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客观的抗肿瘤坏死因子(TNF)抗体被成功用于治疗克罗恩病。然而,大约40%的患者显示未能anti-TNF疗法。在这里,我们描述分子机制与内窥镜相关抗anti-TNF疗法。
设计粘膜和血液细胞与克罗恩病的患者之前和期间anti-TNF疗法。细胞因子,细胞表面标记,由微阵列信号蛋白和细胞凋亡进行了评估,免疫组织化学,qPCR, ELISA,整个机关文化和流式细胞仪。
结果急救员anti-TNF治疗显示肿瘤坏死因子受体表达明显高于2 (TNFR2)但不是IL23R anti-TNF治疗前T细胞比无。anti-TNF治疗期间,有一个重要的upregulation粘膜IL-23p19, IL23R和IL-17A anti-TNF无但没有反应。Apoptosis-resistant TNFR2 + IL23R + T细胞明显扩大anti-TNF无与反应相比,肠道热带α4β7整合蛋白表达,并表现出增加IFN-γ的表达式,T-bet, IL-17A和RORγt而TNFR2 + IL23R−细胞,表明混合Th1 / Th17-like表型。肠道TNFR2 + IL23R + T细胞被IL-23来源于CD14 +巨噬细胞激活,这是更多的出现在无anti-TNF之前治疗。IL-23 anti-TNF-treated粘膜器官管理文化导致的扩张CD4 + IL23R + TNFR2 +淋巴细胞。功能研究表明anti-TNF-induced IL-23粘膜T细胞凋亡是废除。
结论扩大apoptosis-resistant肠道TNFR2 + IL23R + T细胞与抵抗anti-TNF治疗克罗恩病。这些研究结果确定IL-23患者作为一个合适的分子目标anti-TNF治疗克罗恩病耐火材料。
- 克罗恩氏病
- 肿瘤坏死因子
- 细胞凋亡
- 肠道T细胞
- 粘膜免疫
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这项研究的意义
已知在这个问题上是什么?
抗肿瘤坏死因子抗体(anti-TNF)在许多患者是有效地用于治疗克罗恩病。
大约有40%的病人耐火anti-TNF疗法或将失去对治疗的反应。
anti-TNF耐火材料克罗恩病的机械原因仍然未知,但它已经表明,抑制IL-23 anti-TNF没有响应患者特别有效。
有什么新发现吗?
克罗恩病的患者应对anti-TNF治疗显示肿瘤坏死因子受体表达明显高于2 (TNFR2)粘膜T细胞比无起始之前治疗。
anti-TNF治疗期间,有重要的粘膜IL-23p19 upregulation, IL23R和IL-17A anti-TNF难治性患者,但没有反应。
IL-23源自CD14 +巨噬细胞废除anti-TNF-induced T细胞凋亡在粘膜和激活肠道TNFR2 + IL23R + T细胞。
TNFR2 + IL23R + T细胞表达gut-tropic整合蛋白α4β7
Apoptosis-resistant TNFR2 + IL23R + T细胞扩大anti-TNF难治性患者,使粘膜炎症。
它会如何影响临床实践在可预见的未来吗?
IL-23集中参与调停抵抗anti-TNF治疗克罗恩病的患者,从而代表一个合适的分子目标anti-TNF难治性疾病。
介绍
克罗恩病(CD)是一种慢性复发性炎症性疾病,特点是一个不受控制的黏膜免疫反应。1异常的炎性细胞因子的生产,特别是肿瘤坏死因子(TNF),被牵连在CD保持肠道炎症的重要因素。2 3它的功能相关性的临床疗效凸显anti-TNF抗体,这已经成为不可或缺的一部分在CD患者的治疗。4 - 6
虽然anti-TNF疗法通常是非常有效的,但是不能显示患者治疗效果相关的子群的CD。大约三分之一的患者治疗CD没有反应初始anti-TNF疗法(基本情况),也可能受益于另一个TNF拮抗剂。7此外,30% - -50%最终失去对治疗的反应(二次情况说明)。8免疫原性主要负责的损失在二级无反应,9但是切换到第二个anti-TNF拮抗剂也同样显示只有减少响应率与anti-TNF-naive患者相比。10除了中和抗体anti-TNF代理、缺乏反应迄今为止主要解释为血清药物水平不足。9然而,最近的一项研究发现了一个大群的二级情况说明anti-TNF治疗患者足够anti-TNF抗体血清槽水平,没有检测到中和抗体。11这些研究结果强烈表明,除了药效学因素,选择机械的原因必须负责观察变量响应anti-TNF治疗组患者的CD。
anti-TNF抗体在CD的确切作用机制仍然是一个不确定性的问题,但这是普遍的共识,他们的一个主要治疗属性是由绑定到膜结合肿瘤坏死因子(mTNF)轴承的免疫细胞。12日13特别是anti-TNF代理可能绑定mTNF-expressing巨噬细胞,从而诱导细胞凋亡在TNFR2-expressing粘膜T细胞缺乏mTNF-dependent聚集有关。14mTNF / TNFR2信号通路是一个至关重要的监管机构调解肠道t细胞凋亡和阻力的存在可能导致那些粘膜炎症。
粘膜免疫系统如何逃脱的免疫抑制及凋亡诱导效应anti-TNF代理了解甚少。然而,众所周知,在CD患者的炎症粘膜细胞因子网络受到改变,受到不同细胞因子的生产模式过程中发生疾病。3例如,从一个Th1过渡到混合Th1 / Th17响应被描述在CD。15此外,异质性疾病病理学,独立的肿瘤坏死因子信号通路,替代TNF-independent细胞因子信号通路的存在也可能有助于抵抗anti-TNF治疗的发展。事实上,除了TNF,各种研究涉及IL-23促炎细胞因子在炎症性肠病的发病机制。16日至18日多态性在IL23R基因编码已确定在全基因组关联研究,并与IBD发病机制有关。19日20IBD的功能研究在临床前模型强调监管IL-23在肠道炎症。它被确认为发展要素及延续慢性肠道炎症。21日22提高粘膜的表达IL-23也在IBD患者,建议一个重要TNF-independent在疾病发病机理中的作用。23日24
虽然促炎细胞因子IL-23 CD发病机理,有关的上下文相关的功能IL-23-mediated信号在anti-TNF耐火粘膜炎症尚未解决。然而,最近公布的数据表明,治疗与选择性IL-23抑制剂risankizumab或MEDI2070导致明显的高响应率的CD失败患者先前anti-TNF疗法。25日26日这些发现表明一个重要的角色在TNF-refractory IL-23肠道炎症。当前研究的目的是描述的功能角色IL-23在这个上下文。具体来说,我们的粘膜细胞因子模式和表型特征肠道T细胞在anti-TNF治疗CD。我们的研究结果确定的参与apoptosis-resistant IL23R + TNFR2 + T细胞在CD患者情况说明anti-TNF疗法。
