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摘要
客观的肠道细菌菌群在人体生理和IBDs中起着重要作用。虽然一些数据表明真菌菌群在IBD发病机制中的作用，但可用的数据很少。我们研究的目的是确定IBD患者粪便真菌菌群的特征。
设计分别使用16S和ITS2测序确定了235名IBD患者和38名健康受试者(HS)粪便微生物群的细菌和真菌组成。利用Qiime管道对所获得的序列进行分析，评价其组成和多样性。细菌和真菌类群与临床参数相关，采用多元关联线性模型进行鉴定。采用Spearman检验和距离相关法研究细菌菌群和真菌菌群的相关性。
结果我们观察到IBD中真菌菌群是倾斜的，担子菌群/子囊菌群比例增加，而子囊菌群比例降低酿酒酵母比例的增加白色念珠菌与HS相比。我们还发现了疾病特异性的多样性变化，表明克罗恩病特异性的肠道环境可能有利于真菌，而不是细菌。同时对细菌和真菌菌群的分析显示，HS中存在密集且同质的相关网络，而IBD中存在显著不平衡的相关网络，这表明存在疾病特异性的跨界改变。
结论除了细菌生态失调，我们的研究还发现了IBD中独特的真菌微生物群生态失调，其特征是生物多样性和组成的改变。此外，我们在这里揭示了IBD中疾病特异性的跨界网络改变，这表明，除了细菌，真菌也可能在IBD的发病机制中发挥作用。
- 炎症性肠病
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视频摘要
本研究的意义
关于这个问题我们已经知道了什么?
肠道细菌菌群在IBDs中是不平衡的，并在其发病机制中发挥作用。
尽管真菌菌群在IBD发病机制中的作用有一些线索，但对其研究很少。
Card9和Dectin1是参与抗真菌先天免疫的两个关键分子，它们强烈影响小鼠对肠道炎症和真菌菌群的易感性。
新的发现是什么?
IBD患者粪便真菌菌群不平衡。
对同一受试者的细菌菌群的同时分析显示，IBD和健康受试者之间的细菌和真菌成分存在许多相关性，这表明存在疾病特异性的跨界改变。
在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?
这些结果支持了真菌菌群在IBD发病机制中的作用，并指出了一个新的潜在治疗靶点。
简介
克罗恩病(CD)和UC是IBD的两种主要类型，是通常影响年轻受试者并大大改变其生活质量的终身疾病。IBD的确切发病机制尚不清楚;然而，过去十年的研究表明，IBD涉及在遗传易感性的受试者和环境因素的影响下对肠道微生物群的免疫反应的改变。IBD中的细菌微生物群已被彻底调查，世界各地的几个研究小组观察到细菌生态失调(组成不平衡)，其特征是生物多样性减少，一些属于厚壁菌门的细菌(如细菌)减少Faecalibacterium prausnitzii)和属于变形菌门的细菌的增加，例如大肠杆菌．1 - 5然而，定居在人类肠道的其他微生物类型还没有被彻底研究。除了最近一项研究强调肠道病毒在IBD中可能的作用外，6相关数据很少，特别是关于真菌菌群方面。真菌一直被怀疑与IBD的发病机制有关。很多年前，抗体针对酿酒酵母mannan(抗酿酒酵母抗体(ASCA))被证明与CD有关。此外，一些ibd相关基因，如Card9，参与了对真菌的免疫反应。7在小鼠中，肠道炎症促进真菌增殖;8相反，一些真菌可以负性调节炎症的易感性(白色念珠菌)或正(酿酒boulardii)的方式。8 - 11最后，缺乏与真菌感应有关的主要基因，如Dectin-1或Card9的小鼠，真菌微生物群负荷增加，更容易患结肠炎。12，13这些数据表明真菌菌群和IBD发病机制之间存在联系。
