明了这一假设，表明从感染小鼠的颈部淋巴结细胞转移到naive受体小鼠防止牙周炎对代谢参数的进一步影响。因此，来自定植小鼠的淋巴细胞被诱导到牙周抗原上，并保护受体小鼠免受代谢性炎症的影响。此外，我们可以注意到抗体抗的产生Pg用相应的减毒菌进行处理。产生抗抗体Pg与预防代谢性疾病的发展有关，这表明抗体的保护作用，至少是部分的。先天和适应性免疫系统的作用，特别是TREM-1分子的作用已经被提出44和对脂多糖的反应Pg通过IL-1β和IL-6分泌的增强进行评估。45越来越多的证据表明B、T和自然杀伤淋巴细胞在DT2的发展中起作用。46Pg增加了人牙周炎病变中IL-17和Th17细胞的存在。47在牙周炎引起的关节炎和肥胖中也观察到这一点。48，49重要的是，在免疫系统受损的情况下，感染部位细菌的存在可能导致全身炎症。50文献中的这一假设得到了我们的数据的支持，我们的数据显示，牙周感染显著影响了系统免疫系统。我们的数据表明，接种程序使用Fn或π单独使用不能预防牙周炎引起的代谢改变。这表明如果没有Pg前者的病原体是不够的。但是，我们不能排除这种可能性Fn而且π可能是恶化的因素Pg毒性。
最后，总的来说，我们的数据表明，由富含脂肪的饮食引起的牙周微生物群失调会影响颈部淋巴结和系统免疫系统反应。虽然营养压力和肠道菌群失调本身可以诱发代代谢疾病，但在这里我们进一步表明，伴随的牙周病会触发区域适应性免疫系统，从而增强胰岛素抵抗。我们的数据支持分子因子的作用Pg，如脂多糖。后者被认为是由营养应激引起的牙周炎的佐剂，它们共同触发适应性免疫反应，增强胰岛素抵抗和葡萄糖耐受不良。
致谢
作者感谢法国动脉高血压学会(Société Française d’Hypertension Artérielle)和法国糖尿病学会(Société Francophone du Diabète)对Blasco-Baque博士的支持。他们还感谢zootechnie-Rangueil INSERM/UPS US006 CREFRE;表型- anexplo平台(US006-CREFRE)用于生化分析;Jean Monnet大学(法国圣艾蒂安)医学院的显微断层照相设备，特别是Luc Malaval博士(INSERM U1059)的技术支持;Florence Capilla和Christine Salon在INSERM/UPS US006 CREFRE实验组织病理学平台进行半下颌骨组织学技术援助，图卢兹Purpan，法国;凯瑟琳·勒·安的技术援助p . gingivalis抗体检测;Lorette Gaffié， Robert Cameron博士编辑英文，Tercé François博士对手稿进行批判性审查。作者还感谢保罗萨巴蒂尔图卢兹大学牙科学研究技术平台。
参考文献
补充材料
-
补充数据
此网页文件由BMJ出版集团从作者提供的电子文件制作而成，并没有对内容进行编辑。
- 数据补充1-在线补充
脚注
贡献者VB-B进行实验设计，分析数据，撰写和修改手稿。LG、CP、QE、SN、PL、SLG-D、ML、PK、AW、VA、AC、MB-M进行实验。MS进行实验，分析数据，撰写和修改手稿。RB设计实验，分析数据，撰写和修改手稿。所有作者都同意出版最终版本。
相互竞争的利益没有宣布。
伦理批准所有动物实验程序均经法国图卢兹Rangueil大学医院当地伦理委员会批准。
出处和同行评审不是委托;外部同行评审。