你在这里

条文本

菜单条
XML
炎症性肠病
原始研究
指甲:一种进化上保守的lncRNA，对结肠炎中p38和NFκB的协调激活至关重要
  1. 赛米·坎·阿卡奇克拉尔1，
  2. 乐乐吴1，
  3. 秦峰NG1，
  4. 蔡奕恒1，
  5. Bilal Unal1，
  6. 太极野田佳彦2，
  7. 魏红，Jeff choor1，
  8. Masahito Ikawa2，
  9. Vinay Tergaonkar1，3.
  1. 1分子与细胞生物学研究所(IMCB)， A*STAR(日本科学技术研究局)，分子与细胞生物学研究所“，、新加坡
  2. 2微生物疾病研究所，大阪大学，大阪,日本
  3. 3.病理科，新加坡国立大学医学院、新加坡
  1. 对应到Vinay Tergaonkar，分子与细胞生物学研究所，138673，新加坡;vinayt在{}imcb.a-star.edu.sg

摘要

客观的NFκB是炎症性疾病的关键调控因子。然而，在炎症条件下激活、微调或关闭NFκB活性的关键调控因子尚不清楚。在本研究中，我们旨在研究nf κ b特异性长链非编码rna (lncRNAs)在调节炎症网络中的作用。

设计利用第一次基因筛选鉴定nf κ b特异性lncrna，我们进行了RNA-seqp65-/-和Ikkβ-/-小鼠胚胎成纤维细胞和报告鉴定的进化保守的lncRNA指定mNAIL(老鼠)或hNAIL(人类)。hNAIL在包括UC在内的人类炎症性疾病中上调。我们生成的mNAILΔNFκB小鼠，其中两个NFκB位点的近端启动子缺失mNAIL废除其诱导，研究其在结肠炎中的作用。

结果指甲Wip1是一种已知的促炎p38激酶和NFκB亚基p65的负调控因子，通过隔离和失活Wip1调节炎症。Wip1失活导致p38的协同激活和NFκB的共价修饰，这对于其在特定靶标上的全基因组占用至关重要。指甲能够协调p38和NFκB共激活的反应，导致骨髓中前体细胞分化为未成熟的骨髓细胞，巨噬细胞招募到炎症区域，以及结肠炎中炎症基因的表达。

结论指甲其表达与NFκB活性高度相关，这使得它成为IBD和其他炎症相关疾病的生物标志物和治疗靶点的理想候选。

  • 慢性溃疡性结肠炎
  • 炎症
  • 炎症性肠病

数据可用性声明

数据可以在一个公共的、开放访问的存储库中获得。MEF细胞RNA测序数据GSE157476 -https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE157476)和小鼠结肠组织rna测序数据(GSE138235-https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE138235)储存于GEO开放存取资料库。

http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/

这是一篇开放获取的文章，根据创作共用署名非商业(CC BY-NC 4.0)许可证发布，该许可证允许其他人以非商业方式分发、混音、改编、在此基础上进行构建，并以不同的条款许可其衍生作品，前提是正确引用原始作品，给予适当的荣誉，任何更改都已注明，并且使用是非商业性的。看到的:http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/．

http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl-2020-322980

数据来自Altmetric.com

    请求的权限

    如果您希望重用本文的任何或全部内容，请使用下面的链接，该链接将带您到版权清除中心的RightsLink服务。您将能够快速获得价格和即时许可，以多种不同的方式重用内容。

    本研究的意义

    关于这个问题我们已经知道了什么?

    • NFκB在IBD患者中高度激活，并与疾病严重程度相关。

    • NFκB和p38已被证明是全面炎症的促炎基因表达所必需的。

    • 通过Wip1磷酸酶对活性p65的去磷酸化可以关闭NFκB活性，导致其染色质重塑潜力的丧失，从而降低NFκB靶标的转录。

    • 许多信号调节因子，包括酶、适配器蛋白和非编码rna，如mirna，它们调节NFκB和p38，已经被鉴定和鉴定。

    • 几种lncrna被认为在人类炎症性疾病中被TNFα刺激和失调诱导。

    • lncrna可以与激酶相互作用并调节其活性。

    新的发现是什么?

    • 指甲是第一个通过基因筛选确定的lncRNA，其表达完全依赖于NFκB。这种自动调节是独特的，以前没有记录过。

    • 指甲与NFκB信号通路形成正反馈环路，其在结肠炎中的表达增强。

    • 指甲通过调节炎症细胞因子的表达和效应细胞招募到炎症部位来调节结肠炎的发展。

    • 指甲同时激活p38激酶和转录因子p65。这种两种途径的直接协调激活在任何其他lncRNA中都没有记录。

    • 指甲使一种磷酸酶(Wip1)失活，这种酶对激活NFκB和p38信号转导对于结肠炎的全面炎症至关重要。

    本研究的意义

    在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?

    • 在Wip1-NFκB/p38轴上的NAIL在结肠炎发展中的关键作用，为开发未来对抗炎症性疾病(如UC)或人类癌症(如结肠炎相关的结直肠癌)的治疗方法提供了一个有吸引力的靶点

    简介

    慢性炎症性疾病，如IBD，源于免疫反应失调、细胞因子/趋化因子分泌异常以及肠屏障和微生物群的改变。1在IBD中，肠道菌群释放肠毒素，增加肠粘膜的通透性，导致有害细菌入侵和肠上皮细胞受损导致肠道炎症状态。2在UC患者中，NFκB在上皮细胞和粘膜巨噬细胞中被激活，增强了广泛的NFκB调节细胞因子的分泌，包括TNFα， IL-1和IL-6。3.由于炎症激活的反复循环，IBD患者已被证明更容易受到细胞因子风暴综合征的影响4以及癌症的发展。这是由于nf κ b依赖的细胞因子分泌过度活跃，导致免疫细胞过度增殖和过度的组织损伤，导致新的癌症突变的积累。5个6

    NFκB有多种调控因子，包括激酶、泛素连接酶和mirna。其中一些已被确定为潜在的治疗靶点。7然而，只有~ 1%-2%的人类基因组编码蛋白质，而75%-90%转录成非编码rna;8可能激活、微调或关闭NFκB活性的关键调控因子尚未被发现。长非编码rna (lncRNAs)构成了哺乳动物基因组中这种猖獗的转录的大部分。8 9

    为了鉴定被NFκB直接特异性调控的lncrna，我们从野生型(WT)中提取RNA-seq，p65-/-和Ikkβ-/-不同时间点TNFα处理小鼠胚胎成纤维细胞(mef) (图1 a, B)．该筛选显示了一种新颖的进化保守的lncRNA, Gm16685在小鼠及其人类同源物(loc105375914)中，两者都被NFκB的p65亚基显著特异性激活。我们将这个未注释的lncRNA命名为NFκB一个ssociated我mmunoregulatoryl非编码RNA，钉子。hNAIL在包括UC在内的许多人类炎症疾病中上调。模型钉子的我们删除了近端小鼠中两个保守的NFκB位点指甲（mNAIL)启动子，并生成小鼠模型(mNAILΔNFκB)，其中指甲基因对nf κ b依赖性激活无反应。mNAILΔNFκB小鼠的NFκB靶标表达降低，结肠炎减轻。对于炎症刺激，指甲并隔离Wip1磷酸酶，阻止Wip1去磷酸化，使活跃的p65和其他Wip1靶点(如全面炎症基因表达所必需的p38)失活。这些结果首次证明lncRNAs可以直接调节磷酸酶对其底物的可达性，这在炎症中具有重要的影响。

    Identification of lncRNAs regulated by NFκB signalling pathway. (A) NFκB signalling pathway and screening strategy used to identify NFκB-regulated lncRNAs. Crosses represent loss of the corresponding proteins (Ikkβ, Ikkγ, p65) using KO MEFs. (B) Heatmap of logCPM values of differentially expressed lncRNAs in WT, p65 -/- and Ikkβ -/- in immortalised MEFs exposed to TNFα for the indicated time points and analysed by paired-end RNA-sequencing. Gm16685 is shown with red arrow. (C) Schematic view of genetic loci of Gm16685 lncRNA (blue). Gm16685 is expressed from antisense direction to IL7 gene (red). NFκB binding motifs in the promoter region of Gm16685 shown as yellow highlighted sequences. (D) RT-qPCR analysis of Gm16685 transcript levels in immortalised WT MEFs exposed to TNFα for different time points as indicated. (E) RT-qPCR analysis of Gm16685 in WT (n=5), p65 -/- (n=8) and Ikkβ -/- (n=3) independent primary MEFs treated with TNFα for indicated time courses. P values were calculated using Student’s t-test method (***p<0.001). (F) Gene expression profile of 24 inflamed and patient match non-inflamed samples. Differentially expressed genes are shown in heatmap. LOC105375914 is shown with red arrow. (G) Box plot shows upregulation of hNAIL (LOC105375914) expression in inflamed colon tissue of UC patients. KO, knock out; MEFs, mouse embryonic fibroblasts; WT, wild type.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    NFκB信号通路调控lncrna的鉴定。(A) NFκB信号通路及筛选策略用于鉴定NFκB调控的lncRNAs。用KO mef表示相应蛋白质(Ikkβ， Ikkγ， p65)的损失。(B) WT中差异表达lncrna的logCPM值热图，p65-/-和Ikkβ-/-在指定时间点暴露于TNFα的不朽mef中，并通过配对端rna测序进行分析。Gm16685为红色箭头所示。(C) Gm16685 lncRNA遗传位点示意图(蓝色)。Gm16685由反义方向向表达IL7基因(红色)。在Gm16685启动子区域的NFκB结合基序显示为黄色高亮序列。(D) RT-qPCR分析不同时间点暴露于TNFα的永久WT mef中Gm16685转录水平。(E) WT中Gm16685的RT-qPCR分析(n=5)，p65-/-(n = 8)Ikkβ-/-(n=3)在指定的时间疗程中使用TNFα治疗独立原发性mef。P值采用Student 's t检验方法计算(*** P <0.001)。(F) 24个炎症和患者匹配非炎症样本的基因表达谱。差异表达基因在热图中显示。LOC105375914用红色箭头显示。(G)箱形图显示hNAIL(LOC105375914)在UC患者炎症结肠组织中的表达。KO，击倒;MEFs，小鼠胚胎成纤维细胞;WT，野生型。