在这里，我们使用高通量测序技术对健康受试者(HS)和表型良好的IBD患者的真菌微生物群进行了描述。在相应的患者中，我们还确定了细菌菌群的组成和已知参与真菌易感性的基因中的22个单核苷酸多态性(SNPs)的序列。我们在IBD患者中观察到明显的真菌失调。此外，相关分析表明IBD的王国间关系改变。最后，虽然我们的基因型-真菌菌群分析有些缺乏说服力，但我们的分析表明，基因可能是IBD中真菌菌群失调的驱动因素。
总的来说，本研究提供的数据代表了迄今为止对IBD患者真菌菌群的最全面分析，并为支持真菌菌群在IBD发病机制中的作用提供了理论依据。这些数据为针对真菌菌群的干预研究铺平了道路。
结果
IBD中的细菌失调
我们的研究人群由235例表型良好的IBD患者和38例HS患者组成补充1)．我们首先使用16S测序分析了微生物群的细菌部分。beta多样性分析显示样本根据疾病表型聚类(图1A, B，在线补充图S1)。与HS样本相比，UC和CD的alpha多样性(使用四个不同的指标进行评估)显著降低，特别是耀斑患者的样本(图1C, D，在线补充图S2)。在所有显型中，细菌菌群以厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门(图1E, F，在线补充图S3)。这些数据与已发表的文献一致，验证了我们队列的质量和所使用的方法。
IBD中细菌菌群多样性和组成的改变。(A和B) Beta多样性。布雷-柯蒂斯距离的主坐标分析，每个样本根据疾病表型着色。PC1、PC2和PC3表示捕获大部分多样性的前三个主坐标。由坐标捕获的多样性分数以百分比的形式给出。组间比较采用Permanova法。(C和D)所观察到的描述各研究组中细菌微生物群α多样性的种数(Kruskal-Wallis检验和Dunn's多重比较检验)。(E和F)在门和科水平上细菌微生物群的全球组成。健康受试者(HS)和患者亚组标记在x-轴，表示为各组的相对操作分类单位丰度。在所有面板中:*p<0.05;* * p < 0.01;* * * p < 0.001。乳糜泻，克罗恩病。
IBD中真菌菌群多样性的改变
利用ITS2测序，我们随后评估了我们人群中真菌菌群的组成。根据疾病表型，样本之间的聚类弱于细菌微生物群(图2A, B，在线补充图S4A)。值得注意的是，CD患者与UC患者、缓解期IBD患者与HS患者的样本差异均无统计学意义。然而，在IBD发作和HS患者(p=0.0008)或IBD缓解患者(p=0.0007)的样本之间观察到差异。在耀斑中，这种真菌微生物群特异性信号在UC中观察到的强度高于CD (p=0.006;在网上看到的补充图S4B-C)。与细菌菌群的结果相似，IBD患者真菌菌群的α多样性降低(图2C,在线补充图S5A-D)。这一特征主要存在于UC患者的样本中，而HS和CD患者的真菌多样性在很大程度上是相似的。为了探索肠道中细菌和真菌多样性之间的平衡，我们确定了真菌与细菌多样性的比值。这一比例在IBD样本中增加，特别是在CD和耀斑中(图2D,在线补充图S5E-G)。在有乳糜泻和回肠受累的患者中发现的比例最高。在HS和IBD患者中，真菌菌群以子囊菌门和担子菌门的真菌为主，根据疾病表型有一些变化(图2E, F，在线补充图S6)。其中最具优势的属是酿酒，Debaryomyces，青霉菌，克鲁维酵母菌属而且假丝酵母．有趣的是,酿酒，Debaryomyces而且克鲁维酵母菌属存在于食物中(尤其是奶酪、面包、啤酒);在这个法国队列中，他们可能会定期摄入，这表明饮食习惯可能会产生影响，尽管需要具体的研究来探索这一假设。
