条文本
PDF
摘要
客观的先兆子痫(PE)是使妊娠复杂化的恶性代谢性疾病之一。肠道生态失调已被确定为引起代谢性疾病，但肠道微生物组在PE发病机制中的作用尚不清楚。
设计我们进行了一项病例对照研究，通过16S核糖体RNA (rRNA)测序比较PE和正常血压孕妇的粪便微生物群。为了解决肠道生态失调和PE之间的因果关系，我们在抗生素治疗的小鼠模型中使用粪便微生物群移植(FMT)。最后，我们通过16S rRNA测序、定量PCR和原位杂交检测了人和小鼠胎盘样品中的微生物群易位和免疫应答。
结果PE患者细菌多样性降低，存在明显的生态失调。机会性病原体，特别是梭菌属而且韦永氏球菌属，而有益细菌，包括Faecalibacterium而且Akkermansia，在PE组明显减少。这些鉴别细菌的丰度与血压(BP)、蛋白尿、转氨酶和肌酐水平相关。在成功定殖时，PE患者的肠道微生物组引发了受体小鼠妊娠前血压的显著升高，妊娠后血压进一步升高。此外，pe移植组蛋白尿增加，胚胎吸收增加，胎儿和胎盘重量降低。他们小肠和脾脏中的T调节/辅助-17平衡因更严重的肠漏而被扰乱。在PE和PE- fmt小鼠的胎盘中，总细菌，梭菌属炎性细胞因子水平明显升高。
结论本研究提示PE患者的肠道微生物群存在异常生物，有助于疾病的发病机制。
- 肠道细菌
- 肠屏障功能
- 细菌易位
- 免疫学
这是一篇开放获取的文章，根据创作共用署名非商业(CC BY-NC 4.0)许可证发布，该许可证允许其他人以非商业方式分发、混音、改编、在此基础上进行构建，并以不同的条款许可其衍生作品，前提是正确引用原始作品，给予适当的荣誉，任何更改都已注明，并且使用是非商业性的。看到的:http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/．
数据来自Altmetric.com
本研究的意义
关于这个问题我们已经知道了什么?
先兆子痫(PE)是孕产妇和围产期发病和死亡的主要原因之一，缺乏可靠的预测方法和详细的发病机制知识。
PE可被认为是一种使妊娠复杂化的代谢性疾病。
肠道菌群失调在代谢综合征和复杂妊娠的发展中起着致病作用。
新的发现是什么?
接种PE患者的肠道微生物组可导致妊娠前血压显著升高，妊娠期间出现PE样表型，包括高血压加重、蛋白尿加重和宫内生长受限。
更高水平的细菌和梭菌属与正常血压样品相比，PE胎盘样品中的微生物群分布发生了变化。
肠道微生物群的失衡导致了与t淋巴细胞和肠屏障功能障碍相关的免疫失衡，促进了细菌向宫腔的转运，最终引发胎盘炎症，导致胎盘发育不良。
在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?
