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  • 乳杆菌GG引起注册会计师/刺- I型干扰素的依赖,提高免疫反应检查点封锁

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肠道微生物群
原始研究
乳杆菌GG引起注册会计师/刺- I型干扰素的依赖,提高免疫反应检查点封锁
  1. 魏Si1,
  2. 滑亮2,3,
  3. 杰森Bugno2,4,
  4. 齐旭1,
  5. 兴晨叮5,
  6. kait杨2,3,
  7. Yanbin傅2,3,
  8. 拉尔夫·R Weichselbaum2,3,
  9. 赵新1,
  10. Liangliang王2,3
  1. 1美国动物科学,麦吉尔大学,蒙特利尔,魁北克、加拿大
  2. 2部门的辐射和细胞肿瘤,芝加哥大学,芝加哥,伊利诺斯州美国
  3. 3路德维希转移研究中心,芝加哥大学,芝加哥,伊利诺斯州美国
  4. 4委员会临床药理学和药物基因组学,芝加哥大学,芝加哥,伊利诺斯州美国
  5. 5放射肿瘤学部门,山东省肿瘤医院和研究所山东第一医科大学和山东医学科学院,济南,中国
  1. 对应到Liangliang Wang博士的辐射和细胞肿瘤学,芝加哥大学,芝加哥,60637 - 5418,美国;wangliang在}{uchicago.edu;鑫赵博士,动物科学,麦吉尔大学蒙特利尔,魁北克,加拿大;xin.zhao在{}mcgill.ca;拉尔夫博士R Weichselbaum,辐射和细胞肿瘤学,芝加哥大学,芝加哥,伊利诺斯州,美国;弹头在}{radonc.uchicago.edu

文摘

客观的我们的目标是评估的抗肿瘤疗效乳杆菌GG (LGG)结合免疫检查点封锁(ICB)免疫疗法对肿瘤生长和调查潜在机制。

设计我们使用结肠直肠癌和黑色素瘤的小鼠模型,评估口服LGG是否提高了银行独立委员会疗法的疗效。我们进行了全基因组鸟枪metagenome肠内容和RNA序列的测序树突状细胞(dc)。在一系列的体外和体内实验中,我们进一步定义LGG-mediated抗肿瘤免疫的免疫学和分子机制。

结果我们证明口服活LGG增强的抗肿瘤活性anti-programmed细胞死亡1 (PD-1)通过增加tumour-infiltrating DCs和T细胞免疫疗法。此外,联合治疗改变了肠道微生物群落对浓缩乳酸菌murinus和拟杆菌均匀化已知的增加直流激活和CD8+肿瘤招聘。机械化、治疗与生活LGG单独或结合anti-PD-1抗体在DCs引发了I型干扰素(IFN)生产,增强抗肿瘤的cross-priming CD8+T细胞。在DCs中,循环GMP-AMP合成酶(cga) /刺激干扰素基因(刺痛)所需IFN-β感应LGG,就是明证IFN-β水平显著降低注册会计师或者STING-deficient DCs。LGG诱发IFN-β生产通过注册会计师/刺/坦克绑定激酶1在DCs /干扰素调节因子7轴。

结论我们的研究结果提供了有价值的洞察生活LGG-mediated抗肿瘤免疫的分子机制,建立经验为基础开发口服活LGG作为结合剂与银行独立委员会对癌症疗法。

  • 癌症免疫生物学
  • 免疫疗法
  • 免疫学
  • 肠道免疫
  • 益生菌

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http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl - 2020 - 323426

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    本研究的意义

    已知在这个问题上是什么?

    • 乳杆菌GG (LGG)是最的特征和使用的益生菌之一。

    • LGG报道增加炎症细胞因子分泌水平树突状细胞(dc)。

    有什么新发现吗?

    • LGG与免疫检查点封锁(ICB)代理把提高模型小鼠的抗肿瘤反应癌症。

    • 口服活LGG增强的抗肿瘤活性anti-programmed细胞死亡1 (PD-1)通过增加tumour-infiltrating DCs和T细胞免疫疗法。

    • LGG引发I型干扰素(IFN)在DCs生产,增强抗肿瘤的cross-priming CD8+T细胞。

    • 机械化,LGG诱导IFN-β生产通过循环GMP-AMP合酶/干扰素刺激基因/坦克绑定激酶1在DCs /干扰素调节因子7轴。

    • 联合治疗与LGG anti-PD-1改变肠道微生物群落对浓缩乳酸菌murinus和拟杆菌均匀化已知的增加直流激活和CD8+肿瘤招聘。

    它会如何影响临床实践在可预见的未来吗?

    • 这些发现定义生活LGG-mediated抗肿瘤免疫的分子机制,这有利于正在进行的临床试验。

    • 这些发现表明,LGG可以作为结合剂与银行独立委员会对癌症治疗。

    介绍

    癌症免疫疗法,如使用免疫检查点封锁(ICB),导致显著的进步的治疗各种癌症,包括许多与传统历史不良反应治疗。1单独或组合,这些策略是集中在封锁的免疫抑制性受体,如细胞毒性T淋巴球相关蛋白4 (CTLA4), 1 (PD-1)程序性细胞死亡,细胞程序性death-ligand 1 (PD-L1)和T细胞免疫球蛋白域和粘蛋白domain-3 (TIM-3)。2 - 4虽然大多数患者应对银行独立委员会代理保持持久的疾病控制,三分之一的患者复发。5预计新一代组合疗法需要提高应对银行独立委员会有效治疗和治疗更大比例的癌症患者。6 7

    几项研究已经报道,口服肠道共栖菌的具体结合anti-PD-1 / PD-L1几乎可以消除肿瘤生长的抗体。8 9乳杆菌GG (LGG)是最的特征和使用的益生菌之一。10LGG,自然的一部分,人类共生的微生物区系,出现了溃疡性结肠炎的预防可能的好处和适度的腹泻。11重要的是,LGG也被建议在癌症发展和调节炎症状态转换。12日13例如,管理LGG在肝细胞癌小鼠模型已被证明影响肿瘤进展。14尽管研究测试的有效性LGG在癌症治疗中,它仍然是未知LGG能否协同银行独立委员会,如anti-PD-1 / PD-L1改善抗肿瘤单克隆抗体反应。

    同桌的益生菌与宿主粘膜系统交互,影响系统免疫力。15LGG报道增加炎症细胞因子分泌水平树突状细胞(dc)、巨噬细胞和单核细胞,这表明他们的激活依赖于细胞因子分泌增加。16日17然而,LGG抗肿瘤免疫活动的分子机制仍不清楚。其他革兰氏阳性细菌被证明导致I型干扰素(IFN)的激活循环GMP-AMP合成酶(cga)刺激干扰素基因(刺痛)轴。18 19在这个信号级联,注册会计师作为二级信使激活内质的reticulum-localised蛋白质刺激干扰素基因(刺痛);激活刺然后继续招募坦克绑定激酶1 (TBK1)使磷酸化干扰素调节因子,最终导致I型干扰素的生产。通过这种方式,cGAS-STING通路起着至关重要的作用在抗肿瘤免疫调节I型干扰素的表达。20.出于这些新兴的见解,我们提出假设,LGG诱导I型干扰素的生产可能会对肿瘤促进先天免疫反应。

    在这项研究中,我们评估的抗肿瘤疗效LGG结合anti-PD-1, anti-PD-L1或anti-TIM-3使用小鼠癌症免疫疗法在肿瘤生长模型和研究潜在的机制。我们发现,结合口服活LGG明显抑制肿瘤生长。从力学上看,政府与anti-PD-1住LGG或联合治疗的抗体增加DCs的人口和抗肿瘤作用,从而促进激活CD8的招聘+T细胞的肿瘤微环境。我们也报告直接机制LGG诱发I型IFN-β生产通过注册会计师/刺/ TBK1 /干扰素调节因子7 (IRF7)端依赖信号通路。

