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客观的预防性疫苗需要控制丙肝病毒的流行,与基因型1 - 3造成> 80%的世界范围内的感染。疫苗的发展是受丙肝病毒的异质性,病毒逃避包括保护守恒中和抗原表位和次优丙肝病毒细胞培养系统的功效。我们开发了细胞培养灭活基因型1 - 3丙肝病毒候选疫苗提供本地信封折叠蛋白质引起中和抗体。
设计高产基因型1 a、2 a和3 TNcc丙肝病毒是由串行通道,J6cc和DBN3acc Huh7.5获得突变细胞和工程检测到下一代测序。中和抗原决定部位暴露在细胞中和化验确定使用人类单克隆抗体AR3A AR4A,和多克隆抗体C211。BALB / c小鼠接种处理和灭活基因型1、2或3使用AddaVax病毒,领有执照的辅助MF-59的同系物。纯化鼠标和病人血清免疫球蛋白化验了中和能力;小鼠免疫球蛋白,immune-sera化验了E1和E2绑定。
结果与原病毒相比,高产病毒到~ 1000倍增加传染性滴定度(峰值滴定度:6 - 7 log10 focus-forming单位(洁净)/毫升)和~ 2470倍增加曝光的守恒中和抗原表位。丙肝病毒诱发的免疫球蛋白g广泛中和基因型1 - 6 (EC50: 30 - 193µg /毫升;意味着71µg /毫升),与慢性感染患者,免疫球蛋白g相比毫不逊色,基因型1 - 3 E1和E2;immune-sera端点滴定度达到000 32。
结论高产基因型1 - 3丙肝病毒灭活可以开发为依据候选疫苗诱导小鼠的广泛中和抗体支持进一步的临床开发。
- 丙肝病毒
- 丙型肝炎
- 慢性病毒性肝炎
- 分子生物学
- 免疫反应
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已知关于这个主题是什么呢
预防性疫苗需要控制的丙肝病毒疫情。
丙肝病毒显示大的遗传异质性,与基因型1、2和3造成>全球感染的80%。
中和抗体是关键在疫苗免疫相关保护设置,可以预防慢性丙肝病毒感染。
这种保护与广泛中和抗体不同的HCV基因型和针对守恒中和抗原表位。
丙肝病毒,病毒灭活疫苗的策略是有吸引力的,因为它的能力目前丙肝病毒包膜糖蛋白复杂的天然构象和诱导中和抗体。
这种疫苗的发展受到低丙肝病毒产量目前可用的细胞培养系统。
这个研究增加了
基于之前开发的细胞培养感染丙肝病毒重组,我们开发了高产基因型1、2和3丙肝病毒在细胞培养中重组越来越高滴定度。
与原病毒相比,高产病毒显示增加曝光的守恒的抗原表位的目标中和抗体对预防丙肝病毒感染很重要。
基于候选疫苗灭活基因型1、2或3丙肝病毒,分别和佐剂模拟许可MF-59佐剂有能力引起广泛中和抗体丙肝病毒的主要基因型与公认的流行病学意义。
这项研究可能会如何影响研究、实践或政策
本研究的一个里程碑丙肝病毒灭活疫苗的临床前开发的候选人。
定稿后的临床前开发,包括疫苗生产条件的优化,确定候选疫苗进入临床的发展。
预防丙肝病毒疫苗是一个重要的工具来防止大约150万新感染和每年有290 000人死于这种病毒。
介绍
丙型肝炎病毒(HCV)是一个非常普遍,血源性包膜积极意义单链RNA病毒的黄家庭。1与非结构性蛋白(p7, NS2, NS3、NS4A NS4B, NS5A和NS5B),结构蛋白衣壳蛋白核心和信封E1和E2糖蛋白构成病毒粒子。E1和E2异质二聚体是中和抗体的主要目标(nAb)。2在8 ~ 30%的主要基因型不同的序列,基因型1、2和3全世界引起> 80%的感染。基因型4、5和6显示了更多的限制地理本地化中东/非洲、南非和东南亚,分别,而基因型7和8报告了几个人。1亚型(a, b, c等)不同~ 20%的序列。
每年,~ 150万新感染发生。其中,~ 80%进行慢性感染导致的~ 5800万慢性感染患者肝硬化和肝细胞癌的风险增加,每年造成290 ~ 000人死亡。3目前抗病毒治疗没有对这种流行病产生重大影响,主要是由于缺乏症状严重肝损伤之前,缺乏筛查项目和高处理成本在许多国家。1 3预防性疫苗将被要求达到世卫组织的目标是消除肝炎作为主要的公共卫生威胁。