肠道菌群筛查显示出预测PE发病的潜力，为该病的预防和治疗提供了一种新的方法。
简介
先兆子痫(PE)是一种与新发高血压相关的妊娠障碍，最常发生在妊娠20周后合并蛋白尿。1PE影响2%-8%的妊娠，与不良妊娠结局风险增加有关，包括胎盘早剥、早产和宫内生长受限。2 3迄今为止，没有一项孕早期或孕中期的测试能够可靠地预测所有PE病例的发展，3.因此，在产科领域找到有效和可获得的临床生物标志物是特别有趣的。该病的发病机制至今仍不清楚。2新兴研究表明，PE应被认为是一种与肥胖、糖尿病、胰岛素抵抗、致动脉粥样硬化性血脂异常、高血糖等代谢紊乱密切相关的代谢性疾病。4 - 6糖耐受不良、血脂异常以及高血压可导致内皮功能障碍、胎盘发育不良和胎盘发育异常，这是PE常见的病理异常。7
大量研究表明，肠道生态失调在代谢综合征、慢性炎症疾病和复杂妊娠的发展中起着致病作用。8 9肠道菌群可通过诱导宿主慢性炎症，调节能量代谢相关基因引起脂肪堆积，促进胰岛素抵抗，在代谢性疾病核心症状的发生中起重要作用。10肠道菌群失调是血压调节的关键因素11日12并且会导致蛋白尿，进而导致肾脏疾病。13
PE患者肠道菌群的组成以及肠道菌群与PE的关系至今尚未明确。最近的研究表明，妊娠晚期PE患者的肠道菌群组成被打乱，14日15但缺乏因果分析。在本研究中，我们对粪便样本进行了16S核糖体RNA (rRNA)基因测序，以研究肠道微生物组的详细特征，并通过粪便微生物组移植(FMT)确定紊乱的肠道微生物组在触发pe样表型中的关键作用。
材料与方法
研究对象
2017年3月至2018年3月，中国南方医科大学南方医院产科招募了妊娠晚期的PE患者和既往未接受过治疗的正常妊娠(NP)患者。根据目前美国妇产科医师学会的标准，2PE定义为先前血压正常的孕妇妊娠20周后出现高血压(收缩压(SBP)或舒张压(DBP)至少间隔4小时两次≥140或≥90mmhg)和大量蛋白尿(每24小时尿收集≥300mg蛋白质或蛋白质/肌酐比值≥0.3 mg/dL或随机尿样中试纸读数为2+)。在没有蛋白尿的情况下，当高血压与任何终端器官损害特征相关时，PE被定义为。当存在严重高血压(收缩压或舒张压≥160或≥110 mm Hg)、血小板减少、肝功能受损、肾功能不全、肺水肿、头痛或视力障碍时，考虑有严重特征的PE。总结粪便和胎盘供体的临床特点联机补充表S1和S2,分别。
动物和实验方案
C57BL/6小鼠被安置在特定的无病原体设施中，进行12小时的明暗循环。FMT是根据之前描述的修改方法进行的。16简单地说，6-8周龄的雌性小鼠服用抗生素(万古霉素，100 mg/kg;硫酸新霉素、甲硝唑、氨苄西林，200 mg/kg)，每日ig 1次，连续5天。我们随机选择了3名PE患者和3名NP对照组作为FMT的粪便供体(联机补充表S3)．将三种PE和三种NP供体的粪便上清混合，分别用作PE- fmt和NP- fmt小鼠的单一来源。在抗生素治疗后，接受小鼠口服接种，连续三天，此后每周两次，共59天。另一组雌性小鼠按先前描述的方法灌胃，但供体上清液被磷酸盐缓冲盐水(PBS)取代。在第一次给药6周后，所有雌性小鼠与雄性小鼠以2-3:1的比例安置过夜，阴道精子的存在证实了怀孕。携带PE和NP患者以及PBS菌群的小鼠分别被称为PE- fmt、NP- fmt和对照组。参与研究的小鼠的组数和笼数显示在在线补充表S4．
蛋白表达及生化分析
用商业裂解缓冲液从组织中提取蛋白质。如前所述进行Western blotting。17使用抗occluden带体(ZO)-1 (Invitrogen, Carlsbad, California, USA)、ZO-2 (Abcam, Cambridge, UK)、occludin (Invitrogen)、claudin-4 (Abcam)和甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH, Invitrogen)的一抗。根据制造商说明，使用小鼠白蛋白ELISA试剂盒(Bethyl Labs, Montgomery, Alabama, USA)测定粪便白蛋白和尿蛋白浓度。内毒素水平用商业试剂盒(Bio-Swamp, Beijing, China)测定。
基因表达分析
总RNA按照制造商说明书使用Trizol试剂(Invitrogen)提取。用逆转录酶(Toyobo, Shanghai, China)进行逆转录反应。在ABI Q5实时PCR系统上进行实时定量PCR，定量PCR的特异性引物见在线补充表S5．
流式细胞术