    结果

    Gm16685的鉴定及特性(mNAIL）;一种由NFκB信号通路特异性调控的新型lncRNA

    除了激活NFκB通路外，TNFα受体的参与还导致JNK、p38和凋亡通路的激活(图1一个)．由于NFκB的激活在p65-/-和Ikkβ-/-mef (在线补充图1A,B)，我们利用这些细胞鉴定nf κ b驱动的lncrna。WT之间差异表达的lncRNAs，p65-/-和Ikkβ-/-TNFα刺激的mef被鉴定(图1 b)．为了鉴定直接和特异性受NFκB信号调控的lncrna，我们选择了在WT中以时间依赖方式诱导TNFα而在WT中不诱导的lncrnap65-/-和Ikkβ-/-mef。我们选择了在白介素-7反义方向上表达的新型lncRNA Gm16685 (IL7)，以作进一步的功能及机理研究(图1 c)．TNFα刺激WT mef中Gm16685表达显著上调(图1 d)．然而，与WT MEFs相比，Gm16685在p65-/-，Ikkβ-/-和Ikkγ-/-TNFα刺激显著抑制了永久MEFs (在线补充图1C,D)．由WT衍生的初级mef，p65-/-和Ikkβ-/-小鼠也显示Gm16685的激活以ikk β依赖和p65依赖的方式发生(图1 e)．在WT永生化的mef中，TLR4配体、脂多糖(LPS)刺激也诱导Gm16685的表达(在线补充图1E)．重要的是，反义基因IL7在刺激方面保持相对不变(在线补充图1F)，提示p65经Ikkβ诱导Gm16685的特异性。综上所述，这些结果表明，Gm16685的表达被NFκB信号通路特异性激活，该信号通路位于TNFα和LPS等主要炎症刺激的下游。

    loc105375914 (hNAIL)，是Gm16685在进化上保守的人类同源体(mNAIL)在UC中上调

    确定哪些lncrna在进化上是保守的，突出了这些转录本在基本生物学过程中的功能重要性。10鉴定Gm16685的人类同源物(mNAIL)，我们将小鼠(mm10)中Gm16685 (chr3:7612705-7690001)的基因组坐标通过UCSC liftOver和默认参数转换为人类(hg38)基因组坐标。人lncRNA loc105375914 (hNAIL) (chr8:78804578-78937681)与转换区域(chr8:78804472-78902467)重叠，因此loc105375914被认为是小鼠Gm16685的候选同源物。虽然lncrna的序列保持性较差，但其启动子区域通常较为保守。11因此，我们使用小鼠Gm16685的启动子序列和同一区域31个其他物种的序列，参照UCSC比较基因组轨迹(在线补充图2A)．启动子基序富集分析表明，NFκB是所有同源物中富集最显著的基序(在线补充图2B)．最重要的是，RNA结合蛋白(RBP)结合基序预测使用RBPmap服务器(http://rbpmap.technion.ac.il/结果显示，预测与Gm16685结合的80%的rbp也预测与人loc105375914 lncRNA结合(在线补充图2C)暗示hNAIL和mNAIL很可能在功能上是守恒的。

    公开p65 (RelA) ChIP-seq数据分析12日13小鼠树突状细胞、LPS刺激的巨噬细胞、TNFα刺激的人脂肪细胞和成纤维细胞的研究结果表明，p65以刺激依赖的方式与Gm16685和loc105375914的启动子区域结合(在线补充图2D,E)．此外，RNA聚合酶2 (Pol2) ChIP-seq数据14日15结果表明，loc105375914的表达是由RNA Pol2和NFκB共同驱动的(在线补充图2E)．位于Gm16685上游的两个p65 (RelA)结合基序在物种间高度保守，这表明这些基序在物种间Gm16685的调控和随后的转录中可能具有重要的功能。此外,指甲计算分析显示不具备编码潜力(在线补充图2F)和3 ' Flag标签策略(在线补充图2G)．

    NFκB的过度激活是炎症性疾病发展的功能决定因素，如引起结肠粘膜炎症的UC。16由于loc105375914在转录上受到NFκB的调控，我们分析了来自人类UC患者的24个炎症和匹配的非炎症部分的转录组。在炎症结肠中，我们观察到NFκB靶基因的显著上调，包括肿瘤坏死因子α和摘要意思β（图1 f)，它们是肠道炎症的关键调节因子。17与非炎症对照相比，loc105375914在炎症结肠中的表达显著上调(图1 g)，提示loc105375914的表达与NFκB活性高度相关，可作为ibd的生物标志物。总的来说，这些结果表明loc105375914是Gm16685的一个保守的人类同源物，它们的表达都是由NFκB信号通路特异性驱动的，以响应物种和细胞类型的炎症和微生物触发。以后我们将Gm16685称为mNAILloc105375914 ashNAIL（NFκB一个ssociated我mmunoregulatorylong非编码RNA)。

    mNAILΔNFκB小鼠表现出mNAILNFκB的活化和炎症的抑制

    我们生成的mNAILΔNFκB上游的两个保守的NFκB结合基序mNAIL使用聚簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)-Cas9基因组编辑(图2一个)．mNAILΔNFκB小鼠出生时的孟德尔比例正常，且没有明显的表型(图2 b)．基因分型PCR证实NFκB基序缺失(图2 c)和Sanger测序(图2 d)．三个独立mNAILWT和mNAILΔNFκB初级MEF克隆显示mNAIL表达被废除了mNAILΔNFκB克隆，而表达水平IL7基因不受TNFα治疗影响(图2 e, F)．我们还观察到NFκB靶标的表达降低肿瘤坏死因子α和摘要意思β肿瘤坏死因子α水平的变化mNAILΔNFκBmef与mNAILWTmef (图2 g, H)．损耗的mNAIL显示NFκB靶基因表达降低(图2 i, J)和p65和p38的磷酸化显著降低(图2 k)．为了排除观察到的表型可能源于基因组编辑及其对IL7或其邻近基因的脱靶效应的可能性，我们首先分析了IL7的表达IL7在小鼠的不同组织中使用NCBI片段/千碱基外显子/百万reads (FPKM)数据。自IL7在胸腺、脾脏和结肠组织中高度表达(在线补充图3A)，分析其在胸腺间的表达mNAILWT和mNAILΔNFκB组，观察到RNA和蛋白质水平无显著差异(在线补充图3B,C)．虽然我们没有观察到IL7表达的任何中断(RNA和蛋白质水平)，但我们击倒了IL7利用siRNA研究IL7对NFκB信号通路的影响。损耗的IL7通过TNFα的表达判断，不影响NFκB的激活(在线补充图3D-F)．综上所述，这些结果表明，编辑2个保守的NFκB位点对小鼠免疫功能的影响指甲启动子特异性地抑制诱导性指甲是对炎症刺激的反应指甲进而在体内调控NFκB靶基因。

    mNAILΔNFκB mice display decreased activation of NFκB and inflammation. (A) Schematic view of mNAIL lncRNA promoter targeting with CRISPR-Cas9 editing. NFκB binding motifs are shown in yellow in the promoter region of mNAIL. (B) mNAIL mice were generated using standard methods (refer to ‘Materials and methods’ section). mNAIL mice were born in normal Mendelian ratio (table below) and unchallenged mice appear normal. (C) Genotyping PCR results of mNAILWT and mNAILΔNFκB mice. PCR products from mNAILWT and mNAILΔNFκB alleles are shown. (D) Sanger sequencing results of mNAILWT and mNAILΔNFκB cells. (E–H) mNAILWT and mNAILΔNFκB MEFs (n=3) were treated with TNFα for the indicated time points. Expression analysis was performed by RT-qPCR for (E) mNAIL, (F) IL7, (G) TNFα and (H) IL1β genes. (I–K) WT MEFs were transfected with si-Control, si-NAIL #1 and si-NAIL #2 siRNAs. After 48 hours post-transfection, cells were treated with or without TNFα and harvested for gene expression analysis. Graphs show the gene expression analysis of (I) mNAIL and (J) TNFα by RT-qPCR. Actin was used as a control. Error bars indicate mean±SD of three independent experiments. P values were calculated using Student’s t-test method (*p<0.05; **p<0.01; n.s., not significant). (K) Cells lysate were analysed with western blot for the indicated proteins. MEFs, mouse embryonic fibroblasts; WT, wild type.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    mNAILΔNFκB小鼠的NFκB活化和炎症反应降低。(A)的示意图mNAIL用CRISPR-Cas9编辑lncRNA启动子靶向。的启动子区域，NFκB结合基序以黄色显示mNAIL．(B)mNAIL使用标准方法生成小鼠(参见“材料和方法”部分)。mNAIL小鼠出生时的孟德尔比例正常(见下表)，未受挑战的小鼠表现正常。(C)基因分型PCR结果mNAILWT和mNAILΔNFκB老鼠。PCR产物mNAILWT和mNAILΔNFκB等位基因显示出来。(D) Sanger测序结果mNAILWT和mNAILΔNFκB细胞。(情况)mNAILWT和mNAILΔNFκBmef (n=3)在指定时间点用TNFα治疗。RT-qPCR对(E)进行表达分析mNAIL(F)IL7, (G)肿瘤坏死因子α和(H)摘要意思β基因。(I-K) WT mef转染si-Control、si-NAIL #1和si-NAIL #2 sirna。转染48小时后，细胞分别被添加或不添加TNFα处理，并收集用于基因表达分析。(I)基因表达分析图表mNAIL和(J)肿瘤坏死因子αRT-qPCR。肌动蛋白作为对照。误差条表示三个独立实验的平均值±标准差。采用Student 's t检验方法计算P值(* P <0.05;* * p < 0.01;n.s.，不重要)。(K)用western blot分析细胞裂解液中的指示蛋白。MEFs，小鼠胚胎成纤维细胞;WT，野生型。

    mNAILΔNFκB小鼠表现出较少的结肠炎和结肠炎症

    mNAILΔNFκB小鼠表现出较少的结肠炎和结肠炎症mNAILWT和mNAILΔNFκB小鼠给予3%右旋糖酐硫酸钠(DSS)诱导急性结肠炎(图3一)．初始体重mNAILWT和mNAILΔNFκB然而，在DSS治疗的小鼠中，mNAILΔNFκB与对照组相比，小鼠的体重减轻程度较轻mNAILWT同行(图3一)．在DSS治疗中，结肠缩短明显不明显mNAILΔNFκB与对照组相比，小鼠疾病活性指数(DAI)较低mNAILWT同行(图3罪犯)．这些结果提示炎症减轻mNAILΔNFκB老鼠。