IBD中真菌菌群多样性和组成的改变。(A和B) Beta多样性。布雷-柯蒂斯距离的主坐标分析，每个样本根据疾病表型着色。PC1、PC2和PC3表示捕获大部分多样性的前三个主坐标。由坐标捕获的多样性分数以百分比的形式给出。组间比较采用Permanova法。(C)观察到的物种数量描述了不同研究组中真菌微生物群的α多样性。(D) ITS2/16S观测物种比值(Kruskal-Wallis检验与Dunn’s多重比较检验。(E和F)在门和属水平上真菌菌群的全球组成。健康受试者(HS)和患者亚组标记在x-轴，以各组相对OTUs丰度表示。在所有面板中:*p<0.05;* * p < 0.01;* * * p < 0.001。乳糜泻，克罗恩病。
这些数据表明，真菌菌群多样性的特定改变与细菌菌群的改变并行。综上所述，这表明炎症期间的环境变化可能对真菌和细菌产生不同的影响，并诱导IBD中真菌-细菌间王国关系的改变。
IBD中细菌和真菌菌群组成的扭曲
我们确定了与疾病表型相关的微生物特征，并使用多变量关联检验来控制年龄、性别、吸烟和治疗等潜在混杂因素的影响(线性模型的多变量关联(MaAsLin);详见“材料和方法”)。关于细菌菌群，我们观察到，与HS相比，IBD中几个类群的丰度有所改变，爆发与缓解相比，回肠受累的IBD与无回肠受累的IBD相比(图3一个;在网上看到的补充数据S7A和8，表S1的完整MaAsLin输出)。这些类群中的许多在以前的研究中已经被报道过，1，5包括瘤胃球菌科、乳螺科、肠杆菌科、巴氏杆菌科、利肯菌科和珍菌科。值得注意的是,瘤胃球菌属，Coprococcus，Blautia，真细菌而且DoreaIBD的丰度降低，Roseburia，Faecalibacterium，Dorea而且Blautia在IBD耀斑和瘤胃球菌属gnavus除了证实这些已经证实的相关性外，我们还发现了新的相关性，例如Anaerostipes在IBD中，特别是在耀斑和回肠乳糜泻中，我们还发现链球菌anginosus的增加Aggregatibacter segnis而且放线杆菌(巴氏杆菌科家族的两个成员)在IBD爆发与缓解。
与IBD相关的细菌和真菌分类群。(A和B)使用多元统计方法检测的细菌和真菌类群的丰度差异(见“材料和方法”)。每个分类单元的折叠变化是通过将不同情况下的平均丰度除以对照的丰度来计算的。括号中表示所示分类单元的任何存在(>0)的对象数量，并且在至少一个组中平均丰度为>0.5%的分类单元用“#”表示。(C)绝对酿酒酵母采用qRT-PCR(均值±SEM)测定粪便微生物群丰度。(D)相对比例白色念珠菌的对数减去白念珠菌所有真菌的对数。(E)绝对白念珠菌采用qRT-PCR(均值±SEM)测定粪便微生物群丰度。(F)各组担子菌属/子囊菌属相对丰度比值(Kruskal-Wallis检验与Dunn's多重比较检验，*p<0.05;* * p < 0.01;* * * p < 0.001;* * * * p < 0.0001)。CD，克罗恩病;HS，健康人。
