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文摘
客观的肠上皮细胞是一个快速更新的组织中扮演着中心角色营养吸收,屏障功能,防止肠道炎症。上皮分化的控制是至关重要的这些过程,依赖于特定类型细胞染色质的转录因子结合访问活动。在这里,我们研究了设置域分岔组蛋白赖氨酸甲基转移酶1的作用,也称为ESET (SETDB1),一组蛋白H3K9甲基转移酶,在肠上皮内稳态和炎症性肠病。
设计我们调查了老鼠本构和诱导肠上皮删除Setdb1的表达式,研究了SETDB1 IBD患者和炎症性肠病的小鼠模型,和大量的调查SETDB1变异在健康个体和IBD患者。
结果删除肠上皮Setdb1小鼠肠上皮分化与缺陷,屏障破坏,炎症和死亡率。机械的研究表明,SETDB1损失导致de-silencing内源性逆转录病毒的DNA损伤和肠道上皮细胞死亡。预测功能丧失变异在人类SETDB1经常观察到大大低于预期,符合人类生物学SETDB1的至关重要的作用。虽然绝大多数的IBD患者显示未受损伤的粘膜SETDB1表达式,比较IBD和non-IBD外显显示个体罕见的错义变异的代表SETDB1在炎症性肠病,其中一些预计与损失有关的功能和可能导致肠道炎症的发病机制。
结论SETDB1中扮演着重要的角色在肠道上皮细胞内稳态。未来的工作需要调查是否罕见变异SETDB1导致炎症性肠病的发病机制。
- 炎症性肠病
- 上皮分化
- 肠道炎症
- 炎症性肠病,遗传学
- 肠上皮细胞
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摘要框
已知在这个问题上是什么?
在肠隐窝细胞命运决定依靠细胞类型特异性转录因子的活动一个宽容的染色质结构的存在。
对高压组蛋白在肠道上皮细胞的作用。
设置域分岔组蛋白赖氨酸甲基转移酶1,也称为ESET (SETDB1)是一个H3K9甲基转移酶重要异染色质的形成,基因组稳定性和血统的承诺。
有什么新发现吗?
SETDB1在肠上皮分化和生存中起着基础性作用。
错义并预测功能丧失变异在人类没有什么发言权SETDB1,符合人类生物学SETDB1的至关重要的作用。
粘膜SETDB1表达式是维护在IBD患者绝大多数,但罕见的错义变异在IBD中可以识别并可能导致IBD发病机制。
它会如何影响临床实践在可预见的未来吗?
罕见的变异SETDB1可能导致炎症性肠病的发病机制,在未来的工作需要处理。
SETDB1表情的识别环境监管机构可能揭示SETDB1表达的治疗目标调制。
介绍
肠上皮由一个动态的表型和功能不同的细胞层,中发挥重要作用的吸收营养和水分,微生物群的激素调控。1 2这些函数是保持在一个快速更新组织,大多数上皮细胞类型的交换在几天内。1 2控制动态平衡的重要性的肠上皮细胞(IEC)所示条件与中断相关的观察上皮增殖,废除IEC的分化和细胞粘附与损失严重的缺陷在肠道内稳态和经常死亡。3 - 8
IEC亚型的细胞的身份是由细胞类型特异性转录促进和维护计划。9日10而表观遗传过程,如组蛋白修饰形成染色质景观和可以影响DNA修复转录因子的可访问性,研究肠道上皮细胞显示很大程度上宽容的染色质结构至少在早期分泌和吸收祖细胞。11早期肠道上皮细胞谱系的决定并没有受到明显的分布表示访问染色质的组蛋白标记,如H3K4me2 H3K27ac,而是很大程度上依赖于细胞类型特异性转录因子的活动存在宽容的染色质结构,这是符合非凡的肠上皮细胞的可塑性。1 2 11
而活性染色质组蛋白修饰的分布是研究在肠道上皮细胞,是不为人熟知的角色压抑的组蛋白标记H3K27 H3K9甲基化等。设置域分岔组蛋白赖氨酸甲基转移酶1,也称为ESET (SETDB1)是一种高赖氨酸特异性的甲基转移酶9组蛋白H3的残渣。12 - 14SETDB1有助于生成三甲基H3K9 (H3K9me3),这是异染色质和支持转录镇压。14日至17日而本构删除Setdb1与小鼠胚胎杀伤力,18最近的研究在小鼠诱导特异性删除Setdb1展示了一个关键的角色在肝细胞分化SETDB117与血统的承诺辅助T 1 (Th1)细胞。19有趣的是,血统Th1细胞的完整性不是由直接控制的Th1型活动,而是通过组织H3K9me3-dependent镇压内源性逆转录病毒(erv),控制Th1-specific增强剂。19这是符合观察他人,SETDB1 erv的镇压中扮演着中心角色在不同的细胞类型,影响细胞命运决定,对维持基因组的稳定性很重要。因此,删除和由此产生的de-repression SETDB1 retrotransposable元素增加大量的双链RNA(极),I型干扰素的诱导体细胞的响应和细胞死亡。20 21相反,高SETDB1转位因子的表达和沉默保护肿瘤细胞免受致命的药物暴露和导致的生存drug-tolerant persister克隆。22
SETDB1显示高表达在小肠特别是肠道上皮细胞,对其在上皮细胞内稳态的作用。在这里,我们表明,SETDB1关键功能的支持肠道上皮分化和生存。损失erv SETDB1与激活、DNA损伤和炎症,导致上皮细胞迅速死亡和小鼠的死亡率。
方法
老鼠
老鼠被安置在特定无菌(SPF)屏障设施和C57BL / 6 j背景。老鼠携带loxP-flanked等位基因Setdb1(Setdb1fl / fl)23过了Villincre24和VillincreERT225小鼠产生VillincreSetdb1fl / fl(Setdb1ΔIEC),VillincreERT2Setdb1fl / fl(Setdb1indΔIEC),分别。胚胎通过定时交配的Setdb1fl / fl和VillincreSetdb1fl / wt男性和女性。交配后的早晨时间被认为是胚胎0.5天(E)。怀孕的雌性牺牲14或16 postcoitum天,胚胎(分别E14.5和E16.5)提取和固定在4%多聚甲醛。肿瘤坏死因子ΔARE老鼠被描述过。26葡聚糖硫酸酯钠(DSS)结肠炎,老鼠收到2.5% DSS饮用水中连续五天,紧随其后的是3天正常的饮用水。分析小鼠在DSS开始治疗后第8天执行。动物研究进行了在混合性别和年龄的方式为每个实验使用的同胞。