    方法

    体内动物实验

    根据使用的所有老鼠被安置和动物实验研究所制定的指导方针的动物保健和使用委员会芝加哥大学的。所有动物都保持在无菌的条件下,照顾依照国际协会的评估和认证实验室动物保健政策和认证。注册会计师−−/,刺痛−−/,刺痛/ f,Rag1−−/和Ifnar−−/老鼠从杰克逊实验室购买。

    肿瘤生长和治疗

    MC38细胞(1×106)或B16F10细胞(2×105右翼)皮下注射的老鼠。老鼠汇集和随机分为不同组肿瘤体积达到约100毫米3。免疫球蛋白抗体同形像控制,anti-PD-1抗体,anit-PD-L1抗体或anti-TIM-3(200µg /鼠标)腹腔注射每周两次。LGG两次口头管理1周。测量肿瘤为3 - 4周每周两次。动物实施安乐死时,肿瘤体积达到2000毫米3。对CD8+T细胞耗竭试验,200µg anti-CD8α抗体是由腹腔内注射,1天前其他治疗方法。实验,I型干扰素封锁200µg anti-IFNAR1马伯的腹腔内注射1天前其他治疗方法。对体内直流损耗,减少DCs是通过腹腔内注射白喉毒素(DT) (50 ng) CD11c-DTR转基因老鼠,其他治疗前24小时。

    统计分析

    评估两组之间的差异的统计学意义,我们使用了一个未配对学生t计算双尾p值。双向方差分析(方差分析)进行了两组比较多。生存分析是使用kaplan meier曲线和执行评估log-rank Mantel-Cox测试。误差线表明SEM除非另有注明。P值标签的数据。P值表示如下:*p < 0.05,* *p < 0.01,* * *p < 0.001,* * * *p < 0.0001。统计分析采用GraphPad棱镜(V.7.0)。

    结果

    口服活LGG提高应对anti-PD-1小鼠黑色素瘤和结肠癌模型

    口服补充共生的细菌最近引起关注的潜在的调节后的抗肿瘤反应ICB免疫疗法。9评价口服LGG是否真的提高了银行独立委员会疗法的疗效,我们轴承MC38肿瘤治疗小鼠生活LGG单独或结合anti-PD-1抗体。LGG + anti-PD-1(联合治疗)显著抑制肿瘤生长与要么独自单剂相比,评估肿瘤大小和生存(图1 a, B)。确定口服活LGG增强了应对其他检查点封锁策略,我们还测试了组合LGG anti-PD-L1抗体或anti-TIM-3抗体。老鼠接受LGG和anti-PD-L1或anti-TIM-3显示类似的抑制肿瘤生长在线补充图S1A, B)。银行独立委员会因其已知的主要阻力,轴承小鼠黑色素瘤B16转椅肿瘤联合治疗同时进行。联合治疗显著地减少肿瘤体积和延长小鼠的生存与任何单一治疗相比,虽然没有这样的福利观察小鼠接受anti-PD-1单一疗法(图1 c, D)。这些结果表明,LGG可以增强抗肿瘤反应银行独立委员会。

    Oral administration of live Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) improves the response to anti-programmed cell death 1 (PD-1) in melanoma and colon cancer mouse models. (A–F) C57BL/6 mice were subcutaneously inoculated with MC38 cells (A, B, E and F) or B16F10 cells (C and D). When tumour volumes reached approximately 100 mm3, tumours received respective treatments as indicated. (A) Tumour volume of MC38 tumour bearing-mice treated with IgG control antibody, anti-PD-1 antibody, oral administration of live LGG (2×109 CFU) or combined LGG and anti-PD-1 antibody (n=5). (B) Survival curves for each treatment group in (A); log-rank (Mantel-Cox) test survival comparison. (C) Tumour volumes of B16 tumour bearing-mice treated with IgG control antibody, anti-PD-1 antibody, oral administration of live LGG or combined LGG and anti-PD-1 antibody (n=4). (D) Survival curves for each treatment group as (C); log-rank (Mantel-Cox) test survival comparison (B and D). *p<0.05; ****p<0.0001. (E) Tumour volume of MC38 tumour bearing-mice treated with IgG control antibody, anti-PD-1 antibody, oral administration of heated-LGG or combined heated-LGG and anti-PD-1 antibody (n=5). (F) Tumour volumes of MC38 tumour bearing-mice treated with IgG control antibody, anti-PD-1 antibody, intratumoural of live LGG (2×107 CFU) or combined intratumoural of live LGG and anti-PD-1 antibody (n=5). Tumour volumes were measured and plotted individually. (A, C, E and F) Data are expressed as mean±SEM Tumour volume results were analysed by using two-way analysis of variance; *p<0.05; **p<0.01; ****p<0.0001.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    口服活乳杆菌GG (LGG)提高了应对anti-programmed黑色素瘤细胞死亡1 (PD-1)和结肠癌小鼠模型。(F) C57BL / 6小鼠皮下接种MC38细胞(A, B, E和F)或B16F10细胞(C和D)。当肿瘤体积达到约100毫米3表明,肿瘤得到相应的治疗。(A)肿瘤体积的MC38肿瘤bearing-mice处理控制免疫球蛋白抗体,anti-PD-1抗体,口服活LGG (2×109CFU)或结合LGG和anti-PD-1抗体(n = 5)。(B)中每个治疗组的生存曲线(一个);log-rank (Mantel-Cox)测试生存比较。(C)肿瘤的治疗bearing-mice B16转椅肿瘤与免疫球蛋白控制抗体,anti-PD-1抗体,口服活LGG或结合LGG anti-PD-1抗体(n = 4)。(D)生存曲线为每个治疗组(C);log-rank (Mantel-Cox)测试生存比较(B和D)。* p < 0.05;* * * * p < 0.0001。(E)肿瘤体积的MC38肿瘤bearing-mice处理控制免疫球蛋白抗体,anti-PD-1抗体,口服heated-LGG或结合heated-LGG和anti-PD-1抗体(n = 5)。(F)肿瘤体积的MC38肿瘤bearing-mice处理控制免疫球蛋白抗体,anti-PD-1抗体,intratumoural住LGG (2×107CFU)或结合intratumoural住LGG和anti-PD-1抗体(n = 5)。肿瘤体积测量和绘制。(A、C、E和F)数据表示为均值±SEM肿瘤体积结果分析利用双向方差分析;* p < 0.05;* * p < 0.01;* * * * p < 0.0001。

    这是指出LGG单一疗法显著抑制B16转椅和MC38肿瘤的生长(图1 a, C分别,p = 0.0283, p = 0.0235)。这些结果符合出版的文献显示,仅LGG减少小鼠的肝脏肿瘤的生长。14我们因此检查LGG能否直接影响肿瘤细胞生存使用与MC38细胞体外集落形成试验。LGG没有直接影响肿瘤细胞的增殖(在线补充图就是S1C)。总的来说,这些结果表明,LGG直接诱导抗肿瘤免疫。最近的研究结果表明,灭活LGG可以影响免疫调节。21然而,填喂法相同剂量的heat-killed LGG在这项研究中未能改善应对anti-PD-1 MC38抗体治疗肿瘤小鼠轴承(图1 e)。这些结果表明,口服交付LGG生活,但不灭活LGG,被要求促进anti-PD-1抗体的治疗效果。

    据报道,几个gut-derived微生物检测人类大肠癌和殖民22和intratumoural注入益生菌可以增强抗肿瘤免疫力。23值得注意的是,intratumoural管理LGG生活在老鼠轴承MC38肿瘤在这个研究是无法控制肿瘤生长,不影响反应anti-PD-1免疫疗法(图1 f)。进一步确认是否LGG它生活在肿瘤系统性管理,我们使用选择性培养板(德曼,Rogosa沙普琼脂(夫人))来检测LGG细菌负荷MC38肿瘤组织两个剂量的口服后生活LGG (2.0×109CFU /鼠标)。在肿瘤组织(LGG几乎检测不到在线补充图S1D)。这些结果表明,口服LGG能够诱导抗肿瘤免疫,增强银行独立委员会没有本土化在肿瘤的抗肿瘤效应。