材料和方法
病人
肠活检或肠道切除术患者克罗恩氏病或控制用于微阵列、细胞培养、RNA隔离或免疫荧光研究。与CD共有154名患者(69名男性,85名女性;年龄18 - 82)和18控制患者(13男5女;年龄18 - 89)被包括在内。CD患者分为反应anti-TNF疗法,如果他们正在anti-TNF疗法(英夫利昔单抗或adalimumab) / 3个月,一个简单的克罗恩病的内镜得分(SES-CD)27 28< 5时的内窥镜检查活检。情况说明定义了SES-CD≥5持续anti-TNF疗法(超过3个月),或者如果手术肠道标本使用有一个节段SES-CD≥5。当前大多数接受定义内窥镜反应在临床试验中减少≥50%的SES-CD得分。29日我们没有在我们的研究能够应用这个定义我们的病人常常没有一个内窥镜检查起始anti-TNF疗法前,作为我们分析没有嵌入式控制的临床试验中。我们可以因此不评估响应基于SES-CD评分在anti-TNF疗法的发展。我们不得不采取SES-CD阈值区分反应持续anti-TNF治疗期间无。作为验证截止值响应人失踪,因为它尚未定义在多远SES-CD得分变化代表临床有意义的结果,我们选择4的CES-CD分数阈值响应。切断在我们看来,这反映了可接受的最低水平轻微内窥镜炎症,我们估计是一个很好的指标在内镜治疗的反应水平。如果临床反应anti-TNF治疗另外定义为评价标准,各自的条件是在文本中。伴随药物的病人包括5-aminosalicylates、布地奈德、糖皮质激素、甲氨蝶呤,6 -巯基嘌呤或硫唑嘌呤。
外周血单核细胞(PBMCs)隔绝62 CD患者(27岁男性,35岁女性;年龄19 - 82岁)和11控制患者(10女,1男;年龄29-54)。分析患者的临床及内镜特点描述在线补充表1。
补充材料
研究样本包括从每个病人获得事先书面知情同意后和样品收集以前经伦理委员会批准的机构审查委员会埃大学。
隔离的RNA和定量实时PCR
RNA从肠活检孤立使用自旋核二世工具包(Macherey-Nagel, Duren,德国)。一微克反转录成RNA的cDNA (iScript;BioRad,慕尼黑,德国)根据制造商的指示。对于定量表达分析,quantitect引物(试剂盒、Venlo、荷兰)。的引物序列BATF被描述。30.数据是正常的看家基因产生Hprt并与对照组没有粘膜炎症图1前,或者各自的表达水平在同一病人在开始治疗图3。
粘膜的几个细胞因子表达水平,患者细胞因子受体和cytokine-inducing转录因子克罗恩病(CD)启动前抗肿瘤坏死因子(TNF)治疗。(A)肠活检最发炎的区域被从anti-TNF-naive CD患者anti-TNF疗法和qPCR启动之前进行。患者分层反应者(n = 8)或无(n = 9 - 11)根据他们的后续临床(减少克罗恩病活动指数> 100分在第12周)和内镜响应(简单内窥镜得分为克罗恩病< 5后续内镜)与adalimumab anti-TNF疗法。数据是正常的看家基因产生Hprt并与对照组没有粘膜炎症。每一个符号代表一个病人。中值显示为一条直线。* * P≤0.01。急救员无没有任何明显的组织学炎症活动开始之前的差异anti-TNF疗法。(B)代表TNFR2免疫荧光染色,CD3和同形像控制肠道cryosections anti-TNF急救员(n = 8)无(n = 7)启动前anti-TNF疗法。酒吧代表10µm规模。 Statistical analyses of the staining. 4–6 high power fields (HPFs) of each sample were analysed. Data represent mean values±SEM. *P≤0.05.
热图的基因显示芯片基于微分IBD相关的易感性和IL23R通路基因的表达在持续抗TNF治疗(A)基因表达谱的孤立LPMCs急救员(n = 3)无(n = 3) anti-TNF CD患者的治疗。显示为一个热图40 IBD易感基因的表达模式和一些另外参与IL23R基因信号(用红色)从微阵列数据,与相应的层次聚类的实验条件(应答或人anti-TNF治疗乳糜泻患者)。结果修正的多个测试Benjamini-Hochberg修正。皮尔森和沃德被用来计算分层聚类的实验条件。每个基因表达数据/行中值归一化表达式的值相应的基因在所有六个样品。(B)独创性通路分析CD anti-TNF反应持续anti-TNF治疗期间无显示细胞因子介导免疫细胞之间的交流的作用。颜色的强度表明upregulation水平(红色)(绿色)各自的差别或对这些细胞因子在anti-TNF anti-TNF相比无反应者。
微阵列实验
RNA从肠活检的患者CD像之前描述的那样被隔离。其完整性验证了使用纳米芯片(RNA 6000;安捷伦科技)生物分析仪(vB.02.03 BSI307;2100;安捷伦科技)推荐的制造商的协议(6000纳米化验Protocol2 RNA)。样品标签和准备微阵列杂交是根据标准协议执行。31日RNA复制三个CD患者内镜或情况说明anti-TNF治疗的反应分别是每个杂交在4×44 K阵列(design-ID 026652;安捷伦科技)。数据提取与特征提取软件包(V.11.7.1;安捷伦科技)使用标准协议。生成的文本文件特征提取软件导入GeneSpring GX (V.12.5;硅遗传学)。数据log2转换正常化的75百分位数和中值修正的样品。功能通过质量检查(旗帜中发现至少一个条件),表达水平的变化等于或超过两个选择进行进一步分析。火山阴谋被应用于确定统计学意义(p > 0.05),超过两个差异表达基因,两个条件,包括Benjamini-Hochberg多个测试修正。皮尔森和沃德被用来生成层次聚类的实验条件(应答或人anti-TNF治疗乳糜泻患者)。 The collected data are deposited in the Gene Expression Omnibus database under the accession number GSE111761.
