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摘要
客观的妊娠可能影响IBD的病程。妊娠和IBD都与免疫和肠道微生物的改变有关。然而，IBD患者的免疫和微生物特征在多大程度上受到怀孕的影响尚不清楚。
设计从46名IBD患者(31名克罗恩病(CD)和15名UC)和179名健康对照中收集粪便和血清样本，这些患者在怀孕前、中期和晚期，以及IBD患者的孕前和产后。ELISA法检测外周血细胞因子谱，16S rRNA基因V4区测序进行微生物组分析。
结果IBD患者的促炎血清细胞因子水平在受孕时显著降低。与健康对照组相比，整个怀孕期间白细胞介素(IL)-10和IL-5水平降低，但IL-8和干扰素(IFN γ)水平升高，但细胞因子模式在妊娠期间保持稳定。与健康女性相比，妊娠IBD患者的微生物多样性降低，妊娠早期UC患者与CD患者之间存在显著差异。然而，这些微生物差异在妊娠中后期不再存在。动态模拟显示细胞因子与微生物组成之间存在显著的相互作用。
结论IBD妊娠患者的血清促炎细胞因子水平在受孕时显著提高，IBD患者的肠道微生物多样性在妊娠中后期恢复正常。因此，我们得出结论，怀孕对IBD患者是安全的，甚至可能是有益的。
- 炎症性肠病
- 克罗恩氏病
- 溃疡性结肠炎
- 肠道微生物
- 细胞因子
这是一篇开放获取的文章，根据创作共用属性4.0 Unported (CC BY 4.0)许可证发布，该许可证允许其他人出于任何目的复制、重新分发、重新混合、转换和构建此作品，前提是原始作品被正确引用，提供到许可证的链接，并表明是否进行了更改。看到的:https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/．
数据来自Altmetric.com
本研究的意义
关于这个问题我们已经知道了什么?
怀孕是一种独特的生理状态，在这种状态下，免疫和微生物的变化为女性身体为胎儿着床、生长和营养做准备。
免疫功能障碍和微生物失调是IBD患者的共同特征。
一些免疫疾病在妊娠期间表现出疾病活动性的改善，这表明妊娠诱导的生理变化影响疾病病理。
对于许多IBD患者来说，怀孕与疾病活动和胎儿结局的不确定性有关。
新的发现是什么?
炎性细胞因子(白细胞介素(IL)-6, IL-8, IL-12, IL-17和肿瘤坏死因子(TNF)α)在IBD患者受孕时显著降低。
健康女性在妊娠三个月期间血清细胞因子显示出与妊娠相关的变化，这在妊娠IBD患者中未见。
通过血清细胞因子谱评估的IBD免疫状态是患者特异性的，但不受疾病类型、炎症或妊娠期的影响。
UC和克罗恩病的患者在怀孕前和怀孕早期都表现出疾病表现特异性但低多样性的微生物群。
通过微生物多样性评估的ibd相关生态失调在妊娠中后期消失。
细胞因子与微生物网络和动态分析提供了微生物组、疾病类型、细胞因子谱与妊娠之间相关性的详细数据。
本研究的意义
在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?
从免疫学和微生物学的角度来看，IBD患者怀孕是有益的，可以安全地推荐给患者。
由于妊娠与肠道菌群的变化有关，因此不建议对合并IBD的妊娠进行以微生物为导向的干预(如粪便移植、抗生素或益生菌治疗)。
简介
IBD，包括克罗恩病(CD)和UC，是复杂的多因素疾病。上皮屏障功能受损、环境触发因素、遗传易感性以及对肠道菌群的无效免疫反应导致慢性间歇性肠道炎症。1 2由于IBD影响育龄妇女，IBD患者普遍关心的问题是怀孕将如何影响她们的病程，反过来，疾病将如何影响她们的怀孕和胎儿健康。这些担忧并非没有根据，因为怀孕和怀孕期间的活动性疾病与更糟糕的妊娠结果有关，3 4IBD患者的孩子本身患IBD的风险也会增加5由于遗传风险因素以及亲代环境和微生物因素。6 - 9然而，相反，怀孕对母体IBD病程的影响则不太清楚。在乳糜泻和UC患者中都观察到产后耀斑减少，10 11尽管彼得森对这些数据提出了质疑等，12他们发现UC患者在怀孕和产后发作的风险都增加了。怀孕是一种独特的状态，在这种状态下，激素诱导的生理变化为身体着床、胎儿生长和分娩做准备。发生的变化包括调节免疫功能，以允许主要组织相容性复合体(MHC)不匹配胎儿的发育。13因此，长期以来，人们认为母亲的免疫耐受在整个怀孕期间都在增加;然而，现在越来越清楚的是，免疫状态在怀孕期间波动，以支持不同阶段的不同需求。成功的着床需要在母胎界面处有促炎的Th1环境，随后在妊娠的主要期间向更耐受性的Th2反应转变，在分割前不久再次增加Th1反应的极化。14日15然而，目前尚不清楚胎盘免疫变化在多大程度上实际上转化为能够影响肠道疾病活动性的全身免疫变化，因为令人惊讶的是，很少有研究调查了妊娠不同三个月的外周变化，而且那些确实显示出相互矛盾的结果。16日至18日