    联合治疗与LGG anti-PD-1抗体修改肠道微生物群的构成

    鉴于微分肠道微生物的合成报道调节应对癌症免疫疗法,9日24我们研究了联合治疗是否调节肠道微生物群。执行全基因组鸟枪metagenome测序的微生物组配置文件来定义MC38肿瘤轴承老鼠。无约束的主坐标分析Bray-Curtis和Jaccard距离进行了评估LGG或anti-PD-1治疗对微生物群落的影响。我们使用置换方差分析(PERMANOVA),嵌套在笼子里纠正可能出现的可能的贡献从co-housed老鼠在同一个笼子里,25日26日比较总体微生物群落组成。Bray-Curtis距离表明,肠道菌群的变化的最大来源是接近LGG治疗在我们的实验中,当anti-PD-1治疗显示一个小但仍然重要协会与微生物群落的结构(图2一个)。小鼠的肠道菌群与anti-PD-1治疗形成两个集群,它沿着第一次坐标轴显示分离是LGG改变肠道微生物群社区(图2一个和在线补充图S2A)。我们也观察到变化的微生物群LGG或/和anti-PD-1治疗后不受笼效应的影响。接下来,我们检查了分类α多样性(香农,细菌的丰富性和辛普森指数)在每个样本。然而,任何改变被发现在这些组(图2 b和图开通在线补充,C)。

    Combination treatment with Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) and anti-programmedcell death 1 (PD-1) antibody modulates the composition of gut microbiota. (A) Unconstrained principal coordinate analysis (PCoA) (for principal coordinates PCo1 and PCo2) with Bray-Curtis distance, with permutational analysis of variance (PERMANOVA) p values nested on cage. The distribution of the first two most informative coordinates was performed in the corresponding marginal box plot. Red and blue dot represent without/with LGG treatment, respectively. Mixed linear model was tested for the first two coordinates of PCoA with Bray-Curtis distance (explaining 60.8% of the variance), evaluating the null hypothesis that the fixed effects LGG, anti-PD-1 and LGG×anti-PD-1 interactions had no effect on the coordinates. Significance was assessed using type III ANOVA with F tests for fixed effects. All p values were adjusted by using the Benjamini and Hochberg methods. *p<0.05; **p<0.01. (B) Shannon index of the intestinal microbiota from the indicated treatment groups. Statistics described the mixed linear model of Shannon index of the intestinal microbiota in LGG or/and anti-PD-1 treated mice, all comparisons and false discovery rate (FDR)-corrected p values were showed. Significance was assessed using type III ANOVA with F tests for fixed effects. All p values were adjusted by using the Benjamini and Hochberg methods. (C) Distribution of the gut microbiota at the phylum-level. The numbers of replicated samples in this figure are as follows: control (n=6), LGG (n=5), anti-PD-1 (n=7), anti-PD-1+LGG (n=7). (D) Relative abundance of Bacteroidetes (phylum level). Data bars represent means. Error bars represent SEM. FDR-corrected p values from the mixed linear model. *p<0.05. (E–G) Manhattan plot showing species enriched in either the combination treatment group, anti-PD-1 treatment (D) or LGG (E) or control (F) group. Each dot, triangle, quadrilateral or hexagonal star represents a single species. Species enriched in combination treatment group are represented by filled triangles; for anti-PD-1 treatment group: empty triangles; for LGG treatment group: hexagonal star; for IgG-control group: quadrilateral (FDR adjusted p<0.05 and log2fold change >1, Wilcoxon rank sum test). Species are arranged at the phylum level and coloured according to the phylum. CPM, counts per million.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    结合治疗乳杆菌GG (LGG)和anti-programmedcell死亡1 (PD-1)抗体调节肠道微生物群的构成。(一)无约束主坐标分析(PCoA)(主坐标PCo1和二氧化碳分压)与Bray-Curtis距离,与置换方差分析(PERMANOVA) p值嵌套在笼子里。前两个分布的最有益的坐标进行相应的边际箱线图。红色和蓝色圆点代表没有/ LGG治疗,分别。混合线性模型测试第一两个坐标的PCoA Bray-Curtis距离(解释方差的60.8%),评估LGG固定影响的零假设,anti-PD-1和LGG×anti-PD-1交互没有影响坐标。意义是评估使用类型III与F方差分析测试固定效果。所有p值调整使用Benjamini和业务方法。* p < 0.05;* * p < 0.01。(B)的肠道微生物群的香农指数显示治疗组。 Statistics described the mixed linear model of Shannon index of the intestinal microbiota in LGG or/and anti-PD-1 treated mice, all comparisons and false discovery rate (FDR)-corrected p values were showed. Significance was assessed using type III ANOVA with F tests for fixed effects. All p values were adjusted by using the Benjamini and Hochberg methods. (C) Distribution of the gut microbiota at the phylum-level. The numbers of replicated samples in this figure are as follows: control (n=6), LGG (n=5), anti-PD-1 (n=7), anti-PD-1+LGG (n=7). (D) Relative abundance of拟杆菌门(门级别)。数据酒吧代表的意思。误差线代表SEM。FDR-corrected p值混合线性模型。* p < 0.05。曼哈顿(eg)图显示,联合治疗组,物种丰富anti-PD-1治疗(D)或LGG (E)和控制(F)组。每个点,三角形,四边形或六角星代表一个单独的物种。物种丰富相结合治疗组由满三角形;anti-PD-1治疗组:空的三角形;LGG治疗组:六角星; for IgG-control group: quadrilateral (FDR adjusted p<0.05 and log2fold change >1, Wilcoxon rank sum test). Species are arranged at the phylum level and coloured according to the phylum. CPM, counts per million.

    分类资料在门级显示,小鼠的肠道微生物群社区接受LGG (LGG单药治疗或联合治疗)是主导厚壁菌门和拟杆菌门,而厚壁菌门和Verrucomicrobia是最丰富的细菌在其他治疗组(图2 c, D)。拟杆菌门和厚壁菌门通常是丰富健康的肠道微生物群的人类,而Verrucomicrobia丰富的胰腺癌患者的肠道。27这一共识转向减少Verrucomicrobia和增加拟杆菌门联合治疗组表明,平衡肠道微生物群,一个更健康的状态。层次聚类的基础上的相对丰度不同的订单显示细菌性的五大最丰富的订单中列出所有四组,是丰富LGG单药治疗和联合治疗(在线补充图S2D)。此外,它更丰富的联合治疗相对于anti-PD-1单药治疗组(p < 0.05) (在线补充图S2E)。因此,联合治疗与LGG anti-PD-1抗体出现影响微生物群落。

    我们还发现了显著的丰富物种根据其分类使用曼哈顿的情节。与控制或anti-PD-1单药治疗组相比,联合治疗组的丰富物种属于一个广泛的类群,包括拟杆菌门,放线菌,变形菌门,蓝藻(错误发现率(罗斯福)调整p < 0.05,图2 e, G)。丰富了物种属于相结合治疗变形菌门相比之下与LGG单药治疗组(罗斯福调整p < 0.05,图2 f)。为了进一步证实了这些,我们还进行高维类比较使用LefSe线性判别分析来展示不同丰富的微生物。丰富的物种,我们注意到乳酸菌murinus和拟杆菌均匀化在LGG丰富治疗(在线补充图S2F)。据报道,l . murinus与小鼠肠道dc的激活吗28和b .均匀化和IFN-γ的频率呈正相关吗+CD8+T细胞在小鼠肠系膜淋巴结(MLN),因此可以触发抗肿瘤免疫力。29日集体,LGG治疗丰富微生物群与抗肿瘤免疫的激活有关。

    联合治疗与LGG anti-PD-1抗体促进激活细胞毒性CD8+T细胞

    我们下一个旨在剖析相结合治疗如何影响T细胞反应,改变肿瘤微环境。以确定是否抗肿瘤LGG取决于T细胞反应的影响,我们LGG管理Rag1−−/老鼠轴承MC38肿瘤。值得注意的是,LGG单独或结合anti-PD-1抗体未能减缓肿瘤进展(图3一)。我们下一个检查是否住LGG或联合治疗的抗肿瘤活性需要CD8+消耗CD8 T细胞+T细胞使用损耗抗体。LGG或联合治疗的抗肿瘤效果缺乏CD8废除+T细胞(图3 b)。这些发现表明联合治疗的治疗效果或LGG单一疗法取决于CD8+T细胞。