在分析真菌菌群时，我们发现与疾病表型相关的数量较少(图3B;在网上看到的补充图S7B，表S2为完整的MaAsLin输出)。其中最显著的特征之一是IBD中担子菌属(Basidiomycota)的丰度增加，尤其是耀斑(flare)，而子囊菌属(Ascomycota)的丰度则相应减少。在IBD和flare中减少的子囊菌属中，细胞死亡sympodialis被确认。然而,酿酒属，特别是酿酒酵母物种表现出最强的信号。因此，我们进行了实时qPCR靶向酿酒酵母在同样的样品上，证实了明显的下降酿酒酵母无论是在绝对数量上，还是在IBD中所占的比例，特别是在耀斑中(图3C,在线补充图S9A-B)。虽然白念珠菌乳糜泻的丰度增加14假丝酵母在多变量分析中未发现与疾病表型相关。因此，我们进行了实时qPCR靶向白念珠菌在同一样品上专门检查这种微生物。的白念珠菌与缓解期相比，IBD发作的比例和绝对数量明显增加(图3D, E，在线补充图S9C)。我们调查了它们各自丰度之间的相关性。担子菌属和子囊菌属丰度之间表现出很强的负相关(见在线)补充图S9D)。此外，担子菌-子囊菌丰度比值根据疾病表型有显著差异，IBD爆发期的担子菌-子囊菌丰度比值高于缓解期和HS (图3F-G)，表明该比值可以代表真菌生态失调指数。
酿酒酵母诱导树突细胞的调节反应
根据测序和qPCR结果，我们假设酿酒酵母而且白念珠菌分别在炎症过程中起保护作用和恶化作用。作为原理的证明，我们评估了两种热杀酵母菌株刺激小鼠骨髓来源的树突状细胞(BMDCs)后白细胞介素(IL)6和IL10的产生。IL6的产量与其他国家相似酿酒酵母而且白念珠菌；然而，抗炎细胞因子IL10的产生在刺激后显著增加酿酒酵母的抗炎作用酿酒酵母相比之下,白念珠菌（图4)．有趣的是，观察到的影响是Card9依赖的，因为Card9 KO小鼠DC中细胞因子的产生几乎被消除。这证实了该基因在宿主-真菌相互作用中的核心作用。
酿酒酵母而且白色念珠菌诱导不同的树突细胞反应。白介素(IL)10 (A)和IL6 (B)由小鼠骨髓来源的树突状细胞刺激后分泌酿酒酵母而且白念珠菌(平均±SEM)。每次实验的小鼠数量n= 5-15只(Mann-WhitneyU测试)。KO,淘汰赛;WT,野生型。
IBD菌群显示特定的细菌-真菌关联
接下来，我们评估了真菌菌群组成是否与细菌组成相关。为了解决这个问题，我们根据疾病表型研究了属水平上的相关性。我们观察到UC与HS相比具有更高数量的显著相关性的疾病特异性模式(图5)．虽然HS和CD的相关数量相似，但CD的相关强度较弱(图5)．
IBD中特异性细菌-真菌相关模式。真菌和细菌属相对丰度的距离相关图。健康受试者(左)，UC(中)和克罗恩病(右)。所有两两比较均有统计学意义;仅显示显著相关性(校正错误发现率后p值<0.05)。正值(蓝色方框)表示正相关，负值(红色方框)表示负相关。正方形的阴影表示关联的大小;深色比浅色更有关联。相关性的符号是用斯皮尔曼方法确定的。
有趣的是，在IBD患者中，蛋白质的丰度之间存在正相关酿酒以及在IBD中显示数量减少的几种细菌的丰度，例如双歧杆菌属，Blautia，Roseburia而且瘤胃球菌属．另一方面，身份不明的Malasseziales遵循相反的模式。然后，为了证明根据疾病表型的全球王国内和王国间的平衡，我们在属水平上建立了涉及细菌和真菌的相关网络(图6)．HS中细菌和真菌的多样性较高(图1而且2)，网络没有显示出明显的吸引焦点，正相关和负相关分布在整个节点上。引人注目的是，CD和UC网络有着显著的不同。值得注意的是，在IBD中观察到许多从变形菌门属到厚壁菌门成员的负相关。与HS相比，担子菌门的真菌属，特别是未识别的Malasseziales的相关性在CD中减少，而在UC中增加。使用Spearman检验建立相关网络时也得到了类似的结果(数据未显示)。
IBD跨界网络失衡。使用Cytoscape生成的健康受试者(A)、克罗恩病(B)和UC (C)的相关网络。每个圆(节点)代表一个微生物属，它的颜色代表它所属的细菌或真菌门，它的大小代表它具有的直接边的数量。边缘颜色表示距离相关的大小;绿色为正相关，红色为负相关(spearman检验)。所有两两比较均有统计学意义;仅显示显著相关性(校正错误发现率后p值<0.05)。