免疫荧光
Cryo-frozen肠道截面和4%多聚甲醛固定(PFA)和染色使用TSA +工具包(珀金埃尔默,Baesweiler,德国)根据制造商的指示。另外,幻灯片和甲醇固定−20°C 10分钟,阻止10%胎牛血清(FCS) / 1%牛血清白蛋白(BSA) 1小时孵化一夜之间在4°C的主要抗体。石蜡包埋组织deparaffinised和抗原暴露了使用柠檬酸缓冲。阻塞后,幻灯片与TNFR2孵化(研发、明尼阿波利斯,明尼苏达州,美国),pSTAT3(细胞信号传导、莱顿、荷兰),CD3 (BD生物科学、海德堡、德国),ki - 67 (eBioscience,法兰克福,德国)或CD14 (Abcam,剑桥,英国)抗体。从每个样本,3 - 6大功率领域使用×10(高通滤波器)病人进行分析客观的放大。活跃的半胱天冬酶染色,CaspACE FITC-VAD-FMK原位标记(Promega,曼海姆,德国)使用。TUNEL染色的执行PBMCs TUNEL试剂盒(罗氏诊断,曼海姆,德国)。图像分析是用荧光显微镜(bz - 8100或bz - 9000;日本基恩士、Neu-Isenburg、德国)或共焦显微镜(LSM;位于德国徕卡微系统公司)。
孤立的人类从外周血单核细胞和固有层
血液从CD或控制收集和PBMCs患者使用密度梯度离心法分离。固有层单核细胞(LPMCs)肠活检或肠道标本分离使用固有层工具包(Miltenyi研究,Bergisch格拉德巴赫,德国)如前所述。14CD4 + T细胞与磁珠分离根据制造商的指示(Miltenyi研究)。
细胞培养,流式细胞术
细胞培养在庆大霉素的存在和一些设置刺激anti-CD3/28抗体(BD生物科学),13µg /毫升英夫利昔单抗(年会;美国莫尔文),1.3µg /毫升anti-IL23p19 (R&D)或13 ng / mL IL-23 (eBioscience)。IL-23刺激,细胞被孵化1µg /毫升有限合伙人(Sigma-Aldrich、Taufkirchen、德国),100 U /毫升IFN-γheat-fixed (eBioscience)和0.001%金黄色葡萄球菌细胞(囊)(默克密理博,Schwalbach,德国)。细胞凋亡检测的膜联蛋白V /碘化propidium工具包(eBioscience)使用。细胞内染色之前,细胞治疗刺激鸡尾酒包含十四烷酸佛波醇酯(PMA) Golgi-Stop和Ionomycin (eBioscience) 4小时37°C。细胞被固定和permeabilised使用一组转录因子缓冲区(BD生物科学)。细胞被染色,TNFR2 RORγt (BD), CD4 (BD生物科学或Miltenyi研究),CD15, CD11c, CD14, il - 10 (BioLegend) IL-17A, FoxP3, IFN-γ,Tbet (ebioscience), CD14、CD16, CD11c, CD15 (Miltenyi研究),整合素α4 (mac Miltenyi),整合素β7 (BioLegend) IL-23p19或IL23R (R&D)和各自的同形像控制。流式细胞仪分析,流式细胞仪石中剑(BD生物科学)。细胞分析使用FlowJo单细胞分析软件(美国TreeStar阿什兰)。在一些实验中,细胞被刺激与IL-23 72小时(20 ng / mL), il - 6 (25 ng / mL)和/或TGF-β(10 ng / mL) (BD生物科学)、白介素(10 ng / mL) (Immunotools) IL-17 (10 ng / mL) (Immunotools)、肿瘤坏死因子(10 ng / mL) (eBioscience)和IL-21 (50 ng / mL) (eBioscience)。
STAT3激活胞内信号
PBMCs像之前描述的那样被孤立和红细胞被耗尽。接下来,CD4 + T细胞与磁珠分离根据制造商的指示(Miltenyi研究)。CD4 + T细胞在RPMI 1640 Glutamax孵化(Gibco)补充100µMβ-mercaptoethanol(生命技术)60分钟37°C,然后染色对CD4细胞外地。后来,1×106细胞被500年µL prewarmed RPMI 1640 GlutaMax (Gibco),补充与100 U /毫升青霉素/链霉亲和素(Gibco)和10% FCS(σ),要么有或没有孵化20 ng / mL IL-23, 20µg /毫升anti-IL6 (BD生物科学)和2µg /毫升anti-IL22 (R&D)为5分钟37°C。刺激停止,细胞被冷的4%多聚甲醛固定在磷酸缓冲盐(PBS)和孵化在室温下10分钟。与PBS单个洗后,细胞在冰冷的甲醇70% PBS permeabilised 30分钟在冰上。细胞被染色的细胞为30分钟在室温下与抗体特定磷酸化STAT3 (pSTAT3) (BD生物科学。557815)和通过流式细胞术分析。
体外肠道器官培养
肠活检每实验过程(3)从CD患者培养24小时24-well板250µL RPMI 1640 GlutaMax (Gibco)补充100 U /毫升青霉素/链霉亲和素(Gibco)和10% FCS(σ)。活组织检查不及时治疗或25µg /毫升英夫利昔单抗(年会)或25µg /毫升英夫利昔单抗(年会)和20 ng / mL IL-23 (eBioscience)补充道。活检的24-well板被放置在一个器官培养箱(比卢普斯Rothenberg) 37°C O为95%2/ 5%股份有限公司2的气氛。24小时的潜伏期后,LPMCs活检的像之前描述的那样孤立和彩色IL23R(研发),CD4和TNFR2 (BD生物科学)流式细胞术分析。
ELISA
使用IL-23 ELISA进行酶联免疫试剂盒(eBioscience)。测定细胞凋亡,细胞死亡检测ELISA +工具包(罗氏诊断)使用,如果控制的样本结果计算相对。
统计分析