按照生产商的说明书(eBioscience, San Diego, California, USA)，将分离的免疫细胞重悬，用抗cd4 - fitc和/或抗cd25 - apc单克隆抗体(mAbs)进行表面抗原染色，用抗foxp3 - pe或抗il - 17a - pe单克隆抗体进行细胞内抗原染色。荧光减1对照平行染色。流式细胞仪数据采集采用BD LSRFortessa流式细胞仪(BD Biosciences, San Jose, California, USA)，分析采用BD FACSDiva Software V.8.0.1 (BD Biosciences)。门控策略显示在在线补充图S1．
原位杂交
原位杂交(ISH)按照Choi描述的修改方案进行等．18 19简单地说，石蜡切片经过脱亲和、复水化和渗透作用。本研究中使用的探针如下:eu细菌探针(EUB338 I-III)与大多数细菌特异性的16s rRNA区域互补的混合物;NON338，与探针EUB338互补的寡核苷酸，作为非特异性结合的打乱对照;梭菌属-特异性探针，是一种与16S rRNA区域互补的属特异性探针梭菌属．所有探针均用地高辛5 ' -标记，二抗为抗地高辛/辣根过氧化物酶抗体。进行酪胺信号扩增，提高细菌信号的检测灵敏度。在荧光显微镜下随机拍摄每个切片的6个区域。ISH的具体探测显示在在线补充表S6．
生物信息处理
利用QIIME V.1.9.1，我们将16S rRNA基因reads合并，应用质量控制并聚类为操作分类单位(OTUs)。分类分组基于Greengenes数据库V.13_8，采用封闭引用进行基于引用的OTU聚类。20 21利用QIIME V.1.9.1生成基于UniFrac度量的alpha多样性(Chao1指数、Shannon指数、系统发育多样性(PD)全树指数和观测OTUs)、beta多样性(un加权UniFrac距离度量)和主坐标分析(PCoA)值。进行置换多元方差分析，以确定组间微生物群的组成是否不同。采用线性判别分析效应量(LEfSe)来确定最可能解释组间差异的特征。22为了识别和过滤潜在的污染物OTUs，去污V.1.4.023和SourceTracker V.1.0.1)24分别应用于胎盘样品和阴性对照。
结果
PE患者肠道菌群失调
本研究共纳入85例血压正常的女性和67例PE患者。PE组有严重特征(PESF) 40例，无严重特征(PETSF) 27例。根据是否在孕33周前发现疾病，PE组进一步分为早发型PE组(21例)和晚发型PE组(46例)。
根据PCoA，使用未加权UniFrac距离，PE组的肠道微生物组与NP组有显著差异(图1一个)．α -多样性指数，包括Chao1和观察到的OTU，在PE组显著降低(图1 b, C而且在线补充图S2A,B)．我们没有观察到有和没有严重特征的PE亚组之间的显著差异(在线补充图S3A-E)或早期和晚期PE亚组之间(在线补充图S4A-E)用于alpha多样性和beta多样性。
PE和NP女性患者肠道菌群失调模式。(A)基于un加权UniFrac距离的主坐标分析显示NP细菌群落与PE细菌群落分开聚类，两者之间更相似。每个圆圈代表一个样本，按组着色。斧主坐标(PC)1和PC2的特征值分别为1.27(6.56%)和0.73(3.53%)。用置换多元方差分析(Adonis)检验NP和PE之间的beta多样性差异。(B,C) PE组和NP组间α多样性指数(Chao1指数和观测的操作分类单位)的比较。**通过Wilcoxon秩和检验表示p<0.01。(D)线性判别分析效应量确定了两组间差异最大的类群。pe富集类群LDA得分为正，NP富集类群LDA得分为负。只有满足LDA显著阈值>3的分类群才被显示出来。 (E–K) Relative abundances of梭状芽胞杆菌，Dialister，韦永氏球菌属，梭菌属，毛螺菌属，Akkermansia而且FaecalibacteriumPE组和NP组之间。*表示p<0.05;**表示p<0.01;***通过Wilcoxon秩和检验表示p<0.001。(L)所选细菌属的相对丰度与临床参数之间的相关性。相关性p<0.05。斯皮尔曼的ρ使用Benjamini和Hochberg方法调整统计量。AT-III，抗凝血酶III;铝青铜,白蛋白;谷丙转氨酶;天冬氨酸氨基转移酶;Cr,肌酐;DBP，舒张压;LDA，线性判别分析;NP，正常妊娠;PE、先兆子痫; SBP, systolic blood pressure; TP, total protein; TT, thrombin time.