    mNAILΔNFκB mice are resistant to dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis. (A) Scheme of DSS-induced colitis model is shown on the top panel. mNAILWT and mNAILΔNFκB mice were treated as shown in top panel. Body weight measurements from mice monitored for 8 days (bottom panel). (B and C) Colon length of DSS-treated mNAILWT and mNAILΔNFκB mice measured at day 8. (D) Disease activity index was recorded daily. (E) Bone marrow cells were isolated from the DSS-treated mNAILWT and mNAILΔNFκB mice at day 8 and were stained for CD11b (PE), Ly6c (BV711) and Ly6g (FITC) cell surface markers. Cells were analysed by FACS and gated as CD11b+cells. Representative FACS data were shown for mNAILWT and mNAILΔNFκB mice treated with or without DSS. (F) CD11b+cells were further gated for Ly6c and Ly6g markers. (G–I) Quantification of CD11b+, CD11b+Ly6Chi+Ly6G−, CD11b+Ly6Clow+Ly6G+cells gated in (E) and (F). Error bars indicate mean±SD of three independent experiments (UT: n=9, DSS: n=15). P values were calculated using Student’s t-test method (*p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001; ****p<0.0001; n.s., not significant). DSS, dextran sulfate sodium; FACS, fluorescence-activated cell sorting; SSC, side scatter; side scatter; UT, untreated; WT, wild type.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
    图3

    mNAILΔNFκB小鼠对右旋糖酐硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎具有耐药性。(A) dss诱导的结肠炎模型方案如图所示。mNAILWT和mNAILΔNFκB小鼠的处理方法如上图所示。监测小鼠体重8天(下图)。(B和C) dss处理的结肠长度mNAILWT和mNAILΔNFκB第8天测量小鼠。(D)每日记录疾病活动指数。(E)从dss处理的骨髓细胞中分离出来mNAILWT和mNAILΔNFκB第8天对小鼠进行CD11b (PE)、Ly6c (BV711)和Ly6g (FITC)细胞表面标志物染色。细胞经FACS分析，并被门控为CD11b+细胞。有代表性的FACS数据显示mNAILWT和mNAILΔNFκB给予DSS或不给予DSS的小鼠。(F) CD11b+细胞进一步门控Ly6c和Ly6g标记。(G-I) CD11b+， CD11b+Ly6C的定量嗨+ Ly6G−CD11b + Ly6C低+Ly6G+细胞在(E)和(F)门控。误差柱表示三个独立实验的平均值±SD (UT: n=9, DSS: n=15)。采用Student 's t检验方法计算P值(* P <0.05;* * p < 0.01;* * * p < 0.001;* * * * p < 0.0001;n.s.，不重要)。DSS，葡聚糖硫酸钠;FACS，荧光激活细胞分选;SSC，侧散射;散射; UT, untreated; WT, wild type.

    DSS治疗已被证明可以改变骨髓中的髓样前体种群，这与结肠炎症的程度直接相关。18 19特别是CD11b+Ly6C衍生的单核细胞嗨Ly6G -未成熟的髓系细胞已被证明在炎症条件下进入组织，并在结肠炎中表达高水平的促炎细胞因子。20 - 22考虑到骨髓细胞是浸润炎症组织的主要细胞，而前体是在骨髓中产生的，23我们分析了骨髓中的骨髓种群mNAILΔNFκB老鼠。不出所料，mNAILWT和mNAILΔNFκB小鼠在DSS治疗后CD11b+数量增加(图3比)．接下来，我们分析了CD11b阳性亚群CD11b+Ly6c嗨+Ly6g−和CD11b+Ly6c低+Ly6g+ (图3 f)．DSS诱导Ly6C升高嗨激活细胞的数量在mNAILWT老鼠(图3 h)．相反，与mNAILWT小鼠的Ly6c水平升高低中可见Ly6g+细胞mNAILΔNFκB老鼠(图3我)．为了进一步调查指甲对骨髓中的干细胞种群有什么作用吗，我们分析了骨髓中的祖细胞mNAILWT和mNAILΔNFκB给予DSS或不给予DSS的小鼠24（在线补充图4A)．细胞最初被门控为LIN-细胞，基于c-KIT和Sca-1表达，选择长期和短期造血干细胞群体(KL, KSL和K-low_S-low)。根据CD16/32和CD34表达进一步门控KL细胞，以鉴定巨核细胞-红细胞、普通髓样祖细胞和粒细胞-巨噬细胞祖细胞。为了确定常见的淋巴样祖细胞群，我们进一步根据K-low_S-low细胞的IL7ra表达对其进行门控。所有样本的代表性FACS数据及定量(在线补充图4A-E)显示为mNAILWT和mNAILΔNFκB老鼠。两组干细胞和前体细胞数量无差异mNAILWT和mNAILΔNFκB老鼠认为指甲不改变干细胞和祖细胞群。相反，我们的数据表明mNAIL是前体细胞在炎症过程中分化为CD11b+ ly6c或Ly6g亚型的关键决定因素。

    mNAIL在骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)中表达受到功能调控

    确定…的主要地点mNAIL在体内的表达，我们解剖的反应mNAIL不同类型的细胞和组织，包括胸腺、肝脏、脾脏、肺和BMDM，使用系统性lps诱导的内毒素血症模型(图4 a e)．我们观察到轻度诱导mNAIL在胸腺和肝脏(图4 a, B)，但在脾脏和肺组织中则没有(图4 c, D)．强诱导mNAIL在BMDMs中观察到(图4 e, F)．我们观察到NFκB靶的诱导受到抑制肿瘤坏死因子α，CCL2和CXCL2对LPS的挑战mNAILΔNFκBBMDM (图4 g-j)．ChIP-qPCR结果显示无mNAIL导致这些已知的NFκB靶基因启动子上的p65占用显著减少(图4 k, L)表明…的损失指甲影响DNA结合，进而影响NFκB的转录。我们观察到，在缺乏磷酸-p65和磷酸-p38水平显著降低mNAIL在bmmdms中(图4米)．我们没有观察到不相关的磷酸化mkk4蛋白的任何变化，这表明特异性指甲作用于p65和p38的磷酸化(图4米)．关键的是，p65和p38的髓系特异性敲除(KO)在DSS模型中显示出减少的炎症反应和体重差异，与在DSS模型中的观察结果高度相似mNAILΔNFκB老鼠。23 25 26确定这种功能的分子基础钉子,我们用结肠组织进行了rna测序mNAILWT和mNAILΔNFκB接受或未接受DSS治疗的小鼠(图5一个)．在未处理(UT)组中，只有少数基因表达差异，这重申了在近端启动子中两个NFκB位点的缺失mNAIL不会因基因组编辑人工制品而导致转录组的任何全局改变(在线补充图5)．然而，DSS处理引起基因表达的巨大变化，大多数基因的表达下调mNAILΔNFκB老鼠(图5一个)．基因本体论分析显示，大多数差异表达和下调的基因mNAILΔNFκB结肠属于NFκB调控的炎症通路(在线补充图5B)．为了验证RNA-seq结果，我们对NFκB靶基因进行了基因表达分析，观察到NFκB靶基因的表达降低肿瘤坏死因子α，摘要意思β和CCL2结肠组织中的基因mNAILΔNFκB与小鼠相比mNAILWT集团(图5中)．与基因表达结果相似，结肠组织中TNFα和IL1β蛋白水平降低(图5 f, G)．我们还观察到dss处理的结肠中磷酸化p65和磷酸化p38的水平降低mNAILΔNFκB相比之下mNAILWT集团(图5 h)．

    mNAIL is expressed mainly in myeloid cells and its expression amplifies activation of NFκB and inflammation. (A–E) LPS (5 mg/kg) was injected intraperitoneally into C57BL/6N WT mice (n=6). (A) Thymus, (B) liver, (C) spleen and (D) lung tissues were collected after 4 hours and expression analysis was performed by RT-qPCR for mNAIL gene. (E, F) Bone marrow cells isolated from WT mice (n=6) and differentiated into bone marrow-derived macrophages (BMDM) for 7 days. BMDM cells were treated with or without LPS (200 ng/mL) for 4 hours. (E) Graph shows the mNAIL expression analysis by qPCR. (F) Time kinetics of mNAIL expression is shown in LPS-stimulated BMDM cells. Data were normalised to actin. (G–J) Bone marrow cells isolated from mNAILWT and mNAILΔNFκB mice (n=6) and differentiated into BMDM for 7 days. BMDM cells were treated with or without LPS (200 ng/mL) for 4 hours. Graph shows the gene expression analysis of (G) mNAIL, (H) TNFα, (I) CCL2 and (J) CXCL2 by qPCR. Data were normalised to actin. (K–L) mNAILWT and mNAILΔNFκB BMDM cells were treated with or without LPS, and ChIP analysis was performed for p65 (n=3). Graph shows the ChIP-qPCR analysis of p65 occupancy on the (K) TNFα and (L) CXCL2 promoters. Error bars indicate mean±SD of three biological replicates. P values were calculated using Student’s t-test method (*p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001; ****p<0.0001; n.s., not significant). (M) Western blot shows the total and phosphorylated p65, p38 and MKK4 in BMDM cells treated with or without LPS. Each replicate is labelled as #1, #2 and #3. UT, untreated; WT, wild type.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
    图4

    mNAIL主要在髓细胞中表达，其表达可增强NFκB的活化和炎症反应。(A-E) LPS (5 mg/kg)腹腔注射C57BL/6N WT小鼠(n=6)。(A)胸腺，(B)肝脏，(C)脾脏和(D)肺组织在4小时后采集，RT-qPCR对其进行表达分析mNAIL基因。(E, F)从WT小鼠(n=6)分离的骨髓细胞分化为骨髓来源的巨噬细胞(BMDM) 7天。用或不加LPS (200 ng/mL)处理BMDM细胞4小时。(E)图表显示mNAILqPCR表达分析。(F)时间动力学mNAIL在lps刺激的BMDM细胞中表达。数据归一化为肌动蛋白。(G-J)骨髓细胞分离mNAILWT和mNAILΔNFκB小鼠(n=6)， 7 d后分化为BMDM。用或不加LPS (200 ng/mL)处理BMDM细胞4小时。图为(G)基因表达分析mNAIL(H)肿瘤坏死因子α,(我)CCL2和(J)CXCL2qPCR。数据归一化为肌动蛋白。(K-L)mNAILWT和mNAILΔNFκB使用或不使用LPS处理BMDM细胞，对p65进行ChIP分析(n=3)。图为p65在(K)位点占用的ChIP-qPCR分析肿瘤坏死因子α和(左)CXCL2启动子。误差条表示三个生物重复的平均值±标准差。采用Student 's t检验方法计算P值(* P <0.05;* * p < 0.01;* * * p < 0.001;* * * * p < 0.0001;n.s.，不重要)。(M) Western blot显示有或没有LPS处理的BMDM细胞中p65、p38和MKK4的总数和磷酸化。每个副本被标记为#1、#2和#3。UT,未经处理的; WT, wild type.