统计分析了使用GraphPad棱镜(美国加州La Jolla GraphPad软件)。测试后的正态分布Shapiro-Wilk正常测试,使用未配对样本之间的显著差异计算学生的学习任务或Mann-Whitney U等级测试(* p≤0.05;* * p≤0.01;* * * p≤0.001)。测试正态分布后,斯皮尔曼相关用于确定相关性不同的标记(< 0.2对应于很低,< 0.5对应于低,< 0.7对应中,< 0.9对应于高> 0.9对应非常高的相关性)。* p≤0.05;* * p≤0.01;* * * p≤0.001。
结果
CD反应anti-TNF治疗显示TNFR2 +肠道T细胞的表达明显高于无起始之前治疗
识别潜在的分子标记预测anti-TNF治疗的临床反应,我们前瞻性地确定一些细胞因子的表达,细胞因子受体和cytokine-inducing转录因子在粘膜活检qPCR anti-TNF-naive CD患者临床(CDAI > 220)和内窥镜(SES-CD≥5)活动性疾病起始之前anti-TNF疗法。随后患者分为临床反应者,如果他们的克罗恩病活动指数(CDAI)减少≥100分12周后anti-TNF疗法。8此外,急救员必须SES-CD < 5在后续内镜持续anti-TNF疗法(3-23个月)。所示图1一个,anti-TNF反应者有显著增加粘膜TNFR2 mRNA表达较治疗前无。其他标记,包括Th17细胞标记,救援人员和无(没有差异图1一个)。蒙蔽组织病理学分析显示无统计差异对粘膜炎症反应和无之间,排除的可能性增加TNFR2表达前者是由于炎症活动的差异。上述患者的免疫荧光染色的粘膜活检证实显著加剧TNFR2表情anti-TNF CD3 + T细胞反应者与无相比之前发起anti-TNF疗法(图1 b)。总的来说,这些发现表明TNFR2表情粘膜T细胞反应的预测后续anti-TNF疗法。
IL23R signalling-dependent基因显著调节在CD相比无反应者持续anti-TNF疗法
我们执行一个数组分析有关分化基因调控概要文件在肠活检的内镜无反应者持续anti-TNF治疗CD。应对anti-TNF患者治疗被定义为一个SES-CD < 5。
CD-susceptible群组内的基因,有显著upregulation与IL23R-dependent信号通路相关的基因在anti-TNF相比无反应者(图2一个)。接下来,聪明才智通路的分析结果是关于细胞因子的表达谱,调节免疫细胞的相互作用。颜色的强度的分析图表表明upregulation水平(红色)(绿色)各自的差别或对这些细胞因子在anti-TNF相比无反应者在持续anti-TNF疗法。然而,IL-23可以确定为其中最调节细胞因子作用于T淋巴细胞(图2 b)。然而,也有其他各种细胞因子的upregulation anti-TNF无,进一步表明分子和复杂的信号通路可能参与调停anti-TNF-treated患者的情况说明。
接下来,我们表达谱特征的细胞因子,细胞因子受体和cytokine-inducing qPCR转录因子的粘膜活检之前和期间anti-TNF疗法在同一患者CD。病人定义为反应或无根据内镜标准,如上所述。这使得成对数据的分析(基线和维护)在同一群反应者无。在这种背景下,anti-TNF-resistant病人显示值的重要upregulation粘膜TNFR2, IL23p19, IL23R和IL17A TGFβmRNA表达水平与急救员anti-TNF治疗期间(图3)。
粘膜表达水平的几个细胞因子、细胞因子受体和cytokine-inducing转录因子在克罗恩病病人持续anti-TNF治疗粘膜活检取自同一CD病人之前和期间发起抗- TNF。应对anti-TNF治疗期间被定义为一个SES-CD < 5的内窥镜检查活检摄下持续anti-TNF治疗。定量rt - pcr分析肠活检的反应(n = 7 - 16)无(n = 6尺11寸)。数据规范化的看家基因产生Hprt和各自的表达水平相比anti-TNF治疗开始前,在每一个病人。基因表达是显示为折叠感应。每一个符号代表一个病人。中值显示为一行* P≤0.05;* * * * * P≤0.01, P≤0.001。
TNFR2 IL23R以及IL17A和IL23R水平显著相关相互反应和无但更高的无组织的。子单元之间有显著相关性p19 p40和p19 IL17A两组,尽管p19之间的相关性和IL17A无价格高(在线补充图1)。
补充材料
肠道TNFR2 + IL23R + T细胞显示混合Th1 / Th17-like表型患者CD
进一步描述TNFR2和IL23R粘膜T细胞的作用,我们进行了比较分析,控制和发炎组织从患者CD。这一分析显示,TNFR2表达明显高于在CD,而IL23R没有(图4一)。肠道TNFR2 +细胞显示显著提高IL23R, IFN-γ和IL-17A相比TNFR2−细胞T-cell-enriched CD患者粘膜细胞(图4 b)。一致,TNFR2 + IL23R + T细胞显示明显高于co-expression IFN-γ和IL-17A (图4 c左面板),Tbet和RORγt (图4 c右面板)与TNFR2-IL23R−T细胞亚型,表明TNFR2 + IL23R +细胞显示混合Th1 / Th17-like表型患者CD。总之,这些发现表明,IL23R表示分组人口的粘膜TNFR2 + T细胞的特点是双重IFN-γ和IL-17A的生产。
粘膜TNFR2 + IL23R +细胞的分子描述患者的克罗恩病(CD)。(一)流仪分析TNFR2在固有层和IL23R细胞表达单核细胞从肠道组织的控制患者(反对;n = 7)和CD患者积极粘膜炎症(CD;n = 9-14)。(B)的定量表达式分析IL23R, IFN-γ和IL-17A TNFR2 +和TNFR2−从CD患者肠道细胞(n = 22-33)。孤立的粘膜细胞流式细胞术分析使用一个淋巴细胞。(C)流仪从CD患者肠道细胞表达分析,表达IFN-γ+ IL17-A +或Tbet + RORγt +细胞在T细胞显示表达TNFR2, IL23R,或者这些受体(n = 9)。流式细胞仪块代表上述表达谱的分析从CD患者肠道细胞。数据代表平均值±SEM。* p≤0.05; **p≤0.01; ***p≤0.001.