在PE患者和血压正常的个体中，肠道细菌群落由18门379属组成。在门和属水平上，PE患者的微生物组成与正常组不同(在线补充图S2C,D)．为了进一步确定PE组和NP组之间不同的细菌类群，我们进行了LEfSe分析，并确定了7个表现出显著差异的属(图1 d)．优势属的丰度比较表明梭状芽胞杆菌，Dialister，韦永氏球菌属而且梭菌属显著富集，而毛螺菌属，Akkermansia而且Faecalibacterium在PE患者(图1 e-k)．但上述属在PESF和PETSF亚组间无显著差异(在线补充数字S3F)．
通过重建未观察状态(PICRUSt)分析进行群落系统发育研究，以推断微生物代谢产物和代谢途径。与炎症相关的途径，包括脂多糖生物合成和细菌毒素，在PE患者中富集(在线补充图S2E,F)．根据所有参与者的Spearman相关计算，这些关键属与血压、蛋白尿、肝功能受损或其他临床表现具有显著相关性(图1 l)．值得注意的是,韦永氏球菌属而且梭菌属与收缩压、舒张压、蛋白尿、水肿、谷丙转氨酶、天门冬氨酸转氨酶、血清肌酐、白蛋白等临床指标均显著相关。的相关系数毛螺菌属，Akkermansia而且Faecalibacterium就在对面。然而，仅对PE组进行测试时，细菌与临床参数无显著相关性，这可能是样本量减少所致。这些结果揭示了PE组肠道微生物群结构的深刻变化，表明肠道微生物在PE发生发展中的重要性。
FMT诱发子痫前期表型
为了进一步测试肠道菌群的改变是否会导致PE在体内的进展，PE患者的粪便微生物组被移植到小鼠体内。在抗生素治疗后，将受体小鼠随机分为组，口服接种PE或NP供体制备的粪便内容物(图2一个)．移植后6周，通过16S RNA测序分析受体小鼠的肠道微生物谱。正如预期的那样，基于未加权UniFrac距离矩阵的PCoA显示FMT组对小鼠粪便微生物组有显著影响(在线补充图S5A,B)．来自供体的128个属中有71个成功在受体小鼠的肠道中定植(在线补充图S5C)．此外，55%的共享属被发现在供体小鼠和受体小鼠的微生物区系中具有相同的变化趋势(在线补充图S5E)．此外，在属水平上，丰度在Coprococcus，梭菌属，Megamonas，梭状芽胞杆菌，Phascolarctobactarium而且Akkermansia在小鼠和供体之间显示出相同的趋势(在线补充图S5D,F)．这些结果表明，人类供体的粪便微生物群组成成功地在受体小鼠中复制。
给PE患者的粪便细菌给小鼠诱导一系列PE样表型。(A) FMT的示意图。将来自3个PE和3个NP供体的新鲜粪便混合，分别用作PE- fmt和NP- fmt小鼠的单一来源。在抗生素治疗后，将受体小鼠随机分组，每天口服接种，连续3天，每周2次，连续59天。(B)对三组妊娠前后收缩压进行评估(对照组和PE-FMT组n=8, NP-FMT组n=10)。α表示当日p<0.01优于NP-FMT组;β表示与对照组相比p<0.01。θ通过双侧学生t检验表示每个相应妊娠日与孕前日(fmt后42天)的p<0.05。(C)在fmt后42天(交配前)和62天(妊娠17天)测量尿蛋白浓度(对照和PE-FMT n=8, NP-FMT n=10)。(D)幼崽数量和每窝吸收率(对照组和PE-FMT n=8, NP-FMT n=10)。 (E) Placental weight and fetal weight significantly decreased in PE-FMT (n=41) compared with in NP-FMT (n=76) and controls (n=59) at 17 days of gestation. (F) Representative images of H&E-stained midsagittal placental tissue sections used in histomorphological analysis. Zones are marked and indicated by labyrinth zone and junctional zone. The ratio between the labyrinth/junctional zones was enhanced in PE-FMT (n=14) compared with in NP-FMT (n=16) and controls (n=16). (G) Rpresentative H&E staining of the labyrinth zone of recipient mouse placentas. Typical lesions are marked with dotted line (original magnification, ×400; scale bar=50 µm). Data are presented as the mean±SEM (B–F). *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 by one-way analysis of variance following Duncan’s multiple range test. ABX, antibiotics; BP, blood pressure; FMT, faecal microbiota transplantation; NP, normotensive pregnant; PE, pre-eclampsia; SBP, systolic blood pressure.