在自然感染T细胞和B细胞似乎引起保护性免疫。T细胞疫苗使用病毒载体方法没有预防慢性感染黑猩猩和人类。4个5相比之下,基于E1和E2糖蛋白B细胞疫苗显示,黑猩猩和保护作用形成诱导nAb在非人类的灵长类动物,黑猩猩和人类,即使nAb在< 50%的人类疫苗接受者诱导能力有限中和不同的HCV基因型。6 - 10nAb的感应与其他病毒疫苗的效果。11日12此外,在自然丙肝病毒感染诱导广泛nAb介导的保护。13 - 15保护nAb针对守恒的构象中和抗原表位在E2和E1和E2本土化抗原区域3和4 (AR3和AR4)2 14 - 16目标的定义良好的人类单克隆抗体(mAb)。17 18对HCV基因型不同,功效未来的疫苗应该目标这样的抗原表位,然而,似乎是被封闭的包膜蛋白构象州(E1、E2的状态)。19日20基于不同的另一种方法可能是一种多价疫苗病毒变体。
丙肝病毒,在老鼠身上全病毒疫苗显示诱导nAb的能力高于蛋白质疫苗,21大概是由于更高的密度和更多的信封蛋白质的天然构象。事实上,许多领有执照的病毒疫苗是基于全病毒或病毒样颗粒。12日22然而,这项技术在丙肝病毒疫苗研制中的应用是受到病毒产量相对较低生产丙肝病毒在细胞培养系统。2005年,第一个系统是基于单个基因型2隔离(JFH1),23日24其次是JFH1-based系统特定蛋白质表达的基因型25和完整的系统不是根据JFH1。代谢途径这些系统通常收益率103-10年5每毫升传染性病毒,认为疫苗发展的理想。然而,免疫原性的概念证明JFH1-based基因型2的重组得到老鼠和非人类的灵长类动物。21日29日然而,高效nAb只有诱导佐剂不许可供人类使用。
本研究的目的是:(1)发展高产文化系统生产基因型1、2和3丙肝病毒,(2)描述中和表位的高收益丙肝病毒关注守恒的抗原表位与保护;和(3)获得概念验证每个高产丙肝病毒在小鼠体内的免疫原性使用佐剂适用于人类使用关注广泛中和抗体基因型1 - 6丙肝病毒的检测。
材料和方法
大多数章节都进一步详细在线补充材料。
丙肝病毒重组
原始TNcc J6cc和DBN3acc重组开发。代谢途径高产HI-recombinants工程使用积累的细胞培养逆转录聚合酶链反应(rt - PCR)扩增子和在融合技术。重组和基因型(隔离)1 (TN), 1 b(阁下),2(卫星),2 b (J8), 3 (S52), 3 (DBN), 4 (ED43)、5 (SA13)和6 (HK6a)24岁25 30具体core-NS2和剩余的基因序列2隔离JFH1被用于体外丙肝病毒中和试验。
细胞
人类肝癌Huh7.5细胞用于传播丙肝病毒。人类胚胎肾HEK293细胞用于生产的丙肝病毒E1和E2复合物。
体外转染的丙肝病毒RNA转录Huh7.5细胞
成绩单是利用T7 RNA聚合酶(Promega);转染是使用Lipofectamine2000(表达载体)。25
与丙肝病毒感染Huh7.5细胞
细胞接种上层清液源自转染实验在感染的高峰期。25
串行通道Huh7.5丙肝病毒的细胞
细胞接种文化上层清液来自前面的通道在感染的高峰期。31日
代的病毒Huh7.5股市细胞
细胞接种培养上清液在感染的高峰期。上层清液收集池周围感染的高峰期。对于股票用于中和病毒化验,丙肝病毒包膜蛋白序列被Sanger测序证实。病毒疫苗病毒生产种子股,完整的丙肝病毒开放阅读框(ORF)分析了下一代测序(门店)。
丙肝病毒抗原在细胞组织化学染色文化
丙肝病毒感染细胞的百分比被免疫染色使用监控主要抗体单克隆抗体C7-50 anti-HCV核心(美国纽约EnzoLifeSciences,法明岱尔)稀释1:5000和单克隆anti-HCV NS5A抗体9 e1024稀释1:5000以及二次抗体Alexa萤石488山羊antimouse免疫球蛋白(H + L)表达载体稀释1:50 0。25
测定丙肝病毒传染性滴定度
丙肝病毒传染性滴定度在文化上清液测定滴定focus-forming单位(洁净)/毫升的96孔板和随后的免疫染色使用初级抗体anti-HCV核心抗体C7-50 (EnzoLifeSciences)稀释1:1000 anti-HCV NS5A抗体9 e10汽油稀释1:3000以及二次抗体ECL羊antimouse免疫球蛋白稀释1:50 0,其次是可视化和洁净的自动计数。32
测序的丙肝病毒细胞培养
丙肝病毒RNA提取文化上层清液,完整的ORF(串行通道实验,首次通过动力学实验和病毒种子股)或E1和E2(中和化验病毒的股票)放大了rt - pcr使用特定的引物(在线补充表1和2),其次是上天(ORF扩增子)或Sanger测序(E1和E2扩增子)。32 33