    mNAIL regulates expression of inflammatory genes in colitis. (A) Heat map shows the genes that are differentially expressed between mNAILWT and mNAILΔNFκB mice treated with DSS. Genes were first filtered for differential genes on DSS treatment between mNAILWT untreated (UT) and DSS to identify DSS-dependent genes. Next, this gene list was used to identify the differentially expressed genes between mNAILWT and mNAILΔNFκB mice treated with DSS. Differentially expressed genes were identified based on the criteria of 2 log2-fold difference with false discovery rate<0.05. (B–E) Expression analysis was performed by RT-qPCR for (B) mNAIL, (C) TNFα (D) IL1β and (E) CCL2 genes in the colon tissues of mNAILWT and mNAILΔNFκB mice treated with or without DSS at day 8 (n=15). (F–G) Protein levels of TNFα and IL1β cytokines were measured in colon samples by ELISA. Error bars indicate mean±SD of three independent experiments. P values were calculated using Student’s t-test method (**p<0.01; ***p<0.001; ****p<0.0001). (H) Total protein lysates isolated from the colon tissues of mNAILWT and mNAILΔNFκB mice treated with or without DSS at day 8 were analysed for phosphorylated and total p65 and p38. Actin was used for normalisation. DSS, dextran sulfate sodium; UT, untreated; WT, wild type.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5
    图5

    mNAIL调节结肠炎炎症基因的表达。(A)热图显示了基因之间的差异表达mNAILWT和mNAILΔNFκBDSS处理的小鼠。首先筛选基因间的差异基因进行DSS处理mNAILWTUT和DSS来鉴定DSS依赖基因。接下来，用这个基因列表来识别之间的差异表达基因mNAILWT和mNAILΔNFκBDSS处理的小鼠。差异表达基因以2 log2倍差异为标准，误发现率<0.05。(B - e)采用RT-qPCR对(B)进行表达分析mNAIL, (C)肿瘤坏死因子α(D)摘要意思β和(E)CCL2结肠组织中的基因mNAILWT和mNAILΔNFκB在第8天给予或不给予DSS治疗的小鼠(n=15)。(F-G) ELISA法检测结肠标本中TNFα和IL1β细胞因子的蛋白水平。误差条表示三个独立实验的平均值±标准差。P值采用Student 's t检验方法计算(** P <0.01;* * * p < 0.001;* * * * p < 0.0001)。(H)从结肠组织分离的总蛋白裂解物mNAILWT和mNAILΔNFκB在第8天，分别对接受DSS治疗或未接受DSS治疗的小鼠进行磷酸化和总p65和p38的分析。肌动蛋白用于正火。DSS，葡聚糖硫酸钠;UT,未经处理的;WT，野生型。

    冒号来自dss处理mNAILWT和mNAILΔNFκB第8天小鼠染色mNAIL-特异性荧光原位杂交(FISH)探针，p-p65和p-p38抗体，并用共聚焦显微镜分析。我们只检测到基础mNAIL未观察到p-p65和p-p38阳性染色mNAILWT和mNAILΔNFκB老鼠。在DSS刺激下，F4/80细胞浸润增加mNAILWT冒号。F4/80和mNAIL显示浸润的巨噬细胞是主要的来源mNAIL在dss处理过的冒号中的表达(图6 a - c右面板)。此外,只有mNAIL表达F4/80+的细胞p-p65显著升高(图6)及p-p38 (在线补充图6A)．类似于我们的western blot分析(图5 h)，我们观察到p-p65和p-p38的诱导受到抑制mNAILΔNFκB与小鼠相比mNAILWT经DSS处理的小鼠(图6 a - c和在线补充图6B)．最后，结肠组织的H&E染色表明，在更严重的病理mNAILWT与小鼠相比mNAILΔNFκB老鼠(在线补充图6C,D)．这些结果，加上我们之前的western blot分析，表明mNAIL结肠浸润巨噬细胞中的表达调节p65和p38的磷酸化，从而调节这些免疫细胞中的炎症程序。

    mNAIL acts via immune cells to regulate inflammation. (A) Colon sections of the DSS-treated mNAILWT and mNAILΔNFκB mice at day 8 were stained with mNAIL specific FISH probe, F4/80 and p-p65 antibodies. Tissue slides were analysed for the indicated molecules by confocal microscopy. (B) Graph shows quantification of the number of F4/80+ cells from A. (C) Graph shows quantification of the number of F4/80+p-p65+cells from A. Error bars indicate mean±SD of three independent fields examined per mouse (n=3 per group). ***p<0.001; ****p<0.0001; n.s., not significant. P values were calculated by two-tailed Student’s t-test method. (D) mNAILWT or mNAILΔNFκB bone marrow reconstituted mNAILWT and mNAILΔNFκB mice were treated with DSS for 8 days. Graph shows the body weight measurements from mice monitored for 8 days (E) and the colon length at day 8. Graphs show gene expression analysis of (F) TNFα and (G) IL1β in the colon tissues of different bone marrow reconstituted groups treated with DSS for 8 days by qPCR. Data are normalised to actin. Error bars indicate mean±SD of two independent experiments (total n=12). P values were calculated using Student’s t-test method (***p<0.001; ****p<0.0001; n.s., not significant). DSS, dextran sulfate sodium; UT, untreated; WT, wild type.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图6
    图6

    mNAIL通过免疫细胞调节炎症。(A)经dss处理的结肠切片mNAILWT和mNAILΔNFκB第8天小鼠染色mNAIL特异性FISH探针，F4/80和p-p65抗体。用共聚焦显微镜分析组织切片中的指示分子。(B)图显示来自a的F4/80+细胞数量的定量。(C)图显示来自a的F4/80+p-p65+细胞数量的定量。误差条表示每只小鼠检测的三个独立区域(每组n=3)的平均值±标准差。* * * p < 0.001;* * * * p < 0.0001;n.s.，不重要。P值采用双尾学生t检验方法计算。(D)mNAILWT或mNAILΔNFκB骨髓再造mNAILWT和mNAILΔNFκBDSS给药8 d。图表显示了监测8天的小鼠体重测量(E)和第8天的结肠长度。(F)基因表达分析图表肿瘤坏死因子α和(G)摘要意思βqPCR检测DSS处理8 d不同骨髓重建组的结肠组织。数据归一化为肌动蛋白。误差条表示两个独立实验的平均值±标准差(共n=12)。使用Student 's t检验方法计算P值(*** P <0.001;* * * * p < 0.0001;n.s.，不重要)。DSS，葡聚糖硫酸钠;UT,未经处理的;WT，野生型。

    的确，减少了免疫细胞的浸润mNAILΔNFκB在p38髓系特异性KO小鼠中也观察到，23可以用表达的减少来解释CCL2基因(图5 e)，是单核细胞向炎症组织募集的关键中介。21与我们的发现一致，在p38的结肠炎模型中，而不是在p65 KO小鼠中，与WT小鼠相比，趋化因子如CCL2、CCL3和CXCL10的表达减少，导致免疫细胞浸润减少。23日25CCR2-CCL2二聚体对Ly6C非常重要嗨骨髓中产生巨噬细胞的细胞，巨噬细胞后来被招募到炎症区域。27很像dss处理的mNAILΔNFκBp38ko小鼠结肠炎模型显示Ly6C水平降低嗨骨髓中的细胞，导致较少的F4/80浸润到结肠。23

    重要的是，我们的研究结果表明mNAIL在肠上皮细胞中没有诱导，TNFα的表达在mNAILWT和mNAILΔNFκB老鼠(在线补充图7A,B)．这些结果表明，BMDMs可能是主要的来源mNAIL所见的表达和表型可能源于这些细胞，我们进行骨髓移植，然后进行DSS刺激(图6 d)．我们辐照mNAILWT和mNAILΔNFκB小鼠和移植骨髓细胞分离得到mNAILWT或mNAILΔNFκB老鼠(图6 d)．mNAILWT或mNAILΔNFκB骨髓再造mNAILWT和mNAILΔNFκB给予DSS处理，测定动物体重，共8 d。相比之下mNAILWT骨髓移植mNAILWT集团(蓝色)mNAILWT骨髓重建mNAILΔNFκB小鼠(红色)表现出相似程度的体重减轻，结肠长度减少和表达肿瘤坏死因子α和摘要意思β（图6 d)．然而，当与mNAILWT骨髓移植mNAILWT组(蓝色)或mNAILWT骨髓移植mNAILΔNFκB集团(红)mNAILΔNFκB骨髓再造mNAILWT组(绿色)体重和结肠长度减少较少，表达较低肿瘤坏死因子α和摘要意思β（图6 d)．

    综上所述，这些结果表明mNAILWT和mNAILΔNFκBDSS模型中的小鼠来源于免疫细胞，尤其是浸润的髓系细胞。这些结果也表明mNAILΔNFκBDSS治疗小鼠表现出NFκB和p38活性受损，导致结肠炎症减轻。减少炎症细胞因子，如CCL2mNAILΔNFκB小鼠解释了这些小鼠骨髓中前体细胞数量的减少。28炎性细胞因子表达减少mNAILΔNFκB小鼠可能归因于p38和p65的激活减少，这是众所周知的上游事件，在应对炎症刺激时积极合作调节炎症基因的转录。