移植后6周，PE-FMT小鼠的孕前收缩压明显高于NP-FMT小鼠和对照组小鼠。妊娠后，PE-FMT组的收缩压从妊娠第5天到妊娠结束进一步升高(图2 b而且在线补充图S6A)．除了高血压恶化外，PE-FMT组在妊娠17天表现出明显更高的尿蛋白浓度，而在交配前fmt后6周尿蛋白排泄没有变化(图2 c)．与NP-FMT组和对照组相比，PE-FMT组的活仔数、胎儿重量和胎盘重量也有所下降，而胎儿吸收率却有所增加(图2 d, E)．为了确定PE患者的粪便细菌如何影响胎盘，我们检查了着床部位的结构。组织形态学分析显示，PE-FMT胎盘发生了显著的结构变化，与NP-FMT组和对照组相比，PE-FMT组胎盘的两个功能带(迷宫区和连接区)之间的比例增加(图2 f)．此外，PE-FMT组胎盘迷宫形态差异明显(图2 g)．PE-FMT小鼠在胎盘迷路层表现出梗死和基质胶原沉积增加。然而，在NP-FMT组中，迷宫形态与对照组相似。此外，肾脏组织未见明显病理异常(在线补充图S6B)．这些结果表明PE样表型是由PE患者粪便细菌转移引起的。
FMT引起免疫失衡
调节性T (Treg)细胞减少和/或T辅助17 (Th17)细胞增加在PE的发病机制中发挥核心作用。26日27日因此，我们研究了FMT观察到的不良反应是否与Treg/Th17比例的变化有关。Treg和Th17细胞被定义为共表达CD4+CD25+Foxp3+和CD4+IL-17A+,分别。Treg和Th17细胞的数量以CD4+ T细胞的百分比表示，并在不同组之间进行比较。流式细胞术分析脾细胞和小肠固有层淋巴细胞，发现PE患者FMT 62天后Treg细胞明显减少，Th17细胞明显增加，与NP-FMT组和对照组相比(图3模拟)．此外，PE-FMT小鼠的Treg/Th17细胞比率低于NP-FMT小鼠和对照组小鼠(图3 e)．我们进一步检查回肠中的炎症基因表达，以检测免疫反应的改变。如图3 f， PE-FMT小鼠表现显著升高摘要意思β，Ccl3，处于受控而且Vegf水平高于NP-FMT或对照小鼠。总的来说，这些数据表明，PE患者的粪便微生物群破坏了粘膜和系统免疫反应。
FMT诱导免疫失衡。分析Treg和Th17细胞CD4的共表达情况+CD25+Foxp3+和CD4+IL-17A+分别用流式细胞仪检测。Treg和Th17细胞的数量以CD4的百分比表示+并在不同组间进行比较。(A-D)测定siLPL和脾脏中Th17细胞和Treg细胞的百分比(每组n=8只小鼠)。(E)示出三组小鼠siLPL和脾脏中的Treg/Th17细胞比例(每组n=8只)。(F)回肠中关键细胞因子和趋化因子的信使RNA水平(n= 7-8)。数据以平均值±SEM (A-F)表示;*P<0.05， **P<0.01， ***P<0.001，经Duncan多极差检验单途径方差分析。FMT，粪便菌群移植;NP，正常妊娠;PE、先兆子痫;siLPL(小肠固有层淋巴细胞); Th17, helper 17 T; Treg, regulatory T.