Subclonal分析
选定的rt - pcr ORF扩增子subcloned使用TOPO-XL克隆工具包(表达载体)Sanger测序紧随其后。
丙肝病毒生产疫苗的一代
丙肝病毒是在个人细胞无血清培养系统生产的工厂。34 35
处理的丙肝病毒疫苗的一代
丙肝病毒是澄清使用5µm 0.65µm过滤器和集中通过切向流过滤(TFF)分子量截止(MWCO) 500 kDa,36紧随其后的是两个超速离心法步骤使用Optiprep密度梯度介质(σ)的形成三个密度缓冲和一个连续的梯度,分别由一个中间TFF步骤(MWCO 500 kDa)。以下尺寸排阻色谱法使用交联葡聚糖g - 100(西格玛奥德里奇),丙肝病毒是紫外线辐照UVG-54手持紫外灯(240 nm紫外线,6瓦)(德国耶拿分析仪器公司)。35
免疫接种的老鼠
BALB / c小鼠年龄在6 - 8周(泰康利农场、丹麦)皮下接种每3周4次与丙肝病毒或卵清蛋白(OVA)制定与辅助AddaVax 50% / 50% (v / v)。
患者样本
慢性丙型肝炎患者血清或血浆从收集(CHC) 2011年5月到2021年8月起生物附着在丹麦数据库中对乙肝和丙肝和丙肝病毒串联组的传染病,哥本哈根大学Hospital-Hvidovre。患者≥18年,没有以前治疗CHC的历史,没有合并感染人类免疫缺陷病毒(HIV)和乙型肝炎病毒,没有最近的静脉注射毒品。
免疫球蛋白的净化、浓度和量化
免疫球蛋白是纯化小鼠血清或病人血清或血浆Amicon Pro亲和力Kit蛋白浓度与50 G kDa Amicon超0.5设备(默克密理博)和集中Vivaspin 500、000 MWCO (GE Lifescience)工具包。鼠标和患者免疫球蛋白量化与免疫球蛋白(总)鼠标裸露的酶联免疫试剂盒(ThermoFisher)和Cedex生物分析仪(罗氏),分别。
体外中和试验
丙肝病毒中和马伯AR3A和AR4A17 18和多克隆抗体C21119完成100年卷µL紧随其后的是镀Huh7.5细胞接种于96孔板,随后受丙肝病毒抗原和自动化洁净工程组织化学染色计数。31日34丙肝病毒中和与纯化鼠标或患者免疫球蛋白是同样体积的10µL完成的。37中和的百分比计算,100 -(100×(洁净工程实验井数)/(平均洁净计数在病毒只有井)]。
丙肝病毒E1和E2复杂的ELISA
E1和E2复合物得到从HEK293细胞溶解产物与E1、E2表达质粒转染。绑定的老鼠免疫球蛋白或immune-sera E1和E2复合物被评估使用二次抗体ELISA ECL羊antimouse免疫球蛋白辣根过氧化物酶与抗体(通用电气医疗集团)稀释1:1000。积极的控制被马伯AP3338和H77.39。39负控制只是二级抗体。
病人和公众参与
患者或公众没有参与设计、实施、报告或传播计划的研究。
结果
代的高产基因型1、2和3多克隆丙肝病毒
发展高收益的文化系统,我们连续通过全身TNcc(基因型1 a),26J6cc 2(基因型)273和DBN3acc(基因型)28丙肝病毒重组在Huh7.5肝癌细胞在丙肝病毒传染性滴定度峰值显示高原~ 6 log10洁净/毫升(图1)。终止一个额外的标准使是公认的检测细胞培养适应替换> 80%的病毒数量由上天决定的。首次TNcc通道线,总会提出病毒准物种种群与突变发生率< 80%,刺激后通过线共有41个病毒的段落。J6cc和DBN3acc 43和22的段落,分别。与最初的段落,段落末显示增加丙肝病毒传染性滴定度高达2.6 log10 TNcc, 1.7 log10 J6cc和1.3 log10 DBN3acc。
体外串行通道导致高收益多克隆基因型1,2和3丙肝病毒。Huh7.5细胞接种细胞培养上清液包含指定的病毒来自前面的通道文化在感染的高峰期,由免疫染色。每2 - 3天,通过文化分裂,丙肝病毒抗原阳性细胞百分比和丙肝病毒传染性滴定度疣、传染性滴定法测定。峰上层的丙肝病毒传染性滴定度确定指定段落的三个复制与标准差(SD)。TNcc,后来通过线接种10病毒从一个初始通道线。蓝色的框架,通过接受上天。基因型2的绿色框架,通过用于生产种子的股票。红色的框架,通过门店和用于生产的基因型1种子的股票。3基因型种子股票是基于发达DBNcc-HI重组之后。洁净,focus-forming单位; NGS, next-generation sequencing.