    Combination treatment with Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) and anti-programmedcell death 1 (PD-1) antibody promotes activation of cytotoxic CD8+ T cells. (A) Rag1 −/− mice were subcutaneously inoculated with MC38 cells and treated with either IgG control antibody, anti-PD-1 antibody, oral administration of LGG (2×109 CFU) or combination of LGG and anti-PD-1 antibody (n=5). (B) C57BL/6 mice were subcutaneously inoculated with MC38 cells and treated with the combination of LGG and anti-PD-1 antibody (n=5). Two hundred micrograms of anti-CD8 antibody was administered intraperitoneally (i.p.) 24 hours before other treatments. (A and B) Data are presented as mean±SEM. Tumour volume results were analysed by using two-way analysisof variance (ANOVA); **p<0.01; ***p<0.001. (C) Representative flow cytometry analysis and quantification of CD8+ T cells (CD45+CD3+CD8+) in MC38 tumours on day 28 with different treatments as indicated (n=3). (D) Representative flow cytometry analysis and quantification of cytolytic CD8+ T cells (CD45+CD3+CD8+IFN-γ+) in MC38 tumours on day 28 with the indicated treatment (n=3). (E) Interferon (IFN)-γ production in CD8+ T cells. MC38 tumours in wild type (WT) mice given the indicated treatment were removed on day 28. Tumours were digested to purify the CD8+ T cells. Purified CD8+ T cells were restimulated with 1 µg/ mL SIINFEKEL for 48 hours and then analysed by IFN-γ ELISPOT assay. (F) Representative flow cytometry analysis and quantification of CD8+ T cells (CD45+CD3+CD8+) and cytolytic CD8+ T cells (CD45+CD3+CD8+IFN-γ+) in tumour draining lymph nodes of the mice treated with LGG (n=4–6). (G) The levels of IFN-γ and tumour necrosis factor (TNF)-α in MC38 tumours after different treatments. MC38 tumours in WT mice given the indicated treatment were removed on day 28. The levels of IFN-γ and TNF-α in tumours were measured using the LEGENDplex cytokine kit. (C, D, E, F and G) Data are means±SEM; unpaired two-tailed Student’s t-tests; *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001; ****p<0.0001. (H) Body weight change after Salmonella challenge. The WT mice were orally administered LGG (2×109 CFU) prior to oral infection with Salmonella (5×106 CFU). The body weight of mice was measured every 2 days. The percent weight change over the course of Salmonella infection is shown. Data are expressed as mean±SEM and were analysed by using two-way ANOVA; **p<0.01; ns p>0.05. DLN, draining lymph nodes.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
    图3

    结合治疗乳杆菌GG (LGG)和anti-programmedcell死亡1抗体促进激活细胞毒性CD8 (PD-1)+T细胞。(一)Rag1−−/小鼠皮下接种MC38细胞,用免疫球蛋白治疗控制抗体,anti-PD-1抗体,口服LGG (2×109CFU)或LGG和anti-PD-1抗体(n = 5)。(B) C57BL / 6小鼠皮下接种MC38细胞和对待LGG和anti-PD-1抗体(n = 5)。二百微克的anti-CD8抗体是腹腔内接种(i.p。)其他治疗前24小时。(A和B)数据提出了均值±SEM。肿瘤体积的结果分析了利用双向对方差(方差分析);* * p < 0.01;* * * p < 0.001。(C)代表CD8的流式细胞仪分析和量化+T细胞(CD45+CD3+CD8+)MC38肿瘤与不同治疗28天(n = 3)表示。(D)代表细胞溶解的CD8的流式细胞仪分析和量化+T细胞(CD45+CD3+CD8+IFN-γ+)在28天MC38肿瘤治疗(n = 3)表示。(E)干扰素(IFN) CD8 -γ生产+T细胞。MC38肿瘤在野生型小鼠(WT)表示治疗28天被移除。肿瘤是净化CD8消化+T细胞。纯化CD8+T细胞是重振1µg /毫升SIINFEKEL 48小时,然后通过有关酶联免疫斑点试验IFN-γ分析。(F)代表CD8的流式细胞仪分析和量化+T细胞(CD45+CD3+CD8+)和细胞溶解的CD8+T细胞(CD45+CD3+CD8+IFN-γ+)在肿瘤引流淋巴结的老鼠接受LGG (n = 4 - 6)。(G)的水平IFN-γ和肿瘤坏死因子(TNF) -αMC38不同治疗后肿瘤。MC38肿瘤在WT老鼠表示治疗28天被移除。的水平IFN-γ和TNF-α使用LEGENDplex细胞因子肿瘤测量设备。(C, D, E, F和G)数据意味着±扫描电镜;未配对的双尾学生t;* p < 0.05;* * p < 0.01;* * * p < 0.001;* * * * p < 0.0001。 (H) Body weight change after沙门氏菌挑战。WT小鼠口服接种LGG (2×109CFU)之前口腔感染沙门氏菌(5×106CFU)。小鼠的体重测量每2天。重量百分比的变化沙门氏菌感染。数据表示为±SEM和分析通过使用双向方差分析;* * p < 0.01;ns p > 0.05。DLN,引流淋巴结。

    为了进一步确定底层LGG-mediated T细胞免疫的免疫学机制,我们测量CD8的丰度+T细胞数量的流式细胞术(fluorescence-activated细胞排序(流式细胞仪))。与anti-PD-1单药治疗相比,联合治疗显著增加肿瘤浸润CD8的数量+T细胞(图3 c,p = 0.0006)。此外,独自LGG CD8也明显增加+T细胞与同形像控制抗体治疗(图3 c,p = 0.0027)。然后我们检查CD8的效应函数+T细胞通过胞内IFN-γ染色和观察IFNγ比例的增加+CD8+T细胞在MC38肿瘤治疗的联合治疗(图3 d)。ELISPOT CD8的IFN-γ分泌能力的分析+T细胞来源于引流淋巴结(DLN) MC38 tumour-bearing老鼠显示LGG单药治疗和联合治疗显著增加IFN-γ生产(图3 e分别,p = 0.0207, p = 0.0011)。一致,CD8的百分比+和IFN-γ+CD8+LGG治疗后T细胞在DLN也增加(图3 f)。同样,MC38肿瘤细胞因子分析揭示IFN-γ水平上升和肿瘤坏死因子(TNF) -α(图3 g),符合一个增强细胞毒性CD8的函数+T细胞。30 31我们还观察到亚兰和CCL5水平增加,主要由效应CD8+T细胞,32在LGG或LGG + anti-PD-1治疗肿瘤(在线补充图S3A, B)。

    因为IFN-γ+CD8+T细胞,促进细胞内病原体的间隙,33 34我们试图检查是否IFN-γ系统性水平高+CD8+T细胞,诱导LGG口服,可以增强宿主对感染的保护性免疫鼠伤寒沙门氏菌可以移植肠道,入侵肠道组织和引起小肠结肠炎。35喂养小鼠活LGG口服之前美国沙门氏菌感染增强美国沙门氏菌感染间隙,明显减轻重量和肠道长度损失(图3 h和在线补充图S3C)。总的来说,这些发现表明口服活LGG激活细胞毒性CD8的函数+T细胞系统。

    鉴于Th1细胞(CD4细胞+IFN-γ+在激活CD8)起着关键的作用+T细胞,36我们也发现了肿瘤浸润CD4细胞+在MC38 T细胞肿瘤。流式细胞仪结果显示显著增加小鼠Th1细胞的渗透处理LGG或联合治疗(图S3D)。为了进一步证实效应CD4的激活+T细胞,我们测量了Th1-associated MC38肿瘤细胞因子和观察到的增加水平的白介素(IL) 6和IFN-γ(在线补充图S3E和图3 g)。是否直接刺激CD8 LGG+CD8 T细胞在体外,我们cocultured纯化+T细胞与LGG不能按老鼠。CD8 IFN-γ生产+T细胞治疗LGG相似,如果没有治疗(在线补充图S3F,p > 0.05),表明LGG不足以刺激CD8+T细胞。因此我们提出的激活T细胞抗原cross-presentation LGG需要通过专业的抗原呈递细胞(apc)。