它莫西芬治疗
诱导Setdb1删除,Setdb1indΔIEC老鼠收到5个连续腹腔注射1毫克三苯氧胺(TAM),葵花籽油,其次是六分之一注射7天。TAM-treatedSetdb1fl / fl同窝出生被用作控制。小鼠安乐死在指定的时间点后第一个TAM注入。
口服葡萄糖耐量试验,分析血清和粪便的屏障功能障碍和分析
小鼠服用TAM描述。10天,小鼠禁食6小时,体重和血糖在零时间点测量使用Accu-Chek英杰华血糖米。小鼠口服接种2毫克/克体重的葡萄糖水和血糖测量在15日30、60、120分钟是post-gavage。
屏障功能障碍的分析,老鼠口服服用0.6毫克/克体重的异硫氰酸荧光素(FITC)右旋糖酐(4 kDa, Sigma-Aldrich)磷酸盐(PBS)和血液收集后4小时。相对荧光单位测量血清中使用FlexStation 3标(分子设备)。
血清和粪便分析、血清Setdb1indΔIEC小鼠和野生型的同胞,以及小肠流体(粪便)Setdb1indΔIEC老鼠收集第一TAM注入后10天。葡萄糖和电解质(K+)的浓度,以及同渗重摩测定血清和粪便;具体来说,葡萄糖和电解质分析Cobas8000分析仪(罗氏诊断),而同渗重摩决心与渗压计(渗压计汽车、Gonotec GmbH)。
组织病理学分析
进行组织病理学分析H&E-stained部分肠道的样本Setdb1ΔIEC小鼠5周,1岁,以及TAM-treatedSetdb1indΔIEC老鼠在第十天。绒毛的长度和宽度以及中性粒细胞地穴渗透测定H&E-stained回肠部分。根据Wirtz炎症评分了等27以下成绩:没有证据表明炎症,1-scattered浸润的单核细胞,2-moderate炎症与多个病灶浸润的单核细胞,血管密度和3台增加肠壁增厚,额外透壁的白细胞浸润。
细胞坏死,评估周期acid-Schiff-stained回肠部分在半定量评估的方式和规模得分为0(无肿胀)到5(最大肿胀)。五高功率字段(HPFs分区)进行评估以严格的双盲的方式至少在9个每组样品。并行,相同的部分是得分的总量坏死碎片/失去膜完整性在典型的隐窝底部的位置,称为地穴坏死的半定量范围0(无地下室坏死)到5(完全坏死)。最后,坏死细胞的数量计入5高通滤波器至少9每个评价组样品。坏死进一步检测亚细胞水平上通过透射电子显微镜(TEM),检查对于线粒体肿胀和碎片,微绒毛的损失以及核和细胞肿胀。28
免疫组织化学、免疫荧光、酶组织化学
免疫组织化学和免疫荧光染色法进行使用石蜡包埋组织如前所述,29日除了SGLT1染色Tris-EDTA缓冲区(10毫米三,1毫米EDTA, pH值9.0)被用于抗原检索。免疫组织化学,抗体SETDB1 (D4M8R 1:1000,细胞信号技术),phospho-histone H2A。X(1:20.0, Cell Signaling Technology), OLFM4 (D6Y5A, 1:400, Cell Signaling Technology), SGLT1 (1:100, Abcam), Ly6G (E6Z1T, 1:200, Cell Signaling Technology) and F4/80 (D2S9R, 1:300, Cell Signaling Technology) were used for staining overnight at 4°C. For detection, Envision antirabbit IgG (Dako) was used according to the manufacturer’s protocol.
5‘-bromo-2脱氧尿苷(BrdU)标签,老鼠注射1毫克的BrdU (BD生物科学)腹腔内牺牲前2小时。进行免疫组织化学染色使用BrdU原位检测设备(BD Pharmingen)根据制造商的协议。
对免疫荧光抗体Ki67 (D3B5 1:400,细胞信号技术)、裂解半胱天冬酶3 (5 a1e, 1:400,细胞信号技术),粘蛋白2 (h - 300, 1:10 0,圣克鲁斯生物技术),溶菌酶C (C-19 1:400,圣克鲁斯生物技术)和chromogranin (1:400 Abcam)是用于染色一夜之间在4°C。
对于细胞死亡分析,末端转移酶的dUTP缺口末端标记(TUNEL)都使用了原位细胞死亡检测荧光素工具包(罗氏)根据制造商的协议。
使用石蜡包埋组织进行酶组织化学检测碱性磷酸酶。部分磷酸与5-bromo-4-chloro-3-indolyl孵化(罗氏)和硝基蓝四唑(罗氏)衬底在美联社缓冲区(0.1 M Tris-HCl pH值9.5,0.1 M氯化钠,0.1 MgCl2;37°C) 15分钟,在dH和PBS冲洗两次,一次2O,复染色与核快红解决方案(σ)25 s和嵌入Entellan。
隔离的肠上皮隐窝
小肠上皮隐窝和孤立如前所述。29 30细胞球要么是resuspended RLT缓冲区(试剂盒,补充β-mercaptoethanol 10µl /毫升)用于RNA隔离,实时定量PCR (RT-qPCR)或RNA序列;或1 x里帕缓冲补充齐全蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏)和停止磷酸酶抑制剂(热科学)和蛋白质进一步处理隔离。
隔离和实时qPCR RNA
组织总RNA RNA分离使用peqGOLD工具包(Peqlab VWR);2µg RNA转录成互补DNA(互补)使用高容量cDNA逆转录工具包(热费希尔科学)和qPCR如前所述。31日引物中列出在线补充表1。从孤立的上皮细胞RNA提取使用RNeasy迷你包(试剂盒)。
RNA序列和数据分析