基因变化获得高收益多克隆基因型1,2和3丙肝病毒
识别高收益表型的遗传相关,我们进行门店多克隆整个羊痘疮的通道(PP)病毒。TNcc-PP-10 TNcc-PP-18,来自10和18的初始通道线,总会提出病毒准物种人口大多数编码核苷酸变化出现在<病毒基因组的80% (在线补充表3)。相比之下,tncc - pp - 38.1来自后通道线,以及J6cc-PP-35 DBNcc-PP-16,人口更均匀的病毒被发现与大多数编码核苷酸变化出现在≥80%的病毒基因组(图2和在线补充表4 - 6)。tncc - pp - 38.1, J6cc-PP-35和DBNcc-PP-16 17日17日和7在≥80%的病毒基因组编码更改,其中4,分别为3和1本地化的膜蛋白。值得注意的是,DBN3acc已经怀有五个编码膜蛋白的变化与共识丙肝病毒序列在本重组是基于受感染的病人,而TNcc和J6cc不包含编码膜蛋白的变化。代谢途径Subclonal分析这些PP-viruses和系统发育分析TNcc-PP积累反映门店结果(在线补充结果,在线补充图1,在线补充表7 - 9)。
工程高产基因型1 a、2 a和3丙肝病毒重组
基于遗传分析高产PP-viruses,我们工程高收益(HI) -recombinants: TNcc-HI-18A和TNcc-HI-18B反映了两个主要的人口在最初的一段线(在线补充图1和在线补充表3)。TNcc-HI反映tncc - pp - 38.1在以后的通道线,J6cc-HI反映J6cc-PP-35和DBNcc-HI反映DBNcc-PP-16怀有编码核苷酸变化> 80%频率在门店subclonal证实了组合分析;作为一个例外,TNcc-HI还怀有G32S发现48%频率(除非另有说明,所有的氨基酸位置数字与H77参考多蛋白,加入基因库AF009606)(图2和在线补充表4 - 9日)。
与原来的重组相比,所有HI-recombinants显示增加健身在转染和感染首次通过动力学实验,加速传播动力学,确定监控的%感染细胞和丙肝病毒传染性滴定度和增加峰值传染性滴定度。TNcc-HI-18A和TNcc-HI-18B峰值传染性滴定度只有接近5 log10洁净/毫升,因此低于6 log10洁净工程的目标/毫升(在线补充图2)。相比之下,在转染/感染实验,TNcc-HI, J6cc-HI和DBNcc-HI产生峰值传染性滴定度的5.8/6.0,6.1/6.8和6.4/7.0 log10洁净/毫升,分别在各自的原始重组了3.0/3.5,分别为3.5/3.4和5.3/5.3 log10洁净/毫升(图3)。在感染的实验中,传染性的滴定度HI-viruses可比与PP-viruses (图3 b)。HI-recombinants基因稳定后第一个病毒通过(没有收购替换除TNcc-HI > 10%频率,获得L179P频率和S1930Y 15%和39%,分别)。
工程高产基因型1、2和3丙肝病毒重组增加了病毒在细胞培养中健身。(A)指定重组转染到Huh7.5细胞使用相同数量的丙肝病毒核糖核酸体外转录直接重组相比,在每一个图。(B)在首次通过动力学实验,细胞被感染的感染复数0.002原始和HI-viruses使用上层清液源自转染实验时峰值传染性滴定度观察;多克隆病毒通过包括进行比较。每2 - 3天(A和B),通过文化分裂,和%丙肝病毒抗原阳性细胞和丙肝病毒传染性滴定度测定免疫染色和传染性滴定法,分别。丙肝病毒传染性滴定度与SD三个复制的方法。洁净,focus-forming单位;莫伊,感染复数。
高产基因型1 a、2 a和3重组显示增加中和抗原表位的接触
与相应的重组与体内派生包膜蛋白序列没有细胞培养适应替换,24 30基于EC50值决定,HI-recombinants显示十二倍2472倍增加敏感性通过人为马伯AR3A来中和17AR4A,18针对守恒的构象表位在E2和E1和E2与保护,分别和多克隆免疫球蛋白g C21119来自一个病人慢性感染与基因型1 (图4)。详细,TNcc-HI显示300倍,2400倍,110倍增加中和AR3A敏感性,AR4A C211,分别在基因型1丙肝病毒株来源于TN-PP-18显示三倍,灵敏度增加15倍和3.2倍。J6cc-HI显示440倍,十二倍和633倍中和敏感性增加。DBNcc-HI显示1250倍、220倍和2472倍,而DBN3acc显示167倍,22倍和88倍中和敏感性增加。与体内病毒衍生TN、卫星和DBN包膜蛋白序列,确定一半最大有效浓度(EC50)与以前的结果一致。20 40 41因此,HI-viruses显示大大增加曝光的守恒的构象中和抗原表位与防止慢性丙肝病毒感染有关。