    LGG增加肿瘤浸润DCs和激活I型干扰素信号

    考虑到DCs是强大的装甲运兵车,我们孤立的DCs MC38肿瘤治疗LGG或联合治疗并通过流式细胞仪分析。联合治疗和LGG单一疗法显著扩大了肿瘤浸润CD11c人口+细胞(图S4A)。接下来,我们分析了DCs (CD11c人口+MHC II+),并观察到显著增加小鼠接受LGG或联合治疗(图4一)。这些发现与我们的假设一致,LGG提高抗原cross-presentation DCs的函数。亚兰也是调解CD103升高+DC肿瘤贩卖,37我们观察到CD103明显增加+DCs在LGG MC38肿瘤或联合治疗(图4 b)。我们也一直观察水平的提高CXCL9和CXCL10 (图4 c),两种趋化因子由DCs强烈渗透调节T细胞肿瘤。38进一步调查是否LGG-induced抗肿瘤免疫力特别依赖于DCs,我们接种MC38细胞CD11c-DTR老鼠。值得注意的是,治疗显著DT废除LGG和联合治疗的抗肿瘤反应(图4 d),这表明抗肿瘤活性依赖于DCs。

    Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) increases tumour infiltrating dendritic cells and activates type I interferon (IFN) signalling. (A) Representative flow cytometry analysis and quantification of dendritic cells (DCs) (CD45+CD11c+MHC II+) in MC38 tumours on day 28 given the indicated treatment (n=3). (B) Representative flow cytometry analysis and quantification of CD103+ DCs (CD45+CD11c+ MHC II+ CD103+) in MC38 tumours on day 28 given the indicated treatment (n=3). (C) The levels of CXCL9 and CXCL10 in MC38 tumours. MC38 tumours in wild type (WT) mice given the indicated treatment were removed on day 28. The levels of CXCL9 and CXCL10 in tumours were measured using a LEGENDplex chemokine kit. (D) CD11c-DTR were subcutaneously inoculated with MC38 cells and treated with IgG control antibody, oral administration of LGG (2×109 CFU) or a combination of LGG and anti-programmedcell death 1 (PD-1) antibody (n=4). Diphtheria toxin was administered 1 day before LGG or anti-PD-1 treatment (+DT). (E) IFN-γ production in CD8+ T cells after coculturing with DCs. MC38-OVA tumours in WT mice were given the indicated treatment. Tumour draining lymph nodes were removed and digested to purify the CD11c+ cells. The CD11c+ cells were cocultured with CD8+ T cells from OT-I mice for 3 days and the cross-priming activity of DCs was analysed by IFN-γ ELISPOT assay. (F) IFN-γ levels in the cell supernatant from DCs and CD8+ T cell coculture as described in (E). (G) IFN-β levels in MC38 tumours in WT mice. MC38 tumours in WT mice given the indicated treatment were removed on day 28. The level of IFN-β in tumours were measured using LEGENDplex cytokines kit. (A, B, C, E, F and G) Data are means±SEM; unpaired two-tailed Student’s t-tests; *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001. (H) WT or Ifnαr −/− mice were inoculated with 1×106 MC38 cells. Mice (n=4) were treated with oral administration of LGG (2×109 CFU). Oral administration of phosphate-buffered saline (PBS) served as the negative control. Tumour growth was measured twice per week. (D and H) Data are expressed as mean±SEM, tumour volume results were analysed by using two-way analysisof variance; *p<0.05; ***p<0.001; ns p>0.05.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
    图4

    乳杆菌GG (LGG)增加肿瘤浸润树突状细胞,激活I型干扰素(IFN)信号。(一)代表流式细胞仪分析和量化的树突细胞(dc) (CD45+CD11c+MHC II+在28天)MC38肿瘤治疗(n = 3)表示。(B)代表CD103流式细胞仪分析和量化+DCs (CD45+CD11c+MHC II+CD103+在28天)MC38肿瘤治疗(n = 3)表示。(C)的水平CXCL9和CXCL10 MC38肿瘤。MC38肿瘤在野生型小鼠(WT)表示治疗28天被移除。CXCL9和CXCL10使用LEGENDplex趋化因子在肿瘤测量设备。(D) CD11c-DTR皮下接种MC38细胞和抗体免疫球蛋白治疗控制,口服LGG (2×109CFU)或LGG和anti-programmedcell死亡1 (PD-1)抗体(n = 4)。白喉毒素管理1天前LGG或anti-PD-1治疗(+ DT)。在CD8 (E) IFN-γ生产+T细胞与DCs coculturing之后。MC38-OVA WT老鼠给指定的治疗肿瘤。肿瘤引流淋巴结被移除和净化CD11c消化+细胞。的CD11c+与CD8细胞cocultured+小鼠T细胞不能按了3天,DCs的cross-priming活动被有关酶联免疫斑点试验IFN-γ分析。(F) IFN-γ水平从DCs和CD8细胞上清液+T细胞coculture如(E)所述。(G) IFN-β水平MC38 WT小鼠的肿瘤。MC38肿瘤在WT老鼠表示治疗28天被移除。使用LEGENDplex IFN-β水平测量肿瘤细胞因子。(A, B, C, E, F, G)数据意味着±扫描电镜;未配对的双尾学生t;* p < 0.05;* * p < 0.01;* * * p < 0.001。WT或(H)Ifnαr−−/小鼠接种1×106MC38细胞。老鼠(n = 4)服用口服LGG (2×109CFU)。口服磷酸盐(PBS)作为消极的控制。肿瘤生长每周两次。(D和H)数据表示为±SEM,肿瘤体积的结果分析了利用双向对方差;* p < 0.05;* * * p < 0.001;ns p > 0.05。

    确定LGG提高肿瘤抗原的交叉表示DCs,我们执行cross-priming有关酶联免疫斑点试验与纯化CD11c IFN-γ化验+细胞的DLN MC38-OVA tumour-bearing老鼠。DCs排序从小鼠LGG或联合治疗显示增加启动功能方面的评估IFN-γ斑点和IFN-γ生产(图4 e, F)。DCs在MLN纯化及其抗原cross-priming检查能力。我们观察IFN-γ丰度增加+T细胞与LGG井含DCs治疗(在线补充图S4B)。此外,LGG治疗显著增加CD11c的数量+细胞MLN (在线补充图自己,p < 0.0001),表明口服活LGG可能在MLN激活DCs。总的来说,这些结果表明,LGG可以系统性增强dc的抗原处理和呈现能力。

    为了进一步确认激活DCs组合治疗,我们进行RNA CD11c测序(RNA-seq)+治疗肿瘤细胞纯化从MC38轴承鼠anti-PD-1抗体或LGG + anti-PD-1抗体。联合治疗IFN-related和细胞因子基因的表达增加(在线补充图S4D)。基因本体论(去)分析显示刺激T细胞激活途径,积极调控细胞因子的生产途径的激活干扰素诱导相关通路(在线补充图S4D),与上述结果一致。我们还发现同样激活免疫治疗与响应相关的通路在DCs鼠LGG相比控制免疫球蛋白抗体。

    考虑到细菌能够触发本地和系统性通过I型干扰素抗肿瘤免疫,39我们测试是否LGG调节通过调节I型干扰素的抗肿瘤功能表达式。我们测量IFN-β浓度MC38肿瘤并观察大于三倍增加IFN-β独自与anti-PD-1相比,联合治疗(图4 g)。我们发现CXCL10的表达,一种我IFN-stimulated趋化因子,也增加了(图4 c)。进一步评估潜在作用LGG-mediated I型干扰素的抗肿瘤免疫力,MC38肿瘤接种到野生型(WT)或Ifnαr−−/老鼠和LGG对待。消失在抗肿瘤效应Ifnαr−−/老鼠(图4 h)。我们还在WT MC38肿瘤治疗anti-IFNα受体的小鼠(IFNAR)抑制性抗体,发现治疗anti-IFNAR显著的抗肿瘤活性受损LGG (在线补充图S4E,p = 0.0427)。因此,这些发现表明,LGG介导激活DCs和I型干扰素信号需要LGG治疗抗肿瘤功效。