除了免疫变化外，研究表明，在健康怀孕期间，肠道微生物组也会发生改变，在妊娠晚期观察到微生物多样性减少，这与代谢性疾病患者的微生物组相似。19虽然我们知道微生物群和免疫系统是密切的相互关系，20目前尚不清楚妊娠期间的免疫和微生物变化是否相关。妊娠晚期粪便微生物群显示具有炎症特征，变形菌门和放线菌门总体增加，这种改变可能有助于分娩所需的炎症环境，并使母体为哺乳所带来的能量需求做好准备。24在非怀孕的IBD患者中，微生物特征的改变已经存在，粪便细菌多样性减少，共生丁酸产生细菌的存在减少(例如，Faecalibacterium prausnitzii)和变形菌门和放线菌门丰度的增加被报道为一些最一致的发现。25日- 27日IBD患者妊娠是否进一步调节肠道菌群，以及妊娠期间微生物的变化是否与疾病状态有关，目前尚不清楚。
虽然怀孕明显影响了IBD中许多不受调控的生理过程，但我们对怀孕期间IBD患者的免疫和微生物特征知之甚少。在这里，我们比较了患有IBD的妊娠患者和健康对照组的外周血细胞因子模式和粪便微生物组，并表明与健康对照组不同，IBD妊娠在我们的队列中并没有伴有外周血细胞因子模式的重大变化。此外，UC和CD患者以及IBD患者与对照组之间存在的微生物多样性差异在怀孕期间消失。
材料与方法
病人招聘
2014年3月至2016年6月期间，在鹿特丹伊拉斯谟MC大学医学中心孕前门诊就诊的诊断为IBD的妇女被要求捐献妊娠第一、第二和第三个月(T1-T3)的粪便和血清，其中可能的样本也在孕前和产后获得(NL47357.078.13荷兰医学伦理委员会)。排除标准包括不能提供同意。对于IBD患者，记录了疾病类型、手术史、诊断年龄和纳入年龄，以及每个样本收集时间点的药物使用、疾病发作(由临床医生根据临床结果、粪便钙保护蛋白和/或内窥镜检查进行评估)和疾病活动评分(CD的Harvey Bradshaw指数(HBI))28UC和ibd未分类的简单临床结肠炎活性指数(SCCAI)29被指出。Healthy controls were recruited at Rabin Medical Center, Petah- Tikva, Israel (Institutional Review Board Approval number 0263-15-RMC and 0608-18-RMC) and in Clalit HMO clinics at Petah-Tikva district Israel (Approval number 0135-15-COM). Following recruitment, participants provided blood and faecal samples at T1, T2 and T3. All procedures used for collection were in accordance with National Institutes of Health Human Microbiome Project standards.30.所有参与者签署知情同意书。
样品制备及测序
根据制造商的说明，使用Power Soil DNA分离试剂盒(MoBio, Carlsbad, USA)从健康孕妇的0.25 g粪便中提取DNA，并进行2分钟的打珠步骤(Biospec, Bartlesville, Oklahoma, USA)。从患有IBD的孕妇中，使用PureLink Microbiome DNA纯化试剂盒(Invitrogen, Carlsbad, California, USA)在打珠2分钟后提取细菌DNA。根据地球微生物组计划(Earth Microbiome Project)协议，使用515F和806R条形码引物从提取的DNA中扩增出细菌16S rRNA基因的V4区。31每个PCR反应由2µL 515F引物(10µM)、2µL 806R引物(10µM)、25µL prime star max PCR mix (Takara, Mountain View, California, USA)、17µL超纯水和4µL样本DNA组成。DNA扩增包括初始变性步骤(95°C) 3min，然后变性(98°C, 10s)，退火(55°C, 5s)和延伸(72°C, 20s) 30个循环，最后延伸步骤(72°C, 1min)。扩增子用AMPure磁珠(Beckman Coulter, Brea, California, USA)纯化，DNA浓度用Qubit dsDNA HS法(Thermo Fisher, Bartlesville, Oklahoma, USA)定量。然后以等浓度(50 ng/µL)混合样品，并再次使用2% E-Gel (Invitrogen)纯化。使用NucleoSpin Gel和PCR cleanup (machery - nagel, Düren，德国)纯化适当大小的DNA片段，并使用以色列Bar-Ilan大学Azrieli医学院基因组中心的Illumina MiSeq平台进行测序。