工程高产基因型1、2和3丙肝病毒重组显示增加敏感性通过人为nAb来中和。重组与体内提取基因型(隔离)1 (TN),30.2(卫星)24和3 (DBN)30.core-NS2序列,以及TNcc-HI J6cc-HI DBNcc-HI,基因型1丙肝病毒种子股票和DBN3acc28与包膜蛋白替换了在体外通过受到中和与人类马伯AR3A AR4A,17 18和多克隆抗体C211。19数据点的三个与SD复制;曲线拟合,EC50与公式计算y = 100 / (1 + 10(log10EC50−X)×hillslope使用GraphPad棱镜)。褶皱增加中和灵敏度计算[(EC50 1 (TN), 2(卫星)或3 (DBN)病毒体内派生包膜蛋白序列)/ (EC50各自病毒体外派生包膜蛋白替换)]。股票病毒包膜蛋白序列经Sanger测序。EC50,一半最大有效浓度;gt,基因型;马伯,单克隆抗体;nAb,中和抗体。
代的候选疫苗灭活1高产基因型的基础上,2和3重组
制作病毒疫苗试验,丙肝病毒接种产生的种子股Huh7.5细胞与多克隆病毒制备TNcc-PP-18、多克隆病毒制备J6cc-PP-38或第一次病毒通过DBNcc-HI病毒,可以在启动疫苗研究。序列证实基因型1、2和3丙肝病毒种子股传染性滴定度为4.8,6.2和6.4 log10洁净/毫升,分别为(在线补充表3、5和6),被用来接种Huh7.5个人细胞细胞丙肝病毒生产工厂,导致总量的16 L丙肝病毒包含上层清液/病毒(在线补充图3)。上层清液受到下游加工,包括初始过滤澄清后跟两个TFF步骤,缓冲超速离心法,另一个TFF梯度超速离心法、色谱和紫外辐照(补充导致失活在线补充文件1和在线补充图4和图5)。
免疫小鼠的灭活基因型1 a、2 a和3丙肝病毒候选疫苗引起广泛中和抗体和包膜蛋白绑定
处理灭活基因型1、2或3 HCVcc或控制抗原与佐剂AddaVax卵子被制定,一个辅助MF-59模拟,这是人类使用许可,用于免疫BALB / c小鼠。
纯化血清免疫球蛋白g从个体动物中和丙肝病毒体内派生包膜蛋白序列中使用的相同的基因型各自的疫苗以浓度依赖方式,意味着EC50的47岁,124年和101年µg /毫升1基因型,分别为2和3丙肝病毒疫苗(图5)。接近完全中和应用免疫球蛋白浓度最高的达到1000µg /毫升。卵子接种小鼠并没有引起丙肝病毒逮捕。
免疫与灭活基因型1、2或3丙肝病毒引起抗体中和细胞培养感染丙肝病毒相同的基因型。三组小鼠接种灭活基因型1、2和3丙肝病毒或卵子与辅助AddaVax制定。纯化血清免疫球蛋白g从个人老鼠被用来抵消包含体内提取重组基因型(隔离)1 (TN),30.2(卫星)24和3 (S52)25具体core-NS2。数据点的三个与SD复制;曲线拟合,EC50与公式计算y = 100 / (1 + 10(log10EC50−X)×hillslope使用GraphPad棱镜)。每个指定的量效曲线独特的符号代表数据从一个动物。股票病毒包膜蛋白序列经Sanger测序。EC50,一半最大有效浓度;nAb,中和抗体;卵,卵清蛋白。
此外,免疫球蛋白池中和基因型1 - 5丙肝病毒体内提取信封序列和基因型6丙肝病毒有两个重要的细胞培养适应替换在信封蛋白质具有相似功效和浓度依赖方式。跨中和病毒,意味着EC50的免疫球蛋白基因型1 a、2 a和3接种动物是67年,68年和77年µg /毫升,分别观察和接近完成中和1000µg /毫升(图6)。小鼠免疫球蛋白中和能力相比和从CHC关于患者疗效和宽宏大量免疫球蛋白(图7)。有趣的是,这些数据证实,5 (SA13)中和灵敏度相对较高,而2(卫星)和3 (S52)中和灵敏度相对较低。42此外,中和能力的免疫球蛋白基因型感染患者低于3,从基因型1,2或2 b被感染的病人。
免疫与灭活基因型1、2或3丙肝病毒引起广泛的逮捕。纯化从每组小鼠的免疫球蛋白,接种与基因型1、2或3丙肝病毒,集中使用相同数量的每个动物的免疫球蛋白。体内免疫球蛋白池被用来抵消重组包含派生的基因型(隔离)1 (TN), 1 b(阁下),2(卫星),2 b (J8), 3 (S52), 4 (ED43)和5 (SA13) core-NS2序列;6 (HK6a)包含两个重要的细胞培养适应在E1和E2替换。24岁25 30数据点的三个与SD复制;曲线拟合,EC50与公式计算y = 100 / (1 + 10(log10EC50−X)×hillslope使用GraphPad棱镜)。股票病毒包膜蛋白序列经Sanger测序。EC50,一半最大有效浓度;nAb,中和抗体。