    指甲将Wip1磷酸酶从其底物p65和p38上隔离

    此前已有研究表明，Wip1磷酸酶通过去磷酸化p65负向调控炎症基因表达29和人们。30.事实上，p65和p38的激活在缺乏的情况下有所下降mNAIL（数字4M和5H)．由于TNFα刺激可激活众多信号通路，我们全面分析了TNF受体连接激活的最直接下游通路(在线补充图7C)．基于p65和p38磷酸化在指甲表达细胞时，我们假设影响这两种底物的Wip1磷酸酶31可能是一个主要的效应指甲．事实上，酶隔离是一种众所周知的控制细胞事件的调节机制。尺码为了验证这一点，我们检查了Wip1-p65在冒号中的相互作用mNAILWT和mNAILΔNFκBDSS处理和不处理小鼠，BMDMs处理和不处理LPS。我们发现更多的Wip1必然会进入p65mNAILΔNFκB结肠和BMDM细胞甚至受到刺激，因此，p65激活是有缺陷的(图7 a, B和在线补充图7D-F)．我们还发现mNAILΔNFκBMEFs和BMDM细胞，si-Wip1获救摘要意思β和肿瘤坏死因子αp65和p38蛋白的表达和磷酸化水平，进一步表明Wip1是一个关键的决定因素指甲操作(在线补充图8)．综上所述，这些结果表明指甲可以通过将Wip1磷酸酶从p65或其他Wip1底物(如p38)中分离出来来发挥其在反式中的功能。Wip1的其他底物也可能在诱导所述现象中发挥作用指甲．鉴于这种诱导依赖于NFκB的p65亚基，指甲可能是进化保守方式下全面炎症反应所需的关键因素。

    mNAIL sequesters Wip1 phosphatase away from its substrate in vivo. (A) Colon tissues were collected from mNAILWT and mNAILΔNFκB mice (n=4) treated with and without DSS for 8 days. (A) p65 protein was immunoprecipitated and coprecipitated proteins were analysed by western blot. Actin was used as a loading control. Each replicates are indicated as #1, #2, #3 and #4. (B) Graph shows quantification of coprecipitated Wip1 from A) (total n=4). Error bars indicate mean±SD of four replicates. P values were calculated using Student’s t-test method (**p<0.01; ***p<0.001). (C) Summary of phenotypes of p65, p38 myeloid specific knock mice, Wip1 null mice and mNAILΔNFκB in DSS model. Model based on our studies. (D) In the colitis model, in the presence of NAIL, activation of p38 and p65 is coordinated in a timely manner. On intestinal damage and release of microbiota to the colon, myeloid progenitor cells differentiate into immature myeloid cells which give rise to macrophages that infiltrate inflamed colon and express inflammatory genes. In the absence of NAIL, Wip1 prevents phosphorylation of p65 and p38 which leads to defects in generation of immature myeloid cells, reduction of recruitment of macrophages and deregulated expression of inflammatory genes. In the absence of TNFα or other inflammatory stimuli, Wip1 phosphatase is bound to p65 and its other targets such as p38. On activation of NFκB by TNFα, p65 is released from IκB proteins and p65 accumulates in the nucleus to activate target genes such as the NAIL lncRNA. Phosphorylation of p65 (p–p65) by a number of kinases mainly (IKKs) in the cytoplasm is critical for it to effectively bind to a subset of target genes, and subsequently, recruit p300 histone acetyltransferase for activating chromatin remodelling and for effectively kick-starting NFκB target gene expression. Meanwhile, NAIL lncRNA stimulated due to activation of p65 and squelches Wip1 phosphatase away from p65 or other Wip1 targets such as p38 thereby temporally regulating the kinetics of p65 and p38 phosphorylation and hence activation of genes dependent downstream of these important pathways. In the absence of NAIL, p65 and other Wip1 targets (p38) are avidly bound by Wip1 even after stimulation and this leads to reduced p-p65 and p-p38 levels and also reduced p300 recruitment to target genes along with lesser interaction of p38 and NFκB targets, resulting in decreased expression of the inflammatory genes. DSS, dextran sulfate sodium; UT, untreated; WT, wild type.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图7
    图7

    mNAIL将Wip1磷酸酶从其底物中隔离。(A)收集结肠组织mNAILWT和mNAILΔNFκB小鼠(n=4)分别加、不加DSS治疗8 d。(A) p65蛋白免疫沉淀，共沉淀蛋白western blot分析。肌动蛋白作为负荷对照。每个重复分别表示为#1、#2、#3和#4。(B)图表显示了A共沉淀Wip1的定量(总n=4)。误差条表示四次重复的平均值±标准差。P值采用Student 's t检验方法计算(** P <0.01;* * * p < 0.001)。(C) p65, p38髓系特异性敲除小鼠，Wip1缺失小鼠和mNAILΔNFκB在DSS模型中。模型基于我们的研究。(D)在结肠炎模型中，存在指甲，及时协调p38和p65的激活。在肠道损伤和微生物群向结肠释放时，髓样祖细胞分化为未成熟的髓样细胞，并产生巨噬细胞，巨噬细胞浸润炎症的结肠并表达炎症基因。在没有指甲， Wip1阻止p65和p38的磷酸化，导致未成熟骨髓细胞生成缺陷，巨噬细胞招募减少和炎症基因表达失调。在缺乏TNFα或其他炎症刺激的情况下，Wip1磷酸酶与p65及其其他靶标(如p38)结合。TNFα激活NFκB后，IκB蛋白释放p65, p65在细胞核中积累，激活靶基因如nf - κ b指甲lncRNA。细胞质中多个激酶主要(IKKs)磷酸化p65 (p-p65)是其有效结合靶基因子集并随后招募p300组蛋白乙酰转移酶激活染色质重塑和有效启动NFκB靶基因表达的关键。与此同时,指甲lncRNA由于p65的激活而受到刺激，并抑制Wip1磷酸酶远离p65或其他Wip1靶标(如p38)，从而暂时调节p65和p38磷酸化的动力学，从而激活这些重要途径下游依赖的基因。在没有指甲， p65和其他Wip1靶标(p38)即使在刺激后也会被Wip1热切结合，导致p-p65和p-p38水平降低，p300招募到靶基因的能力降低，p38和NFκB靶标相互作用减弱，导致炎症基因表达降低。DSS，葡聚糖硫酸钠;UT,未经处理的;WT，野生型。

    讨论

    肠道菌群在UC的发展中起着关键作用，这是非常确定的。大量的调控检查点，主要由NFκB和p38调控，共同协调炎症反应的强度和持续时间。35 36在正常情况下，粘膜免疫系统是对抗肠道微生物群的有效防御系统，同时维持促炎和抗炎反应之间的平衡。在UC中，这种平衡被严重破坏，并向过度活跃的促炎一侧转移，导致免疫细胞数量增加和细胞因子分泌水平升高。3.虽然NFκB和p38对引发炎症反应的影响已经确定，但促炎和抗炎反应是如何保持平衡的尚不清楚。因此，了解这些信号通路是如何被控制的，对于开发新的药物靶点用于炎症性疾病的治疗干预具有重要的临床价值。

    本研究首次使用小鼠遗传工具鉴定了由NFκB信号直接特异性调控的新型lncrna。我们确定了指甲(反义方向IL7基因)作为唯一的进化保守的lncRNA在小鼠和人类。指甲是由炎症细胞因子如TNFα和TLR4配体LPS以p65依赖的方式特异性诱导的。

    crispr介导的NFκB上游结合基序的缺失指甲导致其表达的丧失和体内外炎症的减少。nail缺陷细胞显示p38和p65-转激活降低，随后关键p38和NFκB靶基因表达下降。NFκB和p38已被证明是促炎和趋化基因表达所必需的，包括处于受控，Cxcl2，肿瘤坏死因子α和摘要意思β30.用于全面发炎。最明显的是损失指甲在其他实验室发表的DSS模型中，p38或p65在体内丢失23 25 37（图7 c)．我们的体外BMDM实验(图4转基因)和体内DSS模型清楚地表明，浸润的巨噬细胞是主要的来源mNAIL抑制F4/80+细胞的表达和浸润mNAILΔNFκB冒号(图6 a, B)．此外,只有指甲表达F4/80+的细胞p-p65显著升高，提示指甲其作用机制主要通过免疫细胞发挥作用(图6 a - c)．的确，骨髓重建实验进一步证明了这一点mNAILΔNFκB老鼠在重组后获救mNAILWT骨髓进入辐照mNAILΔNFκB老鼠。因此，我们可以得出结论，这些表型效应源于免疫细胞，特别是浸润的髓系细胞(图6 d)．有趣的是，与p38 KO小鼠不同，p65 KO小鼠没有表现出巨噬细胞向炎症结肠的浸润缺陷，这清楚地强调了同时激活这两种途径对炎症的成功堆积至关重要。

    我们的研究结果清楚地解释了这一点指甲将Wip1从p65和p38上同时隔离，从而实现一个协调的反应，导致(a)骨髓中前体细胞分化为未成熟的髓样细胞，(b)巨噬细胞招募到炎症区域和(c)炎症基因的表达。的确与此相反指甲、p65、p38缺失小鼠、Wip1缺失动物炎症反应增强37（图7 c)．炎症反应和表型观察指甲功能丧失小鼠与Wip1 KO小鼠相反，它们表型了p38和p65 KO模型中观察到的表型组合，很明显指甲是解释Wip1在炎症中共同激活NFκB和p38这两条重要通路的缺失环节。

    在生理条件下，炎症控制的调节包括多层反应。在dss诱导的结肠炎模型的例子中，第一个反应是上皮屏障的损伤，这引起骨髓中的成熟和募集信号。38在感知到损伤信号和微生物群对结肠的渗透后，髓样祖细胞分化为未成熟的髓样细胞，随后产生巨噬细胞，巨噬细胞被招募到结肠的炎症区域39并表达炎症基因(图7 d)．事实上，p38已被证明可以调节骨髓祖细胞向未成熟骨髓细胞的分化，然后通过调节所需的趋化剂导致巨噬细胞浸润到炎症的结肠。23 40 41在接下来的阶段，通过激活NFκB通路，这些细胞表达促炎细胞因子以进行全面的炎症反应。42由于p38和NFκB这两条重要通路必须及时被共同激活，43指甲在结肠炎中起桥梁作用，协调这两种基本途径的活动。

    在慢性疾病如IBD中，免疫抑制药物被用于部分阻断NFκB活性。3.精细解剖的作用指甲在慢性炎症性疾病和癌症方面可能会为设计更好、更有选择性的抗炎药物提供新的见解。这样的指甲抑制剂也可能更有效，因为它们同时靶向NFκB和p38信号通路。与非炎症对照组相比，指甲在发炎的结肠组织中表达明显增强(图1 g)暗示指甲NFκB的表达与NFκB活性高度相关，可作为IBDs和其他炎症为潜在病因的疾病的生物标志物和治疗靶点。

