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肝脏病学
原始研究
CCT3 -LINC00326轴调节致癌脂质代谢
  1. 乔纳斯Nørskov Søndergaard1,
  2. 基督教Sommerauer1,
  3. Ionut Atanasoai1,
  4. 劳拉·C Hinte1,
  5. 耿跨度很大1,
  6. 会Guiducci2,
  7. 佬司布劳提根3.,
  8. Myriam Aouadi4,
  9. Lovorka经纪人2,
  10. 伊莎贝尔休闲区5,
  11. 克劳迪娅·库特1
  1. 1微生物、肿瘤和细胞生物学学系，生命科学实验室,卡罗林斯卡医学院,斯德哥尔摩、瑞典
  2. 2Barts癌症研究所，癌细胞和分子生物学中心，John Vane科学中心，伦敦玛丽女王大学,伦敦、英国
  3. 3.比较医学,卡罗林斯卡医学院,斯德哥尔摩、瑞典
  4. 4医学系的,卡罗林斯卡医学院,斯德哥尔摩、瑞典
  5. 5生理学与药理学学系,卡罗林斯卡医学院,斯德哥尔摩、瑞典
  1. 对应到Claudia Kutter博士，瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡学院微生物、肿瘤和细胞生物学研究室，生命科学实验室;claudia.kutter在{}ki.se

摘要

客观的为了更好地理解癌细胞的转录表型，我们对rna结合蛋白(rbp)进行了全球特征分析，以识别改变的rna，包括长链非编码rna (lncRNAs)。

设计为了阐明RBP-lncRNA在癌症中的相互作用，我们策划了一份人类细胞中约2300个高表达rbp的列表，在多个队列中测试了rbp和lncrna对患者生存的影响，改变表达水平，整合了各种测序、分子和细胞基础数据。

结果在21种癌症中，rbp的高表达对患者的生存有负面影响，尤其是肝细胞癌(HCC)。在敲除前10个上调的rbp和随后的转录组分析后，我们鉴定出88个差异表达的lncrna，包括34个新的转录本。crispra介导的四种lncrna过表达对HCC细胞表型和转录组有重要影响。进一步研究发现，四对RBP-lncRNA参与了不同的调控过程。最明显的RBP- lncrna连接影响脂质代谢，非典型RBP CCT3调节LINC00326以不依赖伴侣的方式。CCT3-的扰动LINC00326调节网络导致脂质积累减少，脂质降解增加在cellulo以及肿瘤生长减弱在活的有机体内。

结论我们发现RBP基因在HCC中的表达受到干扰，并确定RBP在正常生理条件下发挥了超出其任务之外的额外功能，可通过lncrna刺激或增强并影响肿瘤生长。

  • 脂质代谢
  • 肝细胞癌

数据可用性声明

数据可在一个公共的、开放访问的存储库中获得。所有与研究相关的数据都包含在文章中或作为补充信息上传。在这项研究中产生或分析的所有数据都包含在文章中。补充表格和显微成像文件可通过Figshare访问:https://figshare.com/s/2c05765158269b3b4ff2,https://figshare.com/s/a83dbee52555e922ca8d而且https://figshare.com/s/08b0f84f2ea241b03c8d。原始测序数据可从ArrayExpress获得，登录号为:E-MTAB-8915, E-MTAB-9587和E-MTAB-9586。用于生物信息学分析的脚本可以在Github上找到:https://github.com/jonasns/LiveRNome。在线补充表中没有的原始数据可在补充数据1中找到。此外，所有相关数据均可根据作者要求提供。

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http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl-2021-325109

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    本研究的意义

    关于这个问题，我们已经知道了什么?

    • rna结合蛋白(rbp)在癌症中起着至关重要的作用。

    • rbp可以通过长链非编码rna (lncrna)发挥作用。

    • lncrna的细胞类型特异性表达模式具有很强的诊断、预后和治疗价值。

    新的发现是什么?

    • 综合多组学方法，包括一个新的肝癌队列数据集，描述了肝细胞癌(HCC)的转录格局。

    • RBPs在HCC升高和患者生存期降低中显著去调控。

    • 病理性RBPs通过lncrna控制HCC细胞的代谢活性和凋亡。

    • 伴侣蛋白复合物亚基CCT3是一种新型RBP。

    • CCT3通过长链非编码RNA参与肝癌脂质代谢在cellulo LINC00326而且在活的有机体内。

    在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?

    • CCT3和肝癌分期特异性反应的诊断和预后潜力LINC00326。

    • lncRNA过表达在特定HCC疾病阶段的有益治疗作用

    简介

    肝癌包括一系列临床不同的肿瘤亚型，它们起源于恶性肝细胞。肝细胞癌(HCC)是最常见的形式，影响约80%的患者。1肝细胞癌的病因常被归因于内在、外在和未知的特发性因素。2细胞内稳态紊乱导致细胞生长和增殖失控是HCC的特征，但其潜在的分子后果仅被部分了解。近年来，人们越来越关注癌症中去调控的长链非编码rna (lncrna)的研究。3 4然而，许多lncrna的功能仍有待探索。lncrna是一种长度超过200个核苷酸的转录物，它们要么起源于基因间区(lincrna)，要么重合于不同基因的转录单元内。5鉴于lncrna独特的细胞类型和疾病特异性表达模式，6 7它们是生物标志物和治疗进展的新兴靶点，因为它们的存在主要影响病变细胞。lncrna调节多种过程，如细胞周期、增殖、凋亡和细胞死亡。5这些作用可能是通过与rna结合蛋白(rbp)的相互作用介导的。8

    作为重要的酶，rbp控制着RNA调控途径。9RBP活性可根据RNA转录本的细胞需求进行调整。改变RBP基因表达水平对细胞生理有深远的影响，并有助于在非典型细胞和癌细胞中观察到表型异常。10rbp包含已知或预测的rna结合域(RBD)。例如，典型的RBP胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白1 (IGF2BP1)包含6个rbd, IGF2BP1通过这些rbd调节mRNA的稳定性，例如，通过阻碍miRNAs对其靶标的访问。11在人类细胞中已经发现了超过500种具有经典rbd的蛋白质。12此外，通过更新的技术发现了更多具有rna结合能力的蛋白质(在线补充表S1)．虽然这些非规范rbp具有既定的生物学功能，但它们也可以充当rbp。13例如，Tripartite Motif 25 (TRIM25)使蛋白质泛素化以降解14作为一种非典型RBP结合RNA来调节先天免疫反应途径。14同样，α烯醇化酶(α Enolase, ENO1)在糖酵解过程中也是不可或缺的，它的酶活性通过与lncRNA的相互作用而消失。15

    由于lncrna和rbp之间的频繁依赖，8我们在这里使用了一种新的以rbp为中心的方法来识别功能性lncrna。我们整理了一份在不同细胞类型的RNA相互作用组捕获实验中报告的2282个rbp列表(在线补充表S1)，并在两组HCC患者中发现了异常的RBP基因表达谱。中选定rbp的扰动在cellulo而且在活的有机体内设置揭示了rbp可以采取行动的底层监管网络。我们的方法发现了新的功能lncrna，并揭示了它们在HCC中的调节作用。具体来说，我们发现LINC00326通过与非典型RBP CCT3相互作用调节脂质代谢。