微生物分析
采用QIIME2进行数据分析。32对序列读段进行解复用，并用分裂扩增子去噪算法对序列读段进行纠错。33利用Greengenes参考数据库构建了系统发育树，并对其特征进行了分类。34基于包含至少5928个序列的样本特征表计算Alpha和beta多样性度量。丰富度和均匀度(alpha多样性参数)是用信仰的系统发育多样性计算的，35香农多样性指数和Pielou均匀性指数。36对于样本多样性(beta多样性)之间，计算加权和未加权UniFrac距离。37利用线性判别分析效应量(LEfSe)对过度表征和不足表征特征进行识别。38
正常化
特征被合并到属水平，通过平均所有特征分配到同一属。考虑到特征值的巨大变化，我们通过给每个特征级别(0.01)添加一个最小值并计算每个值的10基对数，将这些值转换为Z分数。然后对表进行统计美白，去掉平均值，除以每个特征的SD。每个归一化细菌在每个时间点上的平均值是为了去除时间对样品的影响。
机器学习
在16S rRNA特征表的归一化和合并版本上进行无监督学习，以识别数据中的模式。主成分分析(PCA)使用Python 3.5版本及其包sklearn进行。双尾p值小于0.05被认为有统计学意义。线性支持向量机使用40个支持向量将UC患者与CD患者进行分类。执行省略一项交叉验证。框约束值为1。由于样本数量有限，没有使用更复杂的方法来限制过拟合。
ELISA
在血清分离管中采集血液(BD Bioscience, Mississauga, Ontario, Canada)。为避免重复冻融循环，对血清进行混叠处理，并在- 80°C保存，直至分析。白细胞介素(IL)-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17, IL-21, TNFα和IFNγ使用试剂盒根据制造商的方案(Ready-SET-Go!eBioscience，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国)。当血清不足时，测量细胞因子的一个子集。细胞因子数据的PCA使用ClustVis进行可视化。39对行进行单位方差缩放;主成分的计算采用奇异值分解加imputation法。X轴和Y轴表示主成分1，主成分预测椭圆是这样的，来自同一组的新观测将落在椭圆内，概率为0.95。采用Shapiro-Wilk检验检验数据分布正态性。采用Wilcoxon配对检验比较孕前细胞因子水平与个体妊娠期的差异。通过方差分析(Friedman检验)比较细胞因子在妊娠三个月间随时间变化的模式，然后进行Dunn的多重比较事后分析。通过Mann-Whitney检验分析IBD患者与对照组或UC患者与CD患者之间每个时间点的比较。热图可视化使用CIMminer进行。40
细胞因子微生物网络及动态分析
我们通过计算以下每两个时间点细胞因子水平和细菌对数频率的变化，并测试三个相关性，建立了一个动态模型:
点1的细菌(对数)水平与点1和点2之间细胞因子变化之间的相关性。
点1的细胞因子水平与点1和点2之间细菌(log)水平的变化之间的相关性。
点1的细菌(log)水平与点1和点2之间细菌(log)水平变化之间的相关性。
然后我们进行了同样的分析，但对细菌进行了打乱。我们计算了置乱集中Pearson系数的最小p值为0.01左右，因此在所有比较中使用0.01作为最小值。Benjamini-Hochberg校正产生了类似的结果，但可能不适合在这里，因为数据不是正态分布。
结果
患者和对照组的特征
我们首先确定了IBD妊娠患者和正常妊娠对照组的基本特征。微生物组分析包括46例患者和179例对照组(表1)．IBD患者和对照组在受孕时年龄相似，分娩方式相似。IBD女性更多地使用辅助生殖技术(p<0.0001)，并且更多地出现初产(p<0.0001)。3例IBD患者在妊娠晚期因尿路或皮肤感染使用了抗生素，其中1例在妊娠早期也使用了抗生素。2例患者在妊娠3个月(T3)发生死产。对于细胞因子水平，研究人员分析了33名IBD患者和40名对照组的亚组(表2)．在该亚组中，与对照组相比，IBD女性在受孕时更年轻(p>0.0001)，具有更高的身体质量指数(BMI) (p=0.002)，并且更多的是初产(p<0.0001)。IBD患者和对照组的分娩方式和分娩结局相似。具体的患者特征在网上总结表S1和S2．在怀孕前使用生物药物的19例患者中，68%的患者在妊娠中期(T2)后停止使用这种药物。妊娠期间发作次数(由临床医生评估，或基于临床结果、粪便钙保护素和/或内窥镜检查)在妊娠过程中没有变化，CD的HBI或UC/IBD的SCCAI也没有分类。我们的结论是，我们的研究小组可以在IBD患者和健康对照之间进行有意义的免疫状态和微生物组谱比较。