信使RNA被poly-dT从500 ng总RNA分离浓缩使用NEBNext保利(A) mRNA磁隔离模块(内)根据制造商的指示。样本然后直接受到工作流strand-specific RNA-Seq图书馆准备(准备超二世定向RNA图书馆、内)。结扎,使用自定义的适配器(Adaptor-Oligo 1: 5”ACA CTC TTT CCC TAC ACG ACG CTC TTC CGA TCT-3’, Adaptor-Oligo 2: 5“-P-GAT CGG亚美大陆煤层气有限公司AGC ACA CGT CTG AAC太极拳AGT CAC-3”)。结扎后,适配器被XP耗尽珠净化(贝克曼库尔特)1:0.9比添加珠子的解决方案。双重索引完成在接下来的PCR浓缩(65°C)周期,使用定制的扩增引物(底漆1:AAT手枪ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC AC NNNNNNNN ACA TCT TTC排气口有条件现金援助ACA公司治理文化TCT手枪移行细胞癌CT;甘氨胆酸底漆2:CAA棉酚广汽GGC ATA CGA手枪NNNNNNNN GTG行动GGA GTT CAG ACG TGT GCT CTT 20 ATC T)后两个XP珠方法进行了净化(1:0.9),图书馆是量化使用片段分析仪(安捷伦)。测序、样本克分子数相等的汇集和测序75个基点单头NextSeq 500 (Illumina公司),导致平均每样本3000万读。测序后,RNA-SeQC (1.1.8)32是用来执行一个基本的质量控制包括其实,intronic和读取和核糖体rna基因间的分布率在每个样本。对齐的读取鼠标参考(mm10)完成GSNAP (v2018-07-04),33和运用基因注释V.92被用来检测接头地点。独特的对齐的读取与featureCounts数(V.1.6.3)34同样运用注释。正常化的原始读计数基于库的大小和测试之间的微分表达式的两个条件进行DESeq2 R包(V.1.24)35和IHW (V.1.12.0)。36RNA序列基因表达数据存在于NCBI综合(地理,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)加入GSE150836数量。
ERV分析,结合使用RepEnrich2读取进行分析37图书馆与重复20 140 131注释。38磨边机(V.3.26.839)是用于检测差异表达重复元素。
人类的粘膜转录组和遗传变异
分位数正常化数量从最近获得描述转录组分析。40研究参与者所给定的采样和数据收集前书面知情同意。此外,我们重新分析粘膜Planell获得的转录组数据等41和奥尔森等,42已通过NCBI获得的基因表达数据的综合(地理,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/,加入数字GDS4365和GDS3119)。病人特点和伦理批准的进一步信息,请参阅相应的出版物。
数据从数据库基因聚合得到的遗传变异(gnomAD,43https://gnomad.broadinstitute.org)和IBD浏览器(外显http://ibd.broadinstitute.org)。
蛋白质分离和免疫印迹分析
对蛋白质分离、隐窝在孵化1 x里帕缓冲补充齐全蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏)和停止磷酸酶抑制剂(热科学)1小时在4°C,离心机(14 000 rpm, 4°C, 10分钟)和上层的收集。免疫印迹分析,60µg蛋白质是由7.5%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离和转移到聚乙二烯二氟化物膜。屁股被封锁5%牛奶三羟甲基氨基甲烷缓冲液Saline-Tween 20和以下主要抗体:anti-p53 (D2H90 1:1000,细胞信号技术)和GAPHD (ABS16 1:1000,默克Milipore)。感兴趣的蛋白质被发现使用清晰西方ECL衬底(Bio-Rad)和4000年ImageQuant LAS成像。
透射电子显微镜法
对TEM,小肠是解剖和固定在4%甲醛(准备从多聚甲醛)100毫米PBS。几洗PBS和水之后,样本进一步解剖到1毫米组织块和后缀修改Karnovsky的固定剂(2%戊二醛、2%多聚甲醛在50 mm玫瑰)一夜之间至少在4°C。44 45样品在100毫米洗玫瑰和水,后缀/彩色水OsO在2%4解决方案包含1.5% CaCl亚铁氰化钾和2毫米2。通过二氨基硫脲,洗涤后,样品被孵化1%再次清洗,对比2%锇在第二次水。46几个洗水后,样品被全体与1%铀酰乙酸/水,再洗水,在一系列分级的乙醇脱水,渗透在epon替代嵌入812 (1 + 2、1 + 1、2 + 1 epon /乙醇混合物,2×纯环氧树脂)最后嵌入平面嵌入模具。超薄部分被削减,徕卡UC6超微切片机和收集formvar-coated槽网格。部分是对比与醋酸双氧铀及柠檬酸铅和成像Jeol JEM1400 + (Ruby, Jeol)运行在80 kV加速电压。
统计数据
未知或偏态分布的数据集,非参数统计分析。中心和变异性的措施以及统计测试应用中的每个数据集描述图的传说。棱镜V.8 GraphPad软件是用来计算P值。
结果
小鼠肠道上皮删除本构SETDB1不是出生在孟德尔比率和显示马赛克SETDB1表达式