    结果

    差异表达的rna结合蛋白影响肝细胞癌患者的生存

    基因失调是癌症的一个重要特征。编码rbp的基因因其调节能力而受到广泛关注。10因此，我们通过检测RNA相互作用组捕获实验和基因本体论(GO)数据库(在线补充表S1)．结果列表包括1321个标准rbd(包含已知rbd)和959个非标准rbp(没有任何特征rbd) (在线补充表S1)．我们比较了RBP的基因表达水平和存活概率与所有其他蛋白质编码基因跨越21种不同的人类癌症类型(癌症基因组图谱，TCGA)。16RBP基因表达与癌症类型无关(双尾无配对学生t检验，p<0.001) (图1一个)，这与先前的估计相符。17将rbp分为规范rbp和非规范rbp得到了相同的结果(在线补充图S1a)．为了研究RBP解除对患者生存的影响，我们比较了每种癌症类型的RBP和非RBP基因的cox比例危险系数(coxph)。16我们发现HCC (LIHC, 6.3 FC)中最大的倍数变化(FC)，其次是肉瘤(SARC, 5.1 FC) (图1 b)．肾癌(KIRP和KIRC)具有相对较高的RBP和非RBP基因的绝对coph值，因此比其他排名靠前的癌症类型更低的fc(分别为4.2和1.6)。因此，RBP基因表达在肝癌中的预后价值高于任何其他被研究的癌症类型，这可能与高增殖率有关17和RBP基因拷贝的全局激活。18通过比较50例LIHC队列患者的肿瘤和瘤周组织配对数据(在线补充图S1b)，我们发现92个RBP基因上调，68个RBP基因下调(图1 c,在线补充表S2)．

    RBPs are deregulated in cancer and affect patient survival. (A,B) Boxplots of (A) gene expression level and (B) cox proportional hazard (coxph) coefficient of protein-coding genes grouped into RBP (green) and non-RBP (grey) genes. Each row represents a different cancer type defined by TCGA. Each cancer type consisted of 144 to1006 patients. Hinges correspond to the first and third quartiles, and whiskers correspond to the 1.5-times interquartile range. (C,D) Volcano plots demonstrate differentially expressed (DE) genes in the two HCC cohorts (C) TCGA-LIHC and (D) Australia HCC. Data points represent DE RBP genes (dark green), not significantly (ns)-DE RBP genes (FDR>0.05, light green) and all other genes (grey). (E,F) Four-way Venn diagrams intersect the number of (E) upregulated and (F) downregulated RBP genes in the TCGA and Australia HCC cohorts as well as in liver cancer cell lines Huh7 and HepG2. Intersections highlighted (bold) show the number of RBP genes commonly deregulated in HCC cohorts and cell lines. (G) Heatmap displays changes in expression levels for commonly upregulated RBP genes in HCC as highlighted in (E). Expression level is sorted by average tumour z-score from left to right. Black bar marks the top 10 highest expressed RBP genes, and purple asterisk marks RBPs with a canonical RBD. Colour gradient indicates z-score differences (green: high; grey: low). (H) Volcano plot displays comparison of the top and bottom tercile in RBP gene expression levels and hazard ratioswithin the TCGA-LIHC cohort (377 patients) (grey: downregulated and green: upregulated in tumour). The size of the circle represents the gene expression level of each RBP relative to each other (broad: high, narrow: low). (I) Kaplan-Meier plot shows the association of CCT3 gene expression level and 10-year survival within the top and bottom tercile within the TCGA-LIHC cohort (377 patients) (black: high and blue: low CCT3 gene expression levels). Statistics: log-rank (Mantel-Cox). BLCA, bladder urothelial carcinoma; BRCA, breast invasive carcinoma; CESC, cervical squamous cell carcinoma and endocervical adenocarcinoma; COAD, colon adenocarcinoma; DE, differentially expressed; ESCA, oesophageal carcinoma; GBM, glioblastoma multiforme; HCC, hepatocellular carcinoma; HNSC, head and neck squamous cell carcinoma; KIRC, kidney renal clear cell carcinoma; KIRP, kidney renal papillary cell carcinoma; LAML, acute myeloid leukaemia; LGG, brain lower grade glioma; LIHC, liver hepatocellular carcinoma; LUAD, lung adenocarcinoma; LUSC, lung squamous cell carcinoma; OV, ovarian serous cystadenocarcinoma; PAAD, pancreatic adenocarcinoma; RBP, RNA-binding proteins; READ, rectum adenocarcinoma; SARC, sarcoma; SKCM, skin cutaneous melanoma; TCGA, The Cancer Genome Atlas; UCEC, uterine corpus endometrial carcinoma.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    rbp在癌症中被解除调控，并影响患者的生存。(A,B)分组为RBP(绿色)和非RBP(灰色)基因的蛋白质编码基因(A)基因表达水平和(B) cox比例风险系数箱线图。每一行代表TCGA定义的不同癌症类型。每种癌症类型包括144到1006名患者。铰链对应第一和第三四分位数，须对应1.5倍的四分位数区间。(C,D)火山图显示两个HCC队列中差异表达(DE)基因(C) TCGA-LIHC和(D)澳大利亚HCC。数据点代表DE RBP基因(深绿色)，不显著(ns)-DE RBP基因(FDR>0.05，浅绿色)和所有其他基因(灰色)。(E,F)四向维恩图相交于TCGA和澳大利亚HCC队列以及肝癌细胞系Huh7和HepG2中(E)上调和(F)下调RBP基因的数量。交叉突出显示的部分(粗体)显示了在HCC队列和细胞系中通常不被调控的RBP基因的数量。(G)热图显示HCC中普遍上调的RBP基因表达水平的变化，如(E)所示。表达水平由左至右按平均肿瘤z评分排序。 Black bar marks the top 10 highest expressed RBP genes, and purple asterisk marks RBPs with a canonical RBD. Colour gradient indicates z-score differences (green: high; grey: low). (H) Volcano plot displays comparison of the top and bottom tercile in RBP gene expression levels and hazard ratioswithin the TCGA-LIHC cohort (377 patients) (grey: downregulated and green: upregulated in tumour). The size of the circle represents the gene expression level of each RBP relative to each other (broad: high, narrow: low). (I) Kaplan-Meier plot shows the association ofCCT3TCGA-LIHC队列中(377例患者)的上、下三胎体的基因表达水平和10年生存率(黑色:高，蓝色:低)CCT3基因表达水平)。统计:log-rank (Mantel-Cox)。BLCA，膀胱尿路上皮癌;BRCA，乳腺浸润性癌;CESC，宫颈鳞状细胞癌和宫颈内腺癌;COAD结肠腺癌;德,差异表达;光电子能谱,食管癌;“绿带运动”,多形性成胶质细胞瘤;肝癌,肝细胞癌; HNSC, head and neck squamous cell carcinoma; KIRC, kidney renal clear cell carcinoma; KIRP, kidney renal papillary cell carcinoma; LAML, acute myeloid leukaemia; LGG, brain lower grade glioma; LIHC, liver hepatocellular carcinoma; LUAD, lung adenocarcinoma; LUSC, lung squamous cell carcinoma; OV, ovarian serous cystadenocarcinoma; PAAD, pancreatic adenocarcinoma; RBP, RNA-binding proteins; READ, rectum adenocarcinoma; SARC, sarcoma; SKCM, skin cutaneous melanoma; TCGA, The Cancer Genome Atlas; UCEC, uterine corpus endometrial carcinoma.