PE菌群患者的FMT损害肠屏障功能
已知肠道免疫反应受损与肠道屏障功能障碍有关。28我们调查了PE患者的粪便细菌是否影响肠道屏障功能。通过粪便白蛋白含量监测肠道通透性，PE-FMT组的粪便白蛋白含量显著增加(图4一)．FMT显著增加PE-FMT小鼠的血浆内毒素水平(图4 b)．此外，PE患者粪便菌群减少Claudin4而且Occludin与NP-FMT或对照小鼠相比，结肠中的基因表达(图4 c)．同样，根据免疫组织化学和western blot分析，结肠中形成屏障的紧密连接蛋白ZO-1和ZO-2, claudin-4和occludin蛋白水平明显降低(图4 d - h)．接下来，我们检查了FMT对肠道组织病理学变化的影响。除PE-FMT小鼠结肠有轻度炎症细胞浸润外，三组小鼠回肠及结肠上皮形态无明显差异(在线补充图S7)．此外，观察到肠道微生物群丰度、肠道屏障和免疫指数之间的显著相关性(图4我)．这些数据表明肠屏障被PE患者的粪便细菌破坏。
FMT损害肠道屏障功能。(A)粪便白蛋白含量(每组n=8)。(B)血浆内毒素水平(各组n=8)。(C)结肠紧密连接信使RNA水平(每组n= 6-8)。(D-G)结肠紧密连接蛋白ZO−1、ZO-2、occludin和claudin-4蛋白水平(每组n=4)。(H)结肠组织ZO-1、ZO-2、occludin、claudin-4免疫荧光染色代表图像(原始放大，×400;比例尺=50µm)。(I)所选细菌属、基因和表型的相对丰度之间的相关性。相关性p<0.05。斯皮尔曼的ρ统计量经Benjamini和Hochberg方法调整。数据以均数±SEM (A-G)表示。Duncan多极差检验后单因素方差分析，*P<0.05， **P<0.01， ***P<0.001。FMT，粪便菌群移植;NP，正常妊娠;PE、先兆子痫;siLPL(小肠固有层淋巴细胞);ZO，闭塞带。
细菌易位与胎盘炎症有关
肠道通透性增加可导致肠道细菌或细菌成分易位到肠外组织。29 30接下来，我们通过定量PCR检测人和小鼠胎盘中的细菌，以评估细菌16S rRNA基因。PE和PE- fmt胎盘中细菌总DNA水平明显升高(图5 a, C)．为了证实这些结果，我们使用针对细菌16S rRNA的探针EUB338进行了ISH。探针特异性也使用序列打乱探针处理的切片进行测试。PE胎盘绒毛组织和PE- fmt胎盘连接层可见较多的细菌信号。打乱探针对照组未观察到染色，但在eub338探针切片中检测到染色(图5 b, D而且网上补充数字S8和S9)．如在线补充图S10A,B的检出率梭菌属通过定量PCR和ISH检测，PE胎盘样品的DNA含量高于NP胎盘样品梭菌属16S rRNA基因。
胎盘中的细菌易位和炎症。(A)恒张力(NP)和PE胎盘中16S rRNA的相对表达量表示的总细菌载量(n= 20-22)。(B) NP和PE胎盘中有代表性的细菌原位检测。胎盘组织切片用DAPI(蓝色)染色，通用真菌探针EUB338(绿色)和置乱探针NOEUB探测。原始放大倍率:×200;比例尺bar=100µm。(C) PE-FMT、NP-FMT和对照组小鼠胎盘总细菌载量的比较(每组n=8)。(D)受体小鼠胎盘交界处原位染色的代表性图像。16S探针EUB338染色为绿色，核染色(DAPI)为蓝色。原始放大倍率:×200; scale bar=100 µm. (E) PCoA of unweighted UniFrac distances for all samples, coloured by sample type. The eigenvalues of axe PC1 and PC2 were 1.61 (8.35%) and 1.07 (5.56%), respectively. (F,G) PCoA based on unweighted UniFrac distances comparing bacterial community structure of placenta samples between patients with PE and NP, and PE-FMT and NP-FMT mice. The eigenvalues of axe PC1 and PC2 were 1.63 (10.14%) and 0.89 (5.51%), respectively (F). The eigenvalues of axe PC1 and PC2 were 1.63 (10.14%) and 0.89 (5.51%), respectively (G). (H) mRNA levels of key cytokines and chemokines in PE and NP placentas (n=21–24). (I) mRNA levels of key cytokines and chemokines in mouse placentas (n=7–8). Differences in beta diversity were tested by permutational multivariate ANOVA (Adonis) (E–G). Data are presented as the mean±SEM (A,C,H,I). *P<0.05, **P<0.01; two-tailed Student’s t test (A,H); one-way ANOVA following Duncan’s multiple range test (C, I). ANOVA, analysis of variance; FMT, faecal microbiota transplantation; mRNA, messenger RNA; NP, normotensive pregnant; PCoA, principal coordinate analysis; PE, pre-eclampsia; rRNA, ribosomal RNA.