![Engineered high-yield genotype 1a, 2a and 3a HCV recombinants showed increased sensitivity to neutralisation by human-derived nAb. Recombinants with in vivo derived genotype(isolate) 1a(TN),30 2a(J6)24 and 3a(DBN)30 core-NS2 sequences, as well as TNcc-HI, J6cc-HI, DBNcc-HI, the genotype 1a HCV seed stock and DBN3acc28 with envelope protein substitutions acquired during in vitro passage were subjected to neutralisation with human mAb AR3A and AR4A,17 18 and polyclonal antibody C211.19 Data points are means of three replicates with SD; curves were fitted, and EC50 were calculated with the formula y=100/(1+10(log10EC50−X)×hillslope) using GraphPad prism. Fold increase in neutralisation sensitivity was calculated as [(EC50 of 1a(TN), 2a(J6) or 3a(DBN) virus with in vivo derived envelope protein sequence)/(EC50 of respective virus with in vitro derived envelope protein substitutions)]. Virus stock envelope protein sequences were confirmed by Sanger sequencing. EC50, half maximal effective concentration; gt, genotype; mAb, monoclonal antibody; nAb, neutralising antibody.](http://www.marcconsult.com/content/gutjnl/72/3/560/F4.large.jpg?width=800&height=600&carousel=1){kind=link}
免疫与灭活基因型1、2或3丙肝病毒引发丙肝病毒包膜蛋白抗体绑定。绑定能力池(A)纯化血清免疫球蛋白或(B和C) immune-sera从小鼠接种灭活基因型1、2或3丙肝病毒或卵子的E1 / E2复合物指定HI-recombinants被ELISA评估。光密度值(OD)读取在450纳米以下减法平均OD 8 -控制。数据点与SD意味着两个复制。(一)积极控制:代替血清免疫球蛋白,特征明显主要使用抗体:AP3338对于绑定TNcc-HI DBNcc-HI E1和E2和H77.3939J6cc-HI E1和E2绑定。消极的控制:不使用免疫球蛋白或immune-sera,和TNcc-HI J6cc-HI DBNcc-HI E1和E2和孵化与二次抗体;消极的控制,OD读~ 0.05。(A和B)在卵巢图表,数据点反映绑定J6cc-HI E1 / E2和DBNcc-HI E1 / E2推动了0.04和0.08单位在y方向上,分别。(C) Immune-sera端点滴定度测定作为OD >收益率最高的血清稀释2倍平均OD -控制。卵,卵清蛋白。
最后,丙肝病毒接种动物组织的免疫球蛋白g池有效绑定TNcc-HI, J6cc-HI和DBNcc-HI E1和E2复合物浓度的方式(图8,在线补充图6)。这些绑定没有观察到池从卵子接种动物免疫球蛋白。池的immune-sera端点的滴定度32 000 (图8,在线补充图7)。
讨论