    为了验证我们在不依赖tcga的HCC队列中的发现，我们通过rna测序(RNA-seq)对来自澳大利亚维多利亚癌症生物库(Australian HCC)的24例HCC患者的原发肿瘤和瘤周肝脏样本进行了配对分析(图1 d)．与TCGA LIHC队列相似，在澳大利亚HCC队列中，表达模式分离了肿瘤和瘤周组织样本(在线补充图S1c)．我们的差异基因表达分析显示，有111个RBP基因上调，64个RBP基因下调(图1 d-f,在线补充表S3和S4)．在两个队列中，我们发现了一组共有的63个上调RBP基因和47个下调RBP基因(图1 e, F)．我们通过包括人类肝癌细胞系HepG2和Huh7的基因表达数据来补充我们的分析。1926个RBP基因上调和23个RBP基因下调在所有HCC数据集中表现出相似的基因表达模式(图1 e, F,在线补充图S1e)．

    我们对所有数据集中的z-score基因表达值进行了排名，并选择了在HCC中表达最高的10个典型和非典型rbp (NQO1,HIST1H1C,CCT3,PEG10,PKM,STMN1,KPNA2,TOP2A,IGF2BP1,DDX39A) (图1 g)．通过分析Cap Analysis of Gene Expression转录组数据，20.我们证实这些RBP基因在HCC (在线补充图S1d)．选定的rbp具有同源基因，属于不同的蛋白质家族，由不同的预测蛋白质结构域(在线补充图S1f)．这些rbp的蛋白表达在多个亚细胞间室中均可检测到(在线补充图S1g)．

    这些上调的RBP基因在HCC中具有突变谱和拷贝数变化。特别是含有TCP1亚基3 (CCT3)经常被放大(在线补充图S1h)．我们检查了危险比(HR)，发现高RBP基因表达水平与患者生存率差相关(图1 h)．大多数rbp(7/10)具有显著的预后价值(根据肿瘤分期、年龄和性别校正)(图1 h,我而且在线补充图S2)．与所有rbp相比，α 2亚基的高表达(KPNA2)的人力资源规模最大，紧随其后的是CCT3和Stathmin 1 (STMN1) (图1 h)．在它们各自的基因家族中，CCT3,IGF2BP1,KPNA2， NAD(P)H醌脱氢酶1NQO1),STMN1HR最高，DExD-Box解旋酶39A (DDX39A组蛋白簇1 H1家族成员C (HIST1H1C)、父爱表达10 (PEG10)和DNA拓扑异构酶II Alpha (TOP2A)的基因家族成员具有较高的HR (在线补充图S3a)．大多数家庭成员的基因表达水平升高与患者生存率降低相关(图1我,在线补充图S3b,c)．以前在除法时也得到了类似的结果CCT3基因表达水平减半21而不是terciles。

    总之，我们确定了一组属于不同基因家族的rbp，这些rbp在HCC中被解除调控。因此，RBP基因表达水平可作为HCC患者潜在的预后标志物。

    RBP基因敲低可降低肝癌细胞生长，改变非编码RNA的表达

    为了分析上调RBP基因在HCC队列和细胞系中的功能作用，我们在Huh7和HepG2中进行了sirna介导的基因敲除(KD) (图2,在线补充图S4a-f)．我们获得了较高的RBP-KD效率，并证实RT-qPCR (图2一个)．对于大多数rbp (7/10)， kd导致转染后3天代谢活性细胞数量显著减少(MTT试验)(图2 b)由于细胞死亡增加(FACS用于晚期细胞凋亡/坏死)(图2 b, C)，尤其是KD之后CCT3而且IGF2BP1。

    Reduced expression of RBP genes impact various cellular and molecular responses in HCC cell lines. (A) Bar graph displays RBP gene expression levels before (black bars) and after siRNA-mediated RBP-KD (coloured bar) relative to ACTB in HepG2 and Huh7 cells determined by qPCR (n=4 mean, ±SEM). Number above each bar shows the average KD efficiency in percent. Colour code: CCT3 (blue), DDX39A (magenta), HIST1H1C (turquoise), IGF2BP1 (red), KPNA2 (plum), NQO1 (grey), PEG10 (yellow), PKM (green), STMN1 (purple) and TOP2A (brown). Individual replicates are displayed by white circles. (B) Line graphs show the relative number of metabolically active cells (measured by optical density) over 7 days after siRNA-mediated RBP-KDs assayed by the MTT assay (n=5). Black line: non-targeting siRNA control (siNT-Ctrl), coloured line: RBP-specific siRNA KD. (C) Dot plot represents the percentage of dead cells after siRNA-mediated RBP-KDs (colour-coded) after 5 days (n=7, mean, ±SEM). (B,C) Statistics: paired two-tailed t-test, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. (D,E) Circle plots display number of genes per RNA biotype affected by RBP-KDs. The diameter of the circles corresponds to the number of genes in each category. Deregulated genes falling into different ncRNA subcategories are shown in figure 2E.(F) Volcano plots demonstrate DE genes after RBP-KDs. Data points represent significantly DE genes (colour-coded by RBP-KD, FDR<0.05) and not significantly DE genes (grey, FDR>0.05). Bolded numbers on the top of each graph indicate total number of DE genes (FDR<0.05). The wider circle in each plot highlights the downregulated RBP. Genes with an FDR value smaller than 1 × 10−10 were collapsed at 1 × 10−10. (G) Circle plot shows GO term and KEGG pathway enrichment analysis of deregulated genes after the CCT3-KD (FDR<0.05). The diameter of the circles corresponds to the number of genes in each GO or KEGG term and the colour code represents varying degrees of significance (white: high and blue: low p value). (H) Interaction network displays connections of the five most significant GO BP terms in figure 2G. GO term is bolded and gene names are highlighted. BP, biological process; CC, cellular compartment; DE, differentially expressed; KD, knockdown; MF, molecular function; OD, optical density; RQ, relative quantity.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    RBP基因表达减少影响肝癌细胞系的各种细胞和分子反应。(A)柱状图显示了RBP基因在sirna介导的RBP- kd之前和之后的表达水平(黑色条)(彩色条)ACTB用qPCR检测HepG2和Huh7细胞的表达(n=4，±SEM)。每个柱状上方的数字表示平均KD效率的百分比。颜色代码:CCT3(蓝色),DDX39A(红色),HIST1H1C(青绿色),IGF2BP1(红色),KPNA2(李)NQO1(灰色)PEG10(黄色),PKM(绿色),STMN1(紫色),TOP2A(布朗)。单个重复用白色圆圈显示。(B)折线图显示了MTT法测定sirna介导的rbp - kd后7天内代谢活性细胞的相对数量(光密度测量)(n=5)。黑线:非靶向siRNA对照(siNT-Ctrl)，彩色线:rbp特异性siRNA KD。(C)点图表示5天后sirna介导rbp - kd(颜色编码)后死亡细胞的百分比(n=7，平均值，±SEM)。(B,C)统计学:配对双尾t检验，*p<0.05， **p<0.01， ***p<0.001。(D,E)圆形图显示受rbp - kd影响的每种RNA生物型的基因数量。圆的直径对应着每一类基因的数量。图2E显示了属于不同ncRNA子类别的解除调控基因。(F)火山图显示了rbp - kd之后的DE基因。数据点代表显著的DE基因(RBP-KD颜色编码，FDR<0.05)，不显著的DE基因(灰色，FDR>0.05)。 Bolded numbers on the top of each graph indicate total number of DE genes (FDR<0.05). The wider circle in each plot highlights the downregulated RBP. Genes with an FDR value smaller than 1 × 10−10坍缩在1 × 10−10。(G)圆图显示失调控基因的GO项和KEGG通路富集分析CCT3kd(罗斯福< 0.05)。圆的直径对应于每个GO或KEGG术语中的基因数量，颜色代码代表不同的显著程度(白色:高，蓝色:低p值)。(H)交互网络显示图2G中五个最重要的GO BP术语之间的连接。GO术语加粗，基因名称高亮显示。英国石油(BP)、生物过程;CC,细胞室;德,差异表达;KD,击倒;MF、分子功能;OD,光密度; RQ, relative quantity.