    LGG诱发DCs通过MyD88-independent I型干扰素反应方式

    据报道,适配器蛋白质,骨髓分化主要回应蛋白88 (MyD88),起着至关重要的作用在I型干扰素的诱导生产。40调查MyD88是否需要调解的响应LGG疗法,我们植入MC38侧翼的肿瘤细胞Myd88有缺陷的老鼠。令人惊讶的是,没有主机MyD88并不影响的抗肿瘤活性LGG或联合治疗(图5一个)。进一步验证这一点,我们进行了流式细胞仪实验来分析大量的T细胞渗透和DCs MC38肿瘤轴承-Myd88−−/老鼠。CD8+T细胞和CD4+Th1细胞显著增加不仅MC38肿瘤治疗的结合,而且在LGG MC38治疗肿瘤(在线补充图S5A, B)。人口的DCs和CD103+DCs也增加(图5 b)。RNA-seq CD11c分析+细胞分离MC38 tumour-bearingMyd88−−/联合治疗小鼠表现出了与T细胞活化相关基因的表达,cytokine-related干扰素通路和反应,类似于老鼠WT (图5 c)。这些发现表明,宿主MyD88不是LGG-induced DCs和T细胞激活的必要条件。

    Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) induces a type I interferon (IFN) response via a non-MyD88 dependent manner in dendriticcells (DCs). (A)Myd88 −/− mice were subcutaneously inoculated with MC38 cells and treated with IgG control antibody, anti-PD-1 antibody, oral administration of live LGG (2×109 CFU) or combination of LGG and anti-programmedcell death 1 (PD-1) antibody (n=5). (B) Representative flow cytometry analysis and quantification of DCs and CD103+ DCs in MC38 tumours from Myd88 −/− mice on day 21 given the indicated treatment as described in (A) (n=3). (C) Heatmap illustrating the relative expression of genes and the partitioning of the clusters of genes (gene ontology-GO analysis) based on the RNA-seq analysis of CD11c+ cells in mesenteric lymph nodes (MLN) of MC38 tumour-bearing Myd88 −/− mice given anti-PD-1 antibody or combination treatment with anti-PD-1 antibody and LGG. (D) MC38 tumours in Myd88 −/− mice given the indicated treatment were removed on day 21. The level of IFN-β in tumours was measured using a LEGENDplex cytokine kit. (E)Myd88 −/− mice were subcutaneously inoculated with MC38 cells and treated with IgG control antibody, anti-PD-1 antibody, oral administration of live LGG (2×109 CFU) or a combination of LGG and anti-PD-1 antibody (n=5). Two hundred micrograms anti-IFNAR1 antibody was administered intraperitoneally (i.p.) 24 hours before other treatments. (A and E) Data are expressed as mean±SEM, tumour volume results were analysed by using two-way analysisof variance; *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001. (F) IFN-γ levels in CD8+ T cells from Myd88 −/− mice. The Myd88 −/− mice were gavaged with LGG two times for 1 week. CD11c+ cells were purified from the MLN in and then cocultured with CD8+ T cells and the cross-priming activity of DCs was analysed by IFN-γ ELISPOT assay. (B, D and F) Data are means±SEM; unpaired two-tailed Student’s t-tests; *p<0.05; **p<0.01.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5
    图5

    乳杆菌GG (LGG)诱发I型干扰素(IFN)响应通过non-MyD88依赖方式dendriticcells (DCs)。(一)Myd88−−/小鼠皮下接种MC38细胞和抗体,免疫球蛋白治疗控制住LGG anti-PD-1抗体,口服(2×109CFU)或LGG和anti-programmedcell死亡1 (PD-1)抗体(n = 5)。(B)代表流式细胞仪分析和量化的DCs和CD103+DCs在MC38肿瘤Myd88−−/老鼠在21天的暗示治疗中描述(A) (n = 3)。(C)的热图说明基因的相对表达和集群分区的基因(基因ontology-GO分析)基于RNA-seq CD11c分析+肠系膜淋巴结细胞(MLN) MC38 tumour-bearingMyd88−−/老鼠anti-PD-1抗体或联合治疗anti-PD-1抗体和LGG。(D) MC38肿瘤Myd88−−/表明治疗组21天。IFN-β水平使用LEGENDplex细胞因子肿瘤测量设备。(E)Myd88−−/小鼠皮下接种MC38细胞和抗体,免疫球蛋白治疗控制住LGG anti-PD-1抗体,口服(2×109CFU)或LGG和anti-PD-1抗体(n = 5)。二百微克anti-IFNAR1抗体进行腹腔内(i.p)前24小时其他治疗方法。(A和E)数据表示为±SEM,肿瘤体积的结果分析了利用双向对方差;* p < 0.05;* * p < 0.01;* * * p < 0.001。(F) IFN-γCD8水平+T细胞从Myd88−−/老鼠。的Myd88−−/老鼠强饲法与LGG为一周两次。CD11c+细胞纯化与CD8然后cocultured MLN的+T细胞和DCs的cross-priming活动被有关酶联免疫斑点试验IFN-γ分析。(B、D和F)数据意味着±扫描电镜;未配对的双尾学生t;* p < 0.05;* * p < 0.01。

    为了确定LGG调节DCs和CD8的抗肿瘤功能+T细胞通过调节I型干扰素的表达Myd88−−/老鼠,我们测量的浓度IFN-β蛋白质MC38肿瘤。缺乏MyD88并不影响IFN-β生产,和IFN-β显著增加在肿瘤治疗LGG或组合(图5 d)。接下来我们检查了I型干扰素是否需要增加抗肿瘤效应,我们阻止了I型干扰素信号后使用anti-IFNAR LGG疗法。如先前WT小鼠,观察LGG的抗肿瘤效应Myd88−−/老鼠被政府废除IFNAR抗体(图5 e)。我们也评估cross-presentation能力Myd88−−/有关酶联免疫斑点。DCs在MLN IFN-γMyd88−−/老鼠强饲法与生活LGG每周两次。我们观察到显著增加IFN-γspot-forming细胞包含CD11c井+细胞从LGG-treated分离小鼠(图5 f)。总的来说,这些发现表明LGG-mediated增强直流cross-presentation不是依赖MyD88信号。

    LGG诱发IFN-β生产通过注册会计师/刺/ TBK1 / DCs IRF7轴

    自从LGG诱导的I型干扰素生产MyD88-independent方式,可以想象,LGG可能引发IFN-β感应通过注册会计师/ STING-dependent途径。因此,我们重新进行DCs的RNA-seq结果从MLN WT和排序Myd88−−/老鼠。基因集富集分析发现该基因签名的β干扰素反应强烈倾向于要么LGG治疗(图6 a, B)或联合治疗(在线补充图S6A, B)。我们随后分析了I型IFN-related基因的表达和发现Irf7和Ifnb1都明显调节(在线补充图S6C, D)。我们还观察到胞质DNA-sensing通路被激活。证实了这一点,我们治疗骨骨髓来源DCs (BMDCs)基因组DNA LGG并指出LGG-DNA也显著增加IFN-β生产与控制(图6 c)。总的来说,这些结果表明,LGG可能导致注册会计师/ STING-dependent IFN-β生产方式。

    Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) induces interferon (IFN)-β production via cyclic GMP-AMP synthase (cGAS)/stimulator of IFN genes (STING)/TANK binding kinase 1 (TBK1)/interferon regulatory factor 7 (IRF7) axis in dendriticcells (DCs). (A–B) Gene set enrichment analysis plots of enplot-response to IFN-β were positively correlated with LGG treatment based on the RNA-seq data of CD11c+ cells derived from mesenteric lymph nodes (MLN) in wild type (WT) (A) and Myd88 −/− (B) mice. (C) Bone marrow-derived DCs (BMDCs) were derived from WT mice and then treated with LGG or LGG chromosomal DNA (50 µg/mL) overnight. The supernatants were collected to measure IFN-β by ELISA assay. (D) The mRNA levels of Ifnβ in BMDCs from WT, Sting−/− or Cgas−/− mice. BMDCs were derived from WT, Sting−/− or Cgas−/− mice and then treated with LGG or LGG chromosomal DNA (50 µg/mL) overnight. BMDCs were collected and RT-qPCR was performed to measure the mRNA levels of Ifnβ. (E) BMDCs were derived from WT, Sting−/− or Cgas−/− mice and then treated with LGG or LGG chromosomal DNA (50 µg/mL) overnight. The supernatants were collected to measure IFN-β by ELISA assay. (F) Western blot analysis of phosphorylated p-TBK1, total TBK1, p-IRF3, total IRF3, p-IRF7 and total IRF7 in WT and Cgas −/− BMDCs. (G–H) Ifnβ mRNA level in BMDCs and IFN-β levels in supernatant after siRNA treatments. BMDCs were treated with siRNAs targeting Tbk1, Irf3 and Irf7, respectively. Twenty-four hours later, cells were harvested and cocultured with live LGG. After overnight incubation, the cells were collected for qPCR analysis of Ifnβ mRNA level (G) and the supernatant was collected for IFN-β ELISA (H). (C–E and G–H) Data are expressed as means±SEM; unpaired two-tailed Student’s t-tests; *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001; ****p<0.0001.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图6
    图6

    乳杆菌GG (LGG)诱发干扰素(IFN) -β生产通过循环GMP-AMP合成酶(cga) /刺激干扰素基因(刺痛)/坦克绑定激酶1 (TBK1) /干扰素调节因子7 (IRF7)轴dendriticcells (DCs)。(a - b)基因集富集分析块enplot-response IFN-β与LGG呈正相关,治疗基于RNA-seq CD11c的数据+细胞来源于肠系膜淋巴结(MLN)野生型(A)和(WT)Myd88−−/(B)老鼠。(C)骨骨髓来源DCs (BMDCs)来自WT老鼠,然后接受LGG或LGG一夜之间染色体DNA(50µg /毫升)。上层清液的收集测量IFN-βELISA测定。(D)的mRNA水平Ifnβ在BMDCs WT,刺痛−−/或注册会计师−−/老鼠。BMDCs来自WT,刺痛−−/或注册会计师−−/老鼠,然后接受LGG或LGG一夜之间染色体DNA(50µg /毫升)。BMDCs收集和RT-qPCR进行测量的mRNA水平Ifnβ。(E) BMDCs来自WT,刺痛−−/或注册会计师−−/老鼠,然后接受LGG或LGG一夜之间染色体DNA(50µg /毫升)。上层清液的收集测量IFN-βELISA测定。(F)的免疫印迹分析磷酸化p-TBK1,总TBK1 p-IRF3,总IRF3、p-IRF7和总IRF7 WT注册会计师−−/BMDCs。(G-H)IfnβBMDCs mRNA水平和IFN-β水平在核后上层清液治疗。BMDCs siRNAs对待目标Tbk1,Irf3和Irf7,分别。24小时后,细胞收获和cocultured LGG生活。隔夜孵化后,细胞收集qPCR分析Ifnβ信使rna水平(G)和上层清液收集IFN-βELISA (H)。(汉英和G-H)数据表示为±SEM手段;未配对的双尾学生t;* p < 0.05;* * p < 0.01;* * * p < 0.001;* * * * p < 0.0001。

    确认I型干扰素生产通路激活在DCs LGG是注册会计师/刺的依赖,我们进行了一系列的qPCR实验BMDCs来源于WT,刺痛−−/(Tmem173−−/),注册会计师−−/老鼠。始终,治疗LGG或LGG-DNA强烈的调节Ifnb在WT BMDCs mRNA表达,而STING-deficient或cGAS-deficient BMDCs大减少Ifnb表达式(图6 d)。值得注意的是,IfnbmRNA表达接近被察觉cGAS-deficient BMDCs。此外,我们研究了一组免疫activation-related基因的表达在这些BMDCs。正如所料,表达Tnfα,Il12,Cxcl9,Cxcl10,Cxcl11和Cx3cr1都是调节在WT BMDCs LGG或LGG-DNA治疗(在线补充图S7A)。有趣的是,注册会计师缺乏大幅减少了这些基因的mRNA水平。类似的结果也被观察到刺痛−−/BMDCs除外Tnfα和Cxcl9(在线补充图S7A)。别人曾证明注册会计师信使rna在激活DCs增加细菌感染。41一致,我们发现upregulation注册会计师信使rna在WT和刺痛−−/BMDCs LGG治疗(在线补充图S7B)。这些结果支持了这样的观点,即注册会计师对I型干扰素通路激活在DCs至关重要。

    接下来,探讨注册会计师/刺痛的下游信号是否被激活在BMDCs LGG治疗,我们第一次发现IFN-β生产用ELISA测定。注册会计师和刺缺乏显著降低的感应IFN-βLGG或LGG-DNA治疗(图6 e)。值得注意的是,LGG-DNA不能刺激IFN-β生产注册会计师−−/BMDCs (图6 e)。验证注册会计师/刺负责IFN-β感应的信号LGG治疗,我们收集了WT注册会计师−−/BMDCs刺激与LGG检测TBK1磷酸化(p-TBK1) IRF3磷酸化(p-IRF3)和IRF7磷酸化(p-IRF7)。p-TBK1的蛋白质含量和p-IRF7轻度增加在WT BMDCs LGG刺激,而p-IRF3水平保持不变(图6 f)。相比之下,增加p-TBK1或p-IRF7妥协时,注册会计师缺乏(图6 f和在线补充图S7C)。这些发现表明TBK1和IRF7的两个关键组件由LGG I型干扰素通路激活。

    进一步证实IRF3的角色和IRF7 LGG IFN-β生产途径诱导,我们撞倒了TBK1 IRF3或IRF7 WT BMDCs使用各自的核(在线补充图S7D)。然后我们对待这些BMDCs LGG和IFN-β表达式qPCR和ELISA检测到。LGG治疗,TBK1击倒或IRF7击倒显著降低IFN-β表达式不仅在mRNA水平还在蛋白质水平(图6 g H)。类似的结果,但在较小程度上,观察在IRF3击倒BMDCs (图6 g H)。IFN-β蛋白水平IRF3击倒BMDCs远远高于IRF7击倒BMDCs (图6 h)。因此,尽管我们不能完全排除这种可能性,IRF3有助于LGG-induced IFN-β生产,数据显示,IRF7发挥重要作用在注册会计师/刺/ TBK1 LGG治疗期间途径激活。

    注册会计师/刺痛需要调解LGG和联合治疗的抗肿瘤效应anti-PD-1抗体

    确定了生活LGG能够引起注册会计师/ STING-dependent IFN-β生产体外,我们接下来问是否注册会计师/刺痛信号参与LGG-induced使用小鼠结肠癌模型抗肿瘤效应。在WT和MC38细胞皮下接种注册会计师−−/老鼠和对待LGG或联合治疗与LGG anti-PD-1抗体。WT和注册会计师−−/老鼠表现出相似的肿瘤生长(图7)。注册会计师缺乏显著减毒引起的肿瘤体积减少LGG或联合治疗(图7)。类似的结果也被观察到刺痛−−/老鼠(图7 b)。评估直流信号的作用,我们采用Cd11ccre刺痛/ f老鼠和监控LGG治疗后肿瘤生长。在Cd11ccre刺痛/ f鼠标,刺痛经历尤其是CD11c删除+细胞如DCs。MC38肿瘤细胞增长迅速Cd11ccre刺痛/ f老鼠比控制老鼠LGG治疗或联合治疗(图7 c)。这些结果说明注册会计师和刺在DCs中扮演重要角色的抗肿瘤活性住LGG和联合治疗。

    cGAS/STING is required to mediate the antitumour effects of Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) and combination treatment with anti-programmedcell death 1 (PD-1) antibody. (A) Cgas −/− and wild type (WT) mice were subcutaneously inoculated with MC38 cells and treated with IgG control antibody, oral administration of LGG (2×109 CFU) or a combination of LGG and anti-PD-1 antibody. (B) Sting −/− and WT mice were subcutaneously inoculated with MC38 cells and treated with IgG control antibody, oral administration of LGG (2×109 CFU) or a combination of LGG and anti-PD-1 antibody (n=4). (C) Cd11ccreSting f/f and WT mice were subcutaneously inoculated with MC38 cells and treated with IgG control antibody, oral administration of LGG (2×109 CFU) or a combination of LGG and anti-PD-1 antibody (n=4). (A–C) Data are expressed as mean±SEM. Tumour volume results were analysed by using two-way analysisof variance; *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图7
    图7