IBD患者的促炎细胞因子水平在受孕时下降，在怀孕期间保持稳定和患者特异性
虽然已在未怀孕的IBD患者中描述了血清细胞因子模式的改变，但目前尚不清楚这些模式是否受IBD患者妊娠的调节。因此，我们首先比较了16例IBD患者(12例CD患者和4例UC患者)孕前和妊娠三个月期间血清中IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21、TNFα和IFNγ水平。这些样本的PCA分析表明，CD和UC患者的细胞因子总体谱非常相似，炎症期间采集的样本没有单独聚集(图1一个)．随后，我们调查了怀孕期间与怀孕前比较的单个细胞因子水平。图1 b结果表明，妊娠后血清IL-6 (p=0.005, p=0.027, T1 - 3组p=0.012)、IL-8 (T1组p=0.042, T3组p=0.012)、IL-12 (T2组p=0.034)、IL-17 (T2组p=0.0078)和TNFα (T2组p=0.039)水平显著降低。相反，从孕前到T1, IL-10增加，但不显著。
在UC和CD患者中，促炎细胞因子血清水平在受孕时下降，并在怀孕期间保持稳定。(A)主坐标分析显示UC患者和CD患者在怀孕期间没有整体细胞因子变化。(B)单个细胞因子的中位数水平用颜色梯度表示，绿色表示怀孕期间的最低值，红色表示最高值。与怀孕前相比，怀孕期间观察到几种促炎细胞因子水平显著降低(用星号表示)。除了TNFα外，当单独分析CD患者时，也看到了类似的显著下降(未显示)。(C) CD和UC患者三个月个体细胞因子的比较。显示中位数和IQR。UC患者在不同妊娠期观察到IL-12和IL-21的显著差异(Friedman检验，虚线表示)。UC患者和CD患者在特定三个月的IL-9和IFNγ差异显著(Mann-Whitney试验，实线表示)。CD，克罗恩病;IL,白介素。
接下来，我们在更大的一组患者(25 CD, 8 UC，所有测量，见在线)中进一步探讨了妊娠三个月期间IBD患者细胞因子的变化图S1)．只有UC患者的IL-12和IL-21，以及CD患者的IFNγ在怀孕的不同三个月表现出适度的调节(图1 c， p=0.0375, p=0.0469, p=0.0302)。C反应蛋白(CRP)水平在怀孕期间增加(在线补充图S1)，证实了早期的报告，即CRP不能可靠地用作妊娠晚期疾病活动标志物。40CD患者和UC患者之间的直接比较表明，CD患者的IL-9和IFNγ水平低于UC患者在妊娠中期(p=0.0272和p=0.0201)和妊娠晚期(p=0.0361和p=0.0388)。
怀孕期间药物使用的变化。最值得注意的是，抗肿瘤坏死因子α的使用在T3下降，更多的患者在这个时间点根本不使用药物(在线补充图S2A)．5-氨基水杨酸(ASA)和巯基嘌呤的使用量没有随时间波动。PCA表明，不同的治疗方法与细胞因子谱的整体改变无关(在线补充图开通)．接下来，我们调查了治疗是否会影响个体血清细胞因子水平。方差分析显示，在细胞因子表达方面，不同治疗方案之间没有总体差异图S2C)．然而，与未用药的患者相比，服用5-ASA的患者IL-10 (p=0.0267)和IL-17 (p=0.0428)水平较低。与未治疗的患者相比，抗tnf α单一治疗的患者IL-8水平显著降低(p=0.001)。在我们的队列中，停止抗tnf α的患者没有一例出现耀斑。总体而言，聚类分析显示，样本的分组更多地依赖于患者个体，而不是疾病表现、是否存在肠道炎症以及获得样本的妊娠期或使用的药物(在线补充)图S3)．因此，IBD患者的血清促炎细胞因子水平(以及整体免疫状态)在受孕时下降，在怀孕期间相对稳定。
IL-10和IL-6细胞因子水平在健康孕妇中随着时间的推移而增加，但在IBD中没有