    为了研究RBP-KDs所观察到的细胞表型的分子机制，我们通过RNA-seq分析了基因表达。每个RBP-KD影响不同的注释RNA生物类型(12个不同的类别)(图2 d,在线补充表S5-S7)．大多数差异表达(DE)基因为蛋白编码基因(平均120个，范围6 - 697)，其次为非编码基因(平均44个，范围0-105)和假基因(平均6个，范围0-18)(图2 d)．对非编码RNA生物型的进一步观察显示，在RBP-KD (图2 e)．的CCT3在所有检测的rbp中，-KD表现出最高的RNA生物型多样性，并影响最多的非编码基因(n=105)。的STMN1-KD最高(n=780)，而PEG10-KD导致DE基因数量最少(n=6) (图2 f)．在我们的RBP-KD实验中观察到的DE基因数量与之前在K562细胞中的shRBP-KD实验(n=235)一致(在线补充图S4g)．22日23日为了了解RBP基因表达的改变是否影响特定的调节过程，我们对每个RBP- kd (图2 g, H,在线补充图S5,在线补充表S8)．解除调控的基因属于不同RBP-KD的GO术语，例如脂质代谢(CCT3kd),血管生成(DDX39A-KD)，对氧水平的反应(IGF2BP1-KD)， RNA转运(PKM-KD)，脂质定位和运输(STMN1-KD)和DNA包装和构象改变(TOP2Akd) (在线补充图S5,在线补充表S8)．

    总之，肝细胞癌中某些rbp的失调导致了与代谢和脂肪生成相关的基因调控程序的不同改变。

    每个RBP-KD都伴随着一组特定的注解和新lincRNA基因的基因表达变化

    由于GO术语在很大程度上是基于从蛋白质编码基因中获得的信息来策划的，解除调控的非编码rna的功能关联仍然不确定。除了蛋白质编码基因，我们还发现了54个未调控的注解lincRNAs (图3一)，其中69%(37/54)和31%(17/54)分别解除了一个或多个rbp - kd的管制。在rbp - kd后，LincRNAs上调(76%，41/54)多于下调(24%，13/54)(图3 b)．在上调的lincrna中有肺癌相关转录本1 (LUCAT1)和CDKN1A反义DNA损伤激活RNA启动子(PANDAR)，它们与多种癌症有关。24日25日对标注的去调控的lincrna进行分层聚类，揭示了三组不同的通常上调和下调的lincrna，以及在单个RBP-KD实验中特别受影响的lincrna (图3 b)．我们预期后一组中的lincRNAs在癌症途径中具有特定的而非一般的作用(图3 b)．

    RBP-KD affects lincRNA gene expression levels. (A,C) Bar graph show the number of (A) annotated and (C) novel DE lincRNA genes detectable after RBP-KDs. The frequency of lincRNA genes in one (black dot) or multiple (black dots connected by a line) RBP-KD experiments is shown. (B,D) Circle plots display the occurrence of (B) annotated and (D) novel lincRNA genes per RBP-KD. The diameter of the circles corresponds to varying degrees of significance (large: high, and narrow: low FDR value, black line: FDR<0.05). The colour code represents fold change (red: upregulated and blue: downregulated). Vertical bars specify the three most common clusters defining lincRNAs as either consistently downregulated (blue) or upregulated (red), or with varying pattern deregulation across the ten RBP-KD (purple). A star (*) marks lincRNAs used for further investigation. (E) The UCSC genome browser view demonstrates the genomic location of the novel lincRNA MSTRG.12891 in between genes encoding for PKM and PARP6. Arrows indicate direction of gene transcription. Gene expression patterns in Huh7 cells transfected with siNT-Ctrl (black) or siRNA-mediated KD of STMN1 (purple) are shown. The y-axis of each track specifies normalised RNA-seq read intensity.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
    图3

    RBP-KD影响lincRNA基因表达水平。(A,C)柱状图显示rbp - kd后检测到的(A)注释和(C)新DE lincRNA基因的数量。lincRNA基因在一个(黑点)或多个(黑点用一条线连接)RBP-KD实验中的频率显示出来。(B,D)圆图显示每个RBP-KD中(B)注释和(D)新lincRNA基因的出现情况。圆的直径对应不同程度的显著性(大:高，窄:低FDR值，黑线:FDR<0.05)。颜色代码表示折叠变化(红色:上调，蓝色:下调)。竖条指定了三个最常见的集群，定义了lincrna，要么一致下调(蓝色)，要么上调(红色)，要么在十个RBP-KD(紫色)中有不同模式的放松。星号*表示用于进一步研究的lincrna。(E) UCSC基因组浏览器视图展示了新lincRNA的基因组位置MSTRG.12891在基因编码之间PKM而且PARP6。箭头表示基因转录的方向。转染siNT-Ctrl(黑色)或sirna介导的KD的Huh7细胞的基因表达模式STMN1(紫色)所示。每个轨迹的y轴指定归一化RNA-seq读强度。

    在分析之时，在人类基因组(Gencode GRCh38 v.27)中已经注释了7307个lincRNA基因。为了识别只有在rbp - kd后才能检测到的新型lincrna，我们新创在我们的RNA-seq数据中注释了lincRNA，发现34个新的lincRNA在至少一个RBP-KD中上调(图3汉英,在线补充表S9)．这些新的lincrna可能由于在高度丰富的rbp存在下的快速周转而之前没有被发现。

    总的来说，我们的数据驱动方法揭示了大多数新的lincrna都是针对一个RBP-KD的，特别是在CCT3kd (图3 d)．

    lincRNA基因过表达可改变癌细胞表型，导致早期凋亡

    为了进一步描述lincRNA在HCC中的作用，我们应用了严格的筛选标准，包括(1)lincRNA基因表达的FC， (2) rbp特异性依赖性，(3)lincRNA丰度和(4)基因组浏览器中的视觉检查。这导致了后续对四种lincrna的分析，LINC00326,LINC01419, LINC02119而且MSTRG.12891。由于RBP基因表达水平降低导致lincRNA基因表达水平升高(图3 b, D)，我们假设lincRNA基因表达的增加揭示了一种肝癌细胞特异性表型。我们使用CRISPR-VPR激活(CRISPRa)和三个靶特异性导向rna (gRNAs)来过表达选定的lincRNA基因(lincRNA- oe)，并实现了持续数天的2- 20倍的lincRNA基因表达增加(图4 a, B)．