    方法

    bmdm的隔离和刺激

    从8 - 10周的兄弟姐妹股骨和胫骨中分离出bmdmmNAILWT和mNAILΔNFκB老鼠。细胞在含30% L929条件培养基的DMEM细菌塑料板上沉积4天。第4天，取出未附着的细胞，用预热的磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗，并加入新鲜培养基。第7天，用5 mM的EDTA和细胞刮板分离细胞。用CD11b和F4/80抗体对分化的BMDMs进行染色。用LPS (200 ng/mL)刺激分化的BMDMs，在指定的时间点进行蛋白质分离、RNA分离和染色质免疫沉淀。

    rna测序(RNA-seq)和分析

    使用Trizol从之前描述过的永生化WT和p65以及Ikkβ KO (-/-) mef中分离总RNA。44用10 ng/mL TNFα刺激细胞45和90分钟或对照。RNA-seq文库由Illumina Truseq总RNA测序试剂盒按照说明书制备。使用Illumina Nextseq, 2×76 bp进行配对测序。使用FastQC v0.11.8对原始序列进行碱基质量评估，使用Trimmomatic v0.321对低质量碱基和适配器序列进行筛选。利用HISAT2 V.2.1软件，对含有转录组剪接信息的优质修剪序列与小家鼠(mm10)基因组指数进行剪接比对。采用股对齐(第一股)，最后使用Samtools V.1.8对对齐进行坐标排序。参考从Ensembl (V.96)数据库中获得的基因注释，使用featurets (subread-V.1.6.2包)量化基因水平表达计数(链特异性读计数)。

    差异基因表达分析首先使用edgeR V.3.26.4包中的filterByExp()函数去除reads计数非常低的基因。过滤后重新计算库大小。fold change≥2、false discovery rate (FDR)<0.05的基因被鉴定为显著差异表达基因(significant differential expression Genes, DEGs)。参照各自基因组的GENCODE lncRNA注释提取差异表达的lncRNA。

    从动物的结肠组织中分离出RNAmNAILWT和mNAILΔNFκB给予DSS或不给予DSS的小鼠。RNA- seq文库由Illumina Truseq总RNA测序试剂盒按照说明书制备。使用Illumina Hiseq, 2×150 bp进行配对端测序。通过比较dss处理的差异来鉴定degmNAILΔNFκB与DSS-treatedmNAILWT和DSS-treatedmNAILWT与UTmNAILWT．

    UC患者的RNA测序数据来自NCBI Sequence Read Archive (SRA)， SRP125961 (GEO: GSE107593)。原始序列经过与上述相同的分析过程，并与智人(GRCh38)基因组指数进行比对。DEGs的识别具有相同的阈值(fold change≥2,FDR<0.05)。

    RNA分离和实时qPCR

    总RNA用Trizol提取，RNeasy Mini Kit柱纯化，进行基因表达分析。以1µg RNA为模板，使用Maxima第一链cDNA合成试剂盒(Thermo Scientific)进行反转录反应。然后，用SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix (BioRad)对稀释的cdna进行实时PCR。将实验CT值归一化为β-肌动蛋白，采用∆∆CT法分析相关基因表达量。引物在在线补充表1．

    Western blot分析

    用Totex缓冲液(20 mM Hepes, pH 7.9, 0.35M NaCl, 20%甘油，1% NP-40, 1 mM MgCl)提取总蛋白2， 0.5毫米EDTA, 0.1毫米EGTA, 50毫米NaF和0.3毫米NaVO3.)补充完全蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒(罗氏)。使用以下抗体进行免疫印迹:anti-p-p38 (Thr180/Tyr182) 3D7 (Cell signaling;#9215S)，反p38(圣克鲁斯;#sc-728)， anti-p-p65 (Ser536)(细胞信号;#3031 L)， anti-p65 (Santa Cruz;#sc-8008)，抗肌动蛋白(Sigma;#A2066)，抗hsp90 α/β (F-8) (Santa Cruz;#sc-13119)， p-IKKα/β (Ser176/180)(细胞信号;#2697S)， IKKα/β (H-470) (Santa Cruz;# 7607) (在线补充表1)．

    ELISA分析

    根据制造商说明书(赛默飞世尔科学公司)，从结肠组织中提取总蛋白，使用Quantikine ELISA试剂盒定量TNFα和IL1β蛋白水平。

    电泳迁移率漂移测定

    电泳迁移率漂移试验(EMSA)如前所述进行。45简单地说，20µg总蛋白孵卵于反应缓冲液(50%甘油，200 mM Hepes, pH 7.9, 4 mM EDTA pH 8.0, 4 mM DTT)， 2µg polydI-dC, 1% NP40和[γ-32P]放射性标记DNA探针在室温下放置30分钟。样品在6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上分离，凝胶干燥后暴露在巴斯- ip图像板(富士)上，用Typhoon FLA 7000 (GE Healthcare)扫描。放射标记探针:NF-κB:5 ' -TCAACAGAGGGGACTTTCCGAGAGGCC-3 '， AP-1:5 ' -CGCTTGATGACTCAGCGGGAA-3 '。

    流式细胞术分析

    骨髓细胞从mNAILWT和mNAILΔNFκB给予DSS和不给予DSS的小鼠8天。用氯化铵-钾(ACK)裂解缓冲液(Lonza)处理细胞以消除红细胞。细胞(~ 1×106细胞)与CD11b (PE)、Ly6C (BV711)和Ly6G (FITC)荧光偶联抗体在室温下孵育20分钟。为了鉴定干细胞群体，用谱系抗体鸡尾酒(APC)、c-KIT (PercpCy5.5)、Sca-1 (FITC)、CD34 (PE)、IL7ra (PeCy7)和CD16/32 (APCcy7) (BD Biosciences)对细胞进行染色。抗体孵卵后，用添加1% FBS和2 mM EDTA的PBS洗涤细胞，并使用FACS LSR2仪器(Becton Dickenson)获得细胞。使用Flow Jo软件分析数据。

    荧光原位杂交

    定制的stararis RNA FISH探针设计针对mNAIL通过使用Stellaris RNA FISH探针设计器(生物搜索技术，Petaluma, CA)。FISH使用mNAILstaris FISH探测器套装标签为类星体570，根据制造商的说明，可在网上查询www.biosearchtech.com/stellarisprotocols稍作修改。简单地说，使用切片机以4微米的厚度切片结肠组织，并将其安装在显微镜载玻片上。组织切片在100%二甲苯中浸泡10分钟，再用新鲜的100%二甲苯浸泡5分钟。接下来，将载玻片浸泡在100%乙醇中20分钟，然后在95%乙醇中孵育10分钟。随后，用柠檬酸缓冲液进行抗原提取(将载玻片在微波中浸泡在1倍柠檬酸去掩液中加热，直到开始沸腾，并在低于沸点的温度下(95°- 98°C)保存20分钟)。将载玻片放在工作台上冷却20分钟后，用dH清洗载玻片2O三次，每次5分钟，用阻塞液(1%牛血清白蛋白(BSA)， 2%胎牛血清(FBS)在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中)在室温下阻塞1小时。随后，去除阻塞液，Alexa Fluor 647抗鼠F4/80抗体(克隆号:BM8, Cat# 123122, Biolegend)在阻塞液中稀释，并添加到载玻片上，室温下1小时。用1X PBS冲洗载玻片3次，5min。组织切片在室温下70%乙醇中渗透至少1小时。用1X PBS冲洗载片两次2-5分钟后，用含有NAIL探针(125 nM)和抗体(1:100稀释，phospho-NF-κB p65 (Ser536) Rabbit mAb, Alexa Fluor 488 Conjugate，克隆:93H1, Cat#4886, CST或phospho-p38 MAPK (Thr180/Tyr182) Rabbit mAb, Alexa Fluor 488 Conjugate，克隆:3D7， #41768, CST)的杂交缓冲液(SMF-HB1-10, Stelleris)在湿室(150 mm组织培养板，用parfilm密封;在37°C的黑暗环境中过夜。孵育后，将载玻片浸泡在Wash Buffer A (SMF-WA1-60, Stellaris)中，在黑暗中37°C浸泡30分钟，使淹没的盖玻璃从载玻片上脱落。最后，除去洗涤缓冲液A，加入4′，6-二氨基氨基-2-苯基吲哚(DAPI)对核进行反染色，用盖玻片覆盖载玻片，使用蔡司LSM800显微镜成像。

    染色质免疫沉淀反应

    BMDM细胞的来源mNAILWT和mNAILΔNFκB用LPS (200 ng/mL)刺激细胞4小时。将细胞与戊二酸二丁二酰咪酰(DSG) (1.5 mM) (Thermo Fischer Scientific公司)在室温下交联30分钟，并轻轻摇动。去除DSG后，用1%甲醛固定细胞10 min，终浓度为0.125M甘氨酸淬灭反应。裂解后，对细胞裂解液进行平均大小为150-600 bp片段的超声处理，并用Protein A/G sepharose beads进行预处理1小时。离心后，2%的输入作为输入存储。裂解物(~ 400万个细胞)与4µg p65 (Santa-Cruz, sc-372)抗体在旋转器上4°C孵育过夜。用蛋白A/G琼脂糖珠免疫沉淀免疫复合物，反向交联过夜后以最终体积60µL洗脱样品。ChIP-qPCR用肿瘤坏死因子α和CXCL2promoter-specific引物。用%输入法计算富集度。

    免疫沉淀反应试验

    收集细胞并在IP裂解缓冲液[50 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5%脱氧胆酸钠，0.1%十二烷基硫酸钠(SDS)]中裂解。用Bradford法测定蛋白质浓度。p65在用p65抗体孵育细胞裂解液6小时后，用Protein G Sepharose beads再孵育2小时后进行免疫沉淀(GE Healthcare)。用洗涤缓冲液(10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA, 1 mM乙二醇-双(β-氨基乙醚)-N,N,N '，N ' -四乙酸(EGTA)， 150 mM NaCl, 1% Triton X-100)洗涤珠粒3次，免疫沉淀蛋白在2X负载样品缓冲液(LDS) (Invitrogen)中煮沸10分钟。用以下抗体进行免疫印迹，如上所述:抗wip1抗体(1:1000细胞信号;#11901)，抗p65抗体(1:1000，圣克鲁斯;sc - 8008)。

    小鼠的世代

    我们在Gm16685的5’utr中设计了靶向5’-TAGGGTTTAAAAGCGCATCC-3’和5’-AGTCTGGGAGTTTCCGATCC-3’的crrna，并生成指甲ΔNFκB通过电穿孔将CAS9/tracrRNA/ crrna复合物引入小鼠卵母细胞，如前所述。46简而言之，CARD HyperOva (0.1 mL, Kyudo, Tosu, Saga, Japan)被注射到C57BL/6N女性[日本SLC (Hamamatsu, Shizuoka, Japan)]腹腔内，随后注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)(5个单位，ASKA Pharmaceutical)。注射hCG 14小时后，从输卵管壶腹收集卵母细胞用于体外受精。47将受精卵用CAS9/tracrRNA/crRNA核糖核蛋白复合物电穿孔，然后移植到假孕雌性输卵管壶腹。19 d后，通过自然分娩或剖腹产获得后代。我们用KOD-Fx neo (TOYOBO, Osaka, Japan)和引物组(Fw: 5 ' -TTAGATTTGATCAGGGAGC-3 '， Rv: 5 ' -TCAGTGGTTTTCAGCCACTT-3 ')和直接测序对后代进行了基因分型。PCR条件为94°C 3 min, 94°C变性30 s, 55°C退火30 s, 72°C延伸30 s，共40个循环，72°C 2 min。简单地说，我们从89只处理过的受精卵中获得了22只幼崽，12只分析的幼崽中有7只携带80或82 bp的缺失。我们将这些小鼠与野生型动物杂交两代，以纯化80 bp的缺失突变体，并降低脱靶切割的风险。将杂合突变体进行杂交，得到纯合缺失80 bp的突变体小鼠，经Sanger测序证实。随后将KO小鼠与WT杂交，获得杂合子动物，作为育种家，生成同窝动物WT、HT和KO组进行实验。