接下来，我们调查了IBD患者和健康对照组在怀孕期间血清细胞因子水平的表现是否不同。主成分分析表明，在健康妊娠中，细胞因子的总体分布不随时间变化(图2一个)，并且当比较IBD患者和对照组时，该小组的整体细胞因子谱相似(图2 b)．然而，对单个细胞因子的分析显示，健康孕妇的血清IL-6、IL-10和TNFα水平在三个月内发生了显著变化(图2 c， p=0.0124, p=0.0458, p=0.0030)。最值得注意的是，在健康对照组中，IL-6和IL-10水平均在妊娠晚期显著上调。然而，在患有IBD的妊娠患者中没有发现这种上调，IL-10水平在妊娠中期和晚期明显落后于健康对照组(p=0.0385和p=0.0016)。此外，IBD患者在整个怀孕期间IL-5水平显著降低(T1 p=0.0194, T2 p=0.0368, T3 p=0.0228)。相比之下，与对照组相比，IL-8和IFNγ水平升高(IL-8: p<0.0001, p=0.0002和p=0.0003, T1和T3 IFNγ: p=0.0443, T3 p=0.0130)。IBD患者在整个怀孕期间仅表现出IL-9水平的总体差异(p=0.0326)。因此，健康女性的怀孕与外周血细胞因子的特定变化有关，而这些变化在预期患有IBD的患者中似乎基本不存在。
在健康对照组中，IL-6和IL-10血清水平在怀孕期间升高，而IBD患者则没有。(A)主坐标分析(PCA)显示在健康怀孕期间缺乏整体细胞因子变化。(B)主成分分析显示，IBD患者和对照组之间的整体细胞因子模式不会单独聚类。来自妊娠第一、第二和第三个月的样本被纳入分析。(C) IBD患者与健康对照组三个孕期个体细胞因子的比较。显示中位数和IQR。在不同妊娠期的健康对照组中，IL-6、IL-10和TNF-α以及IBD患者的IL-9均存在显著差异(Friedman检验，用虚线表示)。IBD患者与健康对照组在特定三个月的IL-5、IL-8、IL-10和IFNγ (Mann-Whitney试验，用实线表示)有显著差异。IL,白介素。
患有IBD的孕妇的微生物群在CD和UC患者之间是不同的，并且受CD中疾病位置的影响
然后，我们分析了所有患有IBD的患者在整个怀孕期间的微生物群。Beta多样性(样本间)分析未显示与不同时间点或抗生素使用有关的任何显著差异(图3 a, B)．丰富性(图3 c)和均匀度(图3 d)，分别由Faith的PD和Pielou测量，随着时间的推移也没有显著差异。当观察相对丰度时(图3 e)，厚壁菌门(Firmicutes)随着怀孕的进展而增加，放线菌门(Actinobacteria)和疣菌门(Verrucomicrobia)则减少，但不明显。
IBD患者的微生物多样性参数在整个怀孕期间没有变化。收集IBD患者在怀孕前、妊娠早期、妊娠中期、妊娠晚期和产后5个时间点的粪便样本(分别为27、27、21、36和19个样本)。(A和B) β-多样性，使用未加权(A)和加权(B) UniFrac距离的主坐标分析。黑色箭头指向使用抗生素的患者样本。(C和D) α-多样性，使用Faith的系统发育多样性(C)和Pielou的均匀度图(D)测量。(E)门水平分类图。
图4总结了乳糜泻女性和UC女性之间的差异。当对CD和UC患者进行分类时，测试结果的曲线下面积为0.75，表明微生物组反映了疾病类型(图4一)．细菌的光谱聚类显示CD和UC患者之间细菌群落的差异(图4 b)，更具体的分析显示，在两种疾病中表现不同的几种细菌存在显著差异(图4 c)．例如,甲烷细菌属，氨基酸球菌属而且Akkermansia作为YS2目的未分类成员和Clostridia纲的未分类成员，均与CD微生物组呈正相关，与UC微生物组呈负相关。Odoribacter而一种未分类的Peptococcaceae家族成员则表现出相反的行为(图4 c)．
CD患者与UC患者的整体微生物组组成不同。(A) UC (n=41)与CD (n=89)分类的ROC曲线。(B)基于UC和CD细菌差异的细菌光谱聚类。(C) UC和CD细菌差异显著，p<0.05。标记的数值为平均值(10Log)值为每组中每个细菌。CD，克罗恩病;ROC，受试者工作特征。
在确定UC和CD患者的微生物特征是不同的之后，我们接下来询问CD患者的疾病位置是否也会影响微生物组成。未加权UniFrac显示结肠和非结肠疾病患者的粪便微生物组有显著差异(p=0.011) (图5一个)．此外，我们还发现了显著的特征差异。在完全性结肠疾病患者中，表现为双歧杆菌属，Turicibacter，梭状芽胞杆菌，Oscillospira而且Diallster非常丰富。在回肠或回结肠疾病患者中，这些特征Methanobrevibacter而且瘤胃球菌属更丰富(图5 b)．利用Pielou的均匀度图(p=0.02)和Shannon的多样性指数(0.043)，结肠疾病患者样本的Alpha多样性较高(图5 c, D)．CD患者的结肠疾病与UC疾病不相似:将结肠和非结肠CD患者样本与UC样本进行比较时，发现了显著差异(UniFrac beta多样性差异未加权，p＝分别为0.035和p=0.028，数据未显示)。