    Overexpression of lincRNA genes in HCC cell line causes molecular and cellular alterations. (A) Bar graphs exemplify the increase in relative gene expression of LINC00326 over 5 days after transfection of a CRISPRa vector with non-targeting gRNA-CRISPRa controls (CaNT-Ctrl, black gradient) or three lincRNA-specific gRNAs (LINC00326, blue gradient) determined by RT-qPCR. (B) Bar graph demonstrate the fold change in lincRNA gene expression 2 days after CRISPRa transfection of lincRNA-specific versus CaNT-Ctrl determined by RT-qPCR (n=2–4, mean, +SEM). The colour-code links the lincRNA to the respective RBP-KD experiment in which the lincRNA was identified (blue: CCT3, red: IGF2BP1, purple: STMN1). (C) Line graphs show relative increase in metabolically active HCC cell number over 7 days after CRISPRa transfection with CaNT-Ctrl (black) or lincRNA-specific gRNAs (coloured) determined by MTT assay. (D) Dot graph shows the percentage of early apoptotic cells 5 days after CRISPRa transfection with CaNT-Ctrl (black) and lincRNA-specific gRNAs (coloured) determined by FACS (n=2–8, mean, ±SEM). (A–D) Each biological replicate of Huh7 and HepG2 is displayed by circles. Graphs are coloured according to the colour-code selected for the RBP partner through which the lincRNA was identified (blue: CCT3, red: IGF2BP1, purple: STMN1). Statistics: paired two-tailed t-test, *p<0.05, **p<0.01. (E) Volcano plots demonstrate DE genes 2 days after CRISPRa transfection of lincRNA-specific versus CaNT-Ctrl determined by RNA-seq in Huh7. Data points represent significantly DE genes (coloured, FDR<0.01) and not significantly DE genes (grey, FDR>0.01). Bolded numbers on the top of each graph indicate total number of DE genes (FDR<0.01). Circle highlights lincRNA and lincRNA-interacting genes investigated. (F) Four-way Venn diagram intersects the number of DE genes after each lincRNA-OE experiment (FDR<0.01). (G) Circle plot displays the number of genes per RNA biotype affected by the lincRNA-OE. The diameter of the circles corresponds to the number of genes in each category.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
    图4

    lincRNA基因在HCC细胞系中过表达引起分子和细胞的改变。(A)柱状图举例说明相对基因表达的增加LINC00326转染带有非靶向gRNA-CRISPRa对照(CaNT-Ctrl，黑色梯度)的CRISPRa载体或三个lincrna特异性gRNAs (LINC00326蓝色梯度)RT-qPCR测定。(B)柱状图显示了在CRISPRa转染lincRNA特异性2天后，lincRNA基因表达的成倍变化与RT-qPCR检测CaNT-Ctrl (n= 2-4，均值+SEM)。颜色编码将lincRNA与识别出该lincRNA的RBP-KD实验相链接(蓝色:CCT3红色:IGF2BP1紫色:STMN1)．(C)折线图显示，通过MTT法测定，在CRISPRa转染CaNT-Ctrl(黑色)或lincrna特异性gRNAs(彩色)后7天内，代谢活性HCC细胞数量相对增加。(D)点图显示了用FACS测定的CaNT-Ctrl(黑色)和lincrna特异性gRNAs(彩色)转染CRISPRa 5天后早期凋亡细胞的百分比(n= 2-8，平均值，±SEM)。(A-D) Huh7和HepG2的每个生物复制用圆圈表示。根据为识别lincRNA的RBP伙伴选择的色码(蓝色:CCT3红色:IGF2BP1紫色:STMN1)．统计学:配对双尾t检验，*p<0.05， **p<0.01。(E)在CRISPRa转染lincrna特异性2天后，火山图显示DE基因与Huh7中RNA-seq测定的CaNT-Ctrl。数据点代表显著的DE基因(彩色，FDR<0.01)，不显著的DE基因(灰色，FDR>0.01)。每个图顶部加粗的数字表示DE基因总数(FDR<0.01)。圆圈突出lincRNA和lincRNA相互作用基因的研究。(F)四向维恩图相交于每次lincRNA-OE实验后DE基因数量(FDR<0.01)。(G)圆形图显示每种RNA生物型受lincRNA-OE影响的基因数量。圆的直径对应着每一类基因的数量。

    在所有四个lincRNA-OE实验中，我们检测到代谢活跃的Huh7和HepG2细胞数量减少，细胞凋亡早期，这是显著的LINC00326而且MSTRG.12891（图4 c, D,在线补充图S6a-e)．为了解释表型，我们进行了RNA-seq。总的来说，lincRNA-OEs导致更多的基因上调而不是下调(图4 e,在线补充图S6f,在线补充表S10-12)，许多被解除调控的基因对各自的lincRNA-OE (图4 f)．与rbp - kd相比，lincRNA-OEs导致蛋白质编码基因的频繁改变，而ncRNA和假基因表达只有少量变化(图4 g,在线补充图S6g-h)．我们进行了GO项和KEGG通路分析(在线补充图S7,在线补充表S13)，并发现脂质转运蛋白活性增加LINC00326oe和MSTRG.12891-OE和生长因子结合后LINC01419oe和LINC02119oe。

    综上所述，lincRNA-OEs可导致早期凋亡增加、代谢活性降低以及特异性生物学通路的转录改变。特别地，我们发现当增加cct3依赖性基因表达时，扰动最强LINC00326在脂类代谢。

    CCT3 -LINC00326网络调节脂质代谢

    由于表型严重程度最强，我们进一步研究了CCT3和LINC00326。经过过度表达，我们发现LINC00326而不是肝脏特异性对照lincRNA人类负重外骨骼在肝癌细胞中与CCT3共免疫沉淀(图5一个)．伴侣蛋白复合物的其他成分不与之共免疫沉淀LINC00326，表明其功能与伴侣蛋白无关。同样，这些伴侣蛋白成分的KD也没有导致LINC00326upregulation (在线补充图S8a,b)．此外，CCT3蛋白和LINC00326位于同一细胞隔间，使它们相互作用(图5 b, C,在线补充图S1g, S8c-e,26)．CCT3RNA化学计量学数据进一步表明，与健康组织和其他14种癌症类型相比，HCC中伴侣蛋白独立功能丰富。在线补充图S8f)．值得注意的是，双kdCCT3而且LINC00326救了CCT3-KD表型，进一步验证其功能依赖性(图5 d, E)．对70个常见失调控基因的功能检测CCT3kd和LINC00326oe (图5 f)表明其参与脂质代谢过程的调节、对氧含量降低的反应和血管生成(图5 g-h)．脂质通过过氧化作用降解。27因此，平衡的细胞供氧与调节血管形成的过程相关，如血管新生。28本研究中检测的其他RBP-lincRNA相互作用都没有通过这些生物途径起作用(在线补充图S9a-e)．大多数基因(8/10)在胚胎发育过程中向相似方向调控CCT3kd和LINC00326oe (图5我)．当包括我们的HCC队列和HCC细胞系数据集(图1 e, F)，我们注意到一个由编码早期生长反应蛋白1 (EGR1胶质瘤发病相关蛋白1 (GLIPR1),C富含半胱氨酸的血管生成诱导剂61 (CYR61)的表达常常低于相应的非致癌性对照(图5我)．这表明这些基因表达的增加可能有助于生理上更正常的细胞表型。考察如何CCT3-LINC00326当核心基因被调控时，我们在1000多个随机序列中确定了70个通常未调控基因的启动子区域富集的dna结合基序(图5 f, J,在线补充图S9f)．最显著的基序被CREM/CREB/ATF转录因子(tf)识别(图5 j)，它们与脂质代谢和一般Pol II转录的调节交织在一起(图5 k)．此外，ChIP-seq数据在肝癌细胞系和肝癌细胞系23发现CREM/CREB/ATF转录因子与脂质代谢相关基因的启动子直接结合EGR1,CYR61而且GLIPR1（图5 l)．