    注册会计师/刺痛需要调解的抗肿瘤效应乳杆菌GG (LGG)和联合治疗与anti-programmedcell死亡1 (PD-1)抗体。(一)注册会计师−−/和野生型(WT)小鼠皮下接种MC38细胞和抗体免疫球蛋白治疗控制,口服LGG (2×109CFU)或LGG和anti-PD-1抗体的结合。(B)刺痛−−/和WT小鼠皮下接种MC38细胞和抗体免疫球蛋白治疗控制,口服LGG (2×109CFU)或LGG和anti-PD-1抗体(n = 4)。(C)Cd11ccre刺痛/ f和WT小鼠皮下接种MC38细胞和抗体免疫球蛋白治疗控制,口服LGG (2×109CFU)或LGG和anti-PD-1抗体(n = 4)。(a - c)数据表示为±SEM。肿瘤体积的结果分析了利用双向对方差;*p < 0.05;* *p < 0.01;* * *p < 0.001。

    讨论

    我们的研究建立了实证为基础开发口服活LGG益生菌结合银行独立委员会对癌症治疗。需要我们证明注册会计师/刺轴的抗肿瘤效应LGG和I型干扰素的诱导。cGAS-STING-TBK1-IRF7-IFN-β级联介导LGG在DCs的鲁棒自适应免疫反应。此外,LGG治疗与肠道微生物群,可能有助于抗肿瘤功效(图形抽象)。我们的研究结果提供有价值的洞察LGG-mediated抗肿瘤免疫的分子机制和突出的潜力提高银行独立委员会免疫治疗通过结合LGG口服。

    我们提供的证据表明,口服LGG增加MLN的人口和DCs的功能和提高招聘的可能性从肠道肿瘤网站激活DCs。我们的观察与发现,政府的toll样受体(TLR)受体激动剂强烈激活MLN DCs和刺激高水平的细胞因子。42众所周知,肠道DCs与无害的直接接触和致病性腔的内容。43可能LGG吞噬了人口迁徙直流一旦它到达固有层。这个直流人口过程LGG和MLN交通量,激活幼稚T细胞。激活DCs和T细胞迁移到DLN和肿瘤站点。符合这一假设,我们发现大量的肿瘤CD103渗透+DCs和CD8+小鼠T细胞表达IFN-γ对待LGG或联合治疗。这些发现提供了新的见解的规定在遥远的肿瘤免疫细胞反应网站通过肠道和肿瘤之间的串扰。

    根据我们的数据,指出LGG治疗消除CD11c的人口−MHC II+MC38细胞肿瘤。据报道,myeloid-derived抑制细胞MHC II高水平尤其是肿瘤44并能深刻地减少CD8+T细胞的活动。此外,据报道,在单核细胞高表达MHC II是积极与B16转椅肿瘤生长。45因此,我们推测LGG的抗肿瘤作用可能减少CD11c属性−MHC II+。还需要进一步的研究来确定哪些CD11c的亚型−MHC II+由LGG suppressor-like细胞可以抑制。此外,STING-mediated I型干扰素证明诱导自然杀伤(NK)细胞激活,从而有助于消除肿瘤,特别是在黑色素瘤B16转椅。46个47我们不能排除NK细胞活化的重要作用在控制肿瘤。的确考虑LGG介导STING-dependent I型干扰素在DCs激活,它是合理的假设LGG可以增强NKs肿瘤,提高应对免疫疗法。需要额外的调查来解决这个问题。

    LGG可以调节炎症免疫反应在癌症发展和转型,减少急性和慢性腹泻与化疗和放疗患者的癌症有关。48它也被报道支持肿瘤回归诱导适应性免疫反应。14I型干扰素的诱导细菌对CD8的功能至关重要+T细胞。我们确定LGG诱发IFN-β生产DCs通过注册会计师/刺/ TBK1 / IRF7轴,限制,我们只确定gm - csf或FLT3L派生BMDCs通路,这可能代表未成熟dc或cDC2这需要验证主DCs在未来使用。我们所知,这是第一次报告的参与注册会计师/刺/ TBK1 / IRF7轴LGG-mediated I型干扰素诱导癌症治疗。在这个报告中,我们不能完全排除这种可能性,其他介质,也引发I型干扰素诱导,可能导致生活LGG口服的功效。例如,TIR-domain-containing适配器蛋白质诱导IFN-β或cathelicidin-related抗菌肽(在老鼠和人类LL37)也可能参与诱导的I型干扰素的生产。49个50辨别LGG-mediated机制和进一步发展潜力疗法针对这个途径,有必要理解哪些中介由LGG I型干扰素诱导所需。

    此外,我们提供证据表明联合治疗与LGG anti-PD-1抗体可以调节肠道微生物群社区,促进免疫细胞的激活可能是有益的。我们确定一个潜在的两个特定丰富物种(签名l . murinus和b .均匀化)目前LGG治疗。这将是有趣的探索他们的潜力作为银行独立委员会的预测标记免疫疗法在人类的反应。关于激活免疫反应的机制,l . murinus可以增强表达il - 12和减少OX40表达DCs,因此促进激活。28即将到来的研究主要在于探索这些物种的分子机制影响先天和适应性免疫。

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    补充材料

    • 补充数据

      仅这个web文件已经由英国医学杂志出版集团从一个电子文件提供的作者(年代)和没有对内容进行编辑。

    脚注

    • 贡献者WS和LW设计研究。WS、LW QX和XD进行实验和分析数据。WS、LW XZ和HL写的手稿。弹头,JB,肯塔基州,QX和YF编辑的手稿。LW, XZ和弹头监督这个项目。

    • 资金这项工作是支持的芝加哥肿瘤研究所,路德维希癌症研究基金会的捐赠(弹头)。这项工作也发现部分支持格兰特从加拿大自然科学和工程研究理事会(XZ rgpin - 2016 - 04715)。JB被临床疗法培训支持格兰特(T32GM007019)。

    • 相互竞争的利益弹头股票和其他所有权利益与刺激疗法,Immvira,反射制药、协调药品,东方三贤人Oncosenescence疗法。他曾在Aettis咨询或顾问的角色,阿斯利康,协调药品,属,默克公司Serono S.A.,纳米proteagen NKMax美国航天飞机制药业。他有一个专利未决题为《方法和工具对患者的诊断和治疗大肠癌肝转移的(PCT / US2019/028071)。他已经收到了来自瓦里安和Regeneron研究资助资金。他已经收到了补偿包括旅游、住宿或费用报销从阿斯利康、勃林格殷格翰集团和默克公司Serono S.A.

    • 出处和同行评议不是委托;外部同行评议。

    • 补充材料此内容已由作者(年代)。尚未审查由BMJ出版集团有限公司(BMJ)和可能没有被同行评议。任何意见或建议讨论仅代表作者(年代)和不了BMJ的支持。和责任起源于BMJ概不负责任何依赖的内容。内容包括任何翻译材料,BMJ并不保证翻译的准确性和可靠性(包括但不限于当地法规、临床指南,术语,药物名称和药物剂量),和不负责任何错误或遗漏引起的翻译和改编或否则。