删除Setdb1有选择地在iec,我们交叉Setdb1fl / fl老鼠VillinCre老鼠,表达Cre重组酶IEC-specific的控制Villin启动子。24口岸的VillincreSetdb1fl / wt老鼠Setdb1fl / fl显示重要的话语权缺失的小鼠与纯合子IEC-specificSetdb1删除(VillincreSetdb1fl / fl,以后Setdb1ΔIEC老鼠)(在线补充图1),这表明胚胎杀伤力。符合这个概念,Setdb1ΔIEC胚胎观察到预期比率在14.5天postconception (dpc),但在16.5 dpc(代表性在线补充图1 b, C)。那些Setdb1ΔIEC老鼠出生的发达主要趋势不是正常的只有减少体重增加和增长(在线补充图1 d, E)。组织学评价小肠的成年人Setdb1ΔIEC老鼠偶尔分叉或三叉的绒毛、地下室裂变和iec长方体形状(在线补充图1 f)。自Setdb1ΔIEC老鼠不仅出生在孟德尔比率和改变显示不完整的肠上皮结构,我们研究了肠道上皮Setdb1在这些老鼠表达。Setdb1ΔIEC老鼠仅小幅减少Setdb1表达式,在结肠达到统计学意义,但不是在小肠(在线补充图1 g)。免疫组织化学染色证实肠SETDB1表达式是主要局限于肠道上皮和上皮改变显示区域Setdb1ΔIEC老鼠的特点是马赛克的表达与隐窝SETDB1缺乏SETDB1表达式毗邻隐窝与正常SETDB1表达式逃过删除(在线补充图1 h)。类似的观察了小鼠胚胎中活了下来,直到16.5 dpc (我在线补充图1)。重点分析的隐窝SETDB1蛋白表达在成人的损失Setdb1ΔIEC老鼠在上皮增殖而适度增加Villin-Cre-negativeSetdb1fl / fl同窝出生的,Setdb1ΔIEC隐窝逃过删除(在线辅助图2)。此外,绒毛分岔是选择性地观察到的地区SETDB1表达式和地下室裂变的损失也是主要发现地区的损失SETDB1表达式(在线辅助图2 b)。然而,绝大多数的小肠上皮细胞显示正常的表达SETDB1没有上皮变化(数据没有显示)。因此,Setdb1ΔIEC老鼠证明很大程度上改变RNA的表达肠上皮分化的标志(图2 c在线补充)。然而,年龄Setdb1ΔIEC老鼠增加地下室由中性粒细胞浸润(在线辅助图2 d),适度的绒毛削弱(在线辅助图2 e),偶尔的透壁的免疫细胞浸润(在线辅助图2 f),与温和的肠道炎症的不完全外显率一致。这些结果证明本构肠道上皮删除Setdb1与胚胎杀伤力,而幸存的老鼠很大程度上逃避删除吗Setdb1。这表明肠上皮SETDB1的关键作用。
失去上皮Setdb1与肠道炎症和早期死亡率
限制逃离Setdb1删除,我们生成的VillincreERT2Setdb1fl / fl老鼠(以下,Setdb1indΔIEC老鼠),它允许TAM-inducible IEC-specific删除Setdb1。25Setdb1indΔIEC老鼠出生在孟德尔比率和发育正常,如预期。相比Setdb1ΔIEC老鼠,TAM注入Setdb1indΔIEC老鼠与健壮的IEC-specific删除Setdb1经定量PCR (图1一个)和免疫组织化学染色(图1 b)。从第七天开始第一次TAM管理后,Setdb1indΔIEC老鼠腹泻和进步损失的重量,在TAM-injected没有被观察到VillincreERT2负Setdb1fl / fl同窝出生的(图1 c)。在第一次TAM注入后第十天,所有Setdb1indΔIEC老鼠不得不牺牲由于嗜睡,严重的减肥和脱水。充满液体的验尸显示扩张,这些小鼠的小肠(图1 d)。强饲法与FITC-dextran证实肠道屏障功能障碍Setdb1indΔIEC老鼠(图1 e),符合肠道流体损失。组织学评价小肠透露大量的绒毛削弱和适度的地穴伸长导致大幅增加在绒毛/地下室比(图1 f,在线补充图3 a, B)。此外,Setdb1indΔIEC老鼠增加免疫细胞密度在固有层(图1 f),地下室由中性粒细胞浸润(图1 g),增加巨噬细胞和中性粒细胞的数量在固有层(图1设定h),符合肠道炎症(图1 j)。回肠粘膜的Setdb1indΔIEC小鼠进一步显示,增加表达的趋化因子、细胞因子和其他急性期蛋白和炎症介质(图3 c在线补充)。类似的结果在结肠炎症(在线辅助图3 d),焦表面上皮的损失(在线辅助图3 e),大量的细胞碎片以及粘液在肠道内腔(在线辅助图3 e)和减少结肠长度(在线辅助图3 f)。
诱导肠上皮Setdb1删除与炎症和死亡率相关。(一)RNA的表达Setdb1回肠和结肠的表示鼠标菌株10天后第一它莫西芬注射由定量PCR。(B)代表SETDB1回肠的免疫组织化学染色显示鼠标压力第一它莫西芬注射后10天。注意失去上皮细胞信号和守恒的染色的SETDB1固有层Setdb1indΔIEC老鼠。(C)的体重表示鼠标它莫西芬注射后的菌株从第0天开始。平均数±标准差。* * P≤0.01;* * * * P≤0.0001。(D)代表图像的验尸显示鼠标菌株10天后第一它莫西芬注射。(E)异硫氰酸荧光素(FITC)葡聚糖测定血清中显示鼠标的菌株10天后第一它莫西芬注射。(F) Villus-crypt比率以及代表的回肠)染色显示鼠标菌株10天后第一它莫西芬注射。(G)的隐窝包含嗜中性粒细胞比例(左)和代表)染色(右)的回肠表示鼠标菌株第一它莫西芬注射后10天。箭头强调隐窝脓肿。 (H–I) F4/80 (H) and Ly6G (I) immunohistochemistry with quantification (left) and representative images (right) in the ileum of the indicated mouse strains 10 days after the first tamoxifen injection. (J) Inflammation scores in the small intestine of the indicated mice as obtained by analysis of H&E stainings. Representative results of two-three independent experiments are shown (A–J). In (A, E–J), dots represent individual mice and the bar indicates the median. Size bars indicate 100 µm. The Mann-Whitney U test (A, E–J) or Student’s t-test (C) were applied. SETDB1, SET Domain Bifurcated Histone Lysine Methyltransferase 1, also known as ESET.