    The CCT3-LINC00326 interactome regulates lipid metabolism. (A) Bar graph shows enrichment of LINC00326 compared with GAPDH and HULC (negative controls) over input control after RNA immunoprecipitation with a TCP1 (CCT1)-(purple), CCT2- (white) or CCT3-specific (blue) antibody versus the beads-only (no antibody) control (orange) followed by RT-qPCR with gene- and strand-specific primers (n=3, mean, +SEM). Each biological replicate is displayed by circles. Statistics: ANOVA with a Bonferroni’s multiple comparison test, ***p<0.001, ns: non-significant. (B) Microscopic image of single-molecule RNA FISH using exonic probes for LINC00326 (white dots and arrows) in LINC00326-OE Huh7 HCC cells. DAPI (blue) marks the nucleus. Pie chart represents the fraction of signals in the nucleus (blue) or cytoplasm (pink) in cells, or cells without any signal (grey). Scale bar: 5 µm. (C) Violin plots show quantification of LINC00326 RNA FISH signal localisation in Huh7 HCC cells (n=40–53, statistics: paired two-tailed t-test, ns: non-significant). (D) Line graphs shows the relative number of metabolically active cells (measured by optical density, OD) over 7 days after the siRNA-mediated CCT3-KD and/or LINC00326-KD assayed by MTT assay (n=3, mean, +SEM, statistics: ANOVA with a Bonferroni’s multiple comparison test, *p<0.05, **p<0.01). (E) Bar charts show siRNA-KD-efficiencies of targeted RBP genes (figure 5D) (n=3, mean, +SEM). (F) Two-way Venn diagram intersects the number of deregulated genes after CCT3-KD and LINC00326-OE. (G) Circle plot shows GO term and KEGG pathway enrichment analysis of the 70 commonly deregulated genes after CCT3-KD and LINC00326-OE. The diameter of the circles corresponds to the number of genes in each GO or KEGG term and the colour code represents varying degrees of significance (white: high and blue: low p value). (H) Interaction network displays connections of the five most significant GO BP terms shown in figure 5G. GO term is bolded and gene names are highlighted. (I) Heatmap (unsupervised clustering) displays the fold change in expression levels for lipid metabolic process genes (figure 5H) when comparing HCC cohorts and cell lines, CCT3-KD and LINC00326-OE over non-cancerous or NT controls, respectively. Colour gradient indicates log2FC differences (red: high; blue: low). (J) Circle plot demonstrates enrichment of TF-binding motifs in the promoter regions of the 70 commonly deregulated genes of the CCT3-KD and LINC00326-OE. The diameter of the circles corresponds to the fold change over background controls and the colour code represents varying degrees of significance (white: high and blue: low p value). Identified motifs for each TF are shown in online supplemental figure S9f. (K) StringDB interaction network shows the links of the TFs identified in figure 5F and known interaction partners (direct: green, indirect: grey). Two direct connections to lipid metabolism genes are highlighted (blue). (L) The UCSC genome browser view demonstrates genomic location of three lipid metabolism-associated genes and the LINC00326 gene. Arrows indicate direction of gene transcription. Horizontal bars indicate ChIP-seq signals (black: strong; grey: weak) for available TF-binding events in HepG2 or liver cells (ENCODE).
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5
    图5

    CCT3 -LINC00326互作用体调节脂质代谢。(A)柱状图显示LINC00326在使用TCP1 (CCT1)-(紫色)、CCT2-(白色)或cct3特异性抗体(蓝色)进行RNA免疫沉淀后，与输入对照组的GAPDH和HULC(阴性对照)进行比较与纯珠(无抗体)对照(橙色)，然后是带有基因和链特异性引物的RT-qPCR (n=3，平均值，+SEM)。每个生物复制以圆圈显示。统计:采用Bonferroni多重比较检验的方差分析，***p<0.001, ns:不显著。(B)单分子RNA FISH的外显子探针显微图像LINC00326(白点和箭头)LINC00326-OE Huh7 HCC细胞。DAPI(蓝色)表示细胞核。饼图表示细胞内细胞核(蓝色)或细胞质(粉红色)或无信号细胞(灰色)中信号的比例。比例尺:5µm。(C)小提琴情节显示量化LINC00326RNA FISH信号在Huh7 HCC细胞中的定位(n= 40-53，统计学:成对双尾t检验，ns:不显著)。(D)折线图显示sirna介导后7天内代谢活性细胞的相对数量(用光密度、OD测量)CCT3kd和/或LINC00326MTT法测定-KD (n=3，平均值，+SEM，统计学:方差分析，Bonferroni 's多重比较检验，*p<0.05， **p<0.01)。(E)柱状图显示了靶向RBP基因的sirna - kd -效率(图5D) (n=3，平均值，+SEM)。(F)双向维恩图与之后未调控基因的数量相交CCT3kd和LINC00326oe。(G)圆图为70个常见去调控基因后的GO项和KEGG通路富集分析CCT3kd和LINC00326oe。圆的直径对应于每个GO或KEGG术语中的基因数量，颜色代码代表不同的显著程度(白色:高，蓝色:低p值)。(H)交互网络显示图5G中五个最重要的GO BP术语的连接。GO术语加粗，基因名称高亮显示。(I)热图(无监督聚类)显示了比较HCC队列和细胞系时脂质代谢过程基因表达水平的成倍变化(图5H)，CCT3kd和LINC00326-OE分别高于非癌或NT对照组。颜色渐变表示对数2FC差异(红色:高;蓝色:低)。(J)圆形图显示，在70个常见的基因的启动子区域，tf结合基序富集CCT3kd和LINC00326oe。圆圈的直径对应背景控件的折叠变化，颜色代码代表不同的显著程度(白色:高，蓝色:低p值)。为每个TF识别的主题显示在在线补充图S9f。(K) StringDB交互网络显示了图5F中识别的tf和已知交互伙伴之间的链接(直接:绿色，间接:灰色)。两个与脂质代谢基因的直接联系被突出显示(蓝色)。(L) UCSC基因组浏览器视图显示了三个脂质代谢相关基因的基因组位置和LINC00326基因。箭头表示基因转录的方向。横条表示ChIP-seq信号(黑色:强;灰色:弱)用于HepG2或肝细胞中可用的tf结合事件(ENCODE)。

    因此，协调调节CREM/CREB/ATF TFs可能导致脂质代谢、缺氧和血管生成控制基因的表达变化。

    CCT3 -LINC00326网络减轻肿瘤负担在cellulo而且在活的有机体内

    因为我们的分子数据显示CCT3和LINC00326我们检测了RBP-lincRNA相互作用对细胞的影响。通过比较CCT3kd和LINC00326-OE与各自的对照组相比，我们测量到脂质降解显著增加(分别为1.9和1.8 FC) (图6脂质积累显著减少(分别为−2.1和−1.5 FC) (图6 b)和活性氧水平升高(均为1.3 FC)，但没有统计学意义(图6 c)．既然这些化验证实了CCT3而且LINC00326基因表达水平调节脂质代谢，我们检查了脂质代谢障碍患者肝脏活检公开数据(GSE126848和TCGA)。我们发现CCT3与代谢相关的脂肪肝的严重程度和HCC的病理分期相关的基因表达(图6 d, E)．这表明CCT3在细胞系中的功能可以在人体内重现，并与HCC的病因之一有关。LINC00326在这项研究中没有被描述。