积累TNFR2 + IL23R + T细胞的粘膜anti-TNF-resistant CD患者
量化TNFR2 +和IL23R + T细胞的数量在anti-TNF内镜无反应者,我们进行免疫荧光染色和流式细胞仪分析肠活检的患者CD。CD耐火材料持续anti-TNF治疗患者表现出显著增加数量的TNFR2 + CD3 + T细胞粘膜与anti-TNF反应(图5一个)。此外,有一个显著增加肠道T细胞表达激活pSTAT3 anti-TNF相比无反应者。还有一个重要的海拔ki - 67 T细胞表达,表明相比,无增强T细胞增殖反应(图5一个)。
表达TNFR2、IL23R pSTAT3和ki - 67在抗肿瘤坏死因子(TNF)患者治疗克罗恩病(CD)。(A)免疫荧光染色,TNFR2 pSTAT3 ki - 67和CD3进行肠活检的cryosections急救员(n = 8)无(n = 10 - 12) anti-TNF治疗患者CD。酒吧代表7.5µm规模。阳性细胞数在4 - 6大功率领域每张幻灯片(HPFs分区)。统计分析显示double-positive细胞。(B)流仪结果对粘膜的表达TNFR2 + IL23R + CD4 +淋巴细胞在肠道组织的anti-TNF-naive CD患者粘膜炎症(n = 14),以及反应(n = 13)无(n = 16) anti-TNF治疗患者(上左面板)。频率的TNFR2 + IL23R + T细胞anti-TNF治疗同一病人之前和期间anti-TNF急救员(n = 3)无(左下方面板)。代表流式细胞仪图图像显示anti-TNF反应者,无和天真的病人和各自的同形像控制。CD4 +细胞被封闭,TNFR2 + IL23R +细胞评估(右面板)。数据代表平均值±SEM。* p≤0.05; **p≤0.01.
测试是否pSTAT3表达T细胞的增加可能与IL-23水平升高有关,从CD患者CD4 + PBMCs接受IL-23和pSTAT3通过流式细胞仪进行了分析。IL-23-stimulated CD显示患者血液CD4 + T细胞激活的重要upregulation pSTAT3相比,未经处理的细胞。排除其他的可能影响细胞因子对我们的实验设置,我们另外抗体应用il - 6和il - 22生成IL-23-treated细胞。我们能够表明,抑制il - 6和il - 22生成时,以及il - 6和il - 22生成在一起,无法表达下调的高度pSTAT3表达IL-23-treated外周血细胞(在线补充图2)。然而,这并不排除其他细胞因子的分析环境也可能参与观察pSTAT-3超表达。
最后,流式细胞仪分析显示显著增加粘膜TNFR2 + IL23R +表达CD4 + T细胞在anti-TNF无与anti-TNF反应者和anti-TNF-naive CD患者(图5 b上半部分)。接下来我们分析了如果有这些细胞的扩张anti-TNF无。的频率TNFR2 + IL23R + T细胞因此分析anti-TNF疗法之前和期间在同一病人。我们能够证明有统计上显著的增加TNFR2 + IL23R + T细胞只有在anti-TNF无,但没有反应。这些结果表明,TNFR2 + IL23R + T细胞选择性地扩大和积累的粘膜anti-TNF无anti-TNF治疗(图5 b较低的面板)。额外的分析表明,TNFR2 + IL23R + T细胞的增加是独立的一级或二级治疗(在线情况补充图3(在线),或者英夫利昔单抗和adalimumab治疗补充图3 b)。无统计差异同时接触anti-TNF治疗反应之间无(在线补充表1)。
补充材料
扩大IL-23介导gut-tropic IL23R + TNFR2 + CD4 + T细胞在CD患者
然后我们探索的功能角色IL-23肠道T细胞在CD。我们首先调查IL-23可能导致粘膜IL23R表达CD4 + T细胞,IL-23诱导IL23R被发现在人类血液T细胞。32因此我们刺激LPMCs TGF-β的CD患者il - 6 IL-23或所有三个细胞因子的结合,并通过流式细胞仪分析IL23R表达式。刺激与TGF-β,il - 6或IL-23单独或同时导致IL23R相比之下,如果细胞的表达明显高于(图6)。
重要的upregulation gut-tropicα4+β7+ CD4 + IL23R + T细胞在IL-23应用程序。CD4 +固有层(A)患者单核细胞从克罗恩病(CD) (n = 10)与磁珠隔离和不及时治疗或刺激与TGF-β72小时,il - 6 IL-23或所有三个细胞因子的组合。对CD4 +细胞表达IL23R决心通过流式细胞仪分析。(B) CD4 +外周血单核细胞健康对照组(n = 6)或CD患者(n = 13)与磁珠隔离和不及时治疗或刺激与TGF-β72小时,IL23,两者的结合细胞因子,IL12 IL17 IL21或肿瘤坏死因子。对CD4 +细胞表达IL23Rα4−β7−或α4+β7+细胞是由流式细胞仪分析。(C)整肠活检从CD患者在器官培养箱培养24小时在37°C O为95%2/ 5%股份有限公司2的气氛。活检是未经处理的(n = 10)或刺激20 ng / mL IL-23 (n = 10)。对CD4 +细胞表达IL23Rα4−β7−或α4+β7通过流式细胞术+细胞决定。(D)整肠活检从CD患者在器官培养箱培养24小时在37°C O为95%2/ 5%股份有限公司2的气氛。活检是未经处理的,刺激与25µg /毫升anti-TNF抗体抗体+ 20或25µg /毫升anti-TNF ng / mL IL-23。CD4的表达,IL23R TNFR2通过流式细胞仪测定。数据代表平均值±SEM。* p≤0.05;* * p≤0.01;* * * p≤0.001。
接下来我们分析的高度表达是否IL23R上述细胞因子刺激后CD4 + T细胞仅限于CD患者在这个过程是肠道和细胞因子具体多远。患者CD4 + PBMCs从健康对照组或CD和各种细胞因子和IL23R表情刺激血液CD4 + T细胞被流式细胞仪分析。另外细胞被染色的表达式gut-specific整合蛋白α4β7。分析显示,α4 +β7 + CD4 + T细胞刺激后才显示显著高表达的IL23R IL-23 TGF-β或同步应用程序的CD患者。这些重大变化IL23R表达CD患者血液中无法观察到的细胞不表达gut-specific整合蛋白α4β7或任何从健康对照组血液细胞。此外,刺激与il - 12、IL-17 IL-21或TNF并未改变IL23R表达式的分析设置。重大upregulation IL23R只能因此被发现后的应用IL-23或TGF-β,以及IL-23 TGF-β在肠道热带从CD患者T细胞(图6 b)。