需要SETDB1肠道上皮分化和干细胞的生存
的肠上皮细胞Setdb1indΔIEC老鼠一个长方体形状的iec euchromatin-enriched细胞核大,符合异染色质的损失(图2一个)。电镜证实存在组织上皮细胞(图2 b)和形状不规则的肠上皮细胞和肠上皮细胞的核(图2 c,在线辅助图4)和一个改变微绒毛结构(图2 c,在线辅助图4 b)。按照缺陷肠上皮分化,mucin-2 (Muc2)阳性的杯状细胞和血清素和chromogranin积极enteroendocrine细胞在小肠的大幅减少Setdb1indΔIEC老鼠(图2 d)。Lysozyme-positive Paneth细胞在很大程度上保留了小肠隐窝的底部Setdb1indΔIEC老鼠(图2 h,在线辅助图4 c)。Setdb1indΔIEC老鼠还显示mispositioned Paneth细胞沿着绒毛轴和异常分泌细胞阳性Muc2和溶菌酶在绒毛技巧(图2我)。值得注意的是,Paneth细胞的寿命47大大超过了生存Setdb1indΔIEC老鼠,这可能导致有限Paneth细胞改变这些老鼠。
改变肠道上皮分化Setdb1indΔIEC老鼠。回肠绒毛技巧(A)代表)染色法显示鼠标的菌株10天后第一它莫西芬注射。箭头表示明亮,圆形细胞核Setdb1indΔIEC老鼠。(c)代表电子显微镜(EM)图像的回肠表示鼠标菌株10天后第一它莫西芬注射。箭头表示组织上皮细胞(B)。(C)、一个长方体Setdb1indΔIEC肠上皮细胞显示箭头强调一个形状不规则的原子核(N)红线显示基底膜。(D, F)表示基因的RNA表达由定量PCR的回肠表示鼠标菌株10天后第一它莫西芬注射。免疫荧光染色法(E)代表mucin-2 (Muc2)(红色)的回肠表示鼠标菌株第一它莫西芬注射后10天。箭头表示在野生型小鼠(WT)杯状细胞。(G-H)代表Chga免疫荧光染色法(G),绿色,Lyz1 (H)、绿色和双染色Lyz1(绿色)和Muc2(红色)(I)的回肠表示鼠标菌株第一它莫西芬注射后10天。量化Lyz1-positive细胞(H)左边所示。箭头(I)表明Lyz1和Muc2 double-positive细胞。代表三个独立实验的结果(A, d - i)所示。EM图像(c)是三个老鼠每组的代表。在(D、F、H),点代表个人老鼠和酒吧表示中位数。大小酒吧显示50µm (A, E,胃肠道),10µm (B, C)。Mann-Whitney U测试(D、F、H)应用。 SETDB1, SET Domain Bifurcated Histone Lysine Methyltransferase 1, also known as ESET.
Setdb1indΔIEC老鼠的大幅减少,碱性磷酸酶的表达和活性,差异化的肠上皮细胞的标记(图3 a - b)。分化小肠iec扮演关键角色在葡萄糖的吸收肠道内腔,其中包括顶端的葡萄糖转运体SGLT1 (Slc5a1)和基底外侧葡萄糖转运体GLUT2 (Slc2a2)。48在Setdb1indΔIEC老鼠,SGLT1表达式显示表达式(在逐步减少图3 c),几乎完全丧失SGLT1表达式的顶端细胞膜iec前不久死亡(图3 d),而GLUT2表达式仍然是不变的(在线辅助图5)。血糖水平随着时间的推移显示类似的减少明显的低血糖在第一TAM注入(后第十天图3 e)。口服葡萄糖填喂法确认缺陷肠道葡萄糖吸收Setdb1indΔIEC老鼠(图3 f)。符合这些缺陷,葡萄糖浓度较高的肠道内腔与血清Setdb1indΔIEC老鼠,有类似影响钾(图3 g)。因此,同渗重摩高在肠道内腔相比,这些小鼠的血清(图3 g),这是预期导致渗透性腹泻和充满液体的小肠的解释道Setdb1indΔIEC老鼠。
肠上皮细胞分化的损失Setdb1indΔIEC老鼠与那些相关联。(A、C、H)表示基因的RNA表达由定量PCR的回肠表示鼠标菌株(A),第一它莫西芬注射后10天。(B)代表碱性磷酸酶酶组织化学的回肠表示鼠标菌株10天后第一它莫西芬注射。(D)代表免疫组织化学染色SGLT1回肠的表示鼠标菌株10天后第一它莫西芬注射。箭头显示完整SGLT1 SGLT1染色的染色和箭头损失。(E-F)血糖水平(E)和葡萄糖耐量试验(F)显示鼠标的菌株在表示时间点(E)或10天后第一它莫西芬注射(F)。* * P < 0.01。葡萄糖(G)和血清钾浓度以及同渗重摩和小肠细胞腔的内容(粪便)表示老鼠他莫昔芬后10天。代表2 - 3独立实验显示的结果。在(A、C、E、H),点代表个人老鼠和酒吧表示中位数。(F),意味着±扫描电镜显示。 In (G), the bar indicates the mean. Size bars indicate 100 µm. The Mann-Whitney U test (A, C, E, H), the Student’s t-test (F) or one-way analysis of variance (G) were applied. SETDB1, SET Domain Bifurcated Histone Lysine Methyltransferase 1, also known as ESET.