患有结肠疾病的CD患者的微生物群与非结肠疾病患者不同。根据疾病部位将CD患者分为:结肠(n=24)和非结肠(n=65)。(A)未加权UniFrac距离主坐标分析β-多样性(p=0.011) (B) LEfSe分析各类群中有显著丰富的类群。(C和D) α-多样性采用(C) Pielou的均匀度图(p=0.02)和(D) Shannon的多样性指数(p=0.043)。LEfSe，线性判别分析效应大小。
在比较UC和CD患者在特定时间点的差异时，未加权和加权UniFrac (图6 a, B)，但不是在T1, T2或T3或妊娠后(数据未显示)。基于LDA评分的LEfSe分析突出了每个时间点的显著特征(图6 c g)．在怀孕开始前，UC妇女有较高的丰度双歧杆菌adolescentis与患有乳糜泻的女性相比，她们的维生素d丰度更高瘤胃球菌属gnavus而且大肠杆菌（图6 c)．在怀孕早期，UC妇女有过多的代表性拟杆菌caccae还有属Odoribacter而患有乳糜泻的女性则增加了Blautia obeum（图6 d)．高水平的大肠杆菌在患有乳糜泻的孕前妇女中再次出现。患有UC的女性具有更高水平的该属放线菌，Anaerostipes而且韦永氏球菌属（图6 e)．韦永氏球菌属T3在这些女性中也显著高于T3，并且伴随着更高的丰度Blautia与T3中CD菌群的含量相比，T3中CD菌群的含量较高f . prausnitzii而且瘤胃球菌属bromii（图6 f)．r . bromii在怀孕后(乳糜泻患者中)仍然过高，与之相反拟杆菌ovatus，链球菌和一种未分类的Lachnospiraceae成员(T3含量也更高)在产后UC妇女中增加(图6克)．以质心为基础的群集图(图6 h)可以直观地显示两种IBD状态之间的差异，以及在与怀孕有关的不同时间点观察到的差异。
CD和UC患者的微生物群落在每个时间点以不同的物种为主。(A和B) β多样性，使用孕前样本的未加权(A)和加权(B) UniFrac距离的主坐标分析(p=0.041) (CD n=16, UC n=11)。(C - G)使用LEfSe获得的孕前(C)、第一(CD n=19, UC n=8) (D)、第二(CD n=16, UC n=5) (E)、第三(CD n=25, UC n=11) (F)孕中期和产后(CD n=13, UC n=6) (G)肠道微生物群显著差异丰度的分支图。(H)基于UC和CD之间的差异以及所有三个月的细菌谱聚类。CD，克罗恩病;LEfSe，线性判别分析效应大小。
炎症和药物对妊娠期IBD患者微生物特征的影响
研究人员还分别分析了CD和UC患者在怀孕期间经历过耀斑的患者与没有经历过耀斑的患者微生物群的差异。患有乳糜泻的孕妇细菌的均匀度(p=0.025)和丰富度(p=0.03，图7)。LEfSe分析表明，有几个特征在患有耀斑的女性中表现过度。这些措施包括Collinsella aerofaciens，拟杆菌ovatus，Dorea formicigenerans，Bilophila和拟杆菌门(图7 b)．对于UC患者，在丰富性和均匀性测量中没有发现显著差异(在线图S4A B)，尽管LEfSe分析表明，患有耀斑的女性有更高的相对丰度Odoribacter，Bilophila而且Parabacteroides distasonis，而那些没有遭受过耀斑的女性的微生物群丰富Coprococcus，毛螺菌属而且f . prausnitzii．
乳糜泻患者的微生物群在发作时有所不同。患者根据妊娠期间发作的患者(8个样本)与疾病稳定的患者(51个样本)进行了划分，并根据IBD药物进行了划分:口服和口服5-ASA，免疫抑制剂，生物制剂和不用药(分别为3个，14个，12个和23个样本)。(A) α-多样性使用Pielou的均匀度图(p=0.025)和Shannon的多样性指数测量(p=0.03)比较耀斑和无耀斑样本。(B和C)使用LEfSe按耀斑发生(B)或IBD用药(C)获得的微生物类群显著差异的分支图。CD，克罗恩病。
接下来，我们分析了不同药物对微生物群的影响。LEfSe分析揭示了不同处理之间的多个不同特征，总结在图7 c．有趣的是,Coprococcus卡图斯而且瘤胃球菌属扭矩在没有接受任何药物治疗的乳糜泻女性中所占比例过高。UC患者的不同治疗方法差异无统计学意义。我们还研究了BMI对β-多样性和α-多样性的影响，未观察到任何影响。然而，我们确实发现了两个不同的类群(Dorea formicigeneransBMI <25和r . bromiiBMI >25，数据未显示)。