    The CCT3-LINC00326 network affects lipid metabolism and tumour growth in vitro and in vivo. (A–C) Bar graphs show comparison of (A) malondialdehyde (MDA) production (lipid degradation), (B) Oil Red O staining (lipid accumulation) and (C) ROS production of CCT3-KD or LINC00326-OE (blue) to the respective NT controls (black) 48 hours after transfection (n=4–6, mean, +SEM). Each biological replicate is displayed by circles. Statistics: paired two-tailed t-test, (D) Dot graph displays library size-normalised CCT3 mRNA expression level in adult human individuals with normal and obese weight, MAFLD and MASH (n=2–8, mean). LINC00326 was not assayed. Statistics: one-way ANOVA. (E) Boxplot of normalised CCT3-expression in the TCGA-LIHC cohort divided by main pathological cancer stage. Statistics: one-way ANOVA with Tukey Honest Significant Differences test. (F–H) Microscopy images of TUBULIN-GFP expressing Huh7 cells (F) in vitro (scale bar: 100µM) and (G–H) in vivo in zebrafish xenografts (scale bar: 500 µM).(I,J) Box plots show changes in tumour area in zebrafish xenografts after (I) CCT3-KD (n=20–21, mean, ±SEM) or (J) LINC00326-OE (n=21–28, mean, ±SEM). Individual zebrafish were followed over 5 days and tumour area is given relative fold change to day 1 (D1) after injection. Statistics: one-way ANOVA, *p<0.05, ***p<0.001. (K) Schematic model for CCT3-LINC00326 regulation of lipid metabolism. Reducing CCT3 or increasing LINC00326 gene expression in liver cancer cells inhibits lipid accumulation and promotes lipid degradation (peroxidation). Due to the strong dependency of cancer cells towards high lipogenesis, this in turn slows down cancer growth and promotes cell death. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, MAFLD, metabolic-associated fatty liver disease; MASH, metabolic-associated steatohepatitis; NS, non-significant; ROS, reactive oxygen species.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图6
    图6

    CCT3 -LINC00326网络影响脂质代谢和肿瘤生长在体外而且在活的有机体内。(A - C)柱状图显示(A)丙二醛(MDA)的产生(脂质降解)，(B)油红O染色(脂质积累)和(C)活性氧产生的比较CCT3kd或LINC00326-OE(蓝色)与NT对照(黑色)转染48小时后(n= 4-6，平均值，+SEM)。每个生物复制以圆圈显示。统计:成对双尾t检验，(D)点图显示库大小归一化CCT3成人正常体重和肥胖、MAFLD和MASH个体mRNA表达水平(n= 2-8，平均值)。LINC00326没有化验。统计:单向方差分析。(E)归一化箱线图CCT3-在按主要病理癌症分期划分的TCGA-LIHC队列中的表达。统计学:单因素方差分析，采用Tukey诚实显著性差异检验。(F - h)表达TUBULIN-GFP的Huh7细胞显微镜图像(F)在体外(比例尺:100 μ M)和(G-H)在活的有机体内(I,J)箱形图显示(I)后异种斑马鱼移植瘤面积的变化CCT3-KD (n= 20-21，均值，±SEM)或(J) LINC00326-OE (n= 21-28，平均值，±SEM)。单个斑马鱼被随访超过5天，肿瘤面积相对于注射后第1天(D1)的翻倍变化。统计:单因素方差分析，*p<0.05， ***p<0.001。(K) CCT3-的原理模型LINC00326脂质代谢的调节。减少CCT3或增加LINC00326基因表达在肝癌细胞中抑制脂质积累，促进脂质降解(过氧化)。由于癌细胞对高脂生成的强烈依赖，这反过来又减慢了癌细胞的生长，促进了细胞死亡。*p<0.05， **p<0.01， ***p<0.001, MAFLD，代谢相关性脂肪肝;土豆泥,metabolic-associated肝病;NS,非重要;ROS，活性氧。

    因为LINC00326没有进行评估在活的有机体内我们进行了细胞系来源的异种移植实验。我们使用了人类Huh7-GFP细胞CCT3或高LINC00326基因表达，将它们注射到斑马鱼胚胎中，并随着时间的推移监测它们的细胞生长。CCT3kd和LINC00326与相应的对照相比，-OE可显著抑制肿瘤生长(图6 f j)确认低CCT3和高LINC00326基因表达减少了肿瘤负担。

    总之，我们的研究证明功能性lincrna可以通过rbp为中心的方法来识别，通过这种方法我们发现了CCT3-LINC00326相互作用调节癌细胞脂质代谢。我们发现通过rbp调节lincRNA的生物生成可以改变癌细胞的特异性活动，如癌细胞存活和肿瘤生长(图6 k)．

    讨论

    通过先进的RBP-RNA转录组分析、RBP-RNA复合体纯化和功能筛选(在线补充表S1)，具有rna结合能力的蛋白质从几百种增加到2300种。善意的经典rbp的功能已经被很好地描述，而非经典rbp在RNA代谢中的作用也开始被揭示。15通过使用无偏的rbp中心方法，我们发现经典和非经典rbp都通过一个需要lincRNAs参与的纠缠网络作用，从而干扰肝癌病理。基因表达减少后表型改变尤为严重CCT3而且IGF2BP1。有趣的是,CCT3-KD影响大量的ncrna，特别是lincrna和反义rna。相比之下,IGF2BP1-KD主要影响蛋白质编码转录本，这在之前已经观察到。29对特定RNA类型的偏好可以通过RNA结合方式的差异来解释。CCT3是一个没有明显rbd的非典型RBP，而IGF2BP1是一个典型RBP，通过6个rbd发挥其RNA结合活性。11CCT3和其他七个CCT亚基一起形成了化学计量学上均匀的胞质伴侣蛋白复合体，确保了正确的蛋白质折叠。由于改变个别CCT基因表达水平后的转录和表型差异，推测每个成员的伴侣蛋白独立功能30 31以及细胞内不同区域蛋白质含量的差异。32尽管氨基酸高度相同，但每个成员在底物特异性所必需的蛋白质区域上进化出了差异。33由于CCT基因的基本遗传序列处于纯化选择状态，新的平行特异功能正在发展，34甚至可能是新出现的非编码RNA底物的结果。因此，CCT3作为一个非规范RBP独立于其在伴侣蛋白复合体中的作用是合理的。为了更好地了解rbp在HCC中是否通过调控lincrna起作用，我们分析了四种lincrna，我们的数据表明它们与rbp有很强的功能联系。四个lincRNAs中的三个(LINC00326,LINC01419而且LINC02119)是以前注释过的，其中一个代表了一个新的lincRNA (MSTRG.12891)．当改变这些lincrna的表达时，我们观察到HCC细胞中主要的转录和表型变化。

    在所有测试中，CCT3-LINC00326相互作用造成了最严重的分子和细胞效应。我们发现高CCT3基因在HCC中的表达，这与以往的报道一致，并强调了其在HCC中的预后价值。35 36总的来说,CCT3与各种组织类型相比，在恶性细胞中高表达(图1,在线补充图S10a)．相比之下,LINC00326肿瘤组织中的丰度较低，但在治疗后增加CCT3 -KD在肝癌细胞系中的表达(图3)．在正常生理条件下，LINC00326只在睾丸中检测到(在线补充图S10b)．基于LINC00326精子发生过程中的基因表达模式，37LINC00326可能在细胞增殖和控制凋亡中发挥作用，消除发育过程中不可修复的损伤生殖细胞，但具体的调节机制尚不清楚。有趣的是,LINC00326睾丸癌的基因表达几乎完全减少(在线补充图S10b)，并随睾丸癌严重程度的增加而逐渐减少(在线补充图S10c)．这暗示了抗增殖和促凋亡的特性LINC00326（图4)在癌变的早期阶段达到峰值。此外，来自健康睾丸的单细胞RNA-seq数据显示高CCT3精子发生早期的基因表达。减少CCT3在发育后期基因表达增加LINC00326水平(在线补充图S10d-f)．睾丸中这种暂时性的表达模式与我们的CCT3-KD，表明高水平的CCT3抑制LINC00326。