提供洞察肠上皮改变的机制Setdb1indΔIEC老鼠,我们集中分析基因的表达参与上皮分化。虽然大多数的基因研究显示小或无表达的变化Setdb1indΔIEC老鼠(在线辅助图5 b)、转录因子Kruppel-like因子4 (Klf4)和Wnt受体Frizzled-5 (Fzd5)表现出表达的逐步丧失Setdb1indΔIEC老鼠(图3 h)。删除Klf4肠上皮与缺陷相关的终端吸收肠上皮细胞的成熟,碱性磷酸酶的表达和不合Paneth细胞绒毛。49删除Fzd5也与不合Paneth细胞有关。50因此,改变Klf4和Fzd5表达Setdb1indΔIEC老鼠可能导致受损终端吸收肠上皮细胞的分化和不合Paneth细胞。的转录因子Foxa1促进了高脚杯,enteroendocrine分化51增加在Setdb1indΔIEC老鼠,有可能作为补偿机制的酒杯和enteroendocrine细胞损失。在一起,这些发现表明,删除Setdb1和产生的缺陷细胞异染色质的形成与损失相关联的大多数IEC的身份类型。这是预期结果都直接与终末分化相关基因的表达变化iec以及间接影响转录因子的表达(Klf4)和信号传输介质(Fzd5)参与上皮分化的规定。
在去世前不久,小肠隐窝的底部Setdb1indΔIEC老鼠似乎完全由Paneth细胞,尽管Paneth细胞数量没有增加这些老鼠(图2 h)。这提出的问题是否肠道干细胞(isc),它位于Paneth细胞间地下室底部,消失在应对肠道上皮删除Setdb1。事实上,小肠iec获得Setdb1indΔIEC老鼠大量减少干细胞的基因的表达Lgr5就和Olfm49天之后Setdb1删除(图4一)。而剩余OLFM4+isc仍存在于小肠隐窝的底部Setdb1indΔIEC老鼠在这个时间(在线辅助图6),隐窝底部完全缺乏isc 10天(图4 b)。然而,扩散,至少在的细胞后被保留,直到第十天Setdb1删除(在线补充图6 b)。在一起,这些数据揭示的关键作用Setdb1在肠上皮分化和干细胞的生存。
Setdb1删除导致de-repression内源性逆转录病毒和I型干扰素的诱导反应。(一)RNA的表达Lgr5就和Olfm4由定量PCR (qPCR)显示鼠标的回肠菌株9天第一次他莫昔芬后注入。(B)的量化和代表免疫组织化学染色OLFM4回肠的表示鼠标菌株10天后第一它莫西芬注射。箭头显示肠道干细胞(isc)VillincreERT2负Setdb1fl / fl老鼠。(C)基因本体论(去)的前100名调节基因的RNA序列小肠隐窝Setdb1indΔIEC老鼠第一它莫西芬注射后2天。(D)的热图的表达Setdb1(上)和内源性逆转录病毒(erv)(下图)从核糖核酸测序获得的小肠隐窝的Setdb1indΔIEC老鼠第一它莫西芬注射后2天。(E)的表达式表示erv(上)Setdb1(下图)的回肠表示鼠标菌株第一它莫西芬注射后5天由qPCR决定。(F)表示基因的RNA表达由qPCR小鼠的小肠中第一次它莫西芬注射后在指定的时间点。代表2 - 3独立的实验结果(a - b, E-F)所示。RNA序列进行一次(c - d)。E-F (a - b),点代表个人老鼠和酒吧表示中位数。大小酒吧显示100µm。E-F Mann-Whitney U测试(a - b)是应用。SETDB1,设置域分岔组蛋白赖氨酸甲基转移酶1,也称为分野。
SETDB1导致内源性逆转录病毒和防止DNA损伤的沉默
我们接下来解决机制通过SETDB1调节肠道内稳态。区分主要的影响Setdb1删除从二级iec的后果上皮分化和进步的炎症改变,我们执行一个RNA序列肠隐窝第一TAM注射后2天。而Setdb1表情只是在TAM-injected减少到50%的水平VillincreERT2负Setdb1fl / fl在这个较早的时间点(同窝出生的在线辅助图6),基因本体论(去)项分析显示细胞死亡的签名,炎症和I型干扰素信号(图4 c,在线补充表2)。Setdb1对异染色质的形成至关重要,erv的沉默。20 21因此,Setdb1删除已经证明与de-silencing retrotransposable元素,基因组不稳定性和激活的I型干扰素信号通过双链RNA,最终导致细胞死亡或恶性转变。20 21符合这些发现,RNA序列隐窝2天后第一TAM注入已经表现出一致的几个erv的表达增加Setdb1indΔIEC老鼠(图4 d),这与以上的差别的程度对这些相关Setdb1表达式(图4 d顶线)。在后来的时间点,当Setdb1表达式进一步降低(图4 e较低的面板),表达式(erv展览一个戏剧性的增加图4 e)。这是与进步的I型干扰素的诱导有关签名的小肠Setdb1indΔIEC老鼠(图4 f)。此外,iec的Setdb1indΔIEC老鼠大量诱导组蛋白H2AX磷酸化(γH2AX), DNA损伤的标志,在隐窝上皮最为明显(图5一个)和与p53的积累(图5 b)。因此,小肠上皮细胞Setdb1indΔIEC老鼠表现出显著增加细胞死亡由TUNEL染色(图5 c)。而RNA序列在早期时间点建议一个诱导细胞凋亡(图4 c),与p53积累(图5 b在后期),分析裂解半胱天冬酶3没能证明任何显著的细胞凋亡在iec的证据Setdb1indΔIEC老鼠或VillincreERT2消极的同胞(在线辅助图6 d)。相反,Setdb1indΔIEC老鼠证明的证据在隐窝上皮坏死细胞肿胀和坏死细胞(图5 d)。这证实了电子显微镜显示肿胀和线粒体的结构完整性的损失(图5 e-f),其他细胞器和核膜的完整性损失(图5 f)和肿胀细胞质以及质膜的破裂(图5克)。在一起,这些数据表明一个关键的角色在iec SETDB1基因组的稳定。亏损SETDB1 erv的肠上皮与de-repression相关联,从而导致DNA损伤,p53积累和明显的上皮细胞死亡和与肠道炎症有关,缺陷养分吸收和死亡率。
失去上皮SETDB1与DNA损伤和细胞死亡相关。(A)的组蛋白比例H2AX磷酸化(γH2AX)阳性细胞/地下室由免疫组织化学染色法染色(右)(左)和代表的回肠表示鼠标菌株。(B)免疫印迹分析p53和GAPDH小肠肠道上皮细胞(iec)表示鼠标菌株。(C)比例的末端转移酶的dUTP缺口末端标记(TUNEL)阳性细胞/地下室(左)和免疫荧光染色(绿色,TUNEL)代表的回肠表示鼠标菌株。箭头显示TUNEL-positive iec。(D)量化的地穴坏死和细胞肿胀和坏死细胞的数量/高功率领域的回肠表示鼠标菌株。(eg)代表电子显微镜图像的回肠表示鼠标菌株。箭头表示正常的线粒体(E-F)。箭头表示肿胀和线粒体的结构完整性的损失(E)和损失核膜的完整性(F)以及细胞质肿胀和破裂的质膜(G),所有数据得到第一它莫西芬注射后第十天。代表两个独立实验的结果显示(g)。 In (A, C–D), dots represent individual mice and the bar indicates the median. Size bars indicate 100 µm in (A, C), 2 µm (E, F), 10 µm (G). The Student’s t-test (A) or the Mann-Whitney U test (C–D) were applied. SETDB1, SET Domain Bifurcated Histone Lysine Methyltransferase 1, also known as ESET.