在实验处理过程中，我们通过在提取和扩增(空白对照和无模板扩增对照的DNA提取)期间添加无DNA水，以及在胎盘取样(空白对照)期间添加无菌棉签来监测污染。如图5 e与阴性对照相比，来自人类和小鼠样本的胎盘宏基因组在聚类上显著不同。为了排除胎盘微生物群发生是由于环境中的细菌污染的可能性，使用R包decontam和SourceTracker (在线补充图S8C,D)．根据无污染过滤数据，PCoA显示了PE和常压组以及NP-FMT和PE- fmt组两组的显著分离(图5 f, G)．LEfSe分析表明PE组和NP组之间存在不同的分类群假单胞菌PE患者肠杆菌科和肠杆菌科丰富，而瘤胃球菌科和黄杆菌科则减少(在线补充图S10E,F)．这些数据表明，胎盘中存在的低但持续可检测的细菌DNA生物量在分类上不同于潜在的环境阴性对照(在线补充图S10G)．
促炎细胞因子和趋化因子被认为在PE的病理生理中起关键作用。31日32接下来，我们检查了胎盘中趋化因子和促炎细胞因子表达的改变。的水平白细胞介素6，摘要意思β，Ccl3或亚兰与NP组相比，PE组人类和小鼠胎盘信使RNA显著增加(图5 h,我)．
讨论
PE是妊娠期最严重的疾病之一，不仅会导致妊娠流产，还会危及生命。1由于其病因尚不明确，目前缺乏预测、预防和治疗该病的有效方法。3.目前的研究旨在从肠道中寻找这些答案。我们发现PE患者的肠道微生物群发生了巨大的变化。因此，使用FMT，我们证明了肠道生态失调可以导致先兆子痫系统。发生这种情况的一种可能机制可能是肠道屏障破坏和致病菌从肠道转移到胎盘，导致异常免疫反应，因为我们发现总细菌和细菌含量较高梭菌属在人和患有PE的小鼠的胎盘中我们的研究提出，“肠道-胎盘”轴可能在理解PE病因方面发挥关键作用。
在我们的研究中观察到的PE的肠道生态失调是明显的，与以前的报告的发现相呼应。由于人体肠道微生物组在个体之间具有高度异质性，在使用无监督学习分析时，健康和患病个体中的微生物组通常具有部分分化的重叠。8然而，在这项研究中，PE的肠道微生物组明显偏离了对照组，并且几乎没有重叠，表明PE存在严重的生态失调。更有趣的是生态失调模式，比如Faecalibacterium而且Akkermansia消耗殆尽，而梭菌属而且韦永氏球菌属富含PE。与非怀孕高血压患者的菌群特征相似，11Faecalibacterium而且Akkermansia在PE患者中，这些与产生肠上皮营养、维持免疫稳态和加强肠屏障功能有关的蛋白质被消耗殆尽。33 34梭菌属而且韦永氏球菌属主要是机会致病菌，与慢性炎症和不良妊娠结局有关。35-37此外,刘等发现这些细菌在美国和中国南方PE患者的肠道中发生了变化，这表明PE的生态失调模式在不同人群和地区是一致的。14 15 38因此，本研究报道的PE生态失调模式是可靠的。
梭菌属可能是PE过程中肠胎盘轴的关键调节因子。丰富梭菌属尤其值得注意的是，它是一种新发现的促进结直肠癌的关键病原体。39其中的机制是这样的梭菌属细胞凋亡、细胞增殖和DNA修复通过梭菌属粘附A及其通过核因子-κB信号通路激活免疫反应。40换句话说，梭菌属特别擅长破坏肠上皮，导致肠道渗漏。41肠道渗漏的一个可能后果是细菌易位，因为我们已经发现了更多的细菌和细菌梭菌属在患有PE的女性和小鼠的胎盘中此外,Amarasekara等也发现了的增加梭菌属在PE胎盘，这可能侵犯内皮细胞，引起局部炎症。42 43胎盘微生物群的存在是争论的焦点44 45；然而，我们的观点是，细菌可以在病理状态下进入胎盘，这得到了最近研究的支持。46此外，我们在胎盘取样过程中小心地保持无菌条件，并使用对照来监测污染物。尽管目前还不能从理论上排除污染的可能性，但我们相信未来的研究将重点放在梭菌属可以帮助了解PE期间的肠道-胎盘轴。