综上所述，这些结果表明肠道菌群中的细菌和真菌之间存在复杂的关系，并且在CD和UC中存在特定的改变。
真菌微生物群-基因型关联
在小鼠体内，肠道细菌菌群已被证明受到宿主基因的影响。15，16大量数据表明，人类也有类似的效果。17，18然而，没有关于真菌菌群的数据。因此，我们测试了与疾病表型相关的真菌类群的相对丰度之间的相关性(担子菌门和子囊菌门以及酿酒酵母而且m . sympodialis物种)和与IBD相关的Card9 snp以及其他几个参与对真菌反应缺陷的snp。12，19号我们使用标准线性回归，并调整了年龄、性别、吸烟和治疗的所有分析。在总共84次测试中，Bonferroni校正的p值阈值为6×10，初始alpha为5%−4．如表1，其中列出了10个最显著的关联，没有一个测试超过了这个阈值。如此严格的显著性阈值导致我们的人口只有有限的权力。例如，我们有80%的能力检测SNP，解释被测类群10%(或更多)的方差，但<2%的能力检测SNP，解释1%的方差。虽然类群相关SNP的存在和SNP效应的大小仍有待确定，但就这些SNP对IBD的边际效应而言，大效应量(例如≥10%)似乎不太可能。然而，我们发现了有趣的趋势:值得注意的是，Dectin1 SNP与医学难治性UC相关(rs2078178， ' T '等位基因12的丰度呈负相关m . sympodialis(本身在IBD耀斑减少)。以同样的方式，ibd相关的CARD9 SNP (rs10781499， ' A '等位基因21的丰度呈负相关酿酒酵母(本身在IBD中减少)。
讨论
在这项研究中，我们发现IBD中存在真菌肠道微生物群的疾病特异性变化。同时对真菌和细菌微生物群进行分析，可以阐明IBD和HS患者之间王国间平衡的差异。
CD和UC的细菌多样性均降低。然而，只有UC的真菌多样性下降。对于乳糜泻来说，这表明特定于乳糜泻的环境变化可能有利于真菌而不利于细菌。这些结果在累及回肠的CD患者中尤其明显。值得注意的是，不累及回肠的乳糜泻患者与真菌多样性降低的UC患者表现相似补充图而its / 16s生物多样性比值(图2D).最近在患有IBD的儿科患者中观察到肠道真菌菌群的减少。24然而，该研究中分析的患者数量并不能使作者根据疾病表型区分他们，从而排除了对乳糜泻患者特异性的阐明。回肠是肠道生理的主要参与者，特别是通过产生抗菌肽和吸收胆汁酸，这两项功能在回肠乳糜泻中发生改变，并对腔内细菌和真菌有潜在的高度影响。25 - 28回肠乳糜泻的这些改变可能与观察到的特定微生物群改变有关。
根据已发表的数据，HS和IBD患者的粪便真菌菌群组成以子囊菌门和担子菌门的真菌为主。7，24，29，30.子囊菌属和担子菌属丰度呈显著负相关，是IBD与HS微生物区系以及IBD发作与缓解之间最重要的鉴别特征之一。从逻辑上讲，IBD和HS患者的担子菌-子囊菌丰度比率不同。与HS相比，IBD患者在耀斑期(UC或CD)的比例较高，但在缓解期正常，这表明担子菌属和子囊菌属之间的失衡可能是由炎症驱动或参与炎症过程。