    动物研究和伦理要求

    DSS模型如前所述进行。48简单地说,mNAILWT和mNAILΔNFκB用3% DSS的饮用水喂养小鼠4天，然后用正常水替代4天。每天测量体重，第8天处死小鼠。采集结肠(远端)和骨髓组织，用于下游分析，包括RNA、蛋白质和流式细胞术分析。如前所述，从结肠组织中分离肠上皮细胞进行基因表达分析。49采用评价体系对DAI进行评估:(1)体重减轻(体重未减轻为0分，体重减轻1% ~ 5%为1分，体重减轻5% ~ 10%为2分，体重减轻10% ~ 20%为3分，体重减轻20%以上为4分);50大便一致性(形状良好的小球得0分，不粘在肛门上的糊状和半成形粪便得2分，液体粪便仍粘在肛门上得4分)。对于组织学评分，由两名独立的研究人员以盲法对切片进行评分，炎症的程度、炎症的深度从0到3，隐窝损伤的程度从0到4。骨髓移植时，从动物的胫骨和股骨中获得骨髓细胞的单细胞悬液mNAILWT和mNAILΔNFκB8-10周龄(雄性)供体小鼠。3×106骨髓细胞通过尾静脉注入mNAILWT和mNAILΔNFκB致命辐照(9.5灰)8-10周龄受体(雄性)小鼠。移植后两周，小鼠被放置在dss诱导的结肠炎模型上。

    所有动物研究均按照A*STAR(新加坡)机构动物护理和使用委员会的规定进行。所有程序均根据IACUC协议ID # 181 396批准。

    统计分析

    两组间采用双尾学生t检验进行统计学分析。采用PRISM软件V.7绘制图表并进行统计分析。

    数据可用性声明

    数据可以在一个公共的、开放访问的存储库中获得。MEF细胞RNA测序数据GSE157476 -https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE157476)和小鼠结肠组织rna测序数据(GSE138235-https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE138235)储存于GEO开放存取资料库。

    伦理语句

    致谢

    我们感谢Eun Myoung Shin博士对NFκB敲除细胞的电泳迁移率变化分析。感谢陈丽周博士的建议和批判性阅读，以及Sumita Ananthkrishnan对手稿的校对。