过度的母体炎症通常由Treg/Th17失衡参与PE的发病机制，也是肠道生态失调的假定结果。26日47在目前的研究中，PE-FMT小鼠表现出Treg和Th17细胞的粘膜和系统性失衡，并加剧了胎盘的炎症。这增加了炎症细胞因子，导致胎盘氧化应激和血管功能障碍，导致胎儿排斥反应和高血压的发展。32我们发现PE时肠道生态失调可使宿主血压升高，这是PE的主要表现。据报道，肠道微生物群在怀孕时发生了改变48；因此，我们推断，在某些情况下，妊娠期的生态失调状态可使血压升高，导致PE。这一推论为PE病因学提供了新的视角，有待进一步研究。有趣的是，接受PE患者粪便材料的小鼠甚至在怀孕前就显示出血压升高，这表明肠道生态失调的高血压效应与怀孕无关。目前还不清楚为什么有些女性在怀孕期间会出现这种易患pe的生态失调;例如，生态失调是由于激素变化还是饮食变化引起的，需要在未来进行研究。
目前的研究有几个局限性。首先，在小鼠FMT实验中，我们使用了包括细菌、真菌、病毒、噬菌体、蛋白质和来自细菌和宿主的代谢物在内的整个粪便材料。因此，目前还不清楚粪便中的哪种成分在PE中起作用。因此，重要的是使用多重组学技术、灭活粪便和分离的细菌/代谢物来确认导致PE的关键因素。第二，即使我们使用了测序、ISH和定量PCR三种方法，并在胎盘中鉴定出了细菌，但这些方法并不能表明所检测到的细菌的活性。未来从胎盘中分离活细菌的研究肯定会增加我们发现的可信度。最后，尽管我们已经检测到梭菌属在肠道和胎盘中，并假设它从肠道到胎盘的易位，确切的路径梭菌属完成其易位还需进一步调查。
总的来说，我们在这里发现了PE患者明显的肠道生态失调，并证明了这种生态失调可导致子痫前期系统。可能的潜在机制是，生态失调影响了宿主的血压和肠道梭菌属转移到胎盘，引起局部胎盘炎症。从怀孕早期开始跟踪妇女的队列研究，观察她们的微生物组动态、血压变化和PE发生，将提供将肠道微生物组与PE联系起来的关键证据。总之，我们的研究表明肠-胎盘轴在PE中的作用，为PE病因学提供了新的见解。
参考文献
脚注
XC、PL和ML的贡献相同。
贡献者YY, HZ, LH, YH和XC设计了研究并准备了手稿。XC、ML、XY、YF、LZ、YC、YH、GK、MZ、ZW采集样品进行实验。PL, HZ, YH, XC, WT和HH对数据进行了分析。所有作者都同意了手稿的最终版本。
资金国家自然科学基金(81925026,81703078,81771609,81800746,31570497)，国家重点研究发展计划(2019YFA0802300)，广东省自然科学基金(2017A010105025)，中国博士后科学基金(2018M633077)资助。
相互竞争的利益没有宣布。
患者发表同意书不是必需的。
伦理批准南方医院。
出处和同行评审不是委托;外部同行评审。
数据可用性声明数据可以在一个公共的、开放访问的存储库中获得。