我们已经证明过了酿酒酵母代表正常真菌菌群的主要组成部分。通过实时qPCR证实，其下降与IBD(相对于HS)和耀斑(相对于缓解)独立相关。酿酒酵母最近是否被证明可以减少粘连侵袭性结肠炎大肠杆菌一种与回肠CD相关的细菌，在表达ceacam6的小鼠中。31s . boulardii与…密切相关的一种益生菌酵母酿酒酵母，32在一些结肠炎模型中显示出抗炎作用7除了在预防抗生素相关腹泻，急性腹泻，艰难梭状芽胞杆菌感染和肠内喂养相关腹泻。33综合来看，这些数据表明酿酒酵母可能不适应炎症环境和/或它具有抗炎潜力。这增加了在新的治疗方法中使用真菌的可能性，其方式类似于目前正在开发的几种细菌类型。使用体外BMDC系统获得的结果表明酿酒酵母可能对宿主表现出调节作用，特别是通过诱导IL10的产生。这些结果与另一项研究结果一致，该研究报告了接受该药物的小鼠结肠中IL10的表达增加酿酒酵母在结肠炎的情况下。34进一步的实验酿酒酵母还有其他真菌，比如m . sympodialis，将是必要的，以确定这些物种在肠道和肠道炎症期间的作用。
虽然假丝酵母是我们研究人群中最丰富的属之一，在多变量分析中未确定与疾病表型相关。这可能是由于高度的异质性假丝酵母属以及在物种水平上使用我们的测序方法识别真菌的困难。事实上，大多数被确定的序列属于假丝酵母属没有被分配到一个特定的种。因为一些研究表明白念珠菌在IBD患者中7，24，30.我们用实时qPCR方法评估了其在相同样本中的丰度。的显著增长白念珠菌在IBD患者中，尤其是在耀斑患者中。
我们在此鉴定了一种疾病特异性真菌菌群失调，其组成变化涉及子囊菌门和担子菌门两种主要真菌门以及几种真菌物种，包括酿酒酵母，m . sympodialis而且白念珠菌．尽管IBD患者真菌菌群的变化可能与他们改变的饮食习惯有关，35这些变化也可能在炎症过程中发挥作用。对的影响知之甚少m . sympodialis关于肠道炎症。细胞死亡是哺乳动物皮肤上发现的一个属，与从头皮屑到特应性湿疹或糠疹的许多病症有关。36尽管如此细胞死亡显然属于人类皮肤微生物群，该属的物种经常在人类肠道微生物群中被发现，这表明可能是肠道的定殖。7的确，基因组细胞死亡显示存在编码分泌酶的基因类似于众所周知的人类病原体白念珠菌．此外,m . sympodialis已知会分泌强效过敏原，可能会增加IBD患者肠道损伤部分的局部炎症。37最近的数据显示，m . sympodialis可以激活肥大细胞释放半胱氨酸白三烯并增强肥大细胞IgE反应，这可能导致炎症。38此外，我们发现CD中真菌-细菌多样性平衡的改变可能是由修饰的界间相互作用解释的。
真菌和细菌在肠道内共存，并可能直接相互作用。共生真菌和细菌可以在小鼠肠道的区域中一起发现。12在小鼠身上使用抗生素会导致主要的真菌扩张，停止使用抗生素后，真菌扩张会减少，39这表明了真菌和细菌菌群之间的平衡。除了ITS2/16S生物多样性比值的差异外，我们还注意到跨界网络的疾病特异性模式。我们进行了相关性分析，旨在全面调查肠道菌群平衡。结果显示IBD患者的微生物网络不平衡。在UC中，真菌和细菌之间的相关性数量和强度增加。这表明相互作用更紧密。另一方面，CD中its / 16s生物多样性比值较高，而真菌和细菌的相关性较弱，这表明两个王国之间存在脱节。因此，真菌菌群的作用可能根据UC和CD的发病机制而不同。在UC中，细菌和真菌的生物多样性受限与炎症过程中可能涉及的新的界间相互作用有关。然而，乳糜泻的特点是细菌和真菌菌群之间的连接中断。 This suggests that their respective effects on pathogenesis may be independent. Further studies are needed to elucidate more precisely the functional connections within and between kingdoms in the gut microbiota.