人类SETDB1表达,在炎症性肠病的遗传变异
我们的数据证明SETDB1在小鼠肠道内稳态的重要作用,表明SETDB1与生活不兼容。值得注意的是,即使是适度的减少Setdb1表达小鼠与de-repression erv的I型干扰素信号和细胞死亡(图4 d e),这是符合最近的演示haploinsufficiency肠上皮SETDB1的老鼠。52SETDB1在哺乳动物高度保守的氨基酸相似性为92%人类和老鼠,53从而提高是否SETDB1起着同样重要的作用在人类生物学。符合这个概念,人类SETDB1展览和非常低的期望数目比率低错义并预测损失函数(pLoF)变异,分别为(图6,基因组数据库(gnomAD聚合43))。此外,SETDB1显示功能丧失的一个概率不能容忍(pLI) 1 (gnomAD)的得分,这是符合haploinsufficiency甚至表明,适度的失调SETDB1表达可能导致人类病理学。
人类在IBD SETDB1表达和变异。(一)期望率的变异SETDB1基于基因组聚合数据库(gnomAD,43https://gnomad.broadinstitute.org)。pLoF,预测功能丧失变体。(c)分位数正常化阅读数表示基因的RNA序列活检获得的发炎(如果)或non-inflamed (NI)患者肠粘膜的克罗恩病(CD),溃疡性结肠炎(UC),健康对照组(CTR NI)或疾病控制(CTR)。组的详细描述,看到汉斯勒等。40(de)的相对表达SETDB1粘膜转录组的表示病人。病人组以前由Planell描述等41(D)和奥尔森等42(E) (F) 1:150935127 C / T等位基因频率的变异(rs145309946 pArg1075Cys)在芬兰(鳍)和欧洲(NFE) non-Finnish IBD和non-IBD人口通过IBD浏览器(外显http://ibd.broadinstitute.org)。克鲁斯卡尔-沃利斯测试(中)或确切概率法(F)(有关更多信息,请参见里瓦斯等54)应用。NS,不重要;SETDB1,设置域分岔组蛋白赖氨酸甲基转移酶1,也称为分野。
有趣的是,王等最近描述,肠道SETDB1 RNA和蛋白表达在IBD患者一直减少到大约50%的水平在控制,这意味着潜在的贡献大部分IBD患者肠道炎症。52鉴于这些数据,我们首先检查Setdb1表达在肠道炎症的小鼠模型和具体的DSS模型化学诱导结肠炎27和肿瘤坏死因子ΔARE回肠炎模型。26回肠肿瘤坏死因子ΔARE小鼠与野生型的同胞相比,SETDB1表达式是不受影响的,没有证据表明一个I型干扰素签名检测(在线辅助图7)。DSS模型,小鼠显示结肠大幅度降低Setdb1表达式(在线辅助图7 b)。然而,DSS行为通过对iec的毒性27和SETDB1表达很大程度上局限于肠道上皮细胞,表明DSS-induced iec可能导致的损失减少Setdb1表达式。符合这个概念时,老鼠DSS-treated大幅减少的表达上皮钙粘蛋白(标志背景)(在线辅助图7 b)和免疫组织化学染色证实SETDB1信号的损失仅限于上皮糜烂和溃疡,同时保持上皮细胞显示没有SETDB1表达式(在线辅助图7 c)。因此,I型干扰素签名不是DSS-treated小鼠的结肠(检测到的在线辅助图7 b)。
接下来,我们检查的表达SETDB1粘膜转录组中定义良好的患者群发炎或静止的克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)、疾病控制和健康对照组。40由王与观察等,52我们发现的严格监管SETDB1表达在所有研究患者团体没有证据减少表达式在炎症性肠病(图6 b)。此外,我们没有发现证据,I型干扰素在IBD患者签名(图6 c)。这是两个独立的证实军团由Planell描述等41和奥尔森等,42谁比较粘膜转录组的活跃的和不活跃的加州大学non-IBD控制。符合观察在我们的病人群体,我们没有发现证据的失调SETDB1表现在这两个独立的炎症性肠病组(图6 d e)。在一起,这些结果表明,改变SETDB1表达不是IBD的共同特征。然而,罕见的错义和预测功能丧失变体中描述SETDB1(在线辅助表3和https://gnomad.broadinstitute.org),其中一些人在IBD中与non-IBD(外显在线辅助表4和http://ibd.broadinstitute.org)。这个应用,例如,p。一个rg1075Cys (rs145309946), a rare missense variant in a conserved residue of SETDB1 (PhyloP 2.37, PhastCons 1), which is predicted to be damaging (MutationTaster) and over-represented in IBD compared with non-IBD exomes across different cohorts (图6 f,在线辅助表4)。因此,它还有待调查罕见变异SETDB1导致IBD发病机制。
讨论