    从高到中水平降低基因表达量比从低到高水平提高基因表达量效果要小。38因此，KD的高表达CCT3引起的小的增加LINC00326转录丰富，而crispra介导的OE显著刺激LINC00326基因表达和可以解释为什么更多的基因受到LINC00326oe比CCT3-KD在肝癌细胞中的表达对这两种扰动重叠的基因进行检查，发现它们参与控制脂质代谢途径。我们基于细胞的综合分析证实了这一点LINC00326oe和CCT3-KD导致脂质积累减少，过氧化作用增加。我们的研究结果支持越来越多的认识到脂质代谢是癌症混淆因素。39 40对缺氧和氧水平的反应以及血管生成是另外常见的诱导途径，这与先前将非典型缺氧和血管生成条件归因于肿瘤的报道一致。41这些途径是机械连接的，缺氧条件导致NADPH过量，用于脂肪生成，并被认为是维持一个平衡的氧化还原环境。42因此，我们也观察到ros产量增加的趋势CCT3kd或LINC00326oe。综上所述，我们的数据支持CCT3-LINC00326网络通过干扰脂质代谢在肝癌病理过程中发挥重要作用。

    检查突变后出现的未调控基因的启动子区CCT3而且LINC00326基因表达揭示了一组共同的富集转录因子(tf)，它们以协调的方式起作用(图5 k)．我们的网络分析表明，TFs CREM、CREB和ATF不仅与Pol II机制有关，而且与调节脂质代谢的基因有关。此外，我们发现了tgf与脂质代谢基因启动子结合的实验证据(图5 l)．例如，我们确认了强烈的CREM/ creb1与EGR1启动子。EGR1本身就是一个TF，越来越多的证据证实了它在HCC中的肿瘤抑制作用。43EGR1的缺失和肿瘤的发展是通过致癌RAS-PI3K信号连接的44，这也是我们后来确定的一个顶级GO术语LINC00326oe (在线补充图S7)．CCT3kd和LINC00326-OE并没有导致这些TF基因的上调，但TF活性仍然可以改变。之前的研究描述了ATF245和6月46蛋白质与CCT3相互作用。因此，在HCC中CCT3上调后，CCT3可能会结合到TFs(包括ATF2)，从而阻止TFs结合到脂质代谢和相关基因的启动子区域LINC00326（在线补充图S11a)．我们的RIP-qPCR实验证实了CCT3和LINC00326（图5一个)．当LINC00326与CCT3结合，可能阻碍CCT3对ATF2的限制，从而将ATF2从不活跃状态释放，从而允许脂质代谢基因的转录和LINC00326本身(在线补充图S11b)．进一步的研究将进一步阐明拟议中的CCT3-的监管复杂性LINC00326网络。

    大多数rbp在最近的多项研究中被确定(平均值:6.5，中位数:5)(在线补充表S1)，其中许多尚未得到验证。在HCC中有2282个可检测到的RBP，包括959个非典型RBP，未来的挑战是建立RBP和RNA之间确切的功能联系。然而，通过使用以rbp为中心的方法，我们已经确定了与预后相关的rbp和lincRNAs在HCC中具有主要的分子和细胞功能作用。功能丧失和功能恢复的结合在cellulo而且在活的有机体内实验使我们能够构建调节致癌性脂质代谢、损害细胞能量消耗和增加细胞内氧化应激的网络。鉴于本研究中所研究的lincrna在正常生理条件下几乎不表达，我们推测它们作为一种抑制剂，可以阻止健康肝细胞向恶性细胞的细胞转化。因此，它们可能是肝脏病理的新标志物和未来HCC治疗方法的分子靶点。

    材料和方法

    细胞和分子分析以及异种移植实验描述在线补充材料和方法。

    补充表格和显微成像文件可通过Figshare访问:https://figshare.com/s/2c05765158269b3b4ff2,https://figshare.com/s/a83dbee52555e922ca8d而且https://figshare.com/s/08b0f84f2ea241b03c8d。

    本研究生成的数据集存储在ArrayExpress条目E-MTAB-8915、E-MTAB-9587和E-MTAB-9586下。

    用于生物信息学分析的脚本可以在Github上找到:https://githubcom/jonasns/LiveRNome。

    病人资料

    参与这项研究的患者(75%的男性和25%的女性)因乙肝病毒感染、非酒精性脂肪性肝病、酒精性脂肪性肝炎、遗传性血色素病和其他引发HCC的条件而发生HCC。请在ArrayExpress E-MTAB-8915上查看患者信息。让患者或公众参与我们研究的设计、实施、报告或传播计划既不可能也不合适。

    数据可用性声明

    数据可在一个公共的、开放访问的存储库中获得。所有与研究相关的数据都包含在文章中或作为补充信息上传。在这项研究中产生或分析的所有数据都包含在文章中。补充表格和显微成像文件可通过Figshare访问:https://figshare.com/s/2c05765158269b3b4ff2,https://figshare.com/s/a83dbee52555e922ca8d而且https://figshare.com/s/08b0f84f2ea241b03c8d。原始测序数据可从ArrayExpress获得，登录号为:E-MTAB-8915, E-MTAB-9587和E-MTAB-9586。用于生物信息学分析的脚本可以在Github上找到:https://github.com/jonasns/LiveRNome。在线补充表中没有的原始数据可在补充数据1中找到。此外，所有相关数据均可根据作者要求提供。

    伦理语句

    病人同意发表

    伦理批准

    这项研究涉及人类参与者。根据当地伦理委员会的批准(申请号:2010/541-31/1和2017/719-31/2)，在知情同意的情况下，从澳大利亚维多利亚生物银行(Australian victoria Biobank)的24例接受肝细胞癌肝切除术的患者中获得组织标本。参与者在参与研究前给予知情同意。

    致谢

    我们非常感谢Ralf Bartenschlager提供的表达TUBULIN-GFP的Huh7细胞和George Church提供的CRISPR-dCas9-VPR过表达载体。我们感谢Marc Friedländer和Vicent Pelechano实验室以及Hassan Foroughi Asl和Volker Lauschke对实验程序、数据分析和数据演示提供的有益反馈。我们赞赏对Carlos Gallardo Dodd手稿的批评意见。我们感谢TCGA研究网络(www.cancer.gov/tcga)提供的公开数据和卡罗林斯卡学院提供的斑马鱼服务和动物饲养核心设施。

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    补充材料

    脚注

    • 推特@jonasns， @ChrisSommerauer， @IonutAtanasoai， @laurahinte， @keyi_G， @AouadiLab， @stojic_lovorka， @ClaudiaKutter

    • 贡献者JNS和CK设计了该项目的概念。JNS、CS、IA、LCH、KG、LB、GG、LS和IB进行了室内实验。IB负责获取澳大利亚HCC患者样本。JNS进行了分析并可视化了数据。JNS, LS, IB和CK获得了资金。最初的草稿由JNS和CK撰写。CK作为担保人。所有作者都参与了审查和编辑过程。

    • 资金本研究得到了Knut & Alice Wallenberg基金会(KAW 2016.0174, CK)、Ruth & Richard Julin基金会(2017-00358,2018-00328,2020-00294,CK)的支持;sf - scilifelab奖学金(SFO_004, CK)，瑞典研究委员会(2019-05165,CK)， Lillian Sagen & Curt Ericsson研究基金(2021-00427,CK)， Gösta Miltons研究基金(2021-00527,CK)，中国奖学金委员会(KG, CK)， KI-KID基金(2016-00189和2018-00904,CK)， SNIC项目(2017/7-154和sllstore2017022)，尼尔森-埃勒捐赠基金(JNS)，巴茨和伦敦慈善机构(MGU0404, LS)英国癌症研究(RCCFEL\100007, LS)， AIRC海外奖学金(GG)，Tornspiran基金会(IB)和Svenska Läkaresällskapet (SLS-693561和SLS-694791) (IB)。

    • 相互竞争的利益没有宣布。

    • 来源和同行评审不是委托;外部同行评议。

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