进一步评估是否增强IL-23水平导致了粘膜扩大IL23R CD患者CD4 + T细胞,我们管理IL-23肠道器官文化。再次,显著提高CD4 + T细胞表达IL23R相比,如果控制可以观察到(图6 c左面板)。表达式也肠道热带只有α4 +β7 + CD4 + T细胞显示显著增加IL23R表达式与IL-23刺激后(图6 c右面板)。
接下来,IL-23政府的影响有关的表达CD4 + IL23R + TNFR2 + T细胞在肠道器官文化从CD患者在anti-TNF抗体的设置应用程序进行测试。粘膜活检从CD患者接受anti-TNF抗体单独或结合IL-23或不及时治疗。应用anti-TNF一起IL-23导致绝对显著增加细胞数量的CD4 + TNFR2 + IL23R +及CD4 + TNFR2−IL23R +细胞。没有积累的CD4 + T细胞对IL23R不利。此外,CD4 + TNFR2 + IL23R−显示显著减少绝对anti-TNF治疗后细胞数(图6 d)。IL-23 anti-TNF抗体治疗粘膜器官管理文化从CD因此导致扩大患者CD4 + IL23R + TNFR2 +黏膜细胞。
CD14 +肠巨噬细胞的主要生产商IL-23 CD耐火anti-TNF患者治疗
探索潜在的TNFR2 + IL23R +细胞的激活机制,分析了生产IL-23患者CD。我们最初能够表明IL-23生产可以由有限合伙人,囊和IFN-γ培养PBMCs从CD患者(图7)。此外,从CD患者表现出显著高于栽培LPMCs IL-23生产比控制患者(图7 b),这表明差异IL-23生产出现在粘膜免疫隔间。
IL-23生产的血液和肠细胞的患者克罗恩病(CD)。(一)从CD患者外周血单核细胞(n = 16)未经处理或与LPS刺激一夜之间,IFN-γ和囊。IL-23p19水平评估的上层清液中培养细胞。(B) IL-23p19上层清液的浓度培养固有层单核细胞(LPMCs)控制(n = 10)和CD患者(n = 7)。(C)的定量分析IL-23p19表达CD14 + LPMCs控制(n = 8),抗肿瘤坏死因子(TNF)天真的病人(n = 6), anti-TNF急救员(n = 8)或anti-TNF无(n = 10)患者CD(上左面板)。定量分析IL-23p19表达CD16 + CD11c +和CD15 + LPMCs控制(n = 8), anti-TNF急救员(n = 8)或anti-TNF无(n = 10)患者CD(左下方面板)。流式细胞仪分析图像代表的肠巨噬细胞CD14 +控制,反应者无表达IL-23p19(右面板)。(D)代表免疫荧光染色CD14和同形像控制肠道石蜡包埋部分从CD anti-TNF急救员(n = 5)无(n = 7)启动前anti-TNF疗法。3 - 6高功率字段(HPFs分区)每个样本的分析使用×40目的放大。酒吧代表5µm规模。 Statistical analyses of the staining data represent mean values±SEM. *p≤0.05; **p≤0.01; ***p≤0.001.
进一步分析表明,肠道CD14 +巨噬细胞表达更IL-23p19 CD内镜无反应者持续anti-TNF疗法相比,anti-TNF-naive患者或控件(图7 c上半部分)。相比之下,我们不能观察到CD16 + CD11c +或CD15 +细胞anti-TNF无同样能表达高水平的IL-23p19相比,控制或anti-TNF反应(图7 c较低的面板)。
此外,我们发现CD14 +巨噬细胞的数量明显高于anti-TNF无反应者相比肠活检anti-TNF治疗开始前,(图7 d)。反应是由CDAI下降≥100分anti-TNF治疗12周后,SES-CD < 5在后续内镜进行治疗期间(3-23个月)。
IL-23抑制anti-TNF-induced细胞凋亡在固有层从CD患者T细胞
与前面的实验表明,anti-TNF耐火材料CD患者有一个积累IL23R + TNFR2 + t细胞表达数量的粘膜,我们分析了功能相关性的IL-23 anti-TNF-induced粘膜细胞凋亡。因此,T-cell-enriched LPMCs从CD患者种植有或没有IL-23和抗体TNF和IL-23,紧随其后的是流式细胞仪分析。政府anti-TNF或anti-IL23p19抗体诱导细胞凋亡后72小时。此外,添加重组IL-23废除anti-TNF-induced细胞凋亡也导致凋亡细胞与未经处理的LPMCs(相比明显较低图8)。进一步分析表明,添加IL-23能够显著降低的百分比凋亡血液CD4 + T细胞在体外(图8 b)。滴定法研究表明,IL-23 10 - 50 ng / mL的浓度能够减少CD4 + t细胞死亡(图8 c)。
抗肿瘤坏死因子(TNF)的影响和IL-23治疗在血液和细胞凋亡的诱导粘膜细胞。(一个)CD4 +固有层单核细胞(LPMCs)患者CD (n = 15)被孤立,刺激与anti-CD3/28抗体和72小时处理一个anti-TNF anti-TNF anti-IL23p19抗体或抗体结合IL-23重组。通过流式细胞仪分析细胞凋亡分析和CD4 +膜联蛋白V-positive / propidium iodide-negative细胞被用于分析凋亡细胞。代表流式细胞仪治疗LPMCs显示的图像。(B)从CD患者血液CD4 +细胞(n = 15)未经处理或处理IL-23 24小时。细胞凋亡是决定使用TUNEL染色。TUNEL-positive细胞每100细胞是量化和5大功率领域(每个样本HPFs分区)进行分析。酒吧代表10µm规模。(C)CD4 +从CD患者外周血单核细胞分离(n = 6)和细胞治疗或治疗与IL-23在各浓度(10 - 50 ng / mL)为24小时。细胞凋亡分析使用细胞死亡ELISA检测设备。(D)Cryosections肠活检的CD在持续anti-TNF治疗患者CD4和活跃的半胱天冬酶染色和double-positive细胞CD4 + T细胞测定。患者分层反应者(n = 7)或无(n = 14)根据他们简单的内窥镜得分在持续anti-TNF治疗克罗恩病。每张幻灯片4 - 5 HPFs分区进行分析。酒吧代表10µm规模。数据代表平均值±SEM。* p≤0.05;* * p≤0.01;* * * p≤0.001。