在这项工作中,我们解决SETDB1的角色,一个H3K9甲基转移酶的关键异染色质的形成,在肠道上皮细胞。我们表明,SETDB1在肠上皮内稳态中扮演不可或缺的角色。删除上皮Setdb1与肠上皮分化缺陷有关,de-silencing erv和安装的先天免疫反应的特点是I型干扰素签名,可能发生下游dsRNA感应的。20 21 52DNA损伤和p53积累以及进步炎症促进大规模在肠道上皮细胞的死亡,这是与故障相关的肠道屏障,肠道干细胞间的损失。此外,改变上皮分化与转运蛋白营养吸收的关键,如SGLT1,进一步促进死亡率通过代谢功能障碍包括严重的低血糖和脱水由于障碍分解和渗透液的变化。因此,试图既定的删除Setdb1在肠道上皮细胞由于胚胎杀伤力是徒劳的。那些Setdb1ΔIEC出生的老鼠显示部分逃离Setdb1删除只有焦点地区Setdb1损失和邻近的隐窝,逃脱了删除和维护肠道内稳态。虽然我们没有逃避机制研究Setdb1删除在Setdb1ΔIEC老鼠,类似的观察胚胎杀伤力和不完整的Setdb1删除已经由他人在同一小鼠模型。52因此,这些数据强调SETDB1和SETDB1-dependent异染色质的形成的一个关键的角色在肠上皮内稳态,分化和生存。
重要的是,我们的研究结果是一致的结果最近获得的他人。因此,使用类似的小鼠模型,王等表明,肠道上皮删除Setdb1与de-repression erv和双链RNA的增加,由Z-DNA-binding感觉到蛋白1 (ZBP1)和肠上皮细胞通过ZBP1之间的相互作用和促进necroptosis receptor-interacting蛋白激酶3。52与我们的研究结果相似,诱导肠上皮删除Setdb1与快速发展的肠道炎症,屏障崩溃和死亡。52这些结果证实SETDB1在肠道内稳态的关键作用,证明SETDB1促进necroptosis iec的损失。
有趣的是,即使是适度的监管SETDB1表达与上皮内稳态变化有关。因此,即使在早期的时间点TAM注射后,在iec SETDB1表达式时只减少到50%的水平在野生型的同胞,核糖核酸测序证明签名de-repression erv, I型干扰素信号和细胞死亡(图4 c - d)。Setdb1ΔIEC老鼠,这很大程度上逃跑了Setdb1删除,也表现出改变肠道架构和温和的肠道炎症(在线辅助图2 d, E, F)。此外,王等证明肠道炎症在杂合的肠道上皮Setdb1删除。52这些结果表明haploinsufficiency肠上皮SETDB1的老鼠。按照类似相关的角色SETDB1在人类生物学、预测功能丧失变异在人类SETDB1经常观察到的比预期的要小得多(图6)pLI得分为1 (gnomAD),与人类haploinsufficiency一致。这些数据增加的可能性甚至温和或瞬态的监管SETDB1表达式,例如,针对环境因素,可能产生负面影响上皮细胞功能,促进肠道炎症。有趣的是,和符合这个概念,王等描述了一个一致的减少SETDB1表达在人类IBD的患者,建议潜在的参与SETDB1在炎症性肠病的发病机制。52然而,这些数据令人吃惊的特性与SETDB1损失有关,如基因组不稳定,不常在IBD。因此,我们分析了SETDB1表达公正的粘膜转录组数据集的IBD患者和控制通过我们和其他人。这些数据集显示的严格监管SETDB1患者群体之间及其内部的表达,没有下降的证据SETDB1表达式或IBD的I型干扰素签名。SETDB1表达式在小肠主要局限于iec和小鼠模型损失iec的DSS模型结果显示减少肠道SETDB1表达式(在线辅助图7 c)。尽管是推测性的,因此有可能抽样地区的肠道侵蚀和溃疡可能是导致肠道SETDB1表达降低了王的观察等从我们的研究结果,这是截然不同的。总之,从根本上符合SETDB1在肠上皮生物学上起着重要的作用,改变在IBD SETDB1表达不是一个共同的特点,因此不太可能一个通用的机制促进肠道炎症性肠病的炎症。然而,罕见变异SETDB1描述,其中一些人在IBD患者中图6 f)。因此,它是可能的罕见变异SETDB1促进炎症性肠病的发病机制,有可能在一个单基因的方式。
总之,我们的工作演示了一个关键角色的SETDB1肠道上皮内稳态和预防肠道炎症。未来的工作需要调查是否罕见变异SETDB1可以促进炎症性肠病的发病机制。
确认
作者要感谢Caldarelli和b Bazylak-Kaps优秀技术援助以及赫尔姆斯利IBD程序和组织提供了外显子组外显变量数据进行比较。贡献组的完整列表可以在找到http://ibd.broadinstitute.org/about。
引用
脚注
LJ和KP是共同第一作者。
推特@KonradAden
LJ和KP同样起到了推波助澜的作用。
贡献者可,LJ, KP YZ, LM老鼠进行实验。LJ, MB,啊,RH, B-SL KA, ML,广告进行了基因表达分析。TK EM进行分析。AvM和AL细胞死亡进行分析。和GS生成并提供Setdb1fl / fl老鼠和导致实验的实验设计。TC和VN电解质,血糖和同渗重摩测量。铝、SS、PCR、房颤和JH导致监督。深圳协调和监督学习和写的手稿与输入所有的合作者。
资金这项工作是支持的组织学设施,DRESDEN-concept基因组中心的电子和光学显微镜设施CMCB TU德累斯顿技术平台,德意志Forschungsgemeinschaft (DFG)和卓越DFG集群“再生治疗中心”(深圳),DFG集群卓越的精密药在慢性炎症(PMI EXC2167)和脱硫项目号213249687 - sfb 1064 / TP11和项目号213249687 - sfb1321 / TP13 (GS)。
相互竞争的利益没有宣布。
病人和公众参与病人和/或公众没有参与设计、实施、报告或传播计划的研究。
病人同意出版不是必需的。
伦理批准所有老鼠和实验处理批准并符合theinstitutional指南和各自的部门(TU)德累斯顿技术大学(DD24-5131/394/21)。人类研究方案经伦理委员会批准的基尔大学的医学院(参考B231/98-1/13)。
出处和同行评议不是委托;外部同行评议。