胎次影响妊娠IBD患者的微生物群
与未产妇女相比，经产IBD妇女的微生物组在未加权和加权UniFrac中β多样性表现出显著差异(p=0.027和p=0.045) (图8 a, B)．此外，未生育患者的细菌丰富度较高(图8 c)．通过LEfSe分析发现，一些特征在未分娩的样本中高度丰富，如Anaerostipes而且Oscillospira．然而,拟杆菌而且Bilophila在多产产妇中更为丰富(图8 d)．在有过或没有生过孩子的IBD女性之间，细胞因子模式没有发现差异(未显示)。
多胎妊娠的微生物群不同于未产妊娠。妊娠期间收集的粪便样本根据患者既往妊娠情况分为未产妇(n=67)和多产妇(n=17)。(A和B) β-多样性，使用未加权(A)和加权(B) UniFrac距离的主坐标分析(p=0.027和p=0.045)。(C) α-多样性利用Faith的系统发育多样性(p=0.017)。(D)通过LEfSe分析，不同类群中不同数量的类群。
来自患有IBD的孕妇患者的微生物组比健康孕妇对照组的微生物组更少，但更相似
由于这两个队列来自不同的国家，使用不同的试剂盒提取，我们只比较了多样性指数，因为我们之前已经证明了这是一个有效的策略。19IBD患者的微生物群彼此之间更相似(beta多样性)，无论是通过未加权(图9；p=0.001)和加权UniFrac (图9 b；P =0.001)高于健康对照组。IBD患者也有较低的细菌丰富度(由Faith 's PD测量)。图9 c；p<0.001)和用Pielou均匀度(图9 d；p = 0.008)。我们还比较了每三个月的alpha多样性差异。与对照组相比，IBD患者T1的细菌丰富度显著降低(图9 e；p=0.001)，这甚至可能被低估，因为IBD患者也更常无产，且无产与这些患者中更高的α多样性相关。这种影响在怀孕后期消失。排除合并症并没有改变这些结果。
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IBD患者的微生物群比健康对照组更均匀。IBD(130个样本)和对照组(236个样本)孕妇肠道微生物群的比较。(A和B)未加权(A)和加权(B) UniFrac距离的beta多样性(p=0.001)。(C和D) α-多样性使用(C) Faith的系统发育多样性(p<0.0001)和(D) Pielou的均匀度图(p=0.008)测量。(E)通过妊娠三个月比较IBD和对照样本的Faith的系统发育多样性(p=0.0004)。
细胞因子微生物网络及动态分析
总结于图10，Sutterella是细菌网络的中心。这意味着多种特征的丰度与的丰度的增加呈正相关Sutterella在稍后的时间点。我们还观察到细菌之间的负相关，例如，细菌的丰度Faecalibacterium的含量下降有关Roseburia在第二个时间点。当模拟细胞因子水平和细菌丰度之间的相互作用时，我们再次观察到正相关和负相关。例如，IL-9和IL-17的水平均与Rikenellaceae未分类属的丰度下降相关，而IL-5与Rikenellaceae未分类属的丰度增加正相关Akkermansia而且瘤胃球菌属．总的来说，这些分析提供了丰富的数据，详细说明了微生物组、疾病类型、细胞因子谱和怀孕之间的相关性。
源节点当前值与目标节点值变化的相关性。粗绿色箭头代表正相关，而细红色箭头代表负相关。一个灰色的圆箭头表示特征的当前值与未来变化之间的相关性。细胞因子用红色节点标记。
讨论
正常怀孕与激素、微生物和免疫的变化有关，这些变化为母体成功分娩做好了准备。有趣的是，一些自身免疫性疾病，包括类风湿关节炎和多发性硬化症，在怀孕期间表现出改善，而产后复发的风险增加。14 - 16这表明妊娠诱导的生理变化会影响外周部位的免疫过程，并且已经提出treg水平的增加和向Th2细胞因子模式的转变有助于改善th1驱动的疾病41 42相反，也在th2驱动的炎症疾病如妊娠期系统性红斑狼疮的恶化中发挥作用。43 44CD通常被认为是一种Th1/Th17疾病，而UC更多是由Th2/Th17驱动的，这可能解释了在怀孕期间观察到的这些类型的IBD之间的疾病模式的差异。10然而，令人惊讶的是，尽管对其他细胞因子的共识很少，但在健康女性中最一致的发现之一是，从怀孕早期到晚期，外周血IL-6(通常被认为是Th1细胞因子)水平不断上升。18 45-47我们自己的研究结果证实，在健康怀孕期间，细胞因子模式从T1到T3的变化是存在的。然而，我们在怀孕期间观察到的变化不可能归因于Th2细胞因子(如IL-4、IL-5和IL-13)或通常与Th1反应相关的细胞因子(IFNγ和TNFα)。虽然我们在健康女性妊娠晚期观察到IL-6水平升高和TNFα表达降低，但这两种情况都归因于Th1和Th2细胞以及一系列其他细胞类型。48因此，根据我们的数据，怀孕期间明显的Th2转变不太可能改善(自身)免疫疾病。然而，在目前的研究中，我们确实表明几种已知在IBD病理生理学中起作用的促炎细胞因子(IL-6, IL-8, IL-12, IL-17和TNFα)，49个50这表明妊娠降低了IBD患者炎症的免疫参数。在怀孕期间，IBD患者的血清细胞因子水平随后保持相对稳定，在整个三个月期间，与对照组相比，IL-5和IL-10水平降低，IL-8和IFNγ水平升高。总的来说，IBD患者的免疫状态似乎在怀孕期间有所改善。