在最后一个系列研究中,我们分析了肠道CD4 + T细胞的凋亡率在患者持续anti-TNF疗法。从CD患者活检组织学染色CD4和活跃的半胱天冬酶和double-positive细胞中CD4 + T细胞的比例确定。这些研究显示粘膜CD4 + T细胞的凋亡率明显高于集团的内窥镜anti-TNF反应者与无(图8 d)。
讨论
尽管它非凡的治疗能力,anti-TNF疗法是有效的子组患者CD。7在这项研究中,我们描述潜在的分子机制,导致anti-TNF-resistant CD。我们发现粘膜TNFR2-expressing患者CD4 + T细胞可以通过co-expression IL23R,克服anti-TNF-induced凋亡活性的调节IL-23粘膜CD14 +巨噬细胞的生产。粘膜CD4 + T细胞激活抗凋亡蛋白表达pSTAT3 IL-23刺激后产生大量的Th1和Th17细胞因子。他们积累的粘膜anti-TNF耐火材料CD患者,他们通过IL-23延续慢性肠道炎症刺激(图9)。这些研究结果确定IL-23 anti-TNF耐火材料分子的目标是一种很有前途的治疗患者CD。
模型IL-23-mediated粘膜CD4 + T细胞的抗凋亡抗肿瘤坏死因子(TNF)耐火克罗恩病(CD)。治疗反应,anti-TNF抗体结合mTNF-expressing CD14 +巨噬细胞,从而抑制活化的TNFR2粘膜CD4 + T细胞。由此产生的封锁TNFR2-dependent信号通路最终导致间接诱导细胞凋亡在肠道CD4 + T细胞CD。anti-TNF难治性患者,TNFR2轴承肠道另外表达IL23R CD4 + T细胞。提高生产的IL-23 CD14 +巨噬细胞导致绑定IL23R TNFR2 + CD4 + T细胞和诱导STAT3激活,从而增加T细胞抗凋亡,克服了由anti-TNF抗体诱导细胞凋亡。
尽管各种研究解决潜在的作用机制anti-TNF抗体在炎症性肠病,可能驱动的分子途径anti-TNF阻力仍知之甚少。14 33 34关于免疫标记,药物基因组凋亡指数提出了预测在CD anti-TNF响应。35
在我们的实验中,我们能够表明提高预处理TNFR2在粘膜T细胞表达与anti-TNF治疗后高响应率。TNFR2在粘膜T细胞激活mTNF抑制T细胞凋亡,因此建议anti-TNF抗体的后续治疗效果的关键。14 36-38观察到的相关性TNFR2在肠道T细胞表达符合的一份报告表明,TNFR2在T细胞过度加剧的观察实验结肠炎和粘膜TNFR2 + CD4 + T细胞是有效的关键目标anti-TNF疗法。14 39最后,存在mTNF粘膜细胞在体内成像显示预测后续anti-TNF治疗CD的临床反应,进一步暗示mTNF / TNFR2信号通路代表anti-TNF疗法的一个重要目标。40尽管在粘膜TNFR2表达式的监管机构仍有待确定,它迄今为止描述微生物区系的细胞因子和组件参与TNFR2表达式的严格监管。41-43
为了更好地理解底层的炎症机制anti-TNF耐火患者CD,先前的研究粘膜发炎的细胞因子水平决定的。一项研究使用全基因组转录分析显示IL1B的表达增加,IL17A和S100A8 anti-TNF CD患者没有响应,但也抑制il - 6和IL-23p19水平在所有anti-TNF-treated病人,不管他们对治疗的反应。这些基因的调控无支持冗余的可能性这些炎症介质在维护的作用,至少在anti-TNF无。44另一个最近的出版物显示调节制瘤素M的表达在没有响应UC患者anti-TNF治疗期间,45我们能够确认这些数据队列的患者CD(数据未显示)。加州大学的另一项研究报告显著减少粘膜il - 6的mRNA水平在治疗反应而不是无。46同样的,我们显示il - 6的表达明显高于mRNA anti-TNF难治性患者急救员。此外,各种标记的Th17细胞扩增前病人。最后,我们注意到一个重要的诱导IL-23p19 mRNA和增强IL-23生产肠巨噬细胞在anti-TNF难治性患者,建议IL-23-driven t细胞反应的存在。
粘膜内T细胞群的进一步描述anti-TNF耐火病人显示一个独特的扩张TNFR2 + IL23R + T细胞子集上发起anti-TNF治疗,不能被发现在anti-TNF-naive或没有响应的病人。这个子集显示混合Th1 / Th17-like表型IL-17A加剧,IFN-γ和IL23R Th1-associated和Th17-associated转录因子的表达和表达Tbet RORγt。IL-17A和IFN-γ双重生产T淋巴细胞的存在之前已经报道过在人类炎症性肠病等慢性炎症和自身免疫性疾病如多发性硬化症。47-49然而,随之而来的表达式RORγt和Tbet这些细胞表明他们的Th1 / Th17细胞因子是在转录水平决定的。双重生产TNFR2 IL23R + IL23R + T细胞表达,很可能他们会直接回应IL-23刺激。的确,在实验转移结肠炎,IL-23结肠炎发展至关重要的一代IL-17A + / IFN-γ+黏膜T细胞通过IL23R信号。22
我们接下来研究IL-23 anti-TNF难治性患者的细胞来源。肠道CD14 +巨噬细胞从anti-TNF-resistant患者更高水平的IL-23相比反应者和anti-TNF-naive病人。这些结果与之前的研究相一致,确定CD14 +巨噬细胞作为IL-23强有力的生产商的CD。50进一步的研究表明,显著升高的粘膜CD14 +巨噬细胞已经出现在无起始之前anti-TNF疗法,从而代表的潜在生物标志物IL-23-driven anti-TNF IBD患者难治性疾病。与另一项研究中,然而,我们无法确定tissue-infiltrating CD15 +中性粒细胞的生产商IL-23可能是由于这一事实,研究在新诊断IBD的孩子与成人患者相比在目前的研究。51