    参考文献

    1. ↵
      2. 纽赖特曼氏金融
      ．炎症性肠病中的细胞因子．Nat Rev Immunol2014；14：329- - - - - -42．doi: 10.1038 / nri3661pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24751956
      OpenUrl CrossRef PubMed
    2. ↵
      2. 沈Z-H，
      3. 朱cx，
      4. 全y，等
      ．肠道菌群与溃疡性结肠炎的关系:益生菌和粪便菌群移植的机制及临床应用．世界肠胃醇2018；24：5- - - - - -14．doi: 10.3748 / wjg.v24.i1.5pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29358877
      OpenUrl CrossRef PubMed
    3. ↵
      2. Atreya我，
      3. AtreyaR，
      4. 纽赖特曼氏金融
      ．NF-kappaB在炎症性肠病中的作用．J实习医学2008；263：591- - - - - -6．doi: 10.1111 / j.1365-2796.2008.01953.xpmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18479258
      OpenUrl CrossRef PubMed 科学网
    4. ↵
      2. 科恩嗯，
      3. 戴夫米，
      4. Loftus电动汽车
      ．了解免疫调节剂和生物疗法用于炎症性肠病的注意事项和禁忌症．肠炎2017；23：1301- - - - - -15．doi: 10.1097 / MIB.0000000000001199pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28708806
      OpenUrl PubMed
    5. ↵
      2. 卡琳米，
      3. GretenFR
      ．NF-kappaB:将炎症和免疫与癌症的发展和进展联系起来．Nat Rev Immunol2005；5：749- - - - - -59．doi: 10.1038 / nri1703pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16175180
      OpenUrl CrossRef PubMed 科学网
    6. ↵
      2. 奥康纳点，
      3. LapointeTK，
      4. 贝克PL，等
      ．炎症可能增加炎症性肠病中肠癌风险的机制．肠炎2010；16：1411- - - - - -20.．doi: 10.1002 / ibd.21217pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20155848
      OpenUrl CrossRef PubMed 科学网
    7. ↵
      2. 罗兰J
      ．回归稳态:NF-κB反应下调．Nat Immunol2011；12：709- - - - - -14．doi: 10.1038 / ni.2055pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21772279
      OpenUrl CrossRef PubMed
    8. ↵
      2. DerrienT，
      3. 约翰逊R，
      4. BussottiG，等
      ．人类长非编码rna的GENCODE v7目录:分析其基因结构、进化和表达．基因组Res2012；22：1775- - - - - -89．doi: 10.1101 / gr.132159.111pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22955988
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    9. ↵
      2. 哈罗公学J，
      3. 法兰克人的一个，
      4. 冈萨雷斯JM，等
      ．GENCODE:编码项目的参考人类基因组注释．基因组Res2012；22：1760- - - - - -74．doi: 10.1101 / gr.135350.111pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22955987
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    10. ↵
      2. Diederichs年代
      ．非编码RNA守恒的四个维度．趋势麝猫2014；30.：121- - - - - -3.．doi: 10.1016 / j.tig.2014.01.004pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24613441
      OpenUrl CrossRef PubMed
    11. ↵
      2. 陈J，
      3. ShishkinAA，
      4. 朱X，等
      ．对哺乳动物的进化分析揭示了不同种类的长链非编码rna．基因组医学杂志2016；17：19．doi: 10.1186 / s13059 - 016 - 0880 - 9pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26838501
      OpenUrl CrossRef PubMed
    12. ↵
      2. 加伯米，
      3. YosefN，
      4. 征服一个，等
      ．一种高通量染色质免疫沉淀方法揭示了哺乳动物动态基因调控的原理．摩尔细胞2012；47：810- - - - - -22．doi: 10.1016 / j.molcel.2012.07.030pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22940246
      OpenUrl CrossRef PubMed 科学网
    13. ↵
      2. 巴里斯GD，
      3. 余RT，
      4. Karunasiri米，等
      ．Bcl-6和NF-kappaB池介导先天免疫反应的相反调节．基因开发2010；24：2760- - - - - -5．doi: 10.1101 / gad.1998010pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21106671
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    14. ↵
      2. 施密特科幻小说，
      3. 拉森双相障碍，
      4. 阁楼一个，等
      ．急性tnf诱导的细胞身份基因抑制是由nf κ b引导的辅助因子从超级增强子的再分配介导的．基因组Res2015；25：1281- - - - - -94．doi: 10.1101 / gr.188300.114pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26113076
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    15. ↵
      2. 金F，
      3. 李Y，
      4. 迪克森小，等
      ．人类细胞中三维染色质相互作用组的高分辨率地图．自然2013；503：290- - - - - -4．doi: 10.1038 / nature12644pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24141950
      OpenUrl CrossRef PubMed 科学网
    16. ↵
      2. RoglerG，
      3. 品牌K，
      4. VoglD，等
      ．核因子kappaB在炎症肠粘膜的巨噬细胞和上皮细胞中被激活．胃肠病学1998；115：357- - - - - -69．doi: 10.1016 / s0016 - 5085 (98) 70202 - 1pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9679041
      OpenUrl CrossRef PubMed 科学网
    17. ↵
      2. 以下两年代，
      3. 尼古拉斯年代，
      4. HampeJ
      ．核因子κ B激活炎性肠病．肠道1998；42：477- - - - - -84．doi: 10.1136 / gut.42.4.477pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9616307
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    18. ↵
      2. 张R，
      3. 伊藤年代，
      4. 西N，等
      ．右旋糖酐硫酸钠增加脾Gr1(+)CD11b(+)细胞，加速静脉移植后结肠炎的恢复．临床试验免疫2011；164：417- - - - - -27．doi: 10.1111 / j.1365-2249.2011.04374.xpmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21413942
      OpenUrl CrossRef PubMed
    19. ↵
      2. Trottier医学博士，
      3. 欧文R，
      4. 李Y，等
      ．小鼠结肠炎中单核细胞和粒细胞早期谱系的增强生产．美国国立自然科学研究院2012；109：16594- - - - - -9．doi: 10.1073 / pnas.1213854109pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23012474
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    20. ↵
      2. GeissmannF，
      3. 荣格年代，
      4. 利特曼博士
      ．血液单核细胞由两个具有不同迁移特性的主要亚群组成．免疫力2003；19：71- - - - - -82．doi: 10.1016 / s1074 - 7613 (03) 00174 - 2pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12871640
      OpenUrl CrossRef PubMed 科学网
    21. ↵
      2. 贝恩CC，
      3. 斯科特CL，
      4. Uronen-HanssonH，等
      ．结肠中的常驻巨噬细胞和促炎巨噬细胞代表了相同Ly6Chi单核细胞前体的另一种环境依赖性命运．粘膜Immunol2013；6：498- - - - - -510．doi: 10.1038 / mi.2012.89pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22990622
      OpenUrl CrossRef PubMed 科学网
    22. ↵
      2. ZigmondE，
      3. VarolC，
      4. FaracheJ，等
      ．炎症结肠中的Ly6C hi单核细胞产生促炎效应细胞和迁移的抗原提呈细胞．免疫力2012；37：1076- - - - - -90．doi: 10.1016 / j.immuni.2012.08.026pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23219392
      OpenUrl CrossRef PubMed 科学网
    23. ↵
      2. YoussifC，
      3. Cubillos-Rojas米，
      4. Comalada米，等
      ．髓系p38α信号通路促进肠道IGF-1的产生和炎症相关肿瘤的发生．EMBO Mol医学2018；10．doi: 10.15252 / emmm.201708403pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29907597
      OpenUrl PubMed
    24. ↵
      2. 如同一个，
      3. 罗米，
      4. 宋米，等
      ．小鼠造血干细胞的流式细胞术分析．血细胞计数一次2013；83：27- - - - - -37．doi: 10.1002 / cyto.a.22093pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22736515
      OpenUrl CrossRef PubMed
    25. ↵
      2. Waddell一个，
      3. AhrensR，
      4. 蔡而是，等
      ．小鼠肠道CCL11和嗜酸性炎症受骨髓细胞特异性RelA/p65调控．J Immunol2013；190：4773- - - - - -85．doi: 10.4049 / jimmunol.1200057pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23562811
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    26. ↵
      2. 大冢米，
      3. 康YJ，
      4. 任J，等
      ．炎症性肠病小鼠模型中骨髓系和肠道上皮中p38 α缺失的明显影响．胃肠病学2010；138：1255- - - - - -65．65年e1-9．doi: 10.1053 / j.gastro.2010.01.005pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20080092
      OpenUrl CrossRef PubMed 科学网
    27. ↵
      2. 贝恩CC，
      3. 的股票我
      ．巨噬细胞在肠道稳态和炎症中的作用．Immunol牧师2014；260：102- - - - - -17．doi: 10.1111 / imr.12192pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24942685
      OpenUrl CrossRef PubMed
    28. ↵
      2. Gschwandtner米，
      3. DerlerR，
      4. MidwoodKS
      ．不仅仅是吸引人:CCL2如何影响骨髓细胞的行为超越趋化性．前面Immunol2019；10：2759．doi: 10.3389 / fimmu.2019.02759pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/31921102
      OpenUrl CrossRef PubMed
    29. ↵
      2. 咀嚼J，
      3. Biswas年代，
      4. Shreeram年代，等
      ．WIP1磷酸酶是NF-kappaB信号通路的负调控因子．Nat细胞生物学2009；11：659- - - - - -66．doi: 10.1038 / ncb1873pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19377466
      OpenUrl CrossRef PubMed 科学网
    30. ↵
      2. 金C，
      3. 佐野Y，
      4. TodorovaK，等
      ．激酶p38 α在皮肤损伤中服务于细胞类型特异性炎症功能，并协调亲和抗炎基因的表达．Nat Immunol2008；9：1019- - - - - -27．doi: 10.1038 / ni.1640pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18677317
      OpenUrl CrossRef PubMed 科学网
    31. ↵
      2. Donehower拉
      ．磷酸酶逆转p53介导的细胞周期检查点．美国国立自然科学研究院2014；111：7172- - - - - -3.．doi: 10.1073 / pnas.1405663111pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24808140
      OpenUrl 免费的全文
    32. ↵
      2. 冯年代，
      3. Ollivier摩根富林明，
      4. 索亚操作系统
      ．酶隔离作为控制信号网络响应动态的一个调谐点．PLoS计算生物学2016；12：e1004918．doi: 10.1371 / journal.pcbi.1004918pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27163612
      OpenUrl CrossRef PubMed
    33. ↵
      2. 伊藤厘米，
      3. EmanuelliB，
      4. 卡恩CR
      ．信号通路中的关键节点:胰岛素作用的洞察．Nat Rev Mol细胞生物学2006；7：85- - - - - -96．doi: 10.1038 / nrm1837pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16493415
      OpenUrl CrossRef PubMed 科学网
    34. ↵
      2. BluthgenN，
      3. 布莱格曼FJ，
      4. Legewie年代，等
      ．隔离对信号转导级联的影响．2月J2006；273：895- - - - - -906．doi: 10.1111 / j.1742-4658.2006.05105.xpmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16478465
      OpenUrl CrossRef PubMed
    35. ↵
      2. schonthal乙肝，
      3. Guinea-ViniegraJ，
      4. 瓦格纳英孚
      ．通过调节Jun/AP-1通路靶向炎症．安·大黄2011；70(增刊)：i109- - - - - -12．doi: 10.1136 / ard.2010.140533pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21339212
      OpenUrl PubMed
    36. ↵
      2. Oeckinghaus一个，
      3. 海登女士，
      4. 戈什年代
      ．NF-κB信号通路的串扰．Nat Immunol2011；12：695- - - - - -708．doi: 10.1038 / ni.2065pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21772278
      OpenUrl CrossRef PubMed
    37. ↵
      2. 张问，
      3. 张C，
      4. 常F，等
      ．wip1在炎症性肠病中抑制肠道炎症．细胞Immunol2016；310：63- - - - - -70．doi: 10.1016 / j.cellimm.2016.07.012pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27687530
      OpenUrl PubMed
    38. ↵
      2. Gorjifard年代，
      3. GoldszmidRS
      ．肠道外的微生物-骨髓细胞串扰．白细胞生物学2016；One hundred.：865- - - - - -79．doi: 10.1189 / jlb.3ri0516 - 222 rpmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27605211
      OpenUrl CrossRef PubMed
    39. ↵
      2. 裁缝RB
      ．疾病机制:克罗恩病和溃疡性结肠炎的发病机制．Nat Clin Pract胃肠醇肝2006；3.：390- - - - - -407．doi: 10.1038 / ncpgasthep0528pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16819502
      OpenUrl CrossRef PubMed 科学网
    40. ↵
      2. 时一个，
      3. 黛比DK，
      4. Sassano一个，等
      ．p38丝裂原活化蛋白激酶的激活介导I型干扰素和转化生长因子- β对正常造血的抑制作用．生物化学2002；277：7726- - - - - -35．doi: 10.1074 / jbc.M106640200pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11773065
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    41. ↵
      2. 地表古积CR，
      3. Buitenhuis米，
      4. LaarhovenAG)，等
      ．p38 MAP激酶通过丝氨酸21上C/EBPalpha的磷酸化抑制中性粒细胞发育．干细胞2009；27：2271- - - - - -82．doi: 10.1002 / stem.152pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19544470
      OpenUrl CrossRef PubMed
    42. ↵
      2. MedzhitovR，
      3. HorngT
      ．炎症反应的转录控制．Nat Rev Immunol2009；9：692- - - - - -703．doi: 10.1038 / nri2634pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19859064
      OpenUrl CrossRef PubMed 科学网
    43. ↵
      2. 布拉德伯里厘米，
      3. Markovina年代，
      4. 魏SJ，等
      ．吲哚美辛诱导的辐射敏化和抑制电离辐射诱导的HeLa细胞NF-kappaB激活是通过涉及p38 MAP激酶的机制发生的．癌症Res2001；61：7689- - - - - -96．pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11606413
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    44. ↵
      2. TergaonkarV，
      3. BotteroV，
      4. Ikawa米，等
      ．Ikappab激酶独立的IkappaBalpha降解途径:功能性NF-kappaB活性及其对癌症治疗的意义．Mol细胞生物学2003；23：8070- - - - - -83．doi: 10.1128 / mcb.23.22.8070 - 8083.2003pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14585967
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    45. ↵
      2. 胫骨新兴市场，
      3. 干草海关，
      4. 李MH，等
      ．死盒解旋酶DP103定义人类乳腺癌的转移潜力．J临床投资2014；124：3807- - - - - -24．doi: 10.1172 / JCI73451pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25083991
      OpenUrl CrossRef PubMed
    46. ↵
      2. 野田佳彦T，
      3. 樱井N，
      4. NozawaK，等
      ．在附睾中大量表达的9个基因对小鼠的雄性生殖能力不是必需的．男科学2019；7：644- - - - - -53．doi: 10.1111 / andr.12621pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30927342
      OpenUrl PubMed
    47. ↵
      2. TokuhiroK，
      3. Ikawa米，
      4. 班我，等
      ．蛋白质二硫异构酶同源物PDILT用于精子膜蛋白ADAM3和男性生育能力的质量控制[修正]．美国国立自然科学研究院2012；109：3850- - - - - -5．doi: 10.1073 / pnas.1117963109pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22357757
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    48. ↵
      2. HelkeK，
      3. 天使P，
      4. 陆P，等
      ．神经酰胺合成酶6缺乏增强结肠炎DSS模型的炎症反应．Sci代表2018；8：1627．doi: 10.1038 / s41598 - 018 - 20102 - zpmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29374263
      OpenUrl CrossRef PubMed
    49. ↵
      2. 麦乐，
      3. Baumgart直流，
      4. 梳理老，等
      ．长期培养的小鼠原代小肠上皮细胞易感染轮状病毒．J性研究2000；74：5597- - - - - -603．doi: 10.1128 / jvi.74.12.5597 - 5603.2000pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10823867
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    50. ↵
      2. 石井KJ，
      3. 小山年代，
      4. 中川昭一一个，等
      ．宿主先天免疫受体及其他:理解微生物感染．细胞宿主微生物2008；3.：352- - - - - -63．doi: 10.1016 / j.chom.2008.05.003pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18541212
      OpenUrl CrossRef PubMed 科学网

    补充材料

    脚注

    • 斯卡纳尔和LW的贡献相当。

    • 贡献者SCA, BU和VT构想了研究并设计了实验。LW和BU在QFN的帮助下进行了机理实验。SCA、LW借助QFN、TN和MI生成的mNAIL-ΔNFκB小鼠进行小鼠DSS建模实验。JYHC进行了RNA-seq和生物信息学分析。VT指导了这项研究，并与LW和SCA一起撰写了论文。

    • 资金VT实验室由NRF-CRP17-2017-02拨款和IMCB A*STAR的核心资金支持。这项研究得到了新加坡卫生部国家医学研究理事会(NMRC/OFYIRG/18MAY-0008 to SCA)的支持。BU由新加坡A*STAR颁发的SINGA奖学金资助。Ikawa实验室。由日本教育、文化、体育、科学和技术部(MEXT)/日本科学促进协会(JSPS) KAKENHI资助(JP18K14612资助TN, JP17H01394资助MI)支持。

    • 相互竞争的利益没有宣布。

    • 出处和同行评审不是委托;外部同行评审。

    • 补充材料此内容由作者提供。它没有经过BMJ出版集团有限公司(BMJ)的审查，也可能没有经过同行评审。讨论的任何意见或建议仅是作者的意见或建议，不被BMJ认可。BMJ不承担因对内容的任何依赖而产生的所有责任和责任。如果内容包括任何翻译材料，BMJ不保证翻译的准确性和可靠性(包括但不限于当地法规、临床指南、术语、药品名称和药物剂量)，并且对因翻译和改编或其他原因引起的任何错误和/或遗漏不负责。