以前曾报道过乳糜泻和UC微生物群的差异，51因此，在本研究中，我们可以仅根据曲线下面积(area under the curve, AUC)为0.75的微生物群来区分CD和UC。在这里，我们研究了怀孕对UC和CD微生物群的影响，因为我们知道怀孕会影响微生物群。CD和UC患者的微生物群落在整个怀孕期间都保持不同。然而，虽然在怀孕前，UC和CD患者之间的β多样性有所不同，但怀孕的开始导致了β多样性的转变，这导致微生物群落表现出相似的多样性。总的来说，似乎随着怀孕的进展，细菌特征的变化变得更加微妙(图6 h)，表明怀孕对微生物差异有抑制作用。事实上，很少有患者在怀孕期间出现疾病复发。那些乳糜泻患者经历耀斑时，其微生物群的多样性和均匀分布明显低于未经历耀斑的乳糜泻患者。在属水平上，在CD和UC患者中唯一增加的属在怀孕期间任何时候都有发作Bilophila，在炎症和病理情况下，如炎症性疾病和阑尾炎，其含量会增加52并被认为参与了IBD的启动。53然而，丁酸盐产生f . prausnitzii在无复发的UC患者中比例过高。f . prausnitzii被认为具有抗炎特性，可能有助于抑制炎症扩散过程，甚至被认为在IBD中具有临床潜力。54
在疾病和妊娠中观察到的两个主要微生物组特征是较低的α多样性和较大的β多样性。19 55IBD与健康菌群的比较显示，IBD菌群的多样性低于健康对照组，甚至低于健康对照组。在IBD患者中这种低多样性的趋势之前已经有报道51 56这是意料之中的。令我们惊讶的是，我们观察到IBD微生物群落彼此更相似(beta多样性更低)，这表明同一物种在大多数患者的疾病期间正在消失。我们无法确定这两个队列中哪些细菌不同，因为这两个队列来自不同的国家，DNA是使用不同的方案分离的，我们之前已经表明，通过不同方法提取的样本仍然显示相同的多样性模式，但可能在特征水平上发生变化。19然而，我们之前已经证明，健康女性在怀孕期间微生物多样性会下降。19事实上，在怀孕早期，IBD患者和对照组之间的alpha多样性有所不同，但在妊娠后期有所下降，这表明IBD患者在怀孕后，除了已经改变的微生物组成之外，并没有出现额外的多样性损失。
为了建立动态模型，我们测试了两个时间点之间细胞因子或细菌对数水平的变化与初始时间内所有细胞因子和细菌对数表达值的相关性。虽然这些相关性并不是因果关系的明确证据，因为共同的因果关系可能会破坏因果关系，但它们提供了一阶动态模型。最有趣的是Sutterella与其他几种细菌相关，其数量也有所增加。Sutterella与健康对照组相比，IBD患者的胆固醇含量有所增加。57之间的负相关OscillospiraIFNγ先前在小鼠中也有报道。58Oscillospira是一种已知的丁酸酯生产者，已被证明在炎症状态下减少。59之间的相互作用Oscillospira而且放线菌值得一提的是，在IBD中，第一个被描述为减少，57而后者则在IBD患者中增加。60的丰度之间的联系Faecalibacterium而且RoseburiaIBD之前也有描述，61但我们的模型表明Faecalibacterium是否与Roseburia．
因此，总的来说，这些数据表明，妊娠期IBD患者的免疫参数有所改善，而微生物多样性则恢复到健康妊娠时的水平。
参考文献
脚注
JG和DB的贡献相当。
OK和GMF贡献相同。
贡献者JvdG、DB、SF、KT-G和EH采集数据;JvdG、DB、AB、YL、OK和GMF对数据进行分析。可以和GMF起草稿件。CJvdW和MPP对研究进行了概念化，并对手稿提供了关键的输入。
资金作者没有从任何公共、商业或非营利部门的资助机构宣布对这项研究的具体资助。
相互竞争的利益没有宣布。
伦理批准在以色列佩塔提克瓦拉宾医疗中心(机构审查委员会批准号0263-15-RMC和0608-18-RMC)和以色列佩塔提克瓦区Clalit HMO诊所(批准号0135-15-COM)招募健康对照。
出处和同行评审不是委托;外部同行评审。
患者发表同意书不是必需的。