调节粘膜IL23R表达式描述了IBD活动性炎症患者在先前的研究中,虽然响应anti-TNF疗法并没有解决。23日24我们可以证明upregulation粘膜IL23R的T细胞的体外诱导的组合Th17-inducing或Th17-perpetuating细胞因子TGF-βIL-23,都是调节在CD患者抗anti-TNF疗法。是描述IL23R upregulation在人类血液中的T细胞可以诱导IL-23孤单。32幼稚T细胞后另外已知上调IL23R il - 6治疗。52额外的研究表明,粘膜anti-TNF T细胞无表达大量的pSTAT3而反应者。这是一个主要依照Th17-like细胞因子环境,IL-23信号通过STAT3主要介导,Th17细胞的发展至关重要。53然而,另外其他细胞因子可能参与STAT-3归纳的过程。
作为先前的研究显示,激活STAT3驱动器T细胞抵抗细胞凋亡在炎症性肠病,我们的研究表明,增加T细胞在anti-TNF无耐反对通过IL-23 T细胞死亡。54同意这个概念,我们可以证明anti-TNF-induced T-cell-enriched粘膜细胞凋亡的CD患者可以完全由IL-23体外抑制。此外,粘膜t细胞凋亡的减少anti-TNF耐火病人观察免疫荧光显示增强t细胞抗凋亡与反应相比,这些病人体内。总的来说,这些发现表明,高水平的IL-23驱动电阻TNFR2 + T细胞粘膜anti-TNF无通过IL23R信号和STAT3激活IL-23封锁可能有效anti-TNF无。我们研究的局限性包括小样本大小和不同范围的内窥镜反应评估。
最近发表的试验表明,risankizumab MEDI2070,特定抑制剂IL-23 p19在CD患者anti-TNF耐火材料非常有效。尽管这些研究并未anti-TNF-naive之间的响应率和anti-TNF-experienced患者相比,这些发现强调我们的概念,IL-23封锁是有效anti-TNF耐火CD。此外,高血清基线血清浓度Th17细胞因子如IL22、细胞因子的表达由IL-23诱导,MEDI2070反应的可能性大,建议目标分子的高表达可能预测治疗的反应,一种机制同样观察到的mTNF anti-TNF-treated病人。25日26日55这表明变化后炎症IL-23 / Th17通路的激活anti-TNF疗法可能主要占IL-23 inhibition-mediated anti-TNF难治性患者的治疗效果。在和谐中,我们可以确定IL-23的司机CD4 + IL23R + TNFR2 +细胞的扩张和抵抗anti-TNF治疗肠道器官文化。IL-23引起生产各种促炎细胞因子的T细胞如IL-17A / F, il - 6和TNF,我们的研究结果还表明,il - 6或IL-17A IL-23的封锁,而不是封锁/ F独自在anti-TNF耐火材料CD可能有效。56相反,我们的研究结果表明,封锁IL-23函数可能增强anti-TNF治疗IBD的功效。然而,观察到的反应率降低anti-TNF-experienced与anti-TNF-naive CD患者通过p40抑制剂联合il - 12 / IL-23封锁ustekinumab需要进一步调查。
同意这个概念,最近的一项研究表明,纯合子IBD的载体可能加大IL23R变异更容易应对anti-TNF疗法比纯合的载体IBD risk-decreasing IL23R变体。55这可能是由于最近描述特定IL23R变异赋予IL-23响应性T细胞的数量减少和衰减的信号通过IL23R和减少STAT3激活,使它们在很大程度上对IL-23信号。57
我们的发现表明扩大apoptosis-resistant TNFR2 + IL23R + T细胞驱动阻力anti-TNF治疗CD。这些双重IFN-γ-producing和IL-17-producing T细胞的识别演示了在CD细胞因子网络的流动性,随着这些细胞明显的发展通过IL-23-driven补偿炎症通路在肿瘤坏死因子的封锁。这个场景让人想起一些人们等化疗药物耐药机制激活的信号通路增加抗凋亡治疗归纳。58我们的研究结果表明,这种耐药机制可能也存在anti-TNF耐火CD患者和需要考虑未来的治疗方法。这些发现IL-23标识为合适的分子目标CD患者细胞因子网络的抗anti-TNF疗法。
补充材料
确认
作者感谢R Spiegl L Sologub M Rakhimova我Zoller-Utz, F Stutz P鼓手和G Gohring-Waldeck优秀的技术援助。我们感谢医学内窥镜检查单位在第一百货,埃尔兰根大学,提供我们样品需要进行这项研究。我们感谢我们的病人参与。
引用
脚注
RA和最惠国分享资深作者。
贡献者海关、乌兰巴托、WD, TR,党卫军,SR, SH, KH MJW, JM,啊,RG, CN, TM,最惠国和RA提供试剂、协议、样品或设计实验;海关、乌兰巴托和WD进行实验;HS、乌兰巴托、最惠国RA设计的研究,分析,讨论,解释数据和写的手稿;最惠国和RA指导工作。
资金这项研究得到了德意志Forschungsgemeinschaft HS (CRC1181项目二氧化碳),CN和风湿性关节炎;KFO257最惠国和RA,通过研究操作格兰特研究国际组织炎性肠道疾病的最惠国,RA和新兴领域大学埃最惠国,RA的倡议。RA的海森堡教授是由德意志Forschungsgemeinschaft。
相互竞争的利益最惠国专家提供科学建议或接收来自以下公司:勃林格,朱利安尼制药,产后抑郁症,胸骨,詹森,先灵葆雅,埃塞克斯的联合,雅培,Abbvie,福尔克,宾得。RA提供科学建议的专家或接收来自以下公司:Abbvie,詹森。
病人的同意不是必需的。
伦理批准伦理审查委员会Friedrich-Alexander-University埃,德国。
出处和同行评议不是委托;外部同行评议。
调整通知本文已经被修正,因为它第一次在网上发布。共享的高级作者声明已被添加。
发表于这部分工作是在消化疾病周在芝加哥(DDW)中所描述的(2017年),美国欧洲胃肠病学周在巴塞罗那(2017)和国会的欧洲克罗恩氏和结肠炎组织在维也纳(ECCO) (2018)。