在这项研究中,我们开发了高产基因型1 a、2 a和3丙肝病毒细胞培养系统,以促进发展全病毒灭活疫苗的候选人。与原病毒相比,高产病毒显示增加曝光的守恒的构象中和抗原表位与防止慢性丙肝病毒感染有关,所显示被马伯AR3A中和和AR4A敏感性增加。在小鼠免疫原性研究、高产基因型1、2或3病毒,制定模拟人类MF-59佐剂,每个有能力诱导高效nAb广泛中和丙肝病毒的主要基因型与认可的流行病学意义。
高效生产全病毒灭活疫苗,高收益病毒生产是必需的。例如,SARS-CoV-2用于疫苗生产长到传染性滴定度为6.5 7 log10 TCID50 /毫升。43选择高产变异之前开发的完整的重组的最普遍的HCV基因型,代谢途径我们使用一个串行通道的方法,以前用于进一步适应JFH1-based 5基因型病毒。31日应用这种进化的方法,直到没有观察到病毒传染性滴定度进一步增加,直到均匀病毒数量没有明显的证据进行额外假定的自适应选择替换记录预计将导致选择的高度适合和基因病毒种群稳定。31日因此,发达基因稳定、高产丙肝病毒重组在未来可以用来启动病毒生产疫苗抗原序列证实早期病毒通过种子的股票。44 45基于本研究的结果使用完整的重组,以及使用JFH1-based重组从先前的研究结果,31日丙肝病毒传染性滴定度上限的单层Huh7.5细胞培养在6和7之间log10洁净/毫升,这可能是由于有限的可用性需要宿主细胞因子。未来的研究应该关注的调查获得的影响病毒在病毒生命周期替换。有趣的是,一些替换选择在本研究中也选择在细胞培养适应其他的丙肝病毒重组,这表明丙肝病毒细胞培养适应一般的作用(在线补充表10)。
在未来的研究中,这将是特别感兴趣的调查,所选的信封替换授予增加曝光的守恒的构象抗原表位的目标AR3A AR4A。删除等几个基因变化E2 HVR1 (aa, 384 - 410年),40废除N-linked的糖基化,19 46而且具体替换HVR1 400 - 404 (aa)和E2前层(aa 414年、431年和453年;前层:aa 411 - 461)20.介绍了中和敏感度的增加,与开放的E1、E2的状态。19日20TN-PP-18和tn - pp - 38.1于HVR1 N410K收购,而tn - pp - 38.1除了于HVR1 F403L收购。J6cc-PP-35收购H434N E2层和前面的HVR1 DBNcc-PP-16 G395R收购,而DBN3acc怀有S449A E2前线的层。28此外,本土化E2这些特定区域以外的以前与中和敏感性的变化有关,tn - pp - 38.1获得V719I J6cc-PP-35 A573T收购,而DBN3acc包庇D474A, T528N V629A。28
病毒之间的正相关健身和中和表位暴露在以前的研究中也观察到丙肝病毒31日和艾滋病毒。47丙肝病毒,体内保护守恒的构象中和抗原表位可能与健身相关成本封闭E1和E2州可能减少访问的主要丙肝病毒进入受体结合位点的研究,这是与AR3重叠。2
丙肝病毒,删除HVR1导致最大限度开放E1和E2状态中和高灵敏度有关。19个40完整的基因型1 - 3 HI-viruses在本研究和开发之前开发的5 JFH1-based高产基因型丙肝病毒,31日的AR3A抗原表位在HVR1-deleted病毒一样访问,而AR4A抗原表位大约10倍到100倍少接触。35 40不过,HVR1-deleted病毒通常显示传染性滴定度相对较低,阻碍了疫苗生产。48与原病毒相比,HI-viruses显示300 ~ 1250倍高暴露AR3A抗原表位和12 ~ 2400倍高暴露AR4A抗原表位;高产基因型5丙肝病毒显示只有~ 10倍高曝光的AR3A和AR4A比原来的已经高度中和抗原表位敏感基因型5丙肝病毒。35
因此,基因型1、2和3 HI-viruses这项研究和开发的高收益JFH1-based 5基因型丙肝病毒31日现在有趣的疫苗抗原可能促进诱导抗体针对的抗原表位,是守恒的丙肝病毒变异与中介保护人类。疫苗抗原暴露这样的守恒的抗原表位诱导能力广泛nAb可能使不必要的多价疫苗的方法。