最后，尽管我们的研究没有足够的数据证明基因型和真菌菌群之间的相关性，但我们发现了一些趋势，表明与IBD或IBD严重程度相关的snp可能会影响真菌菌群失调。
结论
除了阐明细菌生态失调，我们的研究还发现了IBD中独特的真菌微生物群生态失调，其特征是生物多样性和组成的改变。此外，在这里，我们揭示了IBD中疾病特异性的跨界网络改变，这表明，除了细菌之外，真菌也可能在IBD的发病机制中发挥作用。确定这些领域间相互作用的关键参与者，并了解它们如何影响肠道炎症或受肠道炎症的影响，是进一步研究的方向。
材料与方法
患者及样本采集
所有患者均在圣安东尼医院消化内科(法国巴黎)招募，并提供知情同意书。根据临床、放射学、内窥镜和组织学标准对IBD进行诊断。研究参与者在入组前至少两个月没有服用抗生素或使用结肠清洁产品。患者特征在网上显示补充表S1。收集了235例IBD患者和38例HS患者的粪便样本。整个粪便收集在无菌箱中并立即均质，0.2 g等份在−80°C冷冻以供进一步分析。
健康受试者和IBD患者的微生物区系分析
如前所述，对粪便样本进行DNA提取。3.然后将DNA样本用于16S和ITS2基因测序和序列分析补充材料和方法)．具体分析白念珠菌而且酿酒酵母对粪便DNA进行实时定量PCR检测补充材料和方法)．
树突状细胞对酿酒酵母而且白念珠菌
BMDCs是根据在线描述生成的补充材料和方法．用热杀伤刺激BMDCs白念珠菌或酿酒酵母在18小时内感染多重数(MOI)为10，细胞培养上清用于ELISA分析(见在线补充材料和方法)。
基因分型在网上有描述补充材料和方法．
统计分析
所有分析和图表制备均使用GraphPad Prism V.6.0 (San Diego, California, USA)。所有图数据均以均数±SEM表示，采用双尾非参数Mann-Whitney U检验或Kruskal-Wallis检验及Dunn's多重比较检验进行统计分析。采用Permanova方法(9999个排列)对beta多样性分析的样本分组进行统计学意义分析。p值<0.05为差异显著。
MaAsLin是一个多元统计框架，用于发现临床元数据和微生物群落丰度之间的关联。14
微生物类群丰度数据的相关性由Szekely和Rizzo提出40由Simon和Tibshirani推荐。41它被成功地用于其他微生物群数据分析42以及在人类基因中鉴定基因网络。43它是无标度的，并允许检测非线性关系。距离相关性以0和1为界，如果变量之间存在独立性，则距离相关性等于0。提供了一个统计测试，以评估变量之间的依赖关系，并显示出强大和易于计算。41除距离相关外，还计算了Spearman相关符号，启发式地描述了微生物类群之间的关联方向。使用包在R-3.2.3下计算距离相关性能源v1.6.2．利用Benjamini和Hochberg对p值进行校正，以控制错误发现率。使用Cytoscape 3.1.1构建相关网络。
为了研究真菌分类单元和基因型之间的相关性，我们在四个主要的独立分类单元之间进行了系统的关联筛选，这些分类单元之前被确定与IBD(相对于HS)或与耀斑(相对于缓解)有关(图3B,在线补充图S7B)和21个常见候选snp。所有结果均使用该函数进行秩法向变换进行标准化rntransform从R包GenABEL（http://cran.r-project.org/web/packages/GenABEL/index.html)．我们使用标准线性回归，并调整了年龄、性别、吸烟和治疗的所有分析。
致谢
作者感谢CH Saint Antoine的Christophe Hennequin为他们提供了酿酒酵母压力。他们还感谢Elodie Drouet和Unité de Recherche Clinique de l'Est Parisien(援助Publique-Hôpitaux de Paris和UPMC Paris 06)的临床研究助理团队帮助获得IBD患者样本。
参考文献
脚注
贡献者HS构思并设计了这项研究，进行了数据分析并撰写了手稿。除下文另有说明外，VL和SJ进行了所有实验。HA对遗传资料进行统计分析。H-PP对焦磷酸测序数据进行统计分析。DC和MLR进行体外实验。CL, AB, IN-L, GL, JC, PS, PL, DS, MLR, LB和HS讨论了实验和结果。
资金这项研究得到了广泛医学研究计划、INSERM队列补助金和Francois Aupetit协会的支持。
相互竞争的利益没有宣布。
病人的同意获得的。
伦理批准法兰西岛第四人身保护委员会当地伦理委员会，IRB 00003835, Suivitheque研究，注册号2012/05NICB。
出处和同行评审不是委托;外部同行评审。