事实上,免疫与高产基因型和基因型1 - 3 PP-viruses HI-viruses 5丙肝病毒31日导致广泛nAb的感应。百分之五十中和滴定度和ELISA端点的诱发抗体滴定度比得上那些报道领有执照的抗病毒疫苗和与黑猩猩免于丙肝病毒的挑战与E1和E2异质二聚体疫苗接种后。6 10然而,相比之下,从慢性感染患者免疫球蛋白,E1和E2抗体引起的异质二聚体疫苗8 - 10基于可溶性E2蛋白和不同的候选疫苗,46 49-51nAb诱导在这和之前的研究35显示增加中和不同的丙肝病毒变异的能力。最后,50%的中和滴定度比得上那些报道2基因型灭活疫苗候选人在老鼠和非人类的灵长类动物实验佐剂不适合人类使用应用。21日29日在非人类的灵长类动物的研究,应用程序的许可佐剂氢氧化铝没有导致高效nAb的感应。29日AddaVax / MF-59似乎比氢氧化铝免疫原性。35 52此外,对于其他病毒,建议增加中和表位接触导致免疫原性增加。53 54在未来的研究中,这将是有趣的调查,是否增加曝光的守恒中和抗原表位免疫原性以及不同的HCV基因型/是否增加血清型不同的免疫原性。42 55然而,这需要发展高收益没有病毒E2替换调停抗原决定基曝光,这可能不太可能,因为它可能增加健身是至少部分由这样的替换。可溶性E2和E1和E2异质二聚体疫苗平台可能更适合这样的研究;但是,他们可能不反映本机包膜蛋白构象在整个病毒粒子。在这样的研究中,删除这三个变量的E2地区据报道,导致某些免疫原性的增加,而删除HVR1和/或糖基化网站的修改没有或轻微影响免疫原性。46 49-51 56删除已经高度中和敏感的高产基因型的HVR1 5丙肝病毒,通过后续的文化适应,没有增加免疫原性。35此外,未来的研究需要更多的hiv疫苗诱导nAb和最有可能的派生马伯可能调查的目标这些抗体的抗原表位。
进一步的临床前和临床发展需要优化的疫苗生产和加工条件,以确保兼容性与疫苗生产。36 44此外,进一步的研究应该定义的最有力的候选疫苗开发,基于性能的优化生物过程和详细的免疫原性的研究产生的抗原,以及剂量发现研究。在最初的上游生物工艺研究采用可伸缩的生物反应器44 57和病毒种子股从早期病毒生成段落转染后,基因型2和3 HI-viruses和高产基因型5丙肝病毒35取得了相当高的传染性滴定度比hiv基因型1,标志着为这三个候选人的优势在生产过程。没有免疫活性的丙肝病毒体内挑战模型是可用的。虽然未来的研究可能雇佣专门的小动物模型如人类肝嵌合体uPA-SCID小鼠模型研究的某些方面诱发的保护48和大型动物证实疫苗的安全性和免疫原性,9有希望的候选疫苗可能需要进行临床试验涉及人类感染控制模型58评估他们真正的防护潜力。最后,在寻求一个丙肝病毒疫苗,这将是重要的促进cross-comparison候选疫苗的应用标准化的化验。42 55
总之,我们开发了高产基因型1、2和3的丙肝病毒灭活疫苗组成一个依据候选人可以用于进一步的临床前和临床的发展。
数据可用性声明
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伦理语句
病人同意出版
伦理批准
丙肝病毒串联群是区域伦理委员会批准(h - 21004361)和丹麦数据保护机构(2012-58-0004)。参与者给知情同意参与这项研究之前的部分。
引用
补充材料
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补充数据
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脚注
贡献者研究设计:GPA,法新社、JB、晋城无烟煤矿业集团。收购数据:GPA,法新社、AO CRDH, ZD、科幻和佛罗里达大学。分析和解释数据:GPA,法新社,AO, CRDH,超滤,CS, NW, ML, JCP, JB和晋城无烟煤矿业集团。贡献的材料:CS,西北和毫升。起草的手稿:GPA和晋城无烟煤矿业集团。研究监督:晋城无烟煤矿业集团。担保人:晋城无烟煤矿业集团。所有作者回顾了手稿。
资金这项工作是由博士津贴和奖金的宽袖长袍基金会和哥本哈根大学(法新社、AO JB和JMG),中国学术委员会(ZD和JMG),诺和诺德基金会的拨款(NW、JB、晋城无烟煤矿业集团),丹麦癌症协会(JB和JMG),丹麦独立研究基金(DFF)——医学科学(JB和JMG),创新基金丹麦(JB和JMG), Lundbeck公司基金会(摩根和JB)它是一家,该地区H基金会(法新社、CS、JB和JMG),丰田基金会(AO和JMG), Læge Sofus卡尔·埃米尔Friis og Hustru奥尔加多丽丝Friis”基金会(JMG)和Mauritzen拉封丹基金会(JB)。毫升部分是由国家卫生研究院的基金AI123861